nghiên cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng bacillus phân lập được từ trùn quế

CHƯƠNG 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU IN VITRO KHẢ NĂNG LÀM
PROBIOTIC CHO TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG
BACILLUS PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ TRÙN QUẾ
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh

TP. HCM, 07/2012


CHƯƠNG 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU IN VITRO KHẢ NĂNG LÀM
PROBIOTIC CHO TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG
BACILLUS PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ TRÙN QUẾ
Mã số:

Thành viên đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh
ThS. Dương Nhật Linh
CN. Đỗ Bảo Ngọc
CN. Trần Thị Khánh Linh

CN. Hà Bảo Yến
TP. HCM, 07/2012


M CL C
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4

1.1. BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [1,8,46] ........................................... 5
1.2. PHƯƠNG ÁN XỬ LÝ BỆNH VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA
VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN [9] .............................. 8
1.2.1. Tác động đến môi trường sinh thái. ................................................................ 9
1.2.2. Ảnh hưởng tới vật nuôi thủy sản ..................................................................... 9
1.2.3. Gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh [9,14] ......................... 10
1.2.4. Ảnh hưởng tới sức khỏe con người ............................................................... 10
1.3. PROBIOTIC - CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN .. 11
1.3.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................. 12
1.3.2. Đặc điểm chung cho probiotic [6], [14] ........................................................ 13
1.3.3. Vai trị của probiotic trong ni trồng thủy sản [5,10,34,41] ....................... 14
1.3.4. Cơ chế tác động của probiotic trong nuôi trồng thủy sản ............................. 16
1.4. VI KHUẨN BACILLUS ........................................................................................ 20
1.4.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus .................................................................. 21
1.4.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng ........................................................................... 22
1.4.3. Quá trình tạo bào tử của Bacillus .................................................................. 22
1.4.4. Một số ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản ............................. 24
1.5. TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG NUÔI
TRỒNG THỦY SẢN.................................................................................................. 25
1.5.1. Trùn quế và phân trùn quế ............................................................................ 25

1.5.2. Ứng dụng của trùn và phân trùn quế trong nuôi trồng thủy sản ................... 27
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 29
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................... 30
i


2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 30
2.1.2. Môi trường .................................................................................................... 31
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ .......................................................................................... 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 33
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 33
2.2.2. Tái phân lập Bacillus spp. ............................................................................. 34
2.2.3. Thử đối kháng ............................................................................................... 35
2.2.4. Thử nghiệm đồng ni cấy [37] .................................................................... 36
2.2.5. Thí nghiệm đánh giá tính an tồn của các chủng Bacillus spp. .................... 37
2.2.6. Xử lý kết quả ................................................................................................. 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................... 42
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP BACILLUS SPP. ............................................................... 43
3.2. KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG .............................................................................. 45
3.2.1. Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vng góc ............................... 45
3.2.2. Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép..................................... 47
3.3. THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY ...................................................................... 52
3.3.1. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V.
parahaemolyticus ......................................................................................... 53
3.3.2. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V. alginolyticus ..... 61
3.3.3. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V. harveyi ............. 68
3.4. THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS
SPP. ............................................................................................................................. 76
3.4.1. Thử khả năng gây dung huyết ....................................................................... 76
3.4.2. Thử nghiệm tính an tồn của các chủng Bacillus spp. lên ấu trùng tôm sú .. 77

3.5. THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG VÀ MẬT ĐỘ GÂY NHIỄM THÍCH
HỢP CỦA CÁC CHỦNG VIBRIO LÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ .............................. 79
ii


3.5.1. Ảnh hưởng của Vibrio parahaemolyticus lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm
sú .................................................................................................................. 79
3.5.2. Ảnh hưởng của Vibrio alginolyticus lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú ..... 81
3.5.3. Ảnh hưởng của Vibrio harveyi lên tỷ lệ sống của ấu trùng tơm sú ............... 82
3.6. THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ CỦA CÁC CHỦNG
BACILLUS SPP. LÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ ........................................................... 83
3.6.1. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại V.
parahaemolyticus ......................................................................................... 84
3.6.2. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại
Vibrio alginolyticus ...................................................................................... 85
3.6.3. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại
Vibrio harveyi............................................................................................... 86
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 88
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................. 89
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 91
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 96

iii


DANH M C CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Kết quả tái phân lập ........................................................................................ 43
Bảng 2.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vng góc..................... 46
Bảng 2.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép. ......................... 48

Bảng 2.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 53
Bảng 2.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 54
Bảng 2.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 55
Bảng 2.7 Kết quả đồng ni cấy chủng vi khuẩn F27 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 57
Bảng 2.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) .................................................................................. 58
Bảng 2.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 59
Bảng 2.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 61
Bảng 2.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. alginolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) .................................................................................. 62
Bảng 2.12 Kết quả đồng ni cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 63
Bảng 2.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. alginolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 64
Bảng 2.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. alginolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 65
Bảng 2.15 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 66
Bảng 2.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 68
Bảng 2.17 Kết quả đồng ni cấy chủng vi khuẩn F10 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 69
Bảng 2.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 70

Bảng 2.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 71
Bảng 2.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. harveyi ........................... 72
iv


Bảng 2.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 73
Bảng 2.22 Kết quả khả năng gây dung huyết ................................................................ 76
Bảng 2.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus spp. ................ 78
Bảng 2.24 Tỷ lệ sống (%) của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Vibrio spp. ............ 79
Bảng 2.25 Tỷ lệ sống (%) của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ ở thí nghiệm ....................... 83

v


DANH M C CÁC ĐỒ THỊ
Biểu đồ 2.1 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V.
parahaemolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ ............................. 50
Biểu đồ 2.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V.
alginolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ ..................................... 50
Biểu đồ 2.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V. harveyi
theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ .......................................................... 51
Biểu đồ 2.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F2 ở những mật độ khác nhau .......................................................... 54
Biểu đồ 2.5 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F10 ở những mật độ khác nhau. ........................................................ 55
Biểu đồ 2.6 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F11 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 56
Biểu đồ 2.7 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với

chủng F27 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 57
Biểu đồ 2.8 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F28 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 58
Biểu đồ 2.9 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với
chủng F33 ở những mật độ khác nhau. ........................................................ 60
Biểu đồ 2.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F2 ở những mật độ khác nhau ..................................................................... 62
Biểu đồ 2.11 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F10 ở những mật độ khác nhau. ................................................................... 63
Biểu đồ 2.12 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F11 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 64
Biểu đồ 2.13 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F27 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 65
Biểu đồ 2.14 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F28 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 66
Biểu đồ 2.15 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng
F33 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 67
Biểu đồ 2.16 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 69
Biểu đồ 2.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 70
Biểu đồ 2.18 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 71
Biểu đồ 2.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 72
vi


Biểu đồ 2.20 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 73

Biểu đồ 2.21 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở
những mật độ khác nhau ............................................................................. 74
Biểu đồ 2.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus spp. ............ 78
Biểu đồ 2.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung
V.parahaemolyticus .................................................................................... 80
Biểu đồ 2.24 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung V.alginolyticus ........ 81
Biểu đồ 2.25 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung V. harveyi ................ 82
Biểu đồ 2.26 Khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. chống lại V.
parahaemolyticus ........................................................................................ 84
Biểu đồ 2.27 Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú bởi các chủng Bacillus spp. chống
lại V. alginolyticus ...................................................................................... 85
Biểu đồ 2.28 Khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. chống lại V. harveyi ........ 86

vii


DANH M C CÁC H NH

Hình 1.1. Bệnh phát sáng ở tơm [40] ............................................................................... 8
Hình 1.2. Sự tương tác của hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi trồng thủy sản [34] .. 15
Hình 1.3. Mặt cắt ngang của bảo tử B. subtilis ............ Error! Bookmark not defined.
Hình 2.1Quy trình thí nghiệm ........................................................................................ 33
Hình 2.2 Phương pháp cấy vạch thẳng vng góc......................................................... 36
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng ni cấy ........................................................... 37
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an tồn của các chủng vi khuẩn thử
nghiệm lên ấu trùng tơm sú ........................................................................ 38
Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng và mật độ gây nhiễm thích hợp của
các chủng Vibrio spp. lên ấu trùng tơm sú ................................................. 40
Hình 2.6 Sơ đồ thí nghiệm khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. lên ấu
trùng tơm sú. ............................................................................................... 40

Hình 2.7 Thuần hóa tơm
Hình 2.8 Tồn cảnh bố trí thí nghiệm .................... 41
Hình 2.9 Hộp bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 41
Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus spp. trên NA sau 24h nuôi cấy. ........................ 45
Hình 3.2 Nhuộm gram Bacillus spp. .............................................................................. 45
Hình 3.3 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ................................. 47
Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép .......... 52
Hình 3.5 Khuẩn lạc Vibrio spp. khi trãi trênTCBS ........................................................ 76
Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết............................................................. 77

viii


DANH M C CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

One-way analysis of variance

CFU

Đơn vị khuẩn lạc

Cs

Cộng sự

DC

Đối chứng

LB

Luria Bertani

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

PL

Postlarvae (hậu ấu trùng)

TCBS

Thiosulphate citrate bile salts sucrose

ix


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

_______________

_________________

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thơng tin chung:
-

Tên đề tài: nghiên cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một
số chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế

-

Mã số:

-

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh

-

Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ sinh học

-

Thời gian thực hiện: 7/2011-7/2012

2. Mục tiêu: đánh giá in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng
Bacillus phân lập được từ trùn quế

3. Tính mới và sáng tạo:
- Chưa có cơng trình khoa học nào đề cập đến tuyển chọn vi khuẩn tiềm năng
probiotic từ trùn quế. Kết quả nghiên cứu trên sẽ góp phần cung cấp thêm cơ sở
khoa học cho vai trị và tác dụng của trùn quế trong ni trồng thuỷ sản.
- Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này có tính mới, chưa được tác nào
trong nước sử dụng để nghiên cứu và công bố.
4. Kết quả nghiên cứu: thu được 03 chủng Bacillus (F11, F10 và F2) có khả năng kiểm
sốt đồng thời 3 chủng Vibrio gây bệnh và an tồn đối với ấu trùng tơm sú.
5. Sản phẩm:
- Sản phẩm khoa học:
+ 03 chủng Bacillus (F11, F10 và F2) có khả năng kiểm sốt đồng thời 3
chủng Vibrio gây bệnh và an toàn đối với ấu trùng tôm sú.
x


+ 01 bài báo cáo oral “khả năng kiểm soát Vibrio gây bệnh của một số
chủng Bacillu phân lập từ trùn quế” tại Hội nghị Cơng nghệ Sinh học
tồn quốc Khu vực phía Nam lần thứ II năm 2011 và bài này cũng đã
đăng trên tạp chí khoa học Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn.
+ 01 bài báo khoa học “nghiên cứu tính an tồn và khả năng bảo vệ ấu
trùng tôm sú của một số chủng Bacillus phân lập từ trùn quế trong
điều kiện phịng thí nghiệm” sẽ đăng trên tạp chí Khoa học Trường ĐH
Mở TPHCM (đã phản biện, nhận bài và chờ xuất bản).
- Sản phẩm đào tạo:
+ Hỗ trợ đào tạo 03 cử nhân Công nghệ sinh học chuyên ngành vi sinh
+ Sản phẩm khác: một số hình ảnh và kết quả nghiên cứu được dùng trong
bài giảng lý thuyết môn vi sinh ứng dụng (chương ứng dụng vi sinh vật
trong nuôi trồng thuỷ sản).
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp
dụng:

- Tiếp tục nghiên cứu thêm 1 vài nội dung để hoàn thiện sản phẩm.
- Viết một số bài báo đăng trên tạp chí về nơng nghiệp, thủy sản nhằm
thông tin các kết quả nghiên cứu.
- Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất chế phẩm phục
vụ nuôi trồng thuỷ sản.
Cơ quan chủ trì xác nhận

Ngày 03 tháng 08 năm 2012

KT. HIỆU TRƯỞNG

Chủ nhiệm đề tài

PHÓ HIỆU TRƯỞNG

(Ký, Họ và tên)
Nguyễn Văn Minh
xi


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
-

Project title: In vitro evaluation of probiotic potential for shrimp
aquaculture of Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus

-

Code number:

-

Coordinator: Nguyen Van Minh, M.Sc

-

Implementing institution: Faculty of Biotechnology – Ho Chi Minh City Open
University

-

Duration: from July 2011 to July 2012

2. Objective(s): In vitro evaluation of probiotic potential for shrimp aquaculture
of Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus
3. Creativeness and innovativeness:
- No scientific research referring to the selection of potential probiotic bacteria
from Perionyx excavates. This research results will contribute to provide further
scientific basis for the role and effects of Perionyx excavates in aquaculture.
-

The methods used in this study are new and have not used, researched and
published by any domestic work.

4. Research results: Bacillus strains (F10, F11 and F2) have been recognized to be
safe for black tiger shrimp larvae and have protected them against three pathogenic
Vibrios.
5. Products:
- Scientific products:

+ The three Bacillus strains (F10, F11 and F2) have been recognized to be
safe for black tiger shrimp larvae and have protected them against three
pathogenic Vibrios.
xii


+ One (01) oral report regarding to “Control of pathogenic Vibrio spp. by
Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus” has been presented at the
2nd National Biotechnology Conference in Southern of Vietnam in 2011
and published in Journal of Agricultural and Rural Development.
+ One (01) article “In vitro evaluation of safety and protection capability of
some Bacillus strains isolated from Perionyx excavatus on black tiger
shrimp larvae” that will be published in Journal of science of Ho Chi
Minh City Open University. (accepted).
- Training products:
+ Trained three (03) Bachelors of Biotechnology (major in microbiology).
+ Other products: some images and research results are used in teaching
microbiological

applications’

theory

(Chapter

-

application

of

microorganisms in aquaculture).
6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
 Continuing further research to improve our products.
 Results of this study will be communicated and published in the Journal of
Agriculture or Aquaculture.
 Transfer the research results to organizations for producing bio-products served
in aquaculture.

xiii


ĐẶT VẤN ĐỀ

1


Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế
quốc dân và thu hút nhiều lao động. Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản
nói chung và ni trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ.
Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề ni tơm ở
Việt Nam cịn nhiều vấn đề tồn đọng mà quan trọng nhất là dịch bệnh đã gây nhiều
tổn thất cho người ni tơm nói riêng và ngành thủy sản nói chung. Tình trạng ơ
nhiễm mơi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do phần lớn
các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao
ni.
Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi
khuẩn Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tơm sú,
trong nhóm này có V. harveyi và V. parahaemolyticus là các lịai vi khuẩn có độc
lực cao, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tơm sú. Các lịai Vibrio spp. khác như: V.

vulnificus, V. alginolyticus, V. splendidus, được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ
hội trên tôm sú thương phẩm. Khi Vibrio spp. xuất hiện trong nước với mật độ cao,
có thể gây chết hàng loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 %. [3, 7]
Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩm
thủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh
tế. Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây
bệnh cũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm
bảo được sự phát triển bền vững.
Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thế
kháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường trong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng
vững chắc cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Khác với biện
pháp hóa học và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn,
bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc
sử dụng các men vi sinh để cải thiện mơi trường ni thủy sản nói chung và ni
tơm nói riêng cịn tương đối ít. Trong những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép
2


lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng
các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt.
Mơ hình ni tơm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 của Trung tâm
nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ ni trồng thủy sản Sóc Trăng góp phần đưa
năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ ni tơm có xử lý
chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc
phục được nhiều khó khăn về thời tiết, mơi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng
năng suất.[39]. Ở Cà Mau, việc áp dụng mơ hình ni tôm bằng chế phẩm EM.ZEO
bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tơm
khoẻ mạnh mà hồn tồn khơng sử dụng các loại hố chất độc hại, kháng sinh.
Trong suốt q trình ni, tơm phát triển tốt và khơng bị nhiễm bệnh.[45]

Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản. Nhưng Bacillus spp. vẫn được xem là đối tượng quan
trọng vì đã có nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus spp. giúp thủy
sản sinh trưởng nhanh, tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được
báo cáo nhiều nhất là khả năng đối kháng với Vibrio spp. và khả năng tạo bào tử
của nó.
Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số
chủng Bacillus spp. phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu
muối mật, pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây
bệnh cho động vật thủy sản [4]. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên

cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng
Bacillus phân lập được từ trùn quế”
Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus spp. đã được phân lập từ trùn quế
tiếp tục được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio spp. gây
bệnh và đánh giá tính an tồn đối với ấu trùng tơm sú trong điều kiện phịng thí
nghiệm. Thành cơng của đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển
thành chế phẩm vi sinh trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm
Vibrio spp. gây ra trong các trại sản xuất tôm giống hay tôm nuôi công nghiệp.
3


CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


2.1. BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [1,8,46]
Vibriosis được dùng để chỉ tất cả các dạng nhiễm khuẩn do vi khuẩn thuộc

giống Vibrio gây ra và gây bệnh phổ biến nhất đối với tơm.
Vibrio sp. tìm thấy phổ biến ở trong nước biển và ven bờ, trong nước bể
ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ương ấu trùng. Hầu hết các lồi Vibrio đều cần
có muối để phát triển. Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và
nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối, chúng không phát triển trong môi trường không
muối. Một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển.
Sự hiện diện của Vibrio sp. trong ao nuôi như là quần thể vi khuẩn tự nhiên,
hầu hết các Vibrio sp. là tác nhân gây bệnh cơ hội, khi tôm bị sốc do môi trường
biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, ký sinh trùng. Tơm yếu
khơng có sức đề kháng, các lồi vi khuẩn Vibrio sp. có cơ hội gây bệnh nặng, tơm
sẽ chết từ rải rác tới hàng loạt. Tuy nhiên, một số lồi như V.harveyi lại là tác nhân
gây bệnh chính, đây là lồi vi khuẩn gây bệnh phát sáng, chúng có thể gây chết
hàng loạt ở các bể ấp trứng tôm ở Châu Á.
Khó có thể chỉ định lồi nào của nhóm Vibrio gây bệnh nhiều hay ít vì khả
năng gây bệnh rất khác nhau giữa các loài. Trong hầu hết các trường hợp, tôm
thường bị hại ở một mức độ nào đó trước khi bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, có những
chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh khi chỉ cần những bất lợi ở mức thấp của điều kiện
môi trường. Những chủng khác chỉ gây bệnh khi tôm đã bị tổn thương nghiêm
trọng.
Có nhiều dạng nhiễm bệnh Vibrio:
-

Dạng cấp tính cục bộ hay tồn bộ.

-

Dạng mãng tính cục bộ hay tồn bộ.

Một số dạng bệnh bộc phát được gọi bằng những tên riêng, chẳng hạn như
“hội chứng tôm chết sau một tháng tuổi” thường được xem là bệnh do Vibrio spp,

và các dạng nhiễm khuẩn khác có liên quan đến sự suy thối mơi trường ao ni.
Nếu để tảo đáy phát triển ở ao trong thời kỳ đầu của chu kỳ ni thì chúng có thể bị
phân hủy sau đó. Lúc này, tơm có khuynh hướng tiếp xúc với lớp vật chất đang
5


phân hủy này sau khi lột xác và chúng gặp phải các điều kiện mơi trường bất lợi và
có nhiều vi khuẩn, làm cho một số lớn tôm bị tổn thương ở vỏ hay bị nhiễm khuẩn
toàn thân thường khoảng một tháng sau khi thả nuôi.
Bệnh “mảng đen” (Black splinter) thường được dùng để mô tả một dạng tổn
thương mãng tính có màu đen xuất hiện ở phần cơ bụng. Ở miền Nam và miền
Trung của châu Mỹ, một vài dạng bệnh Vibrio được mô tả như là “hội chứng
bilitos” (bilitos là thuật ngữ Tây Ban Nha) và “hội chứng seagull”. “ Hội chứng
Bilitos” là tình trạng của các mảng biểu mơ nhỏ hình cầu bị tróc ra ở trong ruột, còn
“ Hội chứng seagull” là hiện tượng những con tôm sắp chết ở gần mặt ao trở thành
mồi hấp dẫn những con chim mịng biển (seagull).
Một vài lồi trong giống Vibrio phát sáng. Nếu chúng hiện diện với số lượng
lớn, có thể làm những tơm bị nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối. Dạng nhiễm
khuẩn này thường thấy ở trại giống, nhưng cũng đang trở nên phổ biến ở các ao
nuôi và được gọi là “hội chứng vi khuẩn phát sáng”. Nên phân biệt hiện tượng này
với hiện tượng phát quang do nhiều loài tảo khuê gây ra và thường khơng có hại đối
với tơm ni.
Mối quan hệ giữa bệnh “Vibrio” với một vài trường hợp khác hiện vẫn chưa
rõ. Chẳng hạn, một vài trường hợp được gọi là bệnh hoại tử gan tụy mà hậu quả của
nó là phần lớn gan tụy bị phá hủy, teo đi và trở nên sẫm màu hơn. Trong nhiều
trường hợp, hiện tượng này giống như một dạng của bệnh Vibrio mãn tính, trong
khi đó những báo cáo khác mơ tả bệnh lý tương tự có liên quan tới các chất độc
(aflatoxin) trong thức ăn hay có khi do một vài lồi vi khuẩn nào đó.
Nhiễm khuẩn tồn bộ tức là vi khuẩn có mặt khắp cơ thể tơm, tuy nhiên
khơng phổ biến lắm. Khi hiện tượng nhiễm khuẩn thật sự xảy ra, thường liên quan

tới chất lượng nước xấu hay những bệnh khác. Ở dạng cấp tính, các dấu hiệu bệnh
thường khơng đặc thù, bao gồm: bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi
màu đỏ hoặc xanh.

6


Nếu bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường xấu hay vi khuẩn có khả năng
gây bệnh cao, tơm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn. Nếu không chết, vi khuẩn
có thể bị loại hay bệnh sẽ chuyển thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính.
Hiện tượng nhiễm bệnh mãn tính thường tạo thành những khối u màu đen
trong cơ, và chỉ có thể phát hiện chúng bằng phương pháp mơ học. Những dấu hiệu
bên ngồi của các bệnh trên có liên quan với bất cứ hình thức nhiễm bệnh mãn tính
ở tơm, ví dụ, tập tính sống khác thường, “ đóng rong” và có màu sắc lạ.
Bệnh Vibrio thường xuất hiện trong mối tương quan với những vấn đề khác
mà có thể nói rằng bất cứ tơm chết hay sắp chết cũng đều có nhiễm một vài dạng
của Vibrio. Phát hiện ra vi khuẩn thì tương đối dễ nhưng xác định ảnh hưởng của nó
đối với vấn đề bệnh thì lại khó. Chẳng hạn, một số trường hợp vi khuẩn chỉ là điều
kiện thứ yếu làm cho môi trường nuôi trở nên xấu mà không thực sự ảnh hưởng đến
mức độ chết của tôm. Trong trường hợp khác, vi khuẩn là tác nhân gây bệnh và là
nguyên nhân gây chết chủ yếu.
Hiện tượng hai trường hợp trên không dễ phân biệt. Nếu chỉ có một lồi vi
khuẩn cơ hội với khả năng gây bệnh kém thì khơng phải tất cả tơm đều bị nhiễm
bệnh, có khi có nhiều lồi vi khuẩn được phân lập từ những tôm khác nhau, cũng có
khi bằng chứng của vấn đề lại đối lập nhau.
Nếu vi khuẩn là một tác nhân gây bệnh quan trọng thì nên phân lập chúng từ
tất cả hay đa số các tôm bị nhiễm bệnh và phương thức mô học có thể giúp thêm
chứng cớ cho trường hợp nhiễm khuẩn này. Tỉ lệ chết của tôm không phải là dấu
hiệu đặc trưng về tính tự nhiên của bệnh vì tơm chết từ từ hay chết nhanh cịn có thể
là do điều kiện môi trường xấu hoặc do vi khuẩn.

Đối với tôm Vibrio sp. gây một số bệnh như: bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn
mòn vỏ kitin. Một số loài gây bệnh như: V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V.
harveyi, V. vulnificus, V. anguillarum.
Gần đây, theo bản tin điện tử của Tổng cục Thuỷ sản thì khi khuẩn Vibrio
fischeri là tác nhân chính gây bệnh và chết hàng loạt cho tơm thẻ chân trắng nuôi
công nghiệp tại huyện Tiên Lãng, Hãi Phòng. [46]
7


Hình 1.1. Bệnh phát sáng ở tơm [40]

2.2. PHƯƠNG ÁN XỬ LÝ BỆNH VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG TIÊU
CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NI TRỒNG
THỦY SẢN [9]
Trong ni trồng thủy sản với quy mô công nghiệp, để tiêu diệt tác nhân gây
bệnh, nâng cao sức khỏe vật nuôi và quản lý điều kiện mơi trường thì khơng thể
tránh khỏi việc dùng thuốc.
Để xử lý các bệnh ở tơm, có thể dùng các loại thuốc kháng sinh, chất sát
khuẩn phổ biến như: bioxide, oxolinic, povidine, aquaclean,…
Dùng formalan diệt zoothamnium vào ban đêm trong trường hợp bệnh đóng
rong ở tơm.
Tuy nhiên, ngồi những tác dụng chính của thuốc cịn có các tác dụng phụ
như ảnh hưởng tới sức khỏe vật nuôi, sinh thái môi trường, chất lượng sản phẩm và
sức khỏe con người. Trong số các loại thuốc đã và được sử dụng phổ biến, thuốc sát
trùng, thuốc diệt địch hại và thuốc kháng sinh thường có tác dụng tiêu cực rõ rệt
hơn các chủng loại khác
Theo tác giả Nguyễn Thị Hải Yến (2001) cho biết, khi điều tra 55 trại sản
xuất giống tại Khánh Hịa, đã có 134 loại hóa chất, kháng sinh được sử dụng và khi
8

điều tra trên gần 5000 ha nuôi tôm thương phẩm, trong một vụ nuôi khoảng 4 - 5
tháng, người ta đã sử dụng 426 tấn Chlorine, 345,892 lít Formol, 86 tấn thuốc tím,
46,7 tấn Iodine và 6,8 tấn malachite.
Theo Tạ Khắc Thường (2001), điều tra trên diện tích 668,5 ha nuôi tôm xung
quanh đầm Phả Lại ở tỉnh Ninh Thuận cho biết, mỗi năm, người dân ở đây đã sử
dụng 795 tấn vơi các loại, 15 000 lít Formol, 86 tấn thuốc tím, và 100 tấn thuốc diệt
cá.
Ngồi sử dụng các loại thuốc hóa học, việc sử dụng các vi sinh vật có lợi để
phân hủy các chất hữu cơ dư thừa (Bacillus subtilis1070 hoặc BS-I) cũng được xem
là một trong những biện pháp hiệu quả trong việc phòng và điều trị bệnh cho tôm
nhưng chưa được người dân sử dụng rộng rãi do hiểu biết hạn chế về cơ chế tác
động và hiệu quả của các chế phẩm sinh học.
Những tác động tiêu cực đáng lưu ý do việc sử dụng thuốc trong nuôi trồng
thủy sản gây ra:
2.2.1. Tác động đến mơi trường sinh thái.
Khi dùng một số hóa chất có khả năng diệt trùng cao, phổ diệt trùng rộng như:
nuvan, aquaguar, formol, sulphate đồng, iodine... diệt ký sinh trùng trong các ao
ni cá, tơm, có thể tiêu diệt ln cả những động vật, thực vật có lợi trong ao ni:
có thể gây tảo tàn, gây nghèo sinh vật phù du và sinh vật đáy.
Khi dùng các loại kháng sinh để phịng và trị bệnh nhiễm khuẩn trong ni
trồng thuỷ sản bằng các phương pháp cho ăn (nuôi thương phẩm) và cho vào môi
trường (với sản xuất ấu trùng), một phần kháng sinh không được vật nuôi hấp thụ,
tồn đọng môi trường nuôi, rồi theo nguồn nước thải ra môi trường xung quanh, gây
tác động đáng kể đến môi trường quanh khu vực nuôi.
2.2.2. Ảnh hưởng tới vật nuôi thủy sản
Ngồi những tác động xấu đến mơi trường, những loại thuốc dùng trong nuôi
trồng thủy sản để tiêu diệt tác nhân gây bệnh hoặc địch hại, cịn có những tác động
9

tiêu cực đến sức khỏe vật ni, kháng sinh só thể gây độc cho gan, thận, và tiêu diệt
những vi khuẩn có lợi trong đường ruột, làm giảm đi khả năng tiêu hóa và hấp thụ
thức ăn của vật ni, gây hiện tượng chậm lớn, còi cọc.
Tại việt Nam, để phịng bệnh nhiễm khuẩn trong q trình sản xuất, người ta
thường dùng nhiều loại kháng sinh liên tục trong suốt quá trình ương ấp mặc dù vẫn
xảy ra tình trạng dịch bệnh trong tại giống, mặt khác, việc sử dụng nhiều loại kháng
sinh liên tục còn làm giảm sức khỏe của đàn giống, khi thả chúng ra ao nuôi thương
phẩm, những con giống này sẽ mẫn cảm hơn với tác nhân gây bệnh.
2.2.3. Gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh [9,14]
Hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi sử dụng một loại thuốc quá lâu, sử dụng
không đúng liều lượng, thời điểm trong q trình ni trồng thủy sản.
Kháng kháng sinh là một loại kháng thuốc mà một vi sinh vật có thể tồn tại
khi tiếp xúc với một kháng sinh. Khi vi khuẩn gây bệnh chịu tác động thường
xuyên, lặp đi lặp lại nhiều lần và kéo dài của một loại thuốc kháng sinh nào đó,
kháng sinh này sẽ tác động vào vật chất di truyền nằm bên trong nguyên sinh chất
của tế bào vi khuẩn gây bệnh, làm xuất hiện gen kháng. Gen kháng này có thể di
truyền cho thế hệ sau hoặc ttruyền ngang giữa các tế bào vi khuẩn thông qua tiếp
hợp, tải nạp. Khi đã xảy ra hiện tượng kháng thuốc thì sẽ gặp nhiều khó khăn trong
việc phịng và điều tri bệnh cho vật ni, dễ bùng phát các trận dịch khó kiểm soát,
gây thiệt hại kinh tế.
Ở Việt Nam, hiện tượng lạm dụng thuốc kháng sinh rất phổ biến, đặc biệt là
trong khâu sản xuất tôm giống. Do việc dùng tùy tiện các loại kháng sinh cho người
dể điều trị bệnh cho tôm, sử dụng không đúng liều lượng, cách thức nên hiện tượng
kháng thuốc là rất phổ biến. Cho đến nay, vi khuẩn gây bệnh phát sáng Vibrio
harveyi ở ấu trùng tôm sú gần như đã kháng với hầu hết các loại kháng sinh.
2.2.4. Ảnh hưởng tới sức khỏe con người
Ảnh hưởng trước tiên và trực tiếp của việc sử dụng thuốc là lên sức khỏe của
10