Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp để lên men tạo poly β hydroxybutyrate

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN
THÍCH HỢP ĐỂ LÊN MEN TẠO POLY-βHYDROXYBUTYRATE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Phạm Thị Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN
THÍCH HỢP ĐỂ LÊN MEN TẠO POLY-βHYDROXYBUTYRATE

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. TRẦN HOÀNG DŨNG
TS. CHUNG ANH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tơi.
Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả cơng bố
trong bất kì cơng trình nào.
Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu
tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thị Lệ Quyên


LỜI CÁM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn của tơi, TS. Trần Hồng Dũng
và TS. Chung Anh Dũng – những người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tơi trong
q trình học tập, nghiên cứu và hồn thiện luận văn này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong Hội đồng các
cấp đã đọc và góp ý cho luận văn của tôi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Huỳnh Văn Hiếu, Trường Đại học Nguyễn Tất
Thành đã cho tơi nhiều ý kiến q báu trong q trình làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô của Trường, Phịng Sau đại học, Khoa
Sinh học, bộ mơn công nghệ sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP. HCM , Viện
Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam và Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này.
Qua đây, tơi cũng xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và

bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 03 năm 2015
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thị Lệ Quyên


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cám ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1. Công nghệ lên men .......................................................................................................... 3
1.1.1. Khái quát về quá trình lên men................................................................................. 3
1.1.2. Phương pháp lên men ............................................................................................... 3
1.2. Nhựa phân hủy sinh học................................................................................................... 5
1.3. Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) ........................................................................................ 6
1.3.1. Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB......................................................................... 6
1.3.2. Q trình sinh tổng hợp PHB ................................................................................... 8
1.3.3. Vi sinh vật sản xuất PHB.......................................................................................... 9
1.3.4. Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB ............................................................ 11
1.3.5. Phương hướng cải thiện sản xuất PHB ................................................................... 12
1.3.6. Tách và thu hồi PHB .............................................................................................. 15
1.3.7. Ứng dụng của PHB ................................................................................................. 17

1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước......................................................................... 18

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................20
2.1. Địa điểm – Thời gian thực hiện ..................................................................................... 20
2.2. Vật liệu ........................................................................................................................... 20
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 20
2.2.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................................. 20
2.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................................ 23
2.3.1. Kiểm tra một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn ........................................ 23
2.3.2. Khảo sát một số điều kiện thích hợp để lên men R. eutropha tạo PHB ................. 23
2.3.3. Thí nghiệm lên men theo mẻ R. eutropha để tạo PHB ........................................... 25


2.4. Phương pháp phân tích thí nghiệm ................................................................................ 26
2.4.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn ......................................................................... 26
2.4.2. Kiểm tra hoạt tính tạo PHB của R. eutropha bằng phương pháp nhuộm SBB ...... 26
2.4.3. Xác định khối lượng khô tế bào ............................................................................. 27
2.4.4. Xác định PHB trong tế bào bằng phương pháp nhuộm huỳng quang .................... 27
2.4.5. Tách chiết PHB bằng sodium hypochlorite và chloroform .................................... 27
2.4.6. Định lượng PHB bằng phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại ......................... 28
2.4.7. Phương pháp xử lí số liệu ....................................................................................... 29

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................30
3.1. Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống vi khuẩn.................................... 30
3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn PHB............................................................................. 31
3.3. Kết quả khảo sát một số điều kiện thích hợp để lên men R. eutropha tạo PHB ............ 32
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mật rỉ .................................................... 32
3.3.2. Kết quả khảo sát nguồn nitrogen thích hợp ............................................................ 35
3.3.3. Kết quả khảo sát nồng độ nitrogen thích hợp ......................................................... 37
3.3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu ......................................................... 39

3.4. Kết quả lên men theo mẻ R. eutropha để tạo PHB ........................................................ 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................49
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Chú giải

CoA

Coenzyme A

cs.

cộng sự

PHA

Polyhydroxyalkanoate

PHB

Poly–β–hydroxybutyrate

rpm

Revolutions per minute (số vòng mỗi
phút)

SBB

Sudan Black B

UV

UltraViolet


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính hóa lí của PHB và PP ....................................................7
Bảng 1.2. Thành phần của mật rỉ mía và mật rỉ củ cải đường.......................................14
Bảng 1.3. Một số phương pháp thu hồi PHB ...............................................................16
Bảng 2.1. Các hóa chất phân tích ..................................................................................21
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .........................................22
Bảng 3.1. Tương quan giữa hàm lượng PHB chuẩn và giá trị OD235 ...........................31
Bảng 3.2. Kết quả lượng sinh khối khô tế bào thu được sau 96 giờ lên men................43
Bảng 3.3. Kết quả đo OD235 xác định hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào.............44


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.

Cơng thức cấu trúc tổng qt của PHB ........................................................6

Hình 1.2.

Cơ chế sinh tổng hợp PHB ...........................................................................9

Hình 2.1.

Thiết bị lên men 150 mL ............................................................................22

Hình 2.2.

Sơ đồ phương pháp xử lí mật rỉ đường ......................................................24

Hình 2.3.

Sơ đồ phương pháp tách PHB bằng NaClO và chloroform .......................28

Hình 2.4.

Sơ đồ phương pháp định lượng PHB .........................................................29

Hình 3.1.

Khuẩn lạc R. eutropha và hình dạng tế bào R. eutropha............................30

Hình 3.2

Kết quả nhuộm Sudan Black B ..................................................................30

Hình 3.3.

Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan quan tuyến tính giữa hàm
lượng PHB và giá trị OD235.......................................................................31

Hình 3.4.

Hệ thống lên men R. eutropha 150 mL ......................................................32

Hình 3.5.

Đồ thị thể hiện sự thay đổi sinh khối tế bào theo thời gian dưới ảnh hưởng
của các nồng độ mật rỉ khác nhau. ............................................................33

Hình 3.6.

Đồ thị thể hiện hàm lượng PHB trong tế bào ở các nồng độ mật rỉ khác
nhau ............................................................................................................34

Hình 3.7.

Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên sự sinh
trưởng của tế bào. .......................................................................................35

Hình 3.8.

Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau đến hàm
lượng PHB trong sinh khối tế bào..............................................................36

Hình 3.9.

Đồ thị biễu diễn sự sinh trưởng của vi khuẩn ở những mơi trường có nồng
độ nitrogen khác nhau. ...............................................................................37

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào ở các nồng độ
nitrogen khác nhau. ....................................................................................38
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sinh khối khơ tế bào ở các mơi trường có độ pH khác
nhau. ...........................................................................................................39
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn hàm lượng PHB trong sinh khối tế bào ở các mơi trường
có độ pH khác nhau. ...................................................................................40
Hình 3.13. Bình chứa mơi trường lên men. .................................................................41


Hình 3.14. Hệ thống lên men BioFlo 110 ....................................................................41
Hình 3.15. Kết quả nhuộm Nile blue A .......................................................................42
Hình 3.17. Sản phẩm PHB thu được từ 30 mg sinh khối vi khuẩn..............................43
Hình 3.18. Dung dịch H2SO4 đậm đặc chứa sản phẩm PHB .......................................43


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nhựa tổng hợp có nguồn gốc từ dầu mỏ đang được sử dụng rộng rãi trong việc
sản xuất các sản phẩm nhựa phục vụ con người. Khi thải ra môi trường, các sản phẩm
này cần đến hàng ngàn năm mới phân hủy được, khơng những vậy, q trình phân hủy
chúng cịn tạo ra các sản phẩm thứ cấp độc hại. Hậu quả là mơi trường bị ơ nhiễm
nghiêm trọng. Bên cạnh đó, sự khai thác quá mức của con người cũng đang khiến
nguồn tài nguyên dầu mỏ cạn kiệt dần. Trước tình hình trên, việc cần thiết là phải tìm
ra các nguồn vật liệu mới thân thiện với môi trường để thay thế.
Hiện đang có những nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất nhựa phân hủy sinh
học từ các vật liệu có nguồn gốc thiên nhiên. Đáng chú ý là việc sản xuất poly–β–
hydroxybutyrate (PHB) từ các vi sinh vật. PHB thuộc nhóm polyhydroxyalkanoates
(PHAs) được tổng hợp tự nhiên trong tế bào chất của một số loài vi khuẩn. Đây là các

polyester có tính chất tương tự nhựa tổng hợp. Nhờ đặc tính dẻo, đàn hồi, chịu nhiệt
cao, dễ bị phân hủy hồn tồn bởi các vi sinh vật mà khơng sản sinh độc tố, PHB đang
được xem như một nguồn thay thế lí tưởng cho nhựa tổng hợp. PHB đã được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực từ y học, nông nghiệp cho đến công nghiệp. Tuy nhiên cho đến
nay, các sản phẩm từ PHB vẫn chưa được sản xuất và sử dụng rộng rãi do việc sản
xuất PHB đòi hỏi đầu tư chi phí cao khiến giá thành các sản phẩm có nguồn gốc PHB
đắt đỏ.
Một trong những nguyên nhân khiến chi phí sản xuất PHB cao là do nguồn
nguyên liệu cho môi trường lên men vi khuẩn tạo PHB khá đắt tiền. Nhằm hạ thấp chi
phí và tăng hiệu quả sản xuất PHB, đã có nhiều nghiên cứu tập trung cải tiến các
chủng vi khuẩn tạo PHB cũng như tìm ra phương thức lên men và thu hồi PHB hiệu
quả. Với mong muốn tìm ra một phương pháp sản xuất PHB hiệu quả nhờ vi sinh vật,
sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhằm làm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành
các sản phẩm từ PHB, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu một số điều kiện thích hợp để lên
men tạo Poly-β-hydroxybutyrate”.


2

2. Mục tiêu
Khảo sát điều kiện thích hợp để lên men vi sinh vật tạo PHB trên cơ chất mật rỉ
đường.
3. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Ralstonia eutropha có khả năng sinh tổng hợp PHB.
4. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu xác định một số yếu tố dinh dưỡng và điều kiện mơi trường thích hợp
để vi khuẩn lên men tạo PHB.
5. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu xác định yếu tố dinh dưỡng bổ sung ban đầu để vi khuẩn R. eutropha
tạo PHB tối ưu:

 Nghiên cứu nồng độ mật rỉ đường bổ sung ban đầu.
 Nghiên cứu dạng muối nitrogen bổ sung ban đầu.
 Nghiên cứu nồng độ muối nitrogen bổ sung ban đầu.
 Nghiên cứu pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng.
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Ý nghĩa khoa học
Xác định một số yếu tố dinh dưỡng và điều kiện mơi trường thích hợp để R.
eutropha tạo PHB.
Ý nghĩa thực tiễn
Sản xuất PHB từ chủng R. eutropha trên cơ chất mật rỉ đường, một nguồn
nguyên liệu rẻ tiền nhằm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm PHB.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Công nghệ lên men
1.1.1. Khái qt về q trình lên men
“Lên men” có nguồn gốc từ từ Latinh “fervere”, nghĩa là sự sôi do hoạt động của
nấm men trong dịch chiết quả hoặc malt nghiền. Trong hóa sinh, lên men có nghĩa là
sự tạo thành năng lượng nhờ q trình dị hóa các hợp chất hữu cơ. Trong công nghệ
sinh học, lên men được sử dụng để chỉ việc nuôi cấy các vi sinh vật kị khí và hiếu khí
để sinh tổng hợp nên các sản phẩm mong muốn [4, 37].
Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kị khí. Bắt
đầu q trình lên men, các hợp chất chứa carbohydrate được phân giải thành glucose,
trải qua quá trình chuyển hóa, sản phẩm cuối cùng được tạo thành là CO2 và một số
hợp chất carbon chưa được oxy hóa hồn toàn như ethanol, acid acetic, ketone, … Tên
sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men thường được dùng để gọi quá trình
lên men ấy. Chẳng hạn như q trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic được gọi là
quá trình lên men lactic [5].

Một số vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí,
nhưng lại tạo ra những sản phẩm chưa được oxy hóa hồn tồn giống q trình trình
lên men kị khí như acid acetic, ketoacid, … Quá trình này dù cũng được gọi là lên men
nhưng thực chất là q trình oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều q trình oxy hóa khơng hồn
tồn có ý nghĩa quan trọng trong cơng nghiệp lên men vì tạo ra những sản phẩm có giá
trị [5].
1.1.2. Phương pháp lên men
1.1.2.1. Lên men theo mẻ
Lên men theo mẻ là phương pháp mà trong suốt q trình lên men, ta khơng bổ
sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường, cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối của
quá trình trao đổi chất. Trong lên men theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua các giai đoạn
sinh trưởng: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong [28].
Pha lag là giai đoạn đầu, khi vi sinh vật mới được đưa vào môi trường nuôi cấy
mới, sự tăng sinh tế bào xảy ra không đáng kể. Lúc này, vi sinh vật bắt đầu thích ứng
với mơi trường mới và bắt đầu tổng hợp các chất cần cho sự sinh trưởng. Các loài vi


4

sinh vật khác nhau có độ dài pha lag khác nhau. Pha lag cũng có thể kéo dài nếu giống
cấy ban đầu quá lâu hoặc đã được đông lạnh. Trong sản xuất, để hệ thống lên men
nhanh chóng bước vào pha tăng trường và tổng hợp sản phẩm, cần rút ngắn thời gian
pha lag càng ngắn càng tốt [28].
Pha log là pha vi sinh vật sinh trưởng và phân chia mạnh. Tốc độ sinh trưởng phụ
thuộc vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và sản phẩm tạo ra từ quá
trình trao đổi chất của vi sinh vật [28].
Trong pha cân bằng, sự tăng sinh tế bào bắt đầu chậm lại, số lượng tế bào duy trì
ở mức ổn định do số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi, hoặc do tế bào ngừng phân
chia dù vẫn còn hoạt động trao đổi chất. Một trong những nguyên nhân khiến vi sinh
vật bắt đầu chuyển sang pha cân bằng là do sự giới hạn một yếu tố dinh dưỡng nào đó

trong mơi trường. Đây chính là giai đoạn mà sự sinh tổng hợp PHB ở Ralstonia
eutropha diễn ra mạnh. Các sản phẩm thừa tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh
vật cũng có thể làm sự tăng trưởng giảm. Chẳng hạn như R. eutropha có thể sản sinh
nhiều butyric và các acid hữu cơ khác trong pha tăng trưởng, điều này khiến pH môi
trường giảm, làm ức chế sự sinh trưởng của tế bào [28].
Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa do sự cạn
kiệt dinh dưỡng và tích lũy một số sản phẩm độc hại cho vi sinh vật, một số enzyme
phân giải tế bào. Ở Ralstonia eutropha, tốc độ suy vong có thể giảm trong trường hợp
vi khuẩn sử dụng nguồn năng lượng dự trữ là PHB tích lũy trong tế bào [28].
Phương pháp này có một số ưu điểm là đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ
sung thêm bất kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, giảm khả năng bị nhiễm,
thu hồi sản phẩm đạt mức tối ưu, giảm chi phí sản xuất. Tuy nhiên, phương pháp này
cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên
nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn cơ chất cạn kiệt, giữa các mẻ nuôi phải
ngắt quãng thời gian [4].
1.1.2.2. Lên men theo mẻ có bổ sung (lên men fed-batch)
Trong hệ thống lên men này, môi trường mới được bổ sung liên tục theo giai
đoạn vào bình ni nhưng khơng loại bỏ dịch ni khỏi bình cho đến khi kết thúc quá
trình lên men. Phương pháp này có ưu điểm là giữ được các điều kiện trong quá trình


5

nuôi cấy, tránh được việc cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và hạn chế ảnh hưởng của các
sản phẩm độc trong môi trường [4].
1.1.2.3. Lên men liên tục
Môi trường được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra dịch lên
men để thu nhận sản phẩm theo từng giai đoạn đã định trước. Lên men liên tục có ưu
điểm là làm cho tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật cao, thu được lượng sinh khối
cao, tiết kiệm do khơng có thời gian chết và tối ưu dễ dàng điều kiện nuôi cấy bằng

cách thêm chất dự trữ hoặc thay đổi các thông số. Tuy nhiên, phương pháp này cũng
có một số nhược điểm như dễ bị tạp nhiễm, dễ xảy ra hiện tượng đột biến, … [4]. Đối
với quá trình lên men gồm hai giai đoạn là tăng trưởng và sinh tổng hợp PHB như ở
R. eutropha, lên men liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng lên men theo mẻ
hay lên men theo mẻ có bổ sung do tế bào ln ở trạng thái pha log [28].
1.2. Nhựa phân hủy sinh học
Sự cạn kiệt dần nguồn tài nguyên dầu mỏ cùng với những quan ngại về môi
trường đã tạo nên một áp lực thúc đẩy việc phát triển vật liệu nhựa mới không có
nguồn gốc từ dầu mỏ, vừa bền, vừa thân thiện với môi trường. Những vật liệu này
được gọi là nhựa sinh học, nhựa xanh, nhựa phân hủy sinh học hay nhựa sinh thái.
Nhựa phân hủy sinh học, vốn được xem như là một giải pháp xử lí rác thải nhựa, phải
là loại vật liệu có thể phân hủy hồn tồn, khơng gây ơ nhiễm và có giá cả hợp lí. Một
số loại nhựa sinh học đang được quan tâm hiện nay là hồ dẻo (TPS), polylactide
(PLA), polymalate (PMA) và polyhydroxyalkanoate (PHA)[34]. Trong số đó, PLA
được sử dụng phổ biến. So với PHA thì PLA có giá thành thấp hơn. Tuy nhiên nó cũng
mang một số nhược điểm như giịn, độ kết tinh thấp, chịu nhiệt kém. Bên cạnh đó, dù
acid lactic có thể được sản xuất bằng cách lên men cơng nghiệp, nhưng vẫn cần phải
trải qua q trình polymer hóa hóa học mới tạo được PLA. Q trình này khiến qui
trình sản xuất phức tạp hơn và tiêu tốn thời gian. Chính những nhược điểm đó đã làm
hạn chế ứng dụng của PLA và thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm những loại nhựa
phân hủy sinh học khác [42].
Hiện nay, loại nhựa phân hủy sinh học được nhiều người quan tâm là PHA. PHA
có một vai trị quan trọng bởi PHA được sản xuất từ các vi sinh vật và do đó, có thể


6

được phân hủy hồn tồn thành những hợp chất vơ hại. PHA khơng gây ơ nhiễm vì
khơng cần chất xúc tác hay phụ gia để thúc đẩy quá trình phân hủy. Các lồi vi khuẩn
có khả năng phân hủy loại nhựa này hiện diện ở khắp nơi từ đất, nước, phân đến cống

rác. PHA được phân hủy hoàn toàn thành carbon dioxide và nước trong mơi trường
hiếu khí. Trong điều kiện yếm khí, sự phân hủy PHA có thể tạo nên methane sử dụng
làm nhiên liệu. Chính tính thích ứng sinh học cũng như tiềm năng sản xuất PHA từ
những nguồn nguyên liệu rẻ tiền đã thu hút sự quan tâm toàn cầu. [34]
1.3. Poly-β-hydroxybutyrate (PHB)
Polyhydroxybutyrate (PHB) là loại polymer sinh học thuộc nhóm PHA. Nó được
phát hiện trong Bacillus megaterium vào năm 1926 bởi nhà khoa học người Pháp
Lemoige [34].
1.3.1. Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB
PHB là polyester được tế bào tích lũy dưới dạng thể vùi lipid. Thành phần thể vùi
PHB gồm khoảng 97 – 98% PHB, 2% protein và 0,5% lipid [41].
Với công thức hóa học (C4H6O2)n , cấu trúc phân tử PHB được thể hiện trong
hình 1.2.

Hình 1.1.Cơng thức cấu trúc tổng qt của PHB [15]
PHB có một số đặc tính lí hóa sau:
-

Khối lượng phân tử 100 000 – 800 000 Da.

-

PHB khơng tan trong nước và có sức chống chịu tương đối với các phản ứng
thủy phân. Đây chính là điểm khác biệt của PHB so với các loại nhựa phân
hủy sinh học khác, hầu hết tan trong nước hoặc nhạy độ ẩm.


7

-

PHB không bị phá vỡ cấu trúc bởi tia UV nhưng rất dễ bị hủy bởi acid hoặc
base và dễ tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, methylene
chloride, …

-

Khả năng khuếch tán oxygen tương đối kém. Nhờ tính chất này mà các sản
phẩm bao bì đựng thực phẩm làm từ PHB có thể hạn chế sự oxygen hóa gây
hỏng thực phẩm.

-

Tính tương thích sinh học cao nên rất thích hợp để ứng dụng trong y học.

-

Khơng độc.

-

Có khả năng chịu lực căng khoảng 40 Mpa, tương đương với polypropylene.

Nhanh chóng bị phân hủy trong tự nhiên và thân thiện với môi trường, PHB đang
được quan tâm như một loại vật liệu mới thay thế cho các loại nhựa từ dầu mỏ như
polyetylene (PE), polypropylene (PP),… bởi PHB mang những đặc tính tương tự như
các loại nhựa truyền thống. Bảng 1.1 cho thấy PHB dù cứng và dễ gãy hơn nhưng
trong hầu hết các đặc tính khác thì loại polymer này tốt hơn hoặc tương đương với PP
[3].
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính hóa lí của PHB và PP (Nguồn: Brown, 1991)

Polymer

PHB

PP

171 – 182

171 – 186

65 –80

65 –70

Trọng lượng phân tử (Daltons) (x 105)

1–8

2,2 – 7

Nhiệt độ thủy tinh hóa (oC)

5 – 10

-15

1,23 – 1,25

0,905 – 0,940

3,5 – 4,0

1,7

40

39

Điểm gãy (%)

6–8

400

Kháng UV

Mạnh

Yếu

Kháng dung mơi

Yếu

Mạnh

Phân hủy sinh học

Có

Khơng

Đặc tính
Nhiệt độ nóng chảy (oC)
Tinh thể hóa (%)

Mật độ (g/cm3)
Mơ đun Young (gPa)
Lực căng (mPa)


8

Mặc dù mang nhiều đặc tính tốt, PHB vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do giá
thành sản phẩm từ PHB cao gấp 15 lần các sản phẩm nhựa tổng hợp. Để việc sử dụng
PHB trở nên phổ biến, cần phải có những giải pháp làm giảm giá thành sản phẩm như
tối ưu hóa q trình lên mên tạo PHB, sử dụng mơi trường rẻ tiền và tìm ra phương
pháp thu hồi PHB hiệu quả. Trong quá trình sản xuất PHB, chi phí ngun liệu cho
mơi trường lên men chiếm đến khoảng 40% tổng chi phí sản xuất. Do đó, sử dụng
những nguồn carbon rẻ tiền làm nguyên liệu cho lên men là rất cần thiết nhằm làm
giảm giá thành sản xuất PHB [42].
1.3.2. Quá trình sinh tổng hợp PHB
Ở Ralstonia eutropha, sự tổng hợp PHB nội bào diễn ra trong điều kiện mơi
trường dinh dưỡng có nồng độ carbon thích hợp và bị hạn chế một yếu tố dinh dưỡng
khác như nitrogen, phosphate, oxygen hòa tan hay một số yếu tố khoáng như
magnesium, sắt, …[22].
Con đường sinh tổng hợp PHB được thực hiện qua ba bước với sự xúc tác của
các enzyme β-ketothiolase, acetoacetyl-CoA reductase và PHB synthase.
Đầu tiên, β-ketothiolase xúc tác phản ứng trùng ngưng hai acetyl-CoA thành
acetoacetyl-CoA. Sau đó, acetoacetyl-CoA reductase xúc tác khử acetoacetyl-CoA

thành β-hydroxybutyryl-CoA, quá trình này cần có NADPH. Cuối cùng, βhydroxybutyryl-CoA được polymer hóa thành PHB với sự tham gia của PHB synthase,
đồng thời giải phóng coenzyme-A (Hình 1.3) [10], [34], [36].
Trong điều kiện cân bằng dinh dưỡng, quá trình sinh tổng hợp PHB bị ức chế.
Điều này được gây ra bởi nồng độ coenzyme-A tự do giải phóng từ chu trình Krebs
cao, ức chế enzyme β-ketothiolase. Môi trường dinh dưỡng bị hạn chế một yếu tố dinh
dưỡng thiết yếu làm xuất hiện sự hình thành NADH. Lượng NADH cao làm ức chế sự
tổng hợp citrate, dẫn đến sự ơxi hóa acetyl-CoA trong chu trình Krebs xảy ra chậm,
acetyl-CoA được tích lũy lại. Khi nồng độ NADH và acetyl-CoA cao, trong tế bào bắt
đầu quá trình sinh tổng hợp PHB [11].


9

Hình 1.2. Cơ chế sinh tổng hợp PHB [10]
1.3.3. Vi sinh vật sản xuất PHB
Trong tự nhiên, có nhiều lồi vi sinh vật có khả năng tạo ra một lượng PHB
chiếm 30 – 80% khối lượng khô tế bào. Mặc dù PHB có thể được tổng hợp hóa học sử
dụng β-butyrate hoặc β-hydroxybutyric acid làm monomer, nhưng qui trình điều khiển
khó khăn và giá thành sản xuất cao đã khiến việc sản xuất PHB theo con đường tổng
hợp hóa học trở nên khơng thể thực hiện được. Trong khi đó, sinh tổng hợp PHB nhờ
các vi sinh vật lại mang nhiều thuận lợi bởi qui trình sản xuất địi hỏi điều kiện đơn
giản hơn. Lên men sản xuất PHB sử dụng vi sinh vật đang là hướng đi đáng chú ý
[42].
Dựa trên yêu cầu về điều kiện nuôi cấy để tạo PHB, có thể phân các vi khuẩn
thành hai nhóm. Nhóm thứ nhất gồm những lồi vi khuẩn như R. eutropha,
Pseudomonas olevorans, ... cần điều kiện sinh trưởng mất cân bằng để tổng hợp PHB.
Chúng sẽ tổng hợp và tích lũy PHB khi môi trường giàu carbon và giới hạn một yếu


10

dinh dưỡng thiết yếu khác (nitrogen, oxygen, ...). Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn
sản xuất PHB mà khơng địi hỏi phải giới hạn dinh dưỡng. Điển hình trong nhóm này
là Alcaligenes latus [22].
Trong số các chủng vi sinh vật có khả năng tạo PHB, hai chủng vi khuẩn phổ
biến là Ralstonia eutropha và Alcaligenes latus.
a. Ralstonia eutropha
R. eutropha (trước đây là Alcaligene eutrophus) là vi khuẩn Gram âm, dạng hình
que, khơng hình thành bào tử, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ
tối ưu 30 C [42].
Hệ thống phân loại:

Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp:
Betaproteobacteria
Bộ:
Burkholderiales
Họ:
Burkholderiaceae
Chi:
Cupriavidus/Ralstonia
Loài: Ralstonia eutropha
R. eutropha là chủng vi khuẩn sản xuất PHB hiệu quả nhờ khả năng sử dụng
được nhiều nguồn carbon khác nhau như glucose, fructose, acetic acid, thực vật, dầu
thực vật, … để tích lũy PHB với hàm lượng có thể lên đến 80% khối lượng tế bào
[11]. Vi khuẩn có thể sản sinh PHB trong điều kiện mơi trường có mặt nguồn carbon
song song với sự thiếu hụt một nhân tố sinh trưởng thiết yếu khác. Do đó, qui trình sản
xuất PHB thường trải qua hai bước, mở đầu là sự tăng nhanh sinh khối tế bào, theo sau
là bước sản xuất PHB [42].

b. Alcaligenes latus
A. latus là vi khuẩn Gram âm, sống hiếu khí bắt buộc, sinh trưởng trong nhiệt độ
tối ưu khoảng 35 C. A. latus có thể tích lũy PHB trong tế bào sử dụng nguồn carbon
là sucrose và không cần sự giới hạn của bất kì yếu tố dinh dưỡng nào [42].
c. Một số chủng vi khuẩn khác
Pseudogenes oleovorans có thể sản xuất lượng PHB khá cao (149 g/L) khi được
ni cấy theo mẻ có bổ sung hồn tồn tự động. Tuy nhiên, để đạt được nồng độ PHB


11

trên, cần phải trải qua 170 giờ nuôi cấy. Điều đó đã làm giảm hiệu suất sản xuất PHB
(0,88 g/giờ) [42].
Kim và cộng sự đã nghiên cứu sự sản xuất PHB ở Escherichia coli tái tổ hợp
mang gen quy định tổng hợp PHB của R. eutropha (1992). Nghiên cứu cho thấy E.
coli tái tổ hợp có thể tích lũy lượng PHB đến 80 – 90% khối lượng khô tế bào.
Một số chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHB gồm: Ralstonia eutropha,
Alcaligenes

latus,

Methylobacterium

Pseudogenes
sp.,

Protomonas

oleovorans,
extorquens,

Chromobacterium
Pseudomonas

violaceum,

sp.,

Bacillus

megaterium, Azotobacter vinelandil, Comamonas testosteroni [25, 31].
1.3.4. Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB
PHB đã được đưa vào sản xuất từ cuối những năm 1950. Khi đó, Baptist và
Werber thuộc công ty W.R. Grace (Mỹ) là những người tiên phong mở đường cho việc
sản xuất PHB thương mại. Tuy nhiên, do không thể thu hút được sự quan tâm chú ý
cộng với hiệu suất sản xuất thấp, việc sản xuất PHB đã phải ngừng lại. Một thời gian
dài người ta đã khơng cịn quan tâm đến việc sản xuất PHB thương mại cho đến giữa
những năm bảy mươi, khủng hoảng dầu đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các loại nhựa
thay thế. Trong những năm 1980, một công ty Úc là Chemie Linz AG hợp tác với
Petrochemia Dnubia (PCD) sản xuất PHB từ A. latus trên cơ chất sucrose. Năm 1993,
tiến sĩ Hangii được PCD trao lại công nghệ sản xuất PHB và chủng vi khuẩn. Một năm
sau, ông bắt đầu sản xuất PHB dưới tên thương mại là Biomer [34].
Hầu hết các loại nhựa phân hủy sinh học không thể cạnh tranh giá cả với nhựa có
nguồn gốc từ dầu mỏ. Jaquel và cộng sự đã biên soạn một bài viết về giá thành của
nhiều loại PHA thương mại khác nhau. Năm 2003, các sản phẩm Biomer, Biocycle,
Biogreen, Biopol và Nodax có giá từ 10 đến 20 € một kilogam. Đến năm 2010, giá
thành các sản phẩm này giảm còn 2,20 – 5,0 € một kilogam. Giá thành sản phẩm cao
là do giá nguyên liệu thô cao, chi phí thực hiện qui trình sản xuất cao và sản lượng thu
được thấp. Vì vậy điều cần thiết lúc này là phải tìm ra những giải pháp giúp hạ giá
thành sản xuất PHB [34].

12

1.3.5. Phương hướng cải thiện sản xuất PHB
Hiện nay, các nghiên cứu đang chủ yếu tập trung vào việc hạ giá thành sản xuất
PHB bằng một số phương pháp như sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, sử dụng những
chủng vi khuẩn có hiệu suất sản xuất PHB cao, áp dụng qui trình lên men tốt hơn và có
phương pháp thu hồi PHB hiệu quả hơn.
1.3.5.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn sản xuất PHB thích hợp
Lựa chọn chủng vi khuẩn tổng hợp PHB lý tưởng là cơng việc mang tính quyết
định trong qui trình sản xuất PHB. Để xác định một vi khuẩn là phù hợp với sản xuất
PHB quy mơ lớn, có thể dựa vào một số yếu tố như khả năng tế bào sử dụng nguồn
carbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũy
trong tế bào. Trong đó, các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất tạo PHB, bao
gồm tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũy trong tế
bào cần phải càng cao càng tốt. Không nên chọn những vi sinh vật mà bên cạnh việc
sản xuất PHB cịn tạo polysaccharide ngoại bào bởi nguồn carbon khơng được chúng
tận dụng hết cho quá trình sinh tổng hợp PHB. Mặt khác, như đã trình bày ở trên, vi
khuẩn tổng hợp PHB gồm hai nhóm nên khi lựa chọn chủng vi khuẩn, cần chú ý điểm
này để có phương pháp lên men phù hợp [34].
Hiện, đang có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật mới, cải thiện
năng suất tạo PHB. Gây đột biến tạo chủng vi sinh vật đã được thực hiện nghiên cứu ở
nhiều nơi trên thế giới. Tại Việt Nam, Phạm Thanh Hà và cộng sự (2008) đã gây đột
biến A. lactus VN1 bằng tia UV, năng suất tạo PHB ở chủng đột biến cải thiện được
40% so với chủng dại [7]. Các vi sinh vật chuyển gen cũng được sử dụng trong sản
xuất PHB. Một số nghiên cứu đã đưa được gen qui định sinh tổng hợp PHB của một số
chủng vi khuẩn vào tế bào vi khuẩn tái tổ hợp, làm tăng năng suất tạo PHB. Phổ biến
nhất là E. coli tái tổ hợp mang gen qui định sinh tổng hợp PHB của R. eutropha [24].
1.3.5.2. Tối ưu hóa các điều kiện môi trường lên men sản xuất PHB

Sự thay đổi các điều kiện môi trường khi lên men sản xuất PHB có thể có ảnh
hưởng rất lớn đến hiệu quả sản xuất PHB. Do đó, cần tìm được những thơng số về
thành phần dinh dưỡng, điều kiện lí, hóa thích hợp để quá trình lên men tạo PHB đạt
hiệu quả cao nhất.


13

1.3.5.3. Thay thế nguồn cơ chất trong sản xuất PHB vi sinh
Trong q trình sản xuất, chi phí ngun liệu thơ mà đặc biệt là nguồn carbon có
ảnh hưởng rất lớn đến tổng chi phí thành phẩm. PHB được tích lũy trong điều kiện
hiếu khí, do đó vi khuẩn sử dụng một lượng lớn carbon cho hô hấp tế bào. Kết quả là
chỉ chưa tới 50% lượng carbon được dùng để tạo PHB. Bên cạnh đó, việc sử dụng
nguồn carbon đắt tiền như glucose càng khiến chi phí sản xuất PHB thêm đắt đỏ. Hiện
nay những nguyên liệu thô rẻ tiền, dễ tìm như rác thải nơng nghiệp và cơng nghiệp
đang được xem là nguồn cơ chất carbon tiềm năng. Sử dụng các sản phẩm thải này
không chỉ là giải pháp làm giảm giá thành sản xuất PHB mà còn giúp giảm bớt gánh
nặng loại bỏ rác thải [3, 34].
1.3.5.3.1. Sản xuất PHB sử dụng rác thải nông nghiệp và xác thực vật
Rác thải nông nghiệp đang xem là một nguồn nguyên liệu cung cấp cho quá trình
sản xuất PHB ở một số loài vi sinh vật. Chẳng hạn như Cupriavidus necator có thể
tích lũy PHB khi được bổ sung nguồn carbon và nitrogen là sản phẩm thủy phân lúa
mì và cao nấm men. Trong mơi trường có cám lúa mì được thủy phân nhờ enzyme của
Aspergillus oryzae NM1, Halomonas boliviensis LC1 có khả năng tích lũy lượng PHB
khoảng 34% khối lượng khơ tế bào [34].
Có 60% xác thực vật chứa lignocellulose, nguồn tài nguyên này vô cùng dồi dào
trên trái đất. Tuy nhiên, nguồn vật liệu này cần phải được xử lí trước khi cung cấp cho
q trình lên men vi sinh [34].
1.3.5.3.2. Sản xuất PHB sử dụng chất thải công nghiệp
Nhiều loại chất thải công nghiệp như mật rỉ rất giàu carbon. Chúng đã được sử

dụng để sản xuất các sản phẩm như acid lactid, ethanol, enzyme, ... Một số loại chất
hiện đang được nghiên cứu và sử dụng để sản xuất PHB.
a. Mật rỉ
Mật rỉ là chất thải phổ biến của ngành công nghiệp đường. Trong mật rỉ có chứa
nguồn carbon chính là sucrose, vài loại đường khác và một số nhân tố kích thích sinh
trưởng như vitamin và biotin. Thành phần hóa học trong mật rỉ rất khó dự đốn. Nó
phụ thuộc vào các điều kiện như thổ nhưỡng, thời tiết, giống mía, giai đoạn thu hoạch
cũng như qui trình sản xuất tại mỗi nhà máy [22].


14

Hiện nay, hai loại mật rỉ được sử dụng phổ biến trong sản xuất PHB là mật rỉ mía
và mật rỉ củ cải đường.
Bảng 1.2. Thành phần của mật rỉ mía và mật rỉ củ cải đường (Nguồn: Curtin,
1893; Chen và Chou, 1993; Godbole, 2002)
Thành phần (%)

Mật rỉ mía

Mật rỉ củ cải đường

46,0
Đường

44 – 60a

48,0

50 – 90b

Protein thô

3,0
2,5 – 4,5b

6,0

Calcium

0,8

0,2

Phosphorus

0,08

0,03

Potassium

2,4

4,7

Sodium

0,2

1,0

Chlorine

1,4

0,9

Sulfur

0,5

0,5

a

Godbole (2002);

b

Chen và Chou (1993)

b. Nước sữa
Nước sữa, một sản phẩm phụ của ngành công nghiệp sữa, đang là chất thải và là
nguyên liệu dư thừa ở nhiều nơi trên thế giới. Chúng không chỉ là nguyên liệu thô rẻ
tiền mà còn là một gánh nặng trong việc loại bỏ chất thải cơng nghiệp. Lactose, nguồn
carbon chính trong nước sữa, là cơ chất cho nhiều qui trình cơng nghệ sinh học sản
xuất ethanol sinh học, kháng sinh, polymer sinh học [15, 34].
Người ta đã thực hiện sản xuất PHB trong môi trường có chứa nước sữa, sử dụng
E. coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp PHB của R. eutropha. Khi được ni cấy theo mẻ
có bổ sung dùng nước sữa làm chất dinh dưỡng, E. coli tái tổ hợp có thể tạo được 69

g/L PHB [15, 34].


15

c. Chất thải có chứa tinh bột
Chất thải từ cơng nghiệp chế biến thức ăn nhanh được xem là nguồn dinh dưỡng
lý tưởng nhờ hàm lượng chất hữu cơ mà chúng chứa. Tinh bột và các dẫn xuất của nó
hiện diện trong nước thải từ các ngành công nghiệp dệt, giấy, lên men, nước giải khát
và thực phẩm. Những loại nước thải này có thể được chuyển hóa thành PHB thơng qua
q trình thủy phân và polymer hóa. R. eutropha có khả năng sử dụng nước thải khoai
tây đã được thủy phân bằng mầm lúa mạch để sản xuất một lượng PHB chiếm 76,9%
khối lượng khô tế bào. Một số nhà nghiên cứu đã cố gắng khai thác khả năng tạo
amylase của một số loài vi khuẩn để sản xuất PHB trực tiếp từ tinh bột. Chẳng hạn như
Azotobacter chroococcum có thể tích lũy PHB khi sinh trưởng trong mơi trường dinh
dưỡng có bổ sung tinh bột hịa tan [34].
d. Pha glycerol lỏng từ ngành sản xuất nhiên liệu sinh học
Methylobacterium rhodesanium và R. eutropha có thể tổng hợp PHB, sử dụng
nguồn carbon và nitrogen lần lượt là glycerol và casein peptone. Những vi sinh vật
khác như Paracoccus denitrifican cũng có khả năng sử dụng glycerol tinh khiết hoặc
glycerol thu được khi sản xuất nhiên liệu sinh học từ hạt nho làm cơ chất carbon để
sản xuất PHB [34].
1.3.6. Tách và thu hồi PHB
Sự thành công của việc sản xuất PHB quy mô lớn không chỉ phụ thuộc vào nguồn
nguyên liệu rẻ tiền hay qui trình lên men hiệu quả mà còn chịu ảnh hưởng lớn bởi
phương pháp thu hồi PHB thích hợp.
Việc tách PHB ra khỏi sinh khối tế bào và tinh sạch chúng là việc làm khó khăn
bởi cả phân tử PHB và sinh khối tế bào đều là pha rắn. Thu hồi PHB có thể được thực
hiện theo hai hướng là hòa tan PHB hoặc phân hủy phần sinh khối tế bào không phải
là PHB. Theo hướng thứ nhất, chỉ có PHB được hịa tan trong một dung mơi hữu cơ

thích hợp. Ở hướng cịn lại, phần sinh khối tế bào không phải là PHB sẽ được các tác
nhân hóa học tiêu hóa và hịa tan. Khi thu hồi PHB, người ta chú ý ba yếu tố là độ tinh
sạch, hàm lượng và kích thước phân tử PHB. Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về thu
hồi PHB trên Alcaligenes và E. coli tái tổ hợp. Do sự khác nhau về vách tế bào, thành
phần cấu tạo tế bào cũng như điều kiện để tạo PHB mà phương pháp thu hồi PHB ở