Tài liệu ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất cồn

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (935.44 KB, 67 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

MUÏC LUÏC

Phần 1:Giới thiệu chung...3

Phần 2: Sơ đồ quy trình...4

Phần 3:Ứng dụng của VSV trong cơng đoạn đường hóa dịch cháo...6

I-Giới thiệu chung về nấm mốc...6

1-Cấu tạo sợi nấm...7

2-Sinh sản của nấm...7

II-Những lồi nấm thường dùng...9

1-Rhizopus...11

2-Mucor...11

3-Aspergillus ...12

III- Ni cấy mốc đường hóa : các chế phẩm enzym đường hóa...16

IV- Đường hố tinh bột:...21

1-Tác dụng của enzym amylase lên mạch tinh bột...21

2- Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa tinh bột...23

Phần 4:Ứng dụng của VSV trong cơng đoạn lên men dịch đường...31

A-Nấm men...31

I-Saccharomyces cerevisiae...31

1-Đặc điểm...31

2-Một số chủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng...32

3-Nghiên cứu so sánh khả năng lên men của chủng 12 với chủng
MTB và 1 vài chủng khác hiện có ở nước ta...33

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men

Saccharomyces cerevisiae...36

II- Cơ chế lên men rượu...40

1- Cơ chế hóa sinh học của q trình lên men...41

2- Tiến hành lên men rượu...44

III- Nhận xét, đánh giá các phương pháp lên men...46

IV- Hiệu suất quá trình lên men từ nấm men...48

B-Vi khuaån...48

I.Giới thiệu chung...48

II.Các vi khuẩn lên men cồn...49

1.Zymomonas mobilis...50

a.Đặc điểm...50

b.Điều kiện phát triển...52

c. Ni cấy...53

d- Q trình lên men...55

e-Hiệu suất q trình...55

2.Clostridium...57

a.Đặc điểm...57

b.Điều kiện phát triển...58

Phần 5: Hiệu suất và tổn thất trong sản xuất...62

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

PHẦN 1: GIỚI THIỆU CHUNG

Công nghệ cồn etylic là khoa học về phương pháp và quá trình chế
biến các nguyên liệu chứa tinh bột, đường, xenluloza, etylen thành sản
phẩm etylic hay etanol.

Quy trình cơng nghệ sản xuất cồn etylic có thể chia thành các cơng
đọan chính gồm : chuẩn bị dịch đường lên men; gây men giống, lên men

dịch đường và xử lý dịch lên men.

Chuẩn bị dịch lên men:

- Nếu ngun liệu chứa tinh bột thì cơng đọan này gồm nghiền, nấu,
đường hóa và làm lạnh đến nhiệt độ lên men.

- Nếu nguyên liệu là mật rỉ thì chuẩn bị dịch lên men gồm pha lõang
sơ bộ, xử lý mật rỉ, bổ sung nguồn dinh dưỡng, tách cặn rồi pha
loãng tới nồng độ gây men và lên men

Gây men giống và lên men: muốn lên men trước hết cần phát triển men
giống tới chất lượng và số lượng cần thiết, thường bằng 10% thể tích của
thùng lên men. Sau đó đưa men giống và dịch đường vào thùng rồi khống
chế ở điều kiện xác định để nâùm men chuyển hóa đường thành rượu và
CO2. Dịch nhận được sau lên men gọi là giấm chín.

Xử lý dịch lên men: cơng đoạn này có liên quan tới kiến thức lý học và

chuyển khối. Thực chất là dùng hệ thống chưng luyện phù hợp để tách
rượu và các chất dễ bay hơi khỏi giấm chín, sau đó đem tinh luyện để
nhận được cồn sản phẩm, thỏa mãn tiêu chuẩn và yêu cầu tiêu dùng. Sản
phẩm thu được sau xử lý bao gồm cồn thực phẩm, cồn đầu, dầu fusel hoặc
ancol cao phân tử.

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

nấm men thô dùng cho chăn nuôi, chế biến các lọai kháng sinh… Ở một
số nước, người ta đem cô đặc bã rượu tới nồng độ chất khô nhất định và
bổ sung trực tiếp vào khẩu phần ăn của vật ni. Trong bã rượu từ rỉ
đường cịn có thể thu nhận glyxerin, axít glutamic. Trong những năm gần
đây bã rượu từ mật rỉ còn được nghiên cứu và đưa vào phụ gia của vật

liệu xây dựng.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

PHẦN 2: SƠ ĐỒ QUY TRÌNH

Tinh bột

Xử lý nguyên liệu

Quá trình dịch hóa

Đường hóa

Lên men rượu

Chưng cất

Tinh chế

Mật rỉ

Xử lý nguyên liệu
Nguyên

liệu

Nấm
men

Chuẩn bị dịch lên men

Lên men rượu

Tinh chế
O2

Chế phẩm

amylase của
nấm mốc

Nấm
men

Chưng cất

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG

CÔNG ĐOẠN ĐƯỜNG HÓA DỊCH CHÁO

Nấu xong, tinh bột trong dịch cháo đã chuyển sang trạng thái hòa tan
nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được, mà phải trải qua
quá trình thủy phân do xúc tác của amylase để biến thành đường. Quá trình
trên được gọi là quá trình đường hóa, có vai trị rất quan trọng trong cơng
nghệ sản xuất cồn ethylic. Nó quyết định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu do
giảm bớt hoặc gia tăng đường và tinh bột sót lại sau khi lên men.

Muốn đạt hiệu quả cao trong quá trình thủy phân tinh bột thì phải
chọn được tác nhân đường hóa tốt nhất. Hiện nay, người ta dùng amylase
nhận được từ nuôi cấy vi sinh vật, trong đó nấm mốc được sử dụng nhiều
nhất, sau đó đến vi khuẩn, cuối cùng là nấm men Endomycopsip. Các yếu tố
cần chú ý khi nuôi cấy vi sinh vật là chọn giống, môi trường nuôi cấy, điều

kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy).

I-GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM MỐC

Nấm mốc (mold) là tên chung để chỉ các lọai nấm hiển vi có cấu
tạo sợi. Chúng thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, khơng có diệp lục
tố, khơng có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ khí carbonic mà sử
dụng trực tiếp chất hữu cơ có sẵn để sinh sống.

Nấm mốc chỉ mọc tốt trong mơi trường có nhiều khơng khí, vì vậy
chúng thường phát triển trên lớp bề mặt của cơ chất, dưới dạng những lớp
lún phún hình sợi, lớp mang nhện hay khối sợi bông. Trong cơ chất,
chúng chỉ sinh trưởng trong các khoang hổng chứa khơng khí. Nhiều loại
nấm mốc có giá trị lớn trong cơng nghiệp, trái lại nhiều loại nấm lại gây
nhiều thiệt hại trong công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm, y học

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

1-Cấu tạo sợi nấm

Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một
khối sợi, từng sợi riêng lẻ gọi là sợi nấm (khuẩn ty thể, mycelium). Có 2
loại sợi nấm: sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm khơng có màng
ngăn ngang; trong trường hợp sau, tòan bộ hệ sợi nấm chỉ là 1 tế bào
phân nhánh rất phức tạp. Chiều rộng của sợi nấm thay đổi từ 5-50μm.

Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào trong cơ chất và
hút chất dinh dưỡng ở trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần
hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt của cơ chất (khuẩn ty ký sinh), phần sợi
nấm nằm ngồi này nhiều hay ít tùy theo lồi và mơi trường. Ở nhiều
lồi, các sợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản. Ở
một số nấm khác, sợi nấm đan kết lại dàu đặc với nhau và tạo thành quả

thể.

Cấu tạo tế bào của nấm không khác với cấu tạo của các sinh vật
khác. Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose; ở nhiều loại nấm, trong màng tế
bào có chứa kitin. Trong tế bào chất có khơng bào và các chất khác. Các
chất dự trữ thường gặp ở nấm là glycozen, hạt volutin và các giọt mỡ. Tế
bào nấm có 1,2 hoặc nhiều nhân. Ở nấm, hiện tượng nhiều nhân rất phổ
biến.

2-Sinh saûn của nấm

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

sợi nấm mới. Trong phịng thí nghiệm thường dùng phương pháp này để
nhân giống và phân lập.

Một số nấm sinh sản bằng oidi (bào tử bột). Trong trường hợp này,
sợi nấm bị cắt ra thành từng phần nhỏ đơn bào và mỗi một tế bào đó có
thể phát triển thành một hệ nấm mới. Sợi nấm bị cắt ra, từ ngọn xuống,
và hiện tượng đó có thể tiến hành ở tòan bộ hệ sợi nấm.

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

Ở các loài nấm khác, bào tử lại được hình thành trong các tế bào riêng
biệt nằm ở đầu sợi nấm. Những bào tử đó thường có kích thước lớn, hình
cầu, gọi là bọc bào tử (sporangium) hay bào tử nang, sợi nấm mang gọi
cuống bọc bào từ (cuống bào tử nang). Cuống bọc bào từ thường phát
triển trong bọc bào tử làm thành một trụ có nhiều hình dạng khác nhau,
gọi là lõi (columelle) hay nang trụ

Trong sinh sản hữu tính, nấm tạo ra nang (asque) mang nang bào tử
(ascospore), và đảm (basidi) mang đảm bào tử (basisospore), đó là những
cơ quan sinh sản đặc biệt.

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

NHỮNG LOAØI NẤM THƯỜNG DÙNG
1 . Rhizopus :

Rhizopus có nhiều loại: Rhi. japonicus, Rhi. Orysee, Rhi. pekaII,
Rhi. Tonkinensis…

Rhizopus có đặc điểm sinh trưởng bằng “giả chi” để lan rộng trên bề

mặt. Ở những điểm tiếp xúc với mơi trường đặc, thành ống nghiệm… có
một chùm rễ giả. Ở chỗ có giả căn, thân bị tiếp tục phát triển và sinh ra
các cuốn tử nang chứa nhiều bào tử. Bào tử sinh ra từ nang trụ ở bầu
cuống. Vì một phần nang trụ tiếp xúc với vách nang, do đó khi soi kính,
nửa dưới của nang lộn ngược như cái ô mà cuống nang trụ là cán ô. Lúc
non, bào tử nang trắng, lúc già màu đen, bên trong có nhiều bào tử. Bào
tử hình trứng hay hình bán cầu, mặt thường có nếp nhăn, kích thước 5
-8μm.Nhiệt độ phát triển thích hợp 32-340C.

Rhizopus sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp nhưng ít gặp. Chủ yếu sinh

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

Rhizopus, Absidi thường thấy trên củ, hạt ẩm, bánh mì, cơm, xơi …để

trong khơng khí vài ngày. Bằng mắt thường thấy khuẩn ty của chúng như
những “tấm” mạng nhện, bào tử nang lúc non trắng, khi già đen nhạt có
những chấm nhỏ. Bào tử dễ bay trong khơng khí, gặp điều kiện thuận lợi
sẽ nảy mầm.

Rhizopus thường được nuôi cấy, phát triển trên môi trường dịch thể

giàu dinh dưỡng và có thơng khí, hệ enzym amylase tương đối hòan chỉnh,
nên thường được dùng trong sản xuất rượu theo phương pháp amilose và
nuôi cấy nấm mốc lỏng (phương pháp bề sâu).

2. Mucor

Mucor và Rhizopus rất giống nhau. Song có thể phân biệt giữa
Mucor và Rhizopus ở 3 điểm : Mucor khơng có thể giả căn, cuống bào tử

nang có thể sinh ra ở bất kỳ chỗ nào có nang trụ khơng có hình bán cầu,
khơng sát với vách bào tử nang

Khuẩn ty của Mucor có 2 loại (+) và (-) màu trắng phân nhánh,
giống nhau về hình thái, khác nhau về sinh lý. Từ một lọai khuẩn ty có
thể sinh sản vơ tính. Từ 2 loại khuẩn ty có thể sinh sản hữu tính theo kiểu
tiếp hợp để cho bào tử nang đa hạch, về sau là các bào tử nội sinh.

Trong sản xuất thường gặp các loại : Mucor rouxii, Mucor mucedo,

Mucor javanicus, Mucor hydrophilus… Nhưng sử dụng phổ biến trong sản

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Ở Mucor rouxii, ngoài hệ men amylase cịn có enzym rượu hóa nên
trong điều kiện yếm khí, enzym của Mucor rouxii có thể biến đường
thành rượu. Hiện tượng này rất hay gặp trong q trình sản xuất nấm mốc
bề mặt trên mơi trường chất rắn có tinh bột giữ ở nhiệt độ cao (39-400C).

Mucor rouxii phát triển mạnh trên môi trường thạch Csepek, khuẩn

ty phân nhánh nhiều, không vách ngăn, đa nhân, khuẩn lạc cao, không
nếp nhăn, bán vào nắp hộp lồng (petrie). Đặc biệt cuống bào tử nang

phân nhánh khơng có thứ tự nhất định. Bào tử nang thường trịn, đường
kính 60-80 μm. Nang trụ 20-25 μm. Bào tử trịn, đường kính 6-7 μm.

Khuẩn ty lúc non màu trắng, già có màu xám nhạt. Bào tử nang từ
màu trắng chuyển dần sang màu hơi vàng, đỏ xám, đen, làm cho màu
khuẩn lạc xám dần. Mặt dưới khuẩn lạc khơng có nếp nhăn, khơng màu.

3 . Aspergilus

Aspergilus có thể tìm thấy dễ dàng ở khắp mọi nơi, trên mọi cơ chất.

Vào khoảng năm 1877, ở Nhật, người ta đã phát hiện và sử dụng

Aspergilus vào sản xuất rượu, phân giải acid…

Aspergilus gồm rất nhiều loại, nhưng trong công nghiệp sản xuất

rượu thường dùng các loại : Asp.flavus, Asp.orysee, Asp.batatae,

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

Aspergilus có đặc điểm sau : khuẩn ty không màu hay vành nhạt. Có

2 loại : khuẩn ty ký sinh phát triển trên mặt môi trường và khuẩn ty dinh
dưỡng ăn sâu vào trong môi trường. Khuẩn ty phân nhiều nhánh, có nhiều
ngăn tế bào mỗi tế bào có một nhân. Nang và nang bào tử là quả thể màu
vàng kim. Khi Aspergilus hình thành đính bào tử dễ phân biệt với các
mốc khác. Cuống đính bào tử dài và thẳng, khơng phân nhánh mà đầu
phình to tạo thành chop nang.

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Màu sắc có thay đổi tùy điều kiện môi trường, thời gian nuôi cấy…
trên mơi trường nhất định (ví dụ mơi trường Csepek); màu khuẩn lạc là

một dấu hiệu để phân loại. Asp rất nhạy đối với nguyên tố vi lượng, tạo
ra màu sắc đặc biệt của khuẩn lạc. Mulder đã xác định : Asp. Niger có
màu sẫm nhất khi mơi trường có Cu2+ với nồng độ 0,00025%; ở nồng độ

thấp hơn, màu khuẩn lạc nhạt dần. Khi khơng có đồng, đính bào tử có
màu vàng (bình thường là đen hay nâu)

 Aspergilus Orysee : ni trên thạch Csepek thì trên vùng bào tử có
màu vàng lục trội về màu vàng. Vùng khơng có bào tử hẹp và
trắng. Khuẩn lạc khơng có nếp nhăn hoặc khơng rõ rệt. Bào tử
nang đầu trịn 40-60 μm, cuống đính bào từ dài 0,8-1,5mm, đường
kính 8-12 μm, có thể thấy bằng mắt thường. Đính bào tử hình bầu
dục hay quả lê, kích thước 4-6×5-7 μm. Tế bào chai đặc trưng của
Aspergilus dễ thấy. Bào tử nang lúc non trắng, lúc già vàng lục,
càng già màu càng sẫm. Đính bào tử trần dễ bay. Mốc này sinh ra
các enzym amylase, invectase, maltase, protease và catalase. Hoạt
tính men amylase, protease rất cao. Mốc này phát triển trong
khoảng nhiệt độ 15 - 400C, tối thích 30 - 320C. Mốc này được sử

dụng nhiều rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu, tương, chao,
thuộc da, nước chấm lên men v.v…

 Aspergilus Flavus : ni trên thạch Csepek thì mặt trên vùng bào
tử có màu lục vàng, trội về màu lục. Khuẩn lạc thấp, đính bào tử
nằm sát mặt thạch, do cuống ngắn. Mặt dưới khuẩn lạc thường
không màu, đôi khi vàng nhạt. Bào tử nang đầu tròn 40 - 60 μm.
Cuống đính bào tử ngắn 0,3 - 0,5mm. Đính bào tử tròn hay bầu dục
3,5 - 5 μm. Tế bào chân rõ dễ thấy. Bào tử dễ bay. Aspergilus

orysee rất giống Asp. Flavus, chỉ khác là kích thước lớn hơn, khuẩn

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

A.Orysee, đặc biệt là protease rất hoạt động và chế phẩm tinh khiết

của enzym này được dùng làm tác nhân ổn định bia. Ở một số mơi
trường có chất béo (trên lạc), mốc này có thể sinh ra độc tố
aflatoxin. Có một số tác giả xếp hai giống mốc này thuộc nhóm

A.orysee-flavus.

 Aspergillus niger : thường gọi là mốc đen. Trên môi trường thạch
Csepek, khuẩn lạc tròn, xốp, vùng bào tử màu nâu đen hoặc đen.
Khuẩn lạc có nếp nhăn rõ. Vùng giữa khuẩn lạc sau 3 4 ngày (2
-4mm) cao hơn xung quanh. Mặt dưới thường không màu, đôi khi
vàng nhạt, thấy rõ nếp nhăn từ tâm khuẩn lạc đi ra.

Bào tử nang đầu trịn, khá lớn (100 - 160 μm). Cuống đính bào tử
dài 0,5 - 1,5mm hoặc hơn, đường kính 7 - 17 μm, thấy rõ bằng mắt
thường. Cuống nhỏ hay thể hình chai, có hai lớp hình lăng trụ. Lớp
đầu dài lớn 15 - 25×3 - 4 μm. Đính bào tử trịn, đường kính 3 - 4
μm. Tế bào chân dễ nhận thấy.

Mốc sinh ra enzym amylase, invectase, maltase, protease,
pectinase, glucooxydase. Mốc này được dùng trong sản xuất rượu ,
sản xuất acid citric, acid fumaric. Protease do mốc này họat động ở
pH 2,5 - 3,5 còn ở protease của A. orysee không hoạt động ở vùng
pH này. Trên thế giới, 90% sản lượng acid citric được sản xuất
bằng phương pháp lên men.

 Aspergillus usami (sử dụng ở nhà máy rượu Hà Nội) là chủng niger
đã được đột biến bằng tia phóng xạ Coban 60. Qua nghiên cứu

chúng tôi nhận thấy Asp.Usami của nhà máy rượu có những đặc
điểm:

 Đính bào tử to, khi già có màu hơi nâu đen

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

 Hệ men amylase tương đối đầy đủ, nuôi trên môi trường
rắn (cám, trấu, bột ngơ) trong điều kiện thích hợp, chỉ sau
36 - 40 giờ, khả năng tích lũy men cao nhất. Ngồi tích lũy
amylase, Asp.usami cịn sinh ra một lượng acid khá lớn (2 
-3% trong mơi trường), vì vậy amylase của Asp.usami có thể
thủy phân tinh bột ở pH 4 - 4,5. Mặt khác amylase của

Asp.usami vẫn giữ được hoạt tính ở nhiệt độ cao 600C ±

10C.

Asgergillus awamori và Asgergillus usami gần với A.niger có khả

năng sinh ra nhiều dextrinase và glucomylase, amylase sinh ra ít
hoặc trung bình. Mốc này được dùng nhiều trong cơng nghiệp rượu
để đường hóa tinh bột.

III- NI CẤY MỐC ĐƯỜNG HĨA : CÁC CHẾ PHẨM ENZYM
ĐƯỜNG HĨA

Ni cấy mốc để sản xuất tương hoặc xì dầu ở các nước phương
Đơng có từ thời cổ xưa. Năm 1884 J.Takamine (Nhật Bản) đã nuôi cấy

A.orysee trên gạo, sau đó thay gạo bằng cám mì và thu chế phẩm enzym

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

dùng rộng rãi trong sản xuất rượu ở Mỹ theo quy trình cơng nghệ của
Takamine và được dùng phổ biến trên thế giới để đường hóa các nguồn
nguyên liệu tinh bột trước khi lên men rượu cho đến nay.

Hiện nay trong công nghiệp rượu thường dùng các chủng khác nhau
của mốc nhóm A.orysee, A.niger, A.awamoni, A.usami, A.batatae theo hai
phương pháp nuôi cấy bề mặt và ni cấy chìm.

 Phương pháp ni cấy bề mặt : Khuẩn ty thể của nấm mốc tạo
thành một lớp mỏng trên bề mặt mơi trường ni cấy, lớp khuẩn ty
có thể dày từ 3 - 5cm ; đối với môi trường rắn, khuẩn ty thể xuyên
sâu vào những chỗ hổng của môi trường. Trong công nghiệp sản
xuất rượu, chỉ áp dụng phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề mặt trên
môi trường dinh dưỡng chất rắn, có thơng khơng khí hoặc khơng
thơng khí. Đối với phương pháp ni cấy bề mặt trên môi trường
lỏng, chỉ áp dụng trong công nghiệp sản xuất acid citric.

 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc bề sâu: Nấm mốc nuôi cấy trong
môi trường dinh dưỡng dịch thể, có thơng khơng khí. Khuẩn ty thể
hình thành được phân bố và lơ lửng trong môi trường. Đặc biệt,
trong q trình ni cấy, men amylase được khuyếch tán ra mơi
trường.

Phương pháp ni cấy bề mặt nấm mốc đường hóa thường dùng cám
mì làm cơ chất. Cám mì cần phải lớn và có hơn 20% tinh bột. Cám được
thêm 1 ít formalin và acid clohydric để tăng hiệu quả thanh trùng dưới áp
lực hơi nước nóng 1 atm trong khoảng 1-2 giờ.

Nói chung ni cấy mốc đường hóa theo phương pháp đường hóa
gồm 4 giai đoạn:

 Chuẩn bị giống và nhân giống để thu được mốc trung gian;

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

 Nuôi cấy mốc trên khay, mành, nong, nia… trên các giá trong
các buồng ni mốc có những điều kiện thích hợp để mốc sinh
ra enzym tối đa;

 Đập nhỏ, sấy và đóng gói mốc cám khơ

Mốc giống A. awamori được giữ trong phịng thí nghiệm trên mơi
trường thạch – malt ở chỗ tối 180C. Cứ 3 tháng 1 lần cấy truyền trên mơi

trường nước malt có 7% chất khô với 3% thạch và 0,09% acid citric.

Mốc trước khi đưa vào sản xuất được cấy trên môi trường thạch –
malt 7 - 8 ngày rồi chuyển vài bình tam giác 500ml có 10g cám mì được
làm ẩm bằng 6ml nước đã acid hóa qua thanh trùng 1 giờ. Ni ở buồng
ấm 300C trong 3 ngày, sau đó chuyển sang nuôi ở khay nhôm hoặc mành

với điều kiện tương tự đến khi mốc sinh bào tử nhiều. Mốc cám thu được
này gọi là mốc trung gian dùng để cấy trộn vào môi trường sản xuất tiếp
theo.

Môi trường sản xuất cũng được chuẩn bị tương tự và san đều trên các
khay hoặc mành, nong… Chiều dày lớp môi trường 2,5 - 3cm. Tỷ lệ mốc
cấy chuyền tiếp khoảng 0,2 - 0,4%.

Nuôi mốc trên khay trong các buồng 28 - 320C có thơng gió và giữ

độ ẩm khơng khí 90 - 95%. Thời gian nuôi mốc từ 24 - 26 đến 30 - 36 giờ

và kết thúc khi mốc sắp đến giai đoạn bào tử. Trong q trình ni cần
lật và bẻ nhỏ cám vì hệ sợi mốc phát triển làm cơ chât kết thành bánh.

Mốc cám sau khi nuôi cấy có độ ẩm 40 - 50% cần phải sấy khơ
khơng quá 450C đến khi độ ẩm còn 10 - 12%, nghiền nhỏ. Mốc cám khô

đựng trong các bao hoặc thùng kín, bảo quản ở chổ mát (dưới 200C) và để

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

Qua nghiên cứu và thực tế thấy dùng cám mì làm cơ chất rắn ni
cấy mốc đường thu được kết quả cao nhất. Trường hợp khơng có cám mì
có thể thay bằng các mơi trường có các thành phần sau:

 Môi trường bột ngô : bột ngô nhỏ mịn, vàng – 75%; trấu nhỏ có

1/8 - 1/10 vỏ lúa - 25%; (NH4)2SO4 - 0,5%

 Mơi trường cám bổi: cám gạo có 0,5% (NH4)2SO4

Q trình ni cấy mốc trên những môi trường này tương tự như trên
môi trường cám mì.

Phương pháp ni cấy chìm thường dùng các mốc A.niger, A.usami,

A.batatae-61. Q trình ni cấy gồm các giai đọan :

 Chuẩn bị giống và nhân giống

 Pha chế mơi trường dinh dưỡng

 Nuôi cấy mốc trong thùng men, thu dịch men có hoạt lực cao.

Mốc giống dùng từ ống nghiệm hoặc từ mốc cám trong các bình tam
giác nhân giống như trong phương pháp bề mặt. Nhân giống có thể qua
cấp 1 ở trong bình tam giác và cấp 2 trong các thùng nhân giống có sục
khí. Mơi trường nhân giống gồm: dịch lọc bã rượu từ các nguyên liệu tinh
bột được bổ sung 1,5 bột mì hoặc bột ngơ (có khi dùng 2 - 3% cám); 0,5

cao ngơ; 0,5% KNO3; 0,1 - 0,2% MgO hoặc 0,2% Ca2CO3; pH=5,6 - 5,8.

Môi trường than trùng 1 - 1,5 atm/giờ. Trong mỗi bình tam giác 750 có
130 - 150 ml mơi trường. Nhân giống trong bình tam giác trên máy lắc
200 - 220 v/phút ở 30 - 320C khoảng 72 giờ, sau đó nhân giống tiếp trong

các nồi 2 vỏ có khuấy và sục khí (40 - 60 m3/h) ở 30 - 320C khoảng 24

-30 giờ.

Môi trường dinh dưỡng nuôi mốc để sinh enzym như sau:

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

 Boät 1,5 - 2%

 Cao ngoâ 0,5%

 MgO hoặc CaCO3 0,2%

 pH 5,6 - 5,8%

Trong mơi trường cần có 1,2 - 1,7g% chất khử (khơng tính pentose)
và N tổng: 220 - 280 mg%

Môi trường thanh trùng ở 1,5 - 2 atm khoảng 45 - 60 phút. Tiếp theo
tỷ lệ 1 - 5% (đối với A.batatae chỉ cần 1%)

Q trình ni mốc cần phải sục khí (15 - 20 m3/giờ) và khuấy, có

thể trong 18 giờ đầu khơng cần khuấy vì mốc mới phát triển, độ nhớt
thấp, vì vậy chỉ cần sục khí cũng đủ trộn mơi trường. Thởi gian ni cấy
khoảng 60 - 72 giờ ở 30 - 320C.

Dịch men sau khi nuôi cấy được thêm 0,25 formalin làm chất bảo vệ
và dùng để đường hóa dịch cháo ở nhiệt độ 56 - 570C với tỷ lệ 75 - 100%

(tùy thuộc vào hoạt lực enzym).

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

Đánh giá chất lượng đường hóa theo hoạt lực amylase, dextrinase,
glucoamylase và protease.

IV- ĐƯỜNG HỐ TINH BỘT:

Khối nấu khơng thể trực tiếp lên men rượu (vì trong nấm men
khơng có phức hệ Enzym Amylase) mà phải thủy phân sơ bộ tinh bột
bằng phức hệ Enzym Amylase của nấm mốc hoặc của malt. Trong sản
xuất, q trình này được gọi là đường hóa tinh bột ( hay sự đường hóa);
bán sản phẩm nhận được – dịch đường hóa. Trong sản xuất rượu từ
nguyên liệu có chứa tinh bột, đường hóa là 1 trong những q trình cơng
nghệ quan trọng ảnh hưởng đến q trình lên men, hiệu suất tổng thu hồi,
chất lượng sản phẩm, chu kỳ sản xuất…..

Khi nói đến q trình đường hóa, là kể cả các giai đoạn làm nguội
khối nấu từ nhiệt độ 105 - 110oC xuống nhiệt độ thích hợp cho tác dụng

của men Amylase (60 ± 2oC) và làm nguội dịch đường hóa đến nhiệt độ

thích hợp cho lên men (33 - 36oC).

1-Tác dụng của enzym amylase lên mạch tinh bột:

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

Sản phẩm trung gian và cuối cùng được tạo ra phụ thuộc và cấu trúc
của mạch Amilose và Amilopectin và vào phức hệ men Amylase sử
dụng.

Trong cấu trúc mạch Amilopectin củ tinh bột của các loại hạt, khơng thấy
có sự liên kết của acid Phosphoric (H3PO4) ở vị trí  1 - 6Glucoside nhưng

ở tinh bột khoai tây lại có mối liên kết đó:

Phức hệ Enzym Amylase của nấm mốc khác với phức hệ men
Amylase trong malt. Trong phức hệ men Amylase của Malt, hầu như
khơng thấy có men Glucoamylase (glA), nên sản phẩm cuối cùng của
q trình lên đường hóa tinh bột bằng men Amylase của thóc tạo Malt là
Maltose, lượng đường Glucose do men  - Amylase tạo ra không
đáng kể. Ngược lại, khi thủy phân tinh bột bằng phức hệ men Amylase
của 1 số loài nấm mốc, thì sản phẩm cuối cùng hầu như là đường
Glucose.

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

Dextrin có phân tử lượng khác nhau, Glucose, Maltose, và các
Oligosacchrit khác.

Men Oligo - 1,6Glucozidase cắt đứt các liên kết  - 1,6Glucozid trong
phạm vi của Dextrin, Isomaltase chỉ cắt đứt liên kết của các Disaccharide
mà thôi (đường Isomaltose).

Quan sát các hiện tượng xảy ra trong q trình đường hóa tinh bột bằng
men Amylase, ta thấy:

 Độ nhớt của dung dịch giảm dần.

 Khả năng khử (đối với các dung dịch oxy hóa) tăng lên.

 Phản ứng định tính với Iod thay đổi từ màu xanh, tím xanh, đỏ
nâu, đến khơng màu.

2- Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình đường hóa tinh bột:

a) Nồng độ của men:

Trong sản xuất, tốc độ của sự thủy phân, tinh bột là hàm số của sự
tác dụng tổng cộng của men Amylase trong nấm mốc hoặc trong malt.
Trong phức hệ men Amylase của nấm mốc hoặc trong malt có những men
khác nhau, số lượng khác nhau, hoạt tính khác nhau.

Những điểm đó đưa tới sự thủy phân tinh bột khác nhau (về mức độ
đường hóa, tốc độ đường hóa và sản phẩm cuối của q trình đường hóa).
Tinh bột được hồ hóa triệt để, nồng độ tinh bột 12%, pH - 5, đường hóa ở
nhiệt độ 57oC trong thời gian 30 phút, sau đó làm nguội tới 30oC và tiếp

tục phân tích hàm lượng đường sinh ra trong suốt thời gian làm đường
hóa, cho đến khi có kết quả phân tích nhiều lần khơng thay đổi.

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng sau:

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

dung, % Sau 12h Sau 24h 36 - 48h

2
4
6
8

6.42
6.42
8.70
9.50

8.45
8.95
8.95
10.23

9.20
10.46
10.50
_

Những thí nghiệm tương tự với tỷ lệ men sử dụng 8 - 10% cũng chỉ
đạt 9,5 - 10% lượng đường sinh ra. ( Với hàm lượng tinh bột ban đầu cao
hơn thì hàm lượng đường cùng sinh ra cao hơn tương ứng). Vì vậy, khi nói
đến ảnh hưởng của nồng độ men tức là nói đến hoạt tính, số lượng và sự
cân đối của phức hệ Amylase.

b) Aûnh hưởng của nhiệt độ:

Tốc độ phản ứng của men cũng như phần lớn phẩn ứng hóa học tăng
lên khi tăng nhiệt độ. Tính phụ thuộc của hằng số vận tốc với nhiệt độ,
được thể hiện trong phương trình Arenius:

(dlnK)/(dT)=E/(RT2)

Trong đó: T nhiệt độ tuyệt đối,oK

R hằng số chất khí

Sau khi lấy tích phân phương trình trên trong giới hạn T1 và T2 ta có

E = ((lnK1-lnK2)RT1T2) / (T1-T2)

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

Đặc trưng của phản ứng thủy phân tinh bột bằng Amylase là diễn ra
trong phạm vi nhiệt độ tương đối hẹp, giới hạn là 35 - 63oC ( đây là

khoảng nhiệt độ tối thích của Enzym Amylase).
Nếu đường hóa ở nhiệt độ cao là to

ap của Dextrinase thì lượng

Dextrin tạo ra sẽ nhiều trong khi đó Maltose sinh ra ít, hiệu suất quá trình
thủy phân bị giảm.

Tác dụng của nhiệt độ lên các Enzym không phải tức thời, các Enzym giữ
được hoạt tính cao trong 1 thời gian ngắn.

Đơi khi, trong quá trình làm nguội từ 105 - 109oC xuồng nhiệt độ

thấp hơn (55 - 60oC) ta có thể thêm vào Enzym để tiến hành phân cắt sơ

bộ, làm loãng khối nấu, dễ đưa chúng vào máy làm nguôi.

Nếu đường hóa ở nhiệt độ khoảng 40 - 50oC thì thực ra khơng có lợi

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

c) Aûnh hưởng của pH:

Bản chất của men gần giống như bản chất của Protein, hầu hết
Protein là những hợp chất lưỡng tính. Các Enzym cũng có bản chất là
Protein với các trung tâm hoạt động.

Ion H+ có thể tác dụng vào trung tâm hoạt động và các nhóm bên 1

cách trực tiếp hay gián tiếp (nhóm bên là nhóm amin NH2 hay nhóm

carboxylic COOH).

Qua nghiên cứu hệ Enzym Amylase ta thấy pH tối thích là 4 – 5, khi
pH = 2 hay pH = 10 thì Enzym bị vô hoạt.

Aûnh hưởng pH của Enzym phụ thuộc vào nhiệt độ và các yếu tố
khác ( nếu nhiệt độ tăng thì pHap tăng hướng về phía kiềm)

Độ pH khối nấu phụ thuộc 2 yếu tố:

 Bản thân nguyên liệu nấu (tinh bột và nước)

 Các chất phụ trợ trong quá trình nấu (H2SO4, acid lactic…)

Bởi vì các nguyên liệu trên có độ acid thường khoảng từ 0.2 - 0.5o

tương đương pH của nguên liệu là 4.9 - 5.6, pH này khơng thích hợp vì
khơng bằng với pH tối thích của Enzym Amylase vì thế khi nấu nguyên
liệu người ta hay cho thêm vào acid vô cơ (H2SO4 hay HCl) hay acid hữu

cơ như acid Lactic được nuôi cấy riêng, hay sử dụng bã rượu trong để nấu
nguyên liệu.

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rõ ràng rằng khi dùng acid Lactic
để điều chỉnh pH trong quá trình nấu và đường hóa đã nâng cao hiệu suất
tổng thu hồi rượu 2 - 3% so với dùng các acid vô vơ như HCl hay H2SO4.

Ngồi việc điều chỉnh pH thích hợp acid Lactic còn là nguồân thức ăn cho
nấm men sau này.

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

Trong quá trình đường hóa bằng Amylase của Malt, các chất
Hemicellulose và Pectin trong khối nấu hầu như khơng bị thay đổi nhiều
về mặt hóa học. Nhưng đường hóa bằng Amylase của nấm mốc thì các
chất trên có những biến đổi đáng kể. Trong nấm mốc, ngồi Enzym
Amylase cịn có thêm Enzym Pectinase, Xitase……giúp thủy phân các
Pectin, Hemicellulose, 1 phần Cellulose tạo ra được những chất đường
tương ứng lên men được như Saccharose hay các đường không lên men
được như Arabinose, Xylose. Do đó tạo nhiều sản phẩm phụ trong q
trình đường hóa.

Sự biến đổi của chất đạm trong q trình đường hóa có ý nghĩa quan
trọng. Trong Malt và cũng như trong nấm mốc đều có men Protease. pH
thích hợp cho Protease của Malt là 4.5 - 5.0; của Peptidase là 7.3 - 7.9. Ở
pH này và nhiệt độ 60oC, Protease tương đối bền vững. Nhiệt độ tối thích

của Peptidase là 45 - 47oC, khi nhiệt độ tăng lên, làm đình chỉ nhanh

chóng men Peptidase. Tuy nhiên, trong điều kiện khơng thích hợp như
vậy, q trình đường hóa, Peptidase đã làm tăng hàm lượng acid amin
trong dung dịch đường hóa tăng lên 2.3-3 lần so với ban đầu trong khối
nấu (20%N ở dạng hòa tan).

Nhiệt độ nấu nguyên liệu có ảnh hưởng đến sự phân cắt các
Albumin. Sau khi đường hóa khối nấu là lúa mì, trong dạng đạm hòa tan
số lượng Nitơ như sau:

Nhiệt độ nấu, oC Nitơ hịa tan, % so tổng số.

Tổng số Thành phaàn Albumin

100
200
300

32.8
40.0
41.9

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

Như vậy là nhiệt độ nấu ngun liệu càng cao thì, trong q trình

đường hóa, sự phân cắt của Albumin càng giảm. Nhưng , đối với ngun
liệu là ngơ thì q trình này ngược lại:

Nhiệt độ nấu Nito hòa tan, % trong tồng số

Tổng số Trong đó Albumin

100
135

16.5
36.0

7.5
9.1

Men Protease của nấm mốc (trừ Asp. Awamori) hoạt động thích hợp
ở mơi trường acid yếu và pH hơi thấp.

Trong thời gian đường hóa xuất hiện hoạt tính của men Phosphatase,
men này giải phóng Phospho trong cấu trúc của mạch tinh bột. Hàm
lượng phospho hòa tan cũng tăng lên có tác dụng tốt đối với q trình
sinh trưởng của nấm men, nâng cao được tính đệm của dung dịch đường
hịa và giảm pH trong q trình lên men rượu.

e) Những yếu tố ảnh hưởng khác:

e.1) Aûnh hưởng của chất sát trùng Na2SiF6: để hạn chế và ngăn

chặn sự nhiễm khuẩn trong q trình đường hóa, các nhà máy sản xuất
rượu thường dùng chất sát trùng như formol, Na2SiF6 ….với tỷ lệ 0.02

-0.025% so với khối lượng. Các chất sát trùng có thể cho vào dung dịch
nấm mốc hay dịch sữa Malt, hoặc có thể cho đồng thời vào cả khối nấu
và dịch men Amylase.

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

khi sử dụng phức hệ Enzym đã tách ra ( hoặc sử dụng ở dạng canh
trường).

e.2) Aûnh hưởng của nồng độ rượu : như đã trình bày ở trên, quá trình
đường hóa trong 1 thời gian ngắn, tinh bột khơng hồn tồn bị thủy phân,
mà q trình thủy phân tinh bột cịn tiếp tục đến khi kết thúc q trình
lên men rượu. Vì vậy, cần xét thêm ảnh hưởng của nồng độ cồn đối với
phức hệ men Amylase.

Iarovanko và các cộng sự đã nghiên cứu và rút ra những kết luận
sau:

Thời gian
đường

hóa(thủy
phân), giờ

Mẫu đối
chứng

Đường Glucose tạo thành,%

Nồng độ rượu cho vào, % v

4 6 10

12
24
36
50
4.47
5.12
6.35
6.82
5.15
6.18
6.43
6.82
4.00
5.92
6.35
6.82
4.66
6.18
5.97
7.04

e.3) Thời gian đường hóa : chọn thời gian đường hóa thích hợp
khơng những có ý nghĩa về mặt lý thuyết mà cịn có ý nghĩa lớn trong sản
xuất thực tiễn. Việc lựa chọn thời gian đường hóa cịn phụ thuộc vào
phương pháp làm nguội khối nấu và phương pháp đường hóa. Thời gian

làm nguội và đường hóa quyết định năng suất thiết bị, chất lượng của
dung dịch đường hóa và hiệu suất tổng thu hồi.

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

trong khoảng thời gian từ 15 - 120 phút, hầu như đường lên men trong
dịch đường hóa khơng tăng, nhưng nồng độ chất tan chung của dung dịch
lại tăng 1 cách rõ rệt. Sau 15 phút đường hóa, nồng độ chất tan là 13.8%
và sau đó 120 phút thì nồng độ chất tan là 14.8%, nhưng đường lên men
không tăng. Như vậy, thời gian đường hóa nâng cao hàm lượng chất khơ
hịa tan ( chủ yếu là đạm hịa tan) và nâng cao tính đệm của dung dịch.
Song, kéo dài thời gian đường hóa ở nhiệt độ 55 - 58oC sẽ làm giảm hoạt

tính của Enzym Amylase, khả năng nhiễm khuẩn tăng lên và hiệu suất
tổng thu hồi giảm.

Trong 1 thí nghiệm về ảnh hưởng của việc kéo dài thời gian đường
hóa đến hoạt tính men của Amylase của chủng Asp.orysee như sau:

Sau mỗi giai đoạn đường hóa, xác định hoạt tính của men Amylase( chủ
yếu là AC và DC) như sau:

Thời gian đường hóa đơn vị AC đơn vị DC

0 102.0 100% 114.0 100%
5 100.1 106.0
30 98.3 90.3

60 90.2 88.4% 52.8

51.7%

Như vậy là thời gian đường hóa tốt nhất là 5 phút, cho hiệu suất tổng thu
hồi tăng 37lit cồn/tấn tinh bột so với đường hóa ở 60 phút.

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

PHẦN 4: ỨNG DỤNG CỦA VSV TRONG

CƠNG ĐOẠN LÊN MEN DỊCH ĐƯỜNG

A-NẤM MEN

Nấm men là tác nhân cơ bản gây ra quá trình lên men ethanol. Thường sử
dụng nấm men thuộc họ Saccharomycetaceac, loài S.cerevisiae

I-SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1-Đặc điểm

- Hình dạng: tế bào hình bầu dục nếu ở môi trường giàu chất dinh
dưỡng. Trong điều kiện yếm khí, tế bào có hình trịn; ngược lại, trong điều
kiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn.

- Kích thước thay i trong khong 2,5 - 10 àm ì 4,5 -21µm.

- Chu kì sống: Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có thể tiếp hợp với
nhau để tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n). Sau quá trình giảm
phân sẽ sinh ra các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi). Bình thường khi
khơng có sinh sản hữu tính, chúng vẫn liên tục nảy chồi để sinh sôi nảy nở.

- Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men lên men nổi. Trong

quá trình lên men, tế bào của chúng nổi lơ lửng trong dung dịch lên men và
tập trung trên bề mặt. Nhờ đó tăng diện tích tiếp xúc với cơ chất, q trình

lên men xảy ra nhanh chóng và mạnh mẽ.

-Lên men được nhiều loại đường (glucose, fructose, saccharose,
maltose, 1/3 rafinose, các dextrin …)v à nhiều loại nguyên liệu khác nhau
( như gạo, ngô, khoai, sắn… với lượng đường trong dung dịch là 12 – 14%,
có khi là 16 – 18%).

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

- Chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 nồng độ 0,02 – 0,025% nên có

thể lên men trong điều kiện bắt buộc phải dùng thuốc sát trùng.

- Sinh sản theo kiểu nảy chồi, có khả năng sinh bào tử, sống kị khí
khơng bắt buộc.

2-M ột số ch ủng Saccharomyces cerevisiae thường dùng :

- Chủng XII phân lập từ nấm men bánh mì 1902. Tế bào hình trịn

hoặc oval, có kích thước lớn và mập hơn các chủng khác (5-8). Chu kỳ
sinh trưởng của 1 thế hệ là 1giờ 39 phút.Sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở
điều kiện khắc nghiệt, ở nhiệt độ 250C chỉ trong vịng một ngày cụ thể tạo

thành bào tử (1 – 4 bào tử). Trong tế bào già thường chứa nhiều glycogen và
metaxromatin. Nấm men chủng XII sinh sản mạnh trong 12 giờ đầu nuơi cấy
sau đĩ chậm dần và lên men rất mạnh. Chúng cĩ khả năng lên men rất mạnh
glucose, matose, fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose.
Chủng này không lên men được các đường lactose, kxilose, arabinose,
inulin. Nồng độ rượu trong dịch lên men có thể đạt tới 13% V. Theo giáo
sư Manxep thì chủng XII được xem là tốt nhất khi lên men dịch đường từ
tinh bột ở các nhà máy rượu của Liên Xô cũ.

-Chủng XV có tính chất tương tự chủng XII và hay dùng để lên
men dịch đường hỗn hợp gồm tinh bột và rỉ đường

- Chủng số II (do Linder tách ra từ 1889 trong nhà máy rượu). Đây
là chủng đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất rượu và các ngành sản xuất

khác. Tế bào dài, hình đứng, lớn và sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở 25oC

trong 30 giờ ni cấy có thể tạo thành bào tử (thường trong tế bào có 3 bào
tử); lên men được các loại đường như chủng XII nhưng khả năng sinh sản
kém hơn.

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

- Chủng B, cũng như M.10, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất
rượu từ mật rỉ. Tế bào hình trụ, hình oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x
39-8,9 ; có khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh
mì cao.

- Chủng M (thu được vào 1905) do Ghenebec phân lập từ hỗn hợp
của 4 chủng nấm men nổi. Chủng được dùng để lên men trong môi trường
chứa các hỗn hợp đường khác nhau. Chúng rất bền và ổn định, thích nghi
được những điều kiện khơng bình thường trong thực tế sản xuất.

- Chủng MTB (Ở nước ta trước 1975, các nhà máy rượu chỉ dùng
chủng này do nhà máy rượu Hà Nội cung cấp). Chủng này có khả năng sinh
sản nhanh và cho hiệu suất lên men tương đối tốt.

- Chủng IA : do Iacubopski phân lập từ thùng lên men từ rỉ đường.
Lên men được các đường glucose, maltose, fructose, saccharose,
galactose và 1/3 rafinose. Chủng IA không có khả năng lên men dextrin

và lactose cũng như đường 5 C.

3-Nghiên cứu so sánh khả năng lên men của chủng 12 với chủng

MTB và 1 vài chủng khác hiện có ở nước ta.

Trạng thái sinh lý của nấm men sau 20 giờ ni cấy:

Chủng nấm men Tế bào chết, % Tế bào nảy chồi,

Số tế bào trong
1ml x 106

MTB
T
33
XII
3,6
4,8
6,7
2,5
12,0
8,5
10,3
14,9
164,2
160,8
140,2

103,7

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

Số lượng tế bào trong 1 ml là một trong những chỉ tiêu quan trọng
để đánh giá chất lượng men giống. Tuy nhiên, khi dùng các chủng men
khác nhau để lên men dịch đường, chúng ta không nên chỉ dừng lại ở số
tế bà trong 1 ml mà phải căn cứ thêm vào các chỉ số của dịch lên men
cuối cùng như độ cồn, hàm lượng đường và tinh bột sót trong giấm chín…

Để xét xem chủng nào có khả năng cho hiệu suất lên men cao,
người ta tiến hành thí nghiệm tiếp bằng cách ni cấy 4 chủng men giống
trong những điều kiện như nhau, sau 20 giờ đem làm men giống với số
lượng 10% so với dịch đường lên men. Sau 72 giờ lên men, người ta đem
phân tích các chỉ tiêu của giấm chín và tính lượng CO2 thốt ra trong q

trình lên men.

Kết quả trung bình của đợt thí nghiệm của 1 số chủng nấm men

Các chỉ tiêu Chủng nấm men

XII MTB T 33

Nồng độ đường hóa , %khối lượng
Chất khử tính theo Glucose, g/l
Độ chua, g H2SO4/l

pH dịch đường hóa

Lượng CO2 thốt ra sau 72 giờ,
g/200ml

Độ chua giấm chín, g H2SO4/l
pH giấm chín

Chất khử sót trong giấm chín, g/l
Nồng độ rượu, %V

14,0
30,3
1,06
4,95
12,69
1,51
4,66
9,21
7,12
14,0
30,3
1,06
4,95
11,85
1,67
4,50
10,6
6.73
14,0
30,3
1,06
4,95
11,21

1,85
4,55
11,27
6,45
14,0
30,3
1,06
4,95
10,89
1,92
4,42
11,55
6.30

Theo dõi q trình lên men và căn cứ vào số liệu thu được, ta thấy
chủng XII cho hiệu suất kên men cao hơn so với các chủng đem so sánh.

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

Cần chú ý : một chủng tốt ở nơi này chưa hẳn thích nghi ngay ở

một nơi khác vì vậy trước khi áp dụng cần nghiên cứu kĩ đặc tính sinh lí
và khả năng sinh sản cũng như sản lượng sản phẩm tạo thành.

Trong sản xuất có những trường hợp ngẫu nhiên người ta tìm được
chủng tơt hơn bằng cách phân lập từ các thùng lên men. Chủng XII và IA
nhận được bằng con đường kể trên.

Điều kiện lên men:

- Cơ chất (nguồn C): tinh bột, rỉ đường
- Nồng độ đường: 10 – 16%

- pH: 4 – 5

- Nhiệt độ: 28 – 300C

- Nhu cầu về oxy: Giai đoạn đầu của lên men cần cung cấp một

lượng nhỏ O2 vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất

béo chưa bão hòa và lipid. Áp suất của O2 vào khoảng 0,05 – 0,10 mmHg.

Đến giai đoạn sau không cung cấp oxy nữa.

- Nhu cầu dinh dưỡng:

+ Cần một lượng tương đối các chất dinh dưỡng dùng trong
sự tổng hợp ethanol, gồm C, H, O, N. Nó tỉ lệ thuận với thành phần chính
của tế bào nấm men.

+ Các nguyên tố P, S, K, Mg cần một lượng ít hơn, dùng để
tổng hợp các thành phần thứ yếu.

+ Các muối vô cơ ( Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh
trưởng hữu cơ ( acid amin, acid nucleic, vitamine…) được yêu cầu dưới
dạng vết.

- Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế của ethanol. Với nồng độ cồn

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm
men Saccharomyces cerevisiae

a.Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C.

Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao

và kéo dài hơn. Mặt khác làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế sự

phát triển của tạp khuẩn.

Sau 8 – 10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28 – 300C, tiếp đó cần

làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu.

Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh, chủ yếu là dễ bị

nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C men hoang dại phát

triển nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 -380C chúng

phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần.

Khi lên men ở 29,50C, tổn thất do tạo men là 7,37 %, ở 17,50C tổn thất

do tạo men là 5,32 % và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất do tạo

men chỉ chiếm 4,42 % lượng đường có trong dung dịch.

Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều esther, aldehyde và tổn thất
rượu theo CO2 sẽ tăng.

b.Ảnh hưởng của pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động

của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế
bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như
chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH
nhất định.

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcohol ethylic là 4,5
– 5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH =
4,8 – 5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin
thành đường lên men được.

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

Ở pH 4,2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH = 4,5 – 5,0
nhưng tạp khuẩn hầu như khơng phát triển. Tới lúc nào đó nấm men phát
triển nhiều và đủ mạnh ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh
hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã
nhiều và đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho lên men.

Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất
và gọi là nuôi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên.

Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ khơng ở dạng tự do
mà liên kết hóa học với các muối và giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự
do, chủ yếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4.

Giữa ion H + và lượng acid có tương quan nhất định đối với mỗi

dung dịch nào đó, ví dụ cùng một pH nhưng độ chua của dịch đường hóa từ
ngơ bao giờ cũng lớn hơn từ sắn . Trong thực tế sản xuất không phải cơ sở
nào cũng có điều kiện đo pH, mà thường chỉ xác định độ chua. Đối với mỗi
dung dịch nào đó thì pH có thể xem như gần ổn định còn độ chua lại thay
đổi nhiều phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn của nguyên liệu và dịch lên
men. Khi nhiễm khuẩn sẽ tạo acid hữu cơ có độ phân ly thấp nên ít làm thay
đổi pH. Vì vậy trong sản xuất rượu không chỉ xác định pH mà cịn xác định
độ chua. Độ chua có thể biểu diễn theo độ hay theo gam acid / lít.

Một độ chua được biểu diễn bằng 1ml dung dịch NaOH 2N vừa đủ để
trung hòa acid tự do chứa trong 20 ml dịch hoặc biểu diễn độ chua bằng gam

H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l.

c.Ảnh hưởng của nồng độ lên dịch men

Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái
sinh lý của nấm men. Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế không những tạp khuẩn
mà cả nấm men, dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men.

Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men, tốn
hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

d.Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng

Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm
bảo vơ trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và

hạn chế tạp khuẩn.

Có thể dùng hóa chất khác nhau như clorua vơi, formalin, fluosilicat
natri. Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn
chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt
động của nấm men. Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không
vượt quá 0,02% so với dịch lên men.

Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men:

Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt,

giờ
Làm ngừng sinh

trưởng

Tiêu diệt
men

% Mol/l % Mol/l

HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46

H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04

H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28

CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25

Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27

Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác hại của
chúng lên nấm men sẽ không giống nhau.

Ngồi ra, trong dịch đường lên men ln chứa một lượng furfurol,
melanoidin, cũng gây ảnh hưởng tới nấm men.

Furfurol hạn chế khả năng nảy chồi và kích thước tế bào, tạo ra các
hạt trong không bào. Furfurol chứa nhiều trong mật rỉ có thể làm giảm khả
năng tạo rượu và tăng các tạp chất, giảm hoạt độ của maltase và zymase của
nấm men.

Khi dịch chứa 4 – 6 triệu tế bào/ml thì 0,002% furfurol sẽ ảnh hưởng
xấu đến sinh trưởng và sinh lý của dịch lên men; khi dịch lên men chứa 90
triệu / ml thì 0,006% furfurol mới ảnh hưởng tới sinh lý nấm men.

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

mg / 100ml (0,0015 – 0,002%). Trong điều kiện lên men với tỉ lệ men giống
lớm hơn 10%, ảnh hưởng của furfurol xem như khơng đáng kể.

Melanoidin có ảnh hưởng khơng giống nhau đối với các chủng men.
Nó ảnh hưởng xấu đến sinh sản của chủng B và IA, chỉ trong 12 giờ đầu đối
với chủng r-176 và r-202, melanoidin ảnh hưởng suốt trong thời gian 24 giờ,
số tế bào ít hơn 1,3 – 2 lần so với môi trường chứa 0,005 – 0,3g/100 ml.
Caramela không bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005%
sẽ làm nhiều tế bào bị chết đi.

e.Ảnh hưởng của sục khí

Sục khí để hịa tan oxy vào dịch đường, giúp cho nấm men phát triển

nhanh hơn. Tuy nhiên, sục khí khơng cần thiết đối với dịch đường từ nguyên
liệu tinh bột. Sục khí sẽ làm tăng lượng đường bay hơi. Mặt khác nếu dư dẫn
đến tạo nhiều sinh khối và aldehyde, do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu.
Thực tế thì khơng cần sục khí vào dịch đường. Một lượng nhỏ oxy sẽ
được hòa tan trong thời gian khuấy và làm lạnh, đủ đảm bảo cho sinh trưởng
phát triển và lên men. Với tỉ lệ men giống 10%, sau 50 giờ lên men nồng độ
biểu kiến của dịch đã giảm tới số lượng không đổi với hầu hết thùng lên
men. Sau 70 – 72 giờ nồng độ rượu trong giấm chín đạt trung bình 9% V,
đường sót chỉ vào khoảng 0,3 – 0,5 %.

f.Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung

Ở nước ta, cồn được sản xuất chủ yếu từ nguyên liệu sắn. Do trong
sắn chứa ít protid nên lượng nitơ trong dịch đường hóa khơng đảm bảo cho
phát triển của nấm men.

Bổ sung nitơ vào dịch lên men

Các chỉ tiêu Mẫu kiểm chứng
không bổ sung
nitơ

Nguồn nitơ từ

(NH4)2SO4 (NH2)2CO

- Nồng độ chất
khô dịch đường ,

16,5 16,5 16,5

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

tính theo maltose
g/ 100ml

4,09 4,09 4,09

- pH dịch đường

hóa 5,26 5,26 5,26

- pH giấm chín 4,55 4,00 4,93

- Tăng độ chua 0,31 0,42 0,12

- Độ khô biểu
kiến giấm chín

-0,35 -0,40 -0,77

- Chất khử sót,
%

0,43 0,34 0,14

- Tinh bột sót,
%

0,05 0,046 0,042

- Nồng độ rượu
trong giấm chín,
%V

9,66 9,78 10,04

- Hiệu suất rượu
so với lý thuyết,
%

91,21 92,35 94,80

Bổ sung nitơ với số lượng 30 mg/100ml sẽ rút ngắn thời gian từ 84
giờ xuống 60 giờ, đồng thời lên men cũng tốt và đạt hiệu quả cao hơn mẫu
đối chứng. Trong đó nguồn nitơ từ ure cho kết quả tốt hơn.

II- CƠ CHẾ LÊN MEN RƯỢU:

Dịch men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1 gam men ướt có độ

ẩm khoảng 70-75 % chứa tới 14 tỉ tế bào. Bề mặt của mỗi tế bào chiếm 5.10

-5mm2. Như vậy một gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7000 cm2. Nhờ

có bề mặt lớn này nên nấm men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất
nhanh.

Đường hóa xong, dịch đường được làm lạnh tới 28-32oC và bơm

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

Hai chất này đều khuyếch tán và tan vào môi trường xung quanh.
Rượu do rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch lên men, còn khí
cacbonic hịa tan kém và khuếch tán chậm.

Lúc đầu hịa tan hồn tồn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh
tế bào men và lớn dần tới mức lực đẩy Archimede lớn hơn khối lượng tế bào
men cộng bọt khí.

Lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ
tan vỡ và hợp thành tiếng rào rào (men ăn).

Bọt khí tan, tế bào men sẽ chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp
thụ và lên men rồi lại sản sinh ra rượu và khí carbonic

Như vậy, tế bào nấm men từ chỗ là vi sinh vật không chuyển động đã
biến thành tế bào luôn chuyển động trong q trình lên men. Nhờ đó mà
tăng nhanh tốc độ chuyển hóa đường thành rượu.

Khi đường và các chất dinh dưỡng trong canh trường cịn ít, một
lượng lớn tế bào nấm men sẽ lắng xuống đáy thùng, dịch lên men sẽ trong
dần.

1- Cơ chế hóa sinh học của quá trình lên men

1. Do xúc tác của glucokinase, glucose kết hợp với gốc phosphat của
phân tử ATP (adenoxintriphosphat) trong tế bào nấm men để tạo thành
glucose-6-phosphat và ADP:

C6H12O6 +ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP

2. Gluco-6-phosphat do tác dụng của enzyme đồng phân gluco
phosphat isomerase sẽ biến thành fructo phosphat:

CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)

(CHOH)3COCH2OH

3. Dưới tác dụng của enzime phosphofructokinase, phân tử ATP thứ
hai sẽ đính thêm một gốc phosphat nữa vào fructo-6-phosphat để tạo thành
fructo-1,6-diphosphat và phân tử ADP thứ hai:

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP

CH2O(H2PO3)

(CHOH)3COCH2O(H2PO3) +ADP

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42>

[Giai đoạn thực hiện các nối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi
dưới tác dụng của các enzime].

4. Mạch cacbon của fructodiphosphat thành hai phân tử triose:
aldehyde phosphoglyceric và phosphodioxyacetone (xúc tác: aldolase):

CH2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3)

CH2O(H2PO3)COCH2OH

+CH2O(H2PO3)CHOHCHO

5. Sản phẩm của quá trình trước là aldehyde phosphoglyceric nhưng
trong dịch lên men chúng chứa rất ít do hiện tượng đồng phân dưới tác dụng
của enzime triphosphat isomerase:

CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO

6. Hai phân tử aldehyde phosphoglyceric bị oxi hóa. Phản ứng này có
sự tham gia của acid phosphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzyme
triphosphatdehydronase, coenzime của nó là NAD
(Nicotinamid-Adenin-dinucleotid). Phân tử 3-phosphoglyceroaldehyde kết hợp với phosphat, còn
hidro chuyển sang coenzime NAD:

2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2NAD

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~H2PO3 +

2NADH2

[Năng lượng được giải phóng do oxy hóa 3-phosphoglyceroaldehyde
sễ tióch tụ trong liên kết cao năng của acid 1,3-diphosphoglyceric mới tạo
thành].

7. Với sự tham gia của phosphoglyceratkinase, gốc phosphat chứa cao
năng của acid 1,diphosphoglyceric sẽ chuyển vào phân tử. Kết quả
3-phosphoglyceric được tạo thành , còn Adp nhận thêm năng lượng và biến
thành, còn ADP nhận thêm năng lượng và biến thành ATP:

2CH2(H2PO3)CHOHCOO~(H2PO3) + 2ADP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP

</div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH

9. Dưới tác dụngcủa enolase, acid 2-phosphoglyceric sẽ mất nước và
biến thành acid phosphopyrovic:

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH

+ 2H2O

10. Acid phosphopyrovic rất không bền nên dễ bị mất gốc acid
phosphoric do enzime pyrovatkinase và do đó acid pyrovic được tạo thành:

2CH2=CO~(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH +

2ATP

11. Acid pyrovic bị decacbocyl để tạo thành aldehyde acetic:
2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO

12. Aldehyde acetic bị khử bởi NADH2:
2CH3CHO + 2NADH2 2CH3CH2OH + 2NAD

Tóm lại, Phương trình tổng qt của q trình lên men như sau:

C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH2OH

Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucose sẽ giải
phóng ra khoảng 50 kcal. Năng lượng này được nấm men sử dụng chừng 20
kcal. Số còn lại sẽ thải ra canh trường do đó làm tăng nhiêt độ dịch lên men.
Theo Euler, nhiệt này chiếm 28 kcal/ trên phân tử glucose.

2- Tiến hành lên men rượu

a. Động học của quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng lượng

đường lên men, hoặc gián tiếp tính được lượng rượu tạo thành và lượng CO2

thoát ra trong một đơn vị thời gian. Cũng có thể xác định nhanh bằng cách
đo nồng độ biểu kiến của dịch lên men.

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

Lên men được chia thành 3 giai đoạn: lên men sơ bộ, lên men chính
và lên men phụ.

Trong giai đoạn đầu, thời gian kéo dài gần 60 giờ, đặc trưng cho thời
kì tiềm phát, lượng đường được lên men rất ít.

Giai đoạn thứ hai kéo dài từ khoảng giờ thứ 60 đến giờ thứ 120, sinh
trưởng của nấm men và lên men tăng nhanh, đạt tới cực đại- đặc trưng cho

thời kì lên men chính.

Giai đoạn ba đăc trưng cho lên men phụ kéo dài, tốc độ lên men rất
chậm vì lượng đường trong dịch cịn rất ít, các dextrin chưa kịp biến thành
đường.

Trong điều kiện sản xuất, lượng men giống đưa vào nhiều (8-10%)
nên tốc độ lên men xảy ra rất nhanh. Trung bình mỗi giờ ở giai đoạn lên men
chính, nồng độ đường giảm 1%. Thời gian tiềm phát phụ thuộc vào lượng
men giống đưa vào, thường chỉ từ 5-8 giờ. Tiếp đó chuyển sang lên men
chính, cuối cùng là lên men phụ. Thời gian lên men phụ dài hay ngắn phụ
thuộc chủ yéu vào lượng enzime có khả năng phân cắt nối α-1,6 glucoside.
Vì rằng dextrin chỉ có thể lên men sau khi đã thủy phân thành glucose hoặc
maltose (điều này không xảy ra với lên men rỉ đường).

Tốc độ lên men chính phụ thuộc vào lượng men giống, còn tốc độ lên
men phụ thuộc vào số α-1,6 glucoside và hoạt độ enzime thủy phân nó.

b. Ph ương pháp lên men

Lên men có thể tiến hành theo sơ đồ gián đoạn, bán liên tục hoặc liên
tục.

 Lên men gián đoạn

Thùng phải được vệ sinh sạch sẽ các đường ống và van phải được sát
trùng thường xun. Sau đó tồn bộ được thanh trùng bằng hơi nước. Thời
gian giữ ở 95- 1000C kéo dài 50-60 phút. Thanh trùng xong thùng được làm

lạnh đến 300C, tháo hết nước ngưng rồi đóng van đáy. Men giống và dịch

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

thùng lên men kéo dài từ 6-8 giờ. Nhờ đó tỉ lệ men giống lúc đầu tăng và
hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn.

Sau khi đổ đầy thùng ta để cho lên men và cứ 8 giờ lấy đường lên men
đem lọc để xác định độ chua. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và luôn khống
chế thấp hơn 330C. Về cuối nhiệt độ có thể giảm đến 280C.

Lên men được xem là bình thường nếu sau 50 giờ, độ đường biểu kiến
của dịch lên men đã xuống tới 0 (với rỉ đường sẽ khác), cịn độ chua khơng
tăng q 0,8 gam H2SO4/lít so với độ chua của dịch đường trước khi lên

men.

Trường hơp độ chua khi lên men tăng nhanh, độ đường biểu kiến
giảm chậm thì phải nghĩ ngay tới nhiễm khuẩn, cần kiểm tra vi sinh vật và
xử lí kịp thời.

Lên men được xem là kết thúc nếu sau 8 giờ độ đường biểu kiến
không giảm hoặc chỉ giảm 0,1-0,2 %.

Lên men gián đoạn ở các thùng riêng biệt có ưu điểm dễ làm, khi
nhiễm dễ xử lí nhưng năng suất thu được từ 1 m3 thiết bị thấp. Tuy nhiên,

phương pháp này vẫn đang được áp dụng chủ yếu ở nước ta và cũng cho
hiệu suất khá.

 Lên men liên tục

Đặc điểm của lên men liên tục là dịch đường và men giống được cho

vào thùng đầu (thùng lên men chính) ln chứa một lượng lớn tế bào trong 1
ml dịch. Khi đầy thùng đầu thì dịch men sẽ chảy tiếp sang các thùng bên
cạnh và cuối cùng là thùng chứa giấm chín.

Ưu điểm nổi bật của sơ đồ lên men liên tục là dùng một lượng lớn
men giống nên lên men xảy ra nhanh, hạn chế được sự phát triển của tạp
khuẩn. Khác với lên men gián đoạn là lượng giống ban đầu chỉ 12-15 triệu tế
bào/ml nên lên men xảy ra chậm.

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

Lên men liên tục là phương pháp tiến bộ và cho hiệu quả cao. Tuy
nhiên khi áp dụng cần tính tốn cẩn thận và có biện pháp cơng nghệ phù
hợp, nếu khơng sẽ phản tác dụng, dễ nhiễm khuẩn hàng loạt dẫn đến giảm
hiệu suất lên men.

Lên men liên tục sẽ kết thúc sau 60-62 giờ, còn lên men gián đoạn vẫn
phải kéo dài tới 72 giờ và hơn nữa.

 Lên men cải tiến – bán liên tục

Để tăng cường tỉ lệ lên men giống mà không cần thêm thiết bị gây
men, ta thực hiên dùng ngay lượng men ở các thùng đang lên men mạnh ở
giai đoạn lên men chính, bằng cách dùng acid sulfuric đưa pH về 4,0-4,2; kết
hợp với bơm tuần hoàn và làm lạnh. Sau 1-2 giờ tan bơm ½ dịch lên men
sang thùng khác để làm men giống. Tiếp đó từ từ thêm dịch đường vào cả
hai thùng cho tới đầy và để cho lên men tiếp.

III- NHẬN XÉT, ĐÁNH GIÁ CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN:
1.Phương thức lên men gián đoạn

Thơng thường thời gian địi hỏi cho việc sử dụng hòan tòan cơ chất là từ

36-48 giờ. Nhiệt độ được giữ ở 20- 30oC và pH ban đầu được điều chỉnh

tới 4,5. Tùy thuộc vào bản chất của nguyên liệu hidrat C, hệ số chuyển hĩa
nằm vào khỏang 90- 95% con số lý thuyết với một nồng độ etanol cuối
cùng đạt được là 10-16 % (w/v). Cơng nghệ lên men gián đoạn đã được
vận hành nhiều trong quá khứ vì cĩ thể vận hành dễ dàng, địi hỏi thấp về
khử trùng triệt để, khơng cần nhân cơng cĩ tay nghề cao, khơng cĩ nguy cơ
tổn hại về tài chính và nguyên liệu dễ xử lý. Tuy nhiên những nhược điểm
vốn cĩ của hệ thống này như hiệu suất lên men thấp do thời gian quay
vịng cao và độ dài của pha lag kéo dài đã dẫn đến yêu cầu phải cĩ những
cải tiến.

</div>
(47)<div class='page_container' data-page=47>

tế bào nấm men dậm đạc (23,6g/l) đã rút ngắn thời gian lên men hịan tịan
1 dung dịch glucoza có nồng độ ban đầu là 22% xuống còn 6 giờ. Độ sống
sót của tế bào trong trường hợp lên men nhanh như vậy bị giảm nhanh vì
nồng độ etanol cực kỳ cao trong tế bào. Hạ nhiệt độ lên men và tăng nồng
độ oxi có thể hạn chế mức độ kìm hãm song lại hao hụt về năng suất lên
men

2.Phương thức lên men liên tục

Lên men liên tục loại bỏ được sự hao tốn thời gian trong lên men tĩnh. Đó
là thời gian dành cho việc tẩy rửa và làm sạch thiết bị, tái nạp môi trường,
thời gian tiêu tốn cho pha lag. Ngồi ra, vì vi sinh vật ln được giữ trong
pha sinh trưởng lũy thừa nên năng suất tính theo thời gian tổng số yêu cầu
sẽ tăng lên.

Hai nhược điểm chủ yếu trong các hệ thống liên tục là:

o Nhiễm tạp do đột biến xảy ra trong lòng dịch lên men hoặc

do cơ thể lạ xâm nhập từ bên ngồi vào.

o Khó khăn trong việc giữ 1 tốc độ lên men cao. Sở dĩ tốc độ
lên men trong các hệ thống này thường thấp là vì tế bào bị
chết nhiều do thiếu oxi. Để khắc phục người ta thêm 1 số
chất như tween 80, ecgosterol, hay axit linolenic vào môi
trường lên men hoặc cho nấm men hoặc cho nấm men sinh
trưởng trong đđiều kiện hiếu khí trước khi giai đọan lên men
kỵ khí.

Hiệu suất etanol trong 1 nồi lên men liên tục đơn giản thường bị giới
hạn do sự kìm hãm bởi etanol và bởi 1 nồng độ tế bào thấp. Khi nồng độ
đường trong dung dịch nạp tăng, hiệu suất etanol sẽ giảm do hiệu quả kìm
hãm bởi sản phẩm. Ở nồng độ hidrat C thấp, sự kìm hãm dường như giảm
đi song nồng độ sinh khối tế bào cũng giảm. Do vậy năng suất lên men tối
ưu sẽ đạt được ở nồng độ glucoza nạp khoảng 10%

IV- HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH LÊN MEN TỪ NẤM MEN:

</div>
(48)<div class='page_container' data-page=48>

được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucoza về lý thuyết
có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong thực tế
thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là do 1
phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho
các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng cịn có các phản ứng
phụ xảy ra ( thường dẫn tới glyxerol va sucxinat) tiêu thụ tới 4-5 % cơ
chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng etanol có
thể tăng thêm được 2,7 %.

B-VI KHUẨN

I-GIỚI THIỆU CHUNG

Trong số những vi sinh vật có khả năng sản xuất ra ethanol, ngoài
nấm men Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis là sinh vật có

triển vọng nhất. Nó chuyển hố phần lớn glucose thành CO2 và ethanol,

phát triển nhanh hơn nấm men và thể hiện khả năng sản sinh ethanol rất cao
trong suốt quá trình lên men. So với nấm men thì vi sinh vật này tạo ra được
tỉ lệ ethanol cao hơn hẳn và điều này có ý nghĩa rất quan trọng. Zymomonas

mobilis là một vi sinh vật kị khí và khác với nấm men,nó không cần đến sự

bổ sung oxy để tồn tại và phát triển. Quá trình sả n xuất ethanol của

Zymomonas mobilis ít tạo ra sản phẩm phụ hơn, đặc biệt là rượu tạp. Thao

tác gen trên Zymomonas mobilis cũng đơn giản hơn hẳn nấm men. Điều

này đã mang đến cơ hội mở rộng dãy nguyên liệu trong sản xuất ethanol: từ
lignocellulose hay từ sự tiêu hoá trực tiếp tinh bột. Kỹ thuật lên men
ethanol sử dụng Zymomonas mobilis sẽ được đặc biệt chú ý trong tương lai
vì khả năng sản xuất của vi khuẩn này cao hơn hẳn so với nấm men.

II-CÁC VI KHUẨN LÊN MEN CỒN

</div>
(49)<div class='page_container' data-page=49>

sinh vật này tạo thành ethanol như một sản phẩm chủ yếu (ít nhất một mol
ethanol trên một mol glucose được sử dụng).

Tên vi khuẩn m mol Ethanol sản xuất được trên

M mol Glucose được chuyển hoá

Clostridium sporogenes up to 4.15 a)

Clostridium indolis

(pathogenic) 1.96 a)

Clostridium sphenoides 1.8 a) (1.8) b)
Clostridium sordelli

(pathogenic) 1.7

Zymomonas mobilis 1.9

(syn. Anaerobica) (anaerobe)

Zymomonas mobilis

Ssp. Pomaceas 1.7

Spirochaeta aurantia 1.5 (0.8)

Spirochaeta stenostrepta 0.84 (1.46)

Spirochaeta litoralis 1.1 (1.4)

Erwinia amylovora 1.2

Leuconostoc mesenteroides 1.1

Streptococcus lactis 1.0

Sarcina ventriculi

</div>
(50)<div class='page_container' data-page=50>

khuẩn khác. Nghiên cứu của Naim Kosaric chỉ ra rằng lượng đường hấp thu
và lượng ethanol sinh ra là cao nhất khi dùng môi trường glucose.

1..ZYMOMONAS MOBILIS

Zymomonas mobilis là vi khuẩn thuộc giống Zymomonas nó có khả

năng sản xuất ethanol vượt trội hơn cả nấm men về một số mặt. Nó được
phân lập lần đầu tiên từ đồ uống có chứa cồn, như rượu cọ (palm wine) của
châu Phi hay một loại rượu của Mehico : rượu thùa (pulque), ngồi ra cịn từ
chất lấy từ rượu táo hay bia của người châu Âu.

a.Đặc điểm:

Zymomonas là vi khuẩn Gram (-),kỵ khí, hình que.

Dài từ 2 -6 m và rộng từ 1- 1.5m, xuất hiện từng cái một nhưng hầu
hết ở dạng cặp.

Kích thước chiều rộng lớn của Zymomonas được thể hiện rõ qua kính
hiển vi, hầu hết những vi khuẩn khác chiều rộng chỉ khoảng 0.5-0.75m.

Hầu hết các giống (70%) không di động được, phần ít (30%) di động
được với 1-4 tiên mao phân cực.Khả năng di động bị mất ở 1 số giống.

Hình dạng: 45% giống hình hoa thị, 33% dạng chuỗi, và 62% tế bào
có những sợi nhỏ, có 1 số giống có chiều dài tới 28m.

</div>
(51)<div class='page_container' data-page=51>

Thành phần của tế bào

Thành phần Tỷ lệ (khối lượng khô)

Protein

Giai đoạn phát triển
Giai đoạn tĩnh
RNA

DNA

Carbohydrates

Poly--hydroxybutyrate
Polyphosphate

Sulfur
Ammonia
Amino acids
ATP

Pha log
Pha tử vong

65-69%

54%
17-22%
2.7%
4-5%
0%
0%
0.5%

0.1-0.5mol/mg
0.02-0.2mol/mg

1-5g/mg
0-0.4g/mg

b.Điều kiện phát triển:

Sự phát triển ở các nhịêt độ khác nhau:

Ở 30oC một số giống không phát triển, ở 40oC rất hiếm quan sát thấy

sự phát triển.Vi khuẩn Z.mobilis có thể phát triển ở 36oC.Nhiệt độ có ảnh

hưởng lớn đến sự lên men của vi khuẩn. Ở nhiệt độ 14-18oC sự lên men xảy

ra sau 4 ngày, tại nhiệt độ 16-26oC sự lên men xảy ra chỉ sau 2 ngày nhưng

một số trường hợp khác nhiệt độ thuận lợi nhất cho quá trình lên men là
25-31oC. Ở nhiệt độ quá cao vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt như ở 550C vi khuẩn bị chết

</div>
(52)<div class='page_container' data-page=52>

Bảng: Sự phát triển của các giống Zymomonas ở điều kiện nhiệt độ

khác nhau

Nhiệt độ % giống phát triển

30
34
36
38
40
100
97
97
74
5

Sự phát triển ở các giá trị pH khác nhau

pH % giống phát triển

3.05
3.5
3.7
3.85
5-7
7.5
8.0
0
43
71
90

100
87
0

Phát triển trong sự có mặt của ethanol: nó có thể xảy ra,

Zymomonas chịu được rượu, nó được cơ lập từ đồ uống có chứa 2 – 10%
cồn, sự tập trung 5,5% ethanol trong chất lỏng khá vô hại với Zymomonas.
tại 7.7 và 10% ethanol 73 và 47% các chủng Zymomonas vẫn phát triển.

Phát triển trong sự tập trung cao glucose: Klyuver và

Hoppenbrouwers qua sát rằng lồi lên men rượu thùa(mehicơ) có thể sống
trong mơi trường lên men với 25% glucose

Kiểm tra vài mơi trường lỏng có chứa 2% dịch chiết nấm men và sự
tập trung khác nhau của glucose. với 20% glucose vi khuẩn có thể phát triển

trong 34h, với 30% glucose 88% vi khuẩn có thể sống 2 – 5 ngày( chủng Z1

</div>
(53)<div class='page_container' data-page=53>

Phát triển trong sự có mặt của KCN: sử dụng dung dịch chuẩn chứa

0,0075% KCN , chủng ATCC 29192, NCIB 8777, NCIB 10565, CP3, CP4,
và Ag 11 không phát triển. chủng Zymomonas ATCC10988, 410, NCIN
8227 và 409 phát triển sau 5 ngày, 12 chủng khác bị ức chế bởi sự tập trung
KCN và phát triển sau 1 – 2 ngày

Phát triển trong môi trường chứa NaCl: trong dung dịch chuẩn

chứa 0.5% NaCl chỉ Zymomonas mobilis là khơng phát triển, cịn trong mơi

trường có 2% NaCl thì khơng có chủng Zymomonas nào phát triển được cả.

c. Nuôi cấy

Môi trường ni cấy có chứa glucose(50g/l),dịch chiết nấm men
Difco(5g/l) và muối khống. Trong suốt q trình phát triển, pH của môi
trường thay đổi từ 5,6-5,7 lúc bắt đầu đến khoảng 4,5-4,8 lúc kết thúc sự
nuôi cấy. Để nghiên cứu về hô hấp và tổng hợp ATP trong điểu kiện không
lớn lên của vi khuẩn, tế bào phát triển kị khí theo hàm mũ đã được thu hoạch
bởi máy li tâm, rửa và ngâm trong đệm kali phosphat 50mM (pH 6-9), bổ
sung thêm 5mM magie sunfat, một lượng sinh khối từ 3-5 mg(khối lượng
khô)/ml

Tiếp tục nuôi cấy :Làm việc với 800ml, ở 30oC, bơm 1l/phút dung

dịch, tốc dộ quay là 410 vịng/phút. Mơi trường phát triển giống như cho q
trình ni cấy, trừ sự tập trung glucose 25g/l, pH được giữ ổn định ở 6.0,
thêm vào 10% KOH hoà tan, kali cyanide hoà tan thêm vào riêng ( cyanide
không bền trong môi trường acid yếu.

d. Con đường lên men:

Zymomonas mobilis chuyển hoá đường thành pyruvat qua con đường

ED (Entner-Doudorolff). Pyruvat sau đó lên men tạo ra ethanol và CO2 là

sản phẩm duy nhất ( tương tự nấm men )

Sự thuận lợi của Z. mobilis so với S. cerevisiae về mặt sản xuất
bioethanol là:

 Đường hấp thu và sản lượng ethanol là cao hơn

 Khí tạo thành ít hơn

</div>
(54)<div class='page_container' data-page=54>

 Không phụ thuộc vào sự điều chỉnh lượng oxi thêm vào trong
suốt quá trình lên men.

 Tuân theo sự vận động gen.

Mặc dù có những giới hạn khắt khe hơn so với nấm men: nó tận dụng
được loại chất nền giới hạn glucose, fructose và sucrose. Sử dụng phương
pháp trong công nghệ sinh học, các nhà khoa học hiện nay đang tìm cách
khắc phục điều này. Cái khác của Z. mobilis là chắn chắn chúng có khả năng
sử dụng pentose như là nguồn cacbon để phát triển.

Con đường ED: Glucose bị phosphoryl hóa sau đó bị oxy hóa tới
6-P-gluconat. Tại điểm này, sự loại nước xảy ra tạo thành
2-keto-3-deoxy-6-P-gluconat (KDPG), chất này sau đó bị thuỷ phân nhờ KDPG-aldolase. Từ một
mol glucose sẽ tạo thành 2 mol pyruvat và sinh ra một mol ATP.

Các nghiên cứu nuôi chủng Zymomonas mobilis ZM4 trên các môi
trường nhân tạo chứa glucose, fructose hoặc saccharose đã cho thấy rằng

lồi vi khuẩn này khơng có khả năngchuyển hố các loại đường này theo bất

kì một con đường nào khác ngoài con đường ED. Dẫn liệu động học sinh
trưởng của lồi vi khuẩn này được trình bày theo bảng sau:

Bảng-Các thông số động học đối với sinh trưởng của chủng Zymomonas

mobilis ZM4 trong môi trường nuôi cấy tĩnh với các nguồn carbon khác

nhau (nồng độ ban đầu 250g/l-theo N. Kosaric và ctv., 1983)

Thông số Cơ chất

Glucose Fructose Saccharose

Tốc độ sinh trưởng(h-1) 0,18 0,10 0,14

Tốc độ tiêu thụ cơ chất(g/g/h) 11,3 10,4 10,0

Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 5,4 5,1 4,6

Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 0,015 0,009 0,014

Sản lượng etanol(g/g) 0,48 0,48 0,46

Sản lượng etanol(% so với lí thuyết)94,1 94,1 90,2

</div>
(55)<div class='page_container' data-page=55>

Thời gian có tốc độ cực đại(h) 0-19 0-28 0-15

Theo bảng này tốc độ hấp thu đường và sự sản sinh ethanol đạt cực
đại khi sử dụng môi trường chứa glucose. Sự kiềm hãm do cơ chất khơng
biểu hiện nghiêm trọng ở lồi vi khuẩn này vì sinh trưởng có thể ở nồng độ
40% glucose.

Khi lên men nước mía, chủng Zymomonas mobilis Z7 có khả năng
kết thúc sự lên men 100-200g/l saccharose với hiệu quả 59–88% trong vòng

20–29h. Tốc độ sản sinh etanol dao động từ 2,2–5,3 g/l/h trong các thí
nghiệm loại một lít. Các kết quả này phù hợp với động học lên men trên các
môi trường bán tổng hợp dưới các điều kiện tương tự. Điều này chỉ ra rằng
các cofacto cần thiết, các ion kim loại cũng như các nồng độ C, N, P là đầy
đủ cho quá trình lên men ethanol do vi khuẩn này thực hiện.

Bảng _Các thông số động học đối với Z.mobils và Saccharomyces
cerevisae trên các môi trường chứa 250g glucose trong điều kiện ni cấy

tĩnh khơng thơng khí (30oC, pH5,0 – theo N.Kosaric và ctv_1983)

Các thông số động học Z. mobilis S. uvarum

Tốc độ sinh trưởng riêng(l/h) 0,13 0,055

Tốc độ hấp thu glucose riêng(g/g/h) 5,5 2,1

Tốc độ tạo thành etanol

riêng(g/g/h) 2,5 2,1

Sản lượng tế bào(g/g)

0,019 0,033

Sản lượng etanol (g/g) 0,47 0,44

Sản lượng etanol tương đối(%) 92,5 86

Nồng độ etanol cực đại(g/l) 102 108

Bảng trên cho thấy trong điều kiện nuơi tĩnh (gián đoạn),

Zymomonas mobilis lên men hiệu quả hơn Saccharomyces uvarum. Các

</div>
(56)<div class='page_container' data-page=56>

hơn nấm men), tốc độ sinh ethanol riêng phần (2,9 lần cao hơn) và tốc độ
hấp thu glucose riêng phần (2,6 lần cao hơn)

Trong lên men nấm men, oxy cần thiết để tổng hợp thành tế bào, ổn
định các cấu trúc lipid, và duy trì các quá trình trong tế bào nói chung. Tuy
nhiên, điều kiện hiếu khí cũng dẫn đến việc giảm thu hoạch cồn và tăng
nồng độ sinh khối do hiệu ứng Pasteur. Vì nhiều vi khuẩn là kỵ khí nên có
thể đạt được những năng suất cồn cao hơn và sinh khối thấp hơn. Nồng độ tế
bào vi khuẩn thấp hơn cũng là một hậu quả của việc năng lượng giành cho
sinh trưởng đạt được thấp hơn (1ATP trên 1 glucose tiêu thụ theo con đường
ED so với 2ATP theo con đường EM ở nấm men)

Sơ đồ con đường ED

e. Nguyên liệu và môi trường lên men

Zymomonas mobilis được nuôi cấy trong môi trường glucose

(glucose 80g/dm3,ph ần chi ết men 10 g/dm3, KH

2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4

1g/dm3, và MgSO

4.7H2O 0.5 g/dm3.

Môi trường glucose ( glucose 80 đến 250 g/dm3, phần chiết men 10 g/dm3,

KH2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4 1 g/dm3, v à MgSO4.7H2O 0.5 g/dm3 được sử

dụng trong thí nghiệm.

Q trình lên men được thực hiện trong bình Erlenmeyer chứa 0.2
dm3 mơi trường và 0.2 chất để chủng ( 80 g/dm3 môi trường glucose sau 24

</div>
(57)<div class='page_container' data-page=57>

f. Hiệu suất quá trình:

Chay et al cho rằng giống sản xuất ethanol tốt nhất từ đường hóa
những chất lỏng nhiều đường là những giống của vi khuẩn Z. mobilis và S.

diastaticus. Toran-Diaz et al nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền thủy phân

bằng acid và chất nền thủy phân bằng enzyme trong sản xuất ethanol bằng
giống ZM4 và ZM4F của vi khuẩn Z. mobilis. Chúng đạt được khả năng sản
xuất ethanol : 4,8 g/g/h với Z. mobilis phát triển trong dịch hoa hướng

dương, cao hơn nấm men Kluyveromyces. Hơn nữa, họ quan sát rằng dịch

của hoa hướng dương có thể lên men mà khơng cấn bất kì điều kiện dinh
dưỡng nào.

Gần đây, Lawford et al chứng tỏ rằng chất lỏng ngâm bắp, một sản
phẩm của bắp, như là một chất nền có ảnh hưởng đáng kể cho việc sản xuất
ethanol bằng vi khuẩn Z. mobilis CP4.

Torres và Baratti nghiên cứu sự lên men bằng thủy phân bột lúa mì
bằng Z. mobilis. Họ cho rằng trong sự lên men cùng một loạt , nộng độ
đường cao 223 g/l có thể lên men đến 105 g/l trong 70 giờ. Phần trăm lượng
lý thuyết là 92%. Mẫu lên men của Z. mobilis ATCC10988, ATCC 12526
và NRRL B4286 trong môi trường tổng hợp, dịch mía và mật đường cho ta
giống NRRL B4286 sản xuất lượng ethanol lớn nhất trong môi trường tổng
hợp, trong khi giống ATCC 12526 và ATCC 10988 tốt hơn trong dịch mía.
Tuy nhiên, tất cả giống lên men mật đường thì rất kém.

</div>
(58)<div class='page_container' data-page=58>

Khi Z. mobilis và S. cerevisiae kết hợp khả năng của chúng để sản
xuất ethanol từ glucose và tinh bột thuỷ phân, sinh ra cao hơn so với Z.

mobilis.Chưng cất Z. mobolis cho thấy sản phẩm phụ không phải ethanol

thấp hơn 5 lần so với S. cerevisiae khi lượng ethanol được sản xuất bởi lúa
mạch đen.

Một trong số những quy trình lên men rượu khác nhau, việc tiếp tục
quá trình sử dụng AMG và cell là thuận lợi nhất, với hoạt động ổn định
trong 40 ngày. Sản xuất ethanol từ cây hoa hướng dương sử dụng ZM4F
của Z. mobilis được nghiên cứu bởi Allais et al. Kết quả của họ chỉ ra rằng
thể tích xản suất được là 67.2g/l/h với lượng ethanol cuối cùng khi cô đặc là
42g/l từ 100g/l đường ban đầu. Doelle mơ tả quy trình liên tục sản xuất
ethanol từ tinh bột thuỷ phân. Quá trình này sử dụng Z.mobilis trong pha lên

men cồn đơn giản. Ông ta nhận xác nhận rằng chất lượng tinh bột thuỷ phân

không quuyết định đến sự thành cơng của q trình lên men, và cho rằng

năng suất của sự chuyển hoá là 92%. Một quá trình sản xuất ethanol c ơng

nghiệp từ tinh bột lúa mỳ thuỷ phân sử dụng Z. mobilis được mô tả bởi
Sahm và Bringer-Meyer. Những khám phá đó cho thấy rằng chủng Z.

mobilis sản xuất 60 g ethanol /l trong khoảng thời gian 39 ngày sử dụng.

Biofiml reactor( một kỹ thuật của việc giử cố định những tế bào vi khuẩn
thông thường là nhúng trong những polyme ngoải tế bào để chúng dính chặt
vào bề mặt S và cùng nhau thành lập một cộng đồng vi khuẩn kháng cự cao
đối với cả những tế bào thực khuẩn lẫn chất kháng sinh) cùng với
polypropylene hoặc plastic susport được sử dụng để sản xuất ethanol, kết

quả cho thấy rằng tỷ lệ ethanol được sản xuất ra và được cô cạn trong

biofilm reactor cao hơn trong nuôi cấy trong dung dịch lỏng. Việc liên tục
lên men sử dụng một hỗn hợp nuôi cấy gồm Z. mobilis và S. cerevisiae, sản
xuất 54.3g/l ethanol

1.CLOSTRIDIUM

a-Đặc điểm

Clostridium được phát hiện từ năm 1893, là một loại vi khuẩn kỵ khí,

tự dưỡng, sống tự do trong đất.Vi khuẩn G+, có hình que, khi cịn non có khả

</div>
(59)<div class='page_container' data-page=59>

Quá trình phát triển qua 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Các tế bào tạo thành những hình sợi kéo dài
Giai đoạn 2: Giai đoạn tách các hình sợi này ra

Giai đoạn 3: Giai đoạn có 1 tế bào hoạt động rất mạnh

Giai đoạn 4: Giai đoạn tạo thành nha bào. Đây là giai đoạn phát dục

không ổn định nên hình thành bào tử có tính đề kháng cao.Bào tử hình thành
ở bên trong nên được gọi là nội bào tử.

Bào tử có hình cầu, hình bầu dục hay hình oval, kích thước từ 0.2-2
.Bào tử nằm ở 1 đầu hoặc ở giữa của tế bào. Do kích thước bào tử lớn nên
làm biến dạng tế bào vi khuẩn.Bào tử trong suốt, được cấu tạo bới 1 màng
bao bọc, 1 khối bào tương đặc.Tế bào vi khuẩn bọc ngoài bào tử trong vài
giờ hoặc vài ngày, tuỳ điều kiện cụ thể mà chúng bị tan ra.Bào tử có sức đề
kháng cao, có thể chịu được điều kiện môi trường bất lợi như chất dinh
dưỡng cạn kiệt, chất độc hại nhiều, nhiệt độ cao hay có sự thay đổi điều kiện
sinh trưởng…

Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử phát triển thành vi khuẩn (bào tử
nảy mầm).Bào tử dài ra, vi khuẩn non thoát ra ở 1 đầu hoặc giữa thân

Giai đo ạn 5: Giai đoạn

sinh sản

Clostridium có khả năng đồng hố nhiều nguồn Cacbon khác nhau như

</div>
(60)<div class='page_container' data-page=60>

b.Điều kiện phát triển:

P và K là 2 nguyên tố rất cần thiết cho sự phát triển và cố định Nitơ
của Clostridium. Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng khác như Mo, Co, Cu,
Mn cũng rất cần thiết đối với Clostridium

Clostridium có khả năng phát triển ở pH = 4.7 – 8.5. Bào tử của

chúng có thể chịu đựng được nhiệt độ cao, có thể sống được 1 giờ ở 800C.

Một số lồi cịn có thể chịu được nhiệt độ 1000C trong 30’

Trong các loài Clostridium, 1 loài được dùng trong sản xuất rượu là

Clostridium ljungdahlii. Vi khuẩn này có tỉ lệ G + C khoảng 22-23%.

Chúng phát triển trong khí tổng hợp để sản xuất acetate và ethanol từ chất
nền ở thể khí. Chúng phát triển nhờ sự tổng hợp của CO và chất khí ở áp
suất tuyệt đối khoảng 0.8 – 1.8 atm. Tỉ lệ tế bào và sản phẩm tạo thành là
0.015g tế bào/g CO và 0.41g acetate/g CO. Sự cô đặc ethanol được tăng cao
bởi sự có mặt của H2 và CO2 ban đầu trong pha lỏng. Khơng có sự ức chế

</div>
(61)<div class='page_container' data-page=61></div>
(62)<div class='page_container' data-page=62>

PHẦN 5: HIỆU SUẤT VÀ TỔN THẤT TRONG

SẢN XUẤT

Để đánh giá hiệu quả làm việc của tồn bộ các cơng đoạn trong
q trình sản xuất, người a dùng khái niệm hiệu suất tổng thu hồi. Đó là
tồn bộ lượng cồn nhận được trong sản xuất từ lượng nguyên liệu xác
định (thường tính theo 100kg đường hoặc tinh bột ) chia cho lượng cồn
nhận được theo phương trình lý thuyết và biểu thị theo %. Tỷ số này còn
gọi là hiệu suất thực tế và ký hiệu là

η

t . Hiệu suất này gồm hiệu suất nấu

đường hóa và lên men ( kể cả nghiền nguyên liệu), ký hiệu là ηm và hiệu

suất chưng cất ηc

η

t = ηc . ηm

Lượng cồn nhận được theo lý thuyết tính theo phương trình Gaylussac:
C6H12O6 2C2H5OH + 2 CO2

180,1 92,1 88

Từ phương trình này suy ra, cứ 100 kg đường đơn giản ( glucose,
fructose, …) khi lên men sẽ cho ta 51,14 kg cồn etylic và 48,66 kg CO2 .

Đem chia cho khối lượng riêng của cồn ở 20o C, d204 = 0,78927, ta có :
51,14/ 0,78927 = 64,794 l 100%

Nếu tính cho 100kg đường đơi ( maltose, saccharose) thì cần nhân
với hệ số 1,0526, với tinh bột thì nhân 1,11104. kết quả có thể xem trong
bảng sau

Nguồn glucid Lượng cồn thu được từ 100kg

Theo lít Theo kg

Tinh bột
Đường đơi
Đường đơn

71,998

68,20
64,794

56,818
53,83
51,14

</div>
(63)<div class='page_container' data-page=63>

nhau, từ 75- 93%. Với sự phát triển của khoa học và công nghệ, hiệu thực
tế ngày càng tiệm cận với lý thuyết nhưng không bao giờ đạt tới 100%

Để nâng cao trách nhiệm của người vận hành và dễ kiểm tra sản
xuất, người ta chia ra hiệu suất lên men và hiệu suất chưng cất căn cứ
vào số liệu nguyên liệu và hàm lượng đường hoặc tinh bột đưa vào sản
xuất cũng như lượng giấm chín và nồng độ cồn sau khi lên men, người ta
tính hiệu suất thu được sau lên men rồi giao cho phân xưởng chưng luyện.
Ví dụ: Sau 1 ca đưa vào sản xuất 10 tấn nguyên liệu có hàm lượng
tinh bột trung bình 65%. Lượng giấm thu được tương ứng 48 m3 với nồng

độ cồn 8,8% V. Hiệu suất sau lên men là :

(48 000 x 8,8 = 4224) %= 90,27 %
10000kg x 0,65 x71,99l

Từ 4224 lít cồn chứa trong 48000 lít giấm, sau khi cất chỉ thu được
126 lít cồn đầu với nồng độ 90% và 4050 lít cồn tinh chế với nồng độ
96%. Hiệu suất chưng cất sẽ là

ηc = 126 x 0,9 + 4050 x 0,96 % = 94,73%

4224

Hiệu suất tổng thu hồi thực tế sẽ là:

η

t = ηc . ηm = 90,27 % x 94,73 % = 85,24 %

Trong sản xuất nhiều nơi khơng tính hiệu suất thực tế so với lý
thuyết mà tính tiêu hao nguyên liệu cho 1 lít cồn. Cách tính này đơn giản
nhưng kém chính xác. Vì chất lượng ngun liệu nhiều khi khơng đồng
nhất theo thời gian và giữa các nhà máy. Khi tính tiêu hao kg nguyên liệu
cho 1 lít cồn cần kèm theo: % tinh bột trong nguyên liệu ( nếu đường
cũng nên quy theo tinh bột hoặc ngược lại). Nồng độ cồn cũng cần thống
nhất 100%.

</div>
(64)<div class='page_container' data-page=64>

hàm lượng đường 54%.Lượng đường tiêu tốn cho 1l cồn 100% V ở cở sở
A là 4kg x 0,5=2kg.Hiệu suất tổng thu hồi thực tế:

1 % = 77,16 %

2 x 0,6478

Tiêu tốn đường cho 1l cồn ở cơ sở B:
3,8 x 0,54 = 2,052

Hiệu suất tổng thu hoài:

1 % = 75,21 %

2,052 x 0,6457

Như vậy mới nhìn ta tưởng cơ sở sản xuất B làm ăn có hiệu quả nhưng

thực chất hiệu suất tổng thu hồi lại kém so với cơ sở sản xuất A

Hiêu suất tổng thu hồi cồn từ sắn ở nơi làm ăn có hiệu quả nhất ở nước
ta vào khoảng 82 đến 85 %. Tiêu hao sắn có hàm lượng tinh bột 62 đến
65 %, vào khoang 2,6 đến 2,8kg/l qui 100%.

Trong quá trong quá trình sản xuất có các dạng tổn thất sau:
1- Tổn thất do nghiền, vận chuyển nội bộ 0,2 đến 0,3%;

2- Tổn thất do nấu, đường hóa và lên men 6 đến 12% ( tinh bột sót,
đường sót, tạo men)

3- Tổn thất khơng xác định, đổ ra ngồi, đọng lại ở thiết bị, đường
ống và bay theo CO2 từ 1 đến 2%

4- Tổn thất do chưng cất, do bay hơi, cồn cịn sót lại trong bã rượu,
nước thải có thể xác định theo công thức sau:

</div>
(65)<div class='page_container' data-page=65>

B = %
M

B- là tổn thất cồn theo bã rượu và nước thải, %

A- hàm lượng cồn trong bã và nước thải, kg/m3,thường 0,015 đến
0,03%

n- hệ số chuyển % khối lượng rượu thành tinh bột ( n= 1,8529)
V- thể tích giấm đem cất trong ca hoặc trong ngày m3

m- hệ số pha loãng cho hơi nước ngưng tụ, thường là 1; 1,15;1,2.

M- lượng tinh bột ứng với V m3 giấm cất, kg.

Lượng cồn tổn thất do chưng luyện ở các nứơc tiên tiến chỉ vào
khoảng 1 đến 2%, ở ta tổn thất này còn quá lớn, từ 5 đến 10% và có
nơi cịn cao hơn nữa.

5- Ở trên đã kể tổn thất chung cho lên men có thể từ 6đến 12%. Riêng
tổn thất do nhiễm khuẩn làm tăng độ chua so với bình thường có
thể xác định theo cơng thức sau:

4,5 x N x V x 100

D = %

4,5- lượng đường mất do tăng 10 chua (10 chua tương đương với 2,45g

H2SO4/l, kg/m3).

N- số độ chua tăng quá mức quy định.

Ví dụ: Độ chua trước lên men là 0,3o, theo quy định sau lên men độ

chua chỉ được tăng 0,2, tức tới 0,5o ( tương đương 1,23g/l); nhưng do

dịch lên men bị nhiễm khuẩn nên sau lên men độ chua tăng tới 0,8. Do
đó lượng đường mất do bị nhiễm bằng:

D = 4,5( 0,8- 0,5) x 48 000 x 100 =1%

</div>
(66)<div class='page_container' data-page=66>

Tổng cộng lượng tinh bột hoặc đường tổn thất trong dây chuyền sản xuất
ở các nước tiên tiến vào khoảng 10%; ở nước ta hiện nay vào khoảng
15-40 %.

Giảm tổn thất vơ hình và hữu hình nhằm nâng cao dần hiệu suất tổng thu
hồi là việc làm có ý nghĩa kinh tế kỹ thuật quan trọng. Đây là việc phải
làm thường xuyên liên tục đối với mọi cơ sở sản xuất. Chỉ có trên cơ sở đi
sâu để nắm bắt kỹ thuật công nghệ, chúng ta mới nâng dần hiệu suất thu
hồi cũng như chất lượng sản phẩm, rút ngắn khỏang cách về các mặt giữa
các xí nghiệp của nước ta với các nước tiên tiến.

Nếu chỉ nâng cao hiệu suất thực tế 2% so với hiện tại ở 1 cơ sở sản xuất
nào đó thì ứng với cơ sở có năng suất 5000l cồn / ngày, mỗi ngày cơ sở sẽ
thu thêm khoảng 100 lít cồn. Một năm sẽ thu thêm 30 000 lít mà khơng
tốn kém gì thêm. Với giá bán cồn tinh bột hiện nay 15 000 đ/lít hàng năm
nhà máy sẽ thu thêmkhoảng 450 triệu đồng. Với các cơ sở sản xuất lớn
như Rượu Hà Nội và Bình Tây thì hiệu quả kinh tế cịn cao hơn nhiều. Do
đó ta cần quan tâm hơn đền hiệu kinh tế do tăng hiệu suất tổng thu hồi.

</div>
(67)<div class='page_container' data-page=67>

1- Công nghệ sản xuất & kiểm tra cồn etylic - NXB Khoa học và
kỹ thuật-PGS TS Nguyễn Đình Thưởng, TS Nguyễn Thanh Hằng -Trường
ĐH Bách Khoa Hà Nội

2- Vi sinh vật học - Nguyễn Lân Dũng (chủ biên) - NXB Giáo Dục
3- Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm - Bùi
Ái - ĐHQG TPHCM – ĐH Bách Khoa

</div>