hoàn toàn miễn phí cập nhật nhanh chóng chính xác chất lượng hiệu quả đáng tin cậy

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.62 MB, 7 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

Công ngh

ệ

DNA tái t

ổ

h

ợ

p

Nguy

ễ

n V

ũ

Phong

L

ị

ch s

ử

hình thành

• 1972 – 1973:DNA tái tổhợpin vitro từ3 nguồn vật liệu di truyền
khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen)

• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen,
Henlinski, Boyer).

Tên gọi:

• Kỹthuật DNA tái tổhợp (DNA recombinant technology)

• Kỹthuật gene (Gene engineering) hay cơng nghệgene (Genetic
technology)

• Thao tác gene (Gene manipulation)

• Tạo dịng phân tử(Molecular cloning)

• Kỹthuật di truyền(Genetic engineering): thao tác với những phần
lớn hơn của bộgene.

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

• Bước 1: Ni tếbào chủvà tếbào cho

• Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế

bào cho

• Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục
tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn

• Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng
enzyme nối tạo DNA tái tổhợp hồn
chỉnh

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổhợp vào tế

bào nhận (E. coli, nấm men)

• Bước 6: Chọn lọc và nhân dịng tếbào
mang gene tái tổhợp

• Bước 7: Nghiên cứuđiều kiệnđểgene
biểu hiện ra sản phẩm

1. Enzyme

1.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE)

- 1962: hạn chếsựsinh sản của phage trong tếbào vi khuẩn

- Hệthống hạn chế- biếnđổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ
tếbào khỏi sựxâm nhập của DNA lạ.

Restriction enzyme.swf

1. Enzyme

1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)

- Trình tựnhận biết: gồm 4-6 cặp nuđối xứngđảo ngược(palindrom)

- Cắt tạo thànhđầu so le (sticky end) hayđầu bằng (cohesive end) .

- Khoảng 3000 RE với 230 trình tựnhận biết khác nhau.

- EcoRI: EscherichiacoliR: dịng vi khuẩnI: thứtựtìm ra (I:đầu tiên)

1. Enzyme

1.2. Enzyme nối (Ligase)

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

1. Enzyme

1.3. Enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase)

• Tổng hợpsợi DNA bổsung

c-DNA (complementary
DNA) từ một sợi mRNA
hoặc từ polyribonucleotide
tổng hợp

• c-DNA có thể tổng hợp
thành c-DNA kép (c-DNA

duplex) nhờ DNA

polymerase. c-DNA kép
được dùng trong việc tạo
dòng c-DNA

cDNA.swf

1.4. Các enzyme khác

Enzyme Chức năng

DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phảnứng thủy
phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease)
Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon

nuclease)

S1 nuclease Cắt DNA mạchđơn

Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease
3’-5’

Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn

Thermophilus aquaticus

1. Enzyme

2. Các vector chuy

ể

n gene

Plasmid:
- DNA vịng trịn

- Sao chép độc lập trong tế bào
- Có khả năng mang một số gene

có khả năng biểu hiện thành
protein

Vector:

- Phân tử DNA có khả năng tự tái bản
- Tồn tại độc lập trong tế bào
- Mang được gene mong muốn

Yêu cầu tối thiểu đối với vector
chuyển gene.

- Có trình tựkhởiđầu sao chép (ori)

đểtựsao chép mà tồn tạiđộc lập

- Trình tựnhận biết cho RE tạo vết
cắtđểchèn gene lạ

- Trình tự điều hịa (promoter) tạo

điều kiện thuận lợi phiên mã gene
lạ

- Đảm bảo sự di truyền bền vững
của DNA tái tổhợp

- Có geneđánh dấu (marker)đểdễ

dàng nhận biết các gene lạ.

2. Các vector chuy

ể

n gene

2. Các vector chuy

ể

n gene

Các loại vector chuyển gene

Vector Đặcđiểm Khảnăng
chèn

Ứng dụng

Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote

Phageλ Tự động xâm nhiễm và sinh
sản trong TB vi khuẩn

15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene

Cosmid Plasmid + đoạn cos của
phage λ

45kb Lập thưviện gene

Phage
M13

DNA mạchđơn Xácđịnh trình tựnu
Sản xuất mẫu dị
Gâyđột biếnđiểm

định hướng
BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb

YAC Vịng trịn 2 micrometre cải
tiến

100-2000kb

MAC NST nhân tạođộng vật có vú >2000kb

2. Các vector chuy

ể

n gene

Ứng dụng của vector chuyển gene

- Tạo dịng và khuyếchđại trình tựDNA (nhiều bản sao)

- Nghiên cứu sựbiểu hiện củađoạn DNA

- Chuyển gene

- Sản xuất RNA

- Sản xuất protein từgeneđược tạo dòng.

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Plasmid Ti
- 200Kb

- Agrobacterium tumefaciens

- Chuyển gen ở thực vật

- Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào

2. Các vector chuy

ể

n gene

3. H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

Mục đích:

- Nhân ni tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.
- Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote

- Sản xuất protein tái tổ hợp.

3.1. Escherichia coli (E.coli)

- Dễ ni cấy và nhân dịng

- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.

- Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3. H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

3.2. Saccharomyces cerevisiae
- Eukaryoteđơn bào

- Dễdàng nuôi cấy và thu sinh khối

- Phân lậpđược nhiều promotor hoạtđộng mạnh

- Thực hiện biếnđổi sau dịch mã tạo protein có

đủhoạt tính sinh học.

- Sản xuất protein tái tổhợp dễdàng

- Sinh vật an toàn

3.3. Hệ thống tế bào thực vật

3.4. Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney

- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3. H

ệ

th

ố

ng t

ế

bào ch

ủ

(Host)

1. Lai nucleic acid

Đ

ặc tínhbiến tínhvàhồi tínhcó thểlai giữa DNA-DNA, DNA-RNA,
RNA-RNA

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

Southern Blot.swf

2. Thu nh

ậ

n gene

- Thu nhận DNA từbộ
gene

* Shotgun: toàn bộ

DNA của sinh vật

được cắt đoạn nhỏ

bằng cơhọc hay RE
và gắn vào vector tạo

dòng

*Ngân hàng/thưviện
DNA bộ gene

(Bank/Library of
genomic DNA)

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

2. Thu nh

ậ

n gene

- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

2. Thu nh

ậ

n gene

- Lậpngân hàng c-DNA

* Tạo gene từ các mRNA
thông tin nhờenzyme phiên
mã ngược

Ưuđiểm

- Chứa trình tựmã hóa liên
tục của một gene (không
chứađoạn intron)

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3. T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3. T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

b) Dùng cácđoạn nối (linkers)

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

3. T

ạ

o plasmid tái t

ổ

h

ợ

p

a) Dùng đầu so le

b) Dùng cácđoạn nối (linkers)
c) Dùng enzyme terminal transferase

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4. Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

a)

Hóa bi

ế

n n

ạ

p

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

4. Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

b)

Đ

i

ệ

n bi

ế

n n

ạ

p

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4. Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

c) Vi tiêm

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

4. Bi

ế

n n

ạ

p DNA tái t

ổ

h

ợ

p vào t

ế

bào

d) B

ắ

n gene

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

DNA coated
golden particles

Gene gun

Cell division

A plant cell with

the new gene

Transgenic plant

Plant cell
Cell’s DNA

T

ạ

o cây chuy

ể

n gene

5. Ch

ọ

n l

ọ

c, t

ạ

o dòng và s

ự

bi

ể

u hi

ệ

n gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

K

ỹ

thu

ậ

t và ph

ươ

ng pháp c

ă

n b

ả

n

Screening.swf

5. Ch

ọ

n l

ọ

c, t

ạ

o dòng và s

ự

bi

ể

u hi

ệ

n gene

b) Sự biểu hiện của gene thành protein

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

Ph

ả

n

ứ

ng t

ạ

o chu

ỗ

i nucleotide

(Polymerase Chain Reaction, PCR)

1985, Kary Mullis
1. Nguyên tắc

PCR.swf

PCR dựa trên 3 bướcởnhiệtđộkhác nhau.

1. Biến tính: tạo dâyđơn DNA với nhiệtđộ94oC

2. Bắt cặp: lai giữa primers và DNAđơn. Nhiệtđộkhoảng 50oC

3. Kéo dài : tạo dây DNA bổsung với tácđộng của polymerase và
dNTPs: 72oC.

Lặp lại chu kỳkhoảng 30-40 lần sẽtạo ra sốlượng DNA cần

khuếchđạiđủquan sát trên gel qua quá trìnhđiện di

Polymerase Chain Reaction, PCR

2. Thành phần phản ứng
- Primer

- Polymerase chịu nhiệt
- dNTP

- Dung dịch đệm
- Mẫu
- Dung dịch đệm

Sequencing

1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

Sequencing

1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert
2. Phương pháp didesoxy của F. Sanger

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

1. Khai thác DNA các bộ gene
1.1. Genomics:

- Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng
- Phát hiện, bảo tồn sựđa dạng sinh học, sử dụng chúng.

1.2. Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến

đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng
(function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.
1.3. Human Genome Projet

1.4. Các ngành học khác
- Cellomics
- Metabolomics
- Ionomics

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

2. Công nghệ protein tái tổ hợp
-Sản xuất r-protein

STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent

1 Insulin Tiểu đường 2001

2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung 
thư, ..

2002

3 Interferon beta Xơ cứng 2003

4 Hormon tăng tưởng người Thiểu năng tăng trưởng 2003

5 Erythropoetin Thiếu máu 2004

6 T-PA (tissu plasminogen 
activator)

Nhồi máu cơ tim 2005

7 G-CSF (granulocyte –
COLONY Stimulating Factor

Chemotherapy-induced 
neutropenia

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

3. Chẩn đoán phân tử

- Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản

- DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng
hoặc 2 giống khác nhau.

- Biomarker: dấu chuẩn sinh học

- DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền

- Microarray và Biochips:

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

4. Vi sinh vật chuyển gene

- Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv.

- Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp.

- Công nghệ bề mặt tế bào nấm men.

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

5. Thực vật chuyển gene

- Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh,

- Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa

- Tạo sắc tốở các thực vật chuyển gene

- Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng

- Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu

- Sản xuất dầu nhờn công nghiệp

- Sản xuất plastid

Ứ

ng d

ụ

ng công ngh

ệ

gene

6. Động vật chuyển gene

- Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền,
ung thư,, thối hóa cơ, viêm khớp,…)

- Sản xuất protein tái tổ hợp

- Chăn nuôi gene (gene farming)

7. Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân

* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị

Pharmacogenomics: (Dược học bộ gene)

Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân

Gene therapy:

* Chuyển gen lành thay thế gene sai hỏng
* Thay thế gene

</div>

hoàn toàn miễn phí cập nhật nhanh chóng chính xác chất lượng hiệu quả đáng tin cậy

<b>Công ngh</b>

<b>ệ</b>

<b> DNA tái t</b>

<b>ổ</b>

<b> h</b>

<b>ợ</b>

<b>p</b>

Nguy

ễ

n V

ũ

Phong

L

ị

ch s

ử

hình thành

<b>QUY TRÌNH TIẾN HÀNH</b>

<b>1. Enzyme</b>

<b>1. Enzyme</b>

<b>1. Enzyme</b>

<b>1. Enzyme</b>

<b>1. Enzyme</b>

<b>2. Các vector chuy</b>

<b>ể</b>

<b>n gene</b>

<b>2. Các vector chuy</b>

<b>ể</b>

<b>n gene</b>

<b>2. Các vector chuy</b>

<b>ể</b>

<b>n gene</b>

<b>2. Các vector chuy</b>

<b>ể</b>

<b>n gene</b>

<b>2. Các vector chuy</b>

<b>ể</b>

<b>n gene</b>

<b>3. H</b>

<b>ệ</b>

<b> th</b>

<b>ố</b>

<b>ng t</b>

<b>ế</b>

<b> bào ch</b>

<b>ủ</b>

<b>(Host)</b>

<b>3. H</b>

<b>ệ</b>

<b> th</b>

<b>ố</b>

<b>ng t</b>

<b>ế</b>

<b> bào ch</b>

<b>ủ</b>

<b>(Host)</b>

<b>3. H</b>

<b>ệ</b>

<b> th</b>

<b>ố</b>

<b>ng t</b>

<b>ế</b>

<b> bào ch</b>

<b>ủ</b>

<b>(Host)</b>

1. Lai nucleic acid

Đ

<b>K</b>

<b>ỹ</b>

<b> thu</b>

<b>ậ</b>

<b>t và ph</b>

<b>ươ</b>

<b>ng pháp c</b>

<b>ă</b>

<b>n b</b>

<b>ả</b>

<b>n</b>

2. Thu nh