Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (tamarindus indica l ) việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BÙI NGỌC TÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ
HẠT ME (TAMARINDUS INDICA L.) VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

Hà Nội – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BÙI NGỌC TÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ
HẠT ME (TAMARINDUS INDICA L.) VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62440114

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. THÀNH THỊ THU THỦY
2. TS. NGUYỄN TUẤN ANH

Hà Nội – 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do tôi thực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy và TS. Nguyễn Tuấn Anh. Các số
liệu và kết quả trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chƣa từng đƣợc tác giả
khác công bố.
Hà Nội, ngày
TM Tập thể hƣớng dẫn

tháng

Nghiên cứu sinh

Bùi Ngọc Tân

i

năm 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình nghiên cứu và hồn thành luận án này, tôi đã nhận đƣợc rất
nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều
lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp.
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thành Thị Thu
Thủy, TS. Nguyễn Tuấn Anh - ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tơi trong
suốt q trình học tập và thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án này, đã cho

tơi những lời khun bổ ích, những lời động viên trong những lúc tơi gặp khó khăn
và truyền cho tơi lịng say mê khoa học.
Tiếp theo, tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt
của các cô chú, các anh chị em tại:
- Trung tâm các phƣơng pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
- Bộ môn Hữu cơ - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội.
- Bộ mơn Hóa học - trƣờng Đại học Y Dƣợc Hải Phịng.
- Phịng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng công nghệ Nha Trang.
- Phịng Thử nghiệm Sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Dự án Hộ trợ Nguồn nhân lực Y tế (ADB) - Bộ Y tế
- GS. Yoshiaki Yuguchi tại Đại học Osaka – Nhật Bản.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện Đào
tạo sau Đai học - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân và bạn
bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và hồn
thành luận án.
Tác giả luận án

Bùi Ngọc Tân

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii

DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... x
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Polysaccharide và lớp chất Xyloglucan .......................................................... 3
1.2. Polysaccharide từ quả me ................................................................................ 8
1.2.1. Vài nét về cây me ..................................................................................... 8
1.2.2. Cấu trúc hóa học và ứng dụng của polysaccharide từ quả me ............... 11
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc liên quan đến nội dung nghiên
cứu của luận án ..................................................................................................... 13
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc .......................................................... 13
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 20
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 21
2.1. Phƣơng pháp chiết tách ................................................................................. 21
2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc ..................................................................... 21
2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ............................................. 21
2.2.2. Phƣơng pháp phổ IR .............................................................................. 22
2.2.3. Phƣơng pháp phổ NMR. ........................................................................ 23
............................................................................ 26
2.2.5. Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .... 29
2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học .............................................................. 32
2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ......................................................................... 32
2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa ........................................................................ 33
2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................................................... 35
2.3.4. Hoạt tính chống đơng tụ máu ................................................................. 36
2.3.5. Hoạt tính ly giải cục máu đơng .............................................................. 36
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM................................................................................ 38
iii

3.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................... 38
3.2. Thu hái, định danh và xử lý mẫu quả me ...................................................... 39
3.2.1. Thu hái và định danh ............................................................................. 39
3.2.2 Xử lý mẫu ............................................................................................... 39
3.3. Chiết tách và tinh chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) từ thịt và hạt me
.............................................................................................................................. 39
3.3.1. Xác định thành phần hóa học của thịt và hạt me ................................... 39
3.3.2. Chiết tách và tinh chế TSP từ thịt và hạt me ......................................... 41
3.4. Điều chế dẫn xuất .......................................................................................... 43
3.4.1. Sulfate hóa ............................................................................................. 43
3.4.2. Acetyl hóa .............................................................................................. 46
3.5. Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của TSP ....................................... 49
3.5.1. Xác định thành phần đƣờng ................................................................... 49
3.5.2. GPC ........................................................................................................ 49
3.5.3. Phổ IR .................................................................................................... 49
3.5.4. Phổ NMR ............................................................................................... 49
3.5.5. Phổ MS................................................................................................... 50
3.5.6. Phƣơng pháp SEM ................................................................................. 50
3.5.7. Phƣơng pháp LS..................................................................................... 50
3.5.8. Phƣơng pháp SAXS ............................................................................... 50
3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học ........................................................................... 51
3.6.1. Hoạt tính gây độc tế bào ........................................................................ 51
3.6.2. Hoạt tính chống oxy hóa ........................................................................ 52
3.6.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................................................... 53
3.6.4. Hoạt tính chống đơng tụ máu ................................................................. 54
3.6.5. Hoạt tính ly giải cục máu đông .............................................................. 54
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 55
4.1. Xác định thành phần chính của thịt và hạt quả me ....................................... 55
4.2. Lựa chọn quy trình chiết tách và mẫu nghiên cứu ........................................ 56

4.3. Xác định cấu trúc của TSP ............................................................................ 59
4.4. Điều chế dẫn xuất .......................................................................................... 81
iv


4.4.1. Dẫn xuất TSPS ........................................................................................... 81
4.4.2. Dẫn xuất TSPA .......................................................................................... 88
4.5. Đánh giá hoạt tính sinh học và ảnh hƣởng của mức độ sulfate hóa và acetyl
hóa đến hoạt tính của TSP và các dẫn xuất .......................................................... 94
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 102
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 104
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU.............................................. 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 106
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 120

v


DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh
Association of Official Analytical
Chemist
Arabinopyranose

Diễn giải

Carbon-13 nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
carbon 13

COSY

Correlation spectroscopy

Phổ COSY

CS%

Cell survival %

% tế bào sống sót

DA

Mức độ acetyl hóa

DMSO
DPPH
DS
EC50

Degree of Acetylation
Distortionless enhancement by
polarisation transfer
Dimethyl sulfoxide
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

Degree of Sulfation
Effective Concentration 50%

ESI-MS

Electron spray ionization mass spectra Phổ khối lƣợng ESI-MS

Fucp
Gal
Galp
Glc
Glcp
GPC

Fucopyranose
Galactose
Galactopyranose
Glucose
Glucopyranose
Gel Permeation Chromatography
Proton nuclear magnetic resonance
spectroscopy
Human cervical cell cancer
Human hepatocellular carcinoma

AOAC
Arap
13

C-NMR

DEPT

1

H-NMR

HeLa
Hep-G2
HMBC
HPLC
HR-ESI-MS
HSQC

Heteronuclear Mutiple Mond
Correlation
High Performance liquid
Chromatography
High resolution electrospray
ionization mass spectrum
Heteronuclear Single-Quantum
correlation

vi

Hiệp hội hóa học phân tích

Phổ DEPT

Mức độ sulfate hóa

Nồng độ có hiệu quả 50%

Sắc ký thẩm thấu gel
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
proton
Ung thƣ cổ tử cung
Ung thƣ gan ngƣời
Phổ HMBC
Sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao
Phổ khối lƣợng phân giải cao HRESI-MS
Phổ HSQC


IC50

Inhibitory concentration at 50%

IR
KB

Infrared spectroscopy
Human epidemoid carcinoma

LD50

lethal dose 50%

LS
MCF7

Light Scattering
Michigan cancer foundation-7

Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng
thử nghiệm
Phổ hồng ngoại
Ung thƣ biểu mô ngƣời
Liều gây chết 50% động vật thực
nghiệm
Tán xạ ánh sáng
Ung thƣ vú ngƣời

MIC

Minimum inhibitory concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu
Phổ NOESY

OD

Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy
Optical density

ROESY

Rotating-Frame NOE Spectroscopy

Phổ ROESY

SAXS
SC%
SEM
SRB
TCA
TFA
TKP
TMS
TSP

Small Angle X-ray scattering
% scavenging capacity
Scanning Electron Microscope
Sulforhodamine B
Trichloracetic acid
Trifluoroacetic acid
Tamarind kender power
Tetramethylsilane
Tamarind Seed Polysaccharide

Tán xạ tia X góc nhỏ
% khả năng trung hòa gốc tự do
Hiển vi điện tử quét

TSPA

Acetyl Tamarind Seed Polysaccharide

TSP acetyl hóa

NOESY

TSPS
WHO
XyG
Xyl
Xylp

Sulfated Tamarind Seed
Polysaccharide
World Health Organization
Xyloglucan
Xylose
Xylosepyranose

vii

Mật độ quang học

Acid trichloracetic
Acid trifluoroacetic
Bột hạt me
Polysaccharide từ hạt me

TSP sulfate hóa
Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số monosaccharide của polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật
Bảng 2.1. Một số nhóm đặc trƣng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của
polysaccharide
Bảng 2.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng
glucose, galactose và xylose dung môi D2O
Bảng 2.3. Thông số

đối với một số dạng cấu trúc polymer

Bảng 3.1. Ký hiệu mẫu và tỉ lệ số mol các chất tạo tác nhân sulfate hóa
Bảng 3.2. Ký hiệu mẫu và nồng độ tác nhân acetyl hóa
Bảng 4.1. Thành phần chính của thịt và hạt của quả me
Bảng 4.2. Hiệu suất chiết tách TSP (% khối lƣợng)
Bảng 4.3. Thành phần đƣờng của TSPchiết từ hạt và thịt me
Bảng 4.4. Thành phần đƣờng của TSP
Bảng 4.5. Trọng lƣợng phân tử và thành phần đƣờng của TSP
Bảng 4.6. Kết quả phân tích thành phần phổ IR của TSP
Bảng 4.7. Độ dịch chuyển hóa học phổ 1H và 13C NMR của TSP
Bảng 4.8. Phổ ESI-MS của TSP-oligosaccharide
Bảng 4.9. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1224
Bảng 4.10. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1077
Bảng 4.11. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1011
Bảng 4.12. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 457
Bảng 4.13. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 413
Bảng 4.14. Kết quả từ phép đo LS của TSP
Bảng 4.15. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ số mol tác nhân sulfate với DS
Bảng 4.16. Kết quả phân tích phổ IR của TSPS4
Bảng 4.17. Kết quả từ phép đo LS của TSP và TSPS4
Bảng 4.18. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ số mol acetyl với DA
Bảng 4.19. Kết quả phân tích phổ IR của TSPA4

Bảng 4.20. Giá trị IC50 hoạt tính gây độc tế bào ( g/ml)
Bảng 4.21. Kết quả hoạt tính khử sắt và chống oxy hóa tổng số
Bảng 4.22. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
viii


4.23

ạt tính chống đơng tụ máu

4. Kết quả hoạt tính ly giải cục máu đông

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP)
Hình 2.1. Sơ đồ khối của thiết bị GPC
Hình 2.2. a) Phổ 1H-NMR của (1 3) và (1

4) -D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của

(1 3) và (1 4) -D-glucan
Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong polysaccharide
Hình 2.4. Phổ khối của poysaccharide và dẫn xuất (anion, cation và benzyl amin) đo
bằng a) MALDI-ToF-MS và b) ESI–MS
Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate
Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát về phổ khối nhiều lần
Hình 2.7. Qui trình đánh giá khả năng ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế

bào
Hình 3.1. Quả của cây me (Tamarindus indica L.) thu hái tại huyện Thủy Ngun,
Hải Phịng
Hình 3.2. Sơ đồ chiết tách TSP từ hạt me
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình tạo TSPS
Hình 3.4. Sơ đồ phản ứng tạo TSPA
Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt me
Hình 4.2. Sắc đồ GPC của mẫu TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt quả me
Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của TSP chiết tách theo a) quy trình 1,b) quy trình 2, c) quy
trình 3
Hình 4.4 Phổ IR của TSP (KBr)
Hình 4.5 Phổ a) 1H-NMR b) 13C-NMR của TSP
Hình 4.6. Phổ COSY của TSP
Hình 4.7. Phổ HSQC của TSP
Hình 4.8. Phổ HMBC của TSP
Hình 4.9. Kết quả phân tích phổ a) 1H-NMR b )13C-NMR của TSP
Hình 4.10. Phổ ESI-MS của TSP-oligosaccharide
Hình 4.11. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1224
x


Hình 4.12. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1077
Hình 4.13. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1011
Hình 4.14. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 457
Hình 4.15. Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 413
Hình 4.16. Cấu trúc hóa học của monomer của TSP
Hình 4.17. Ảnh SEM của TSP
Hình 4.18. Sắc đồ của phép đo a) tán xạ ánh sáng tĩnh SLS và b) tán xạ ánh sáng
động DLS của TSP
Hình 4.19. Mơ phỏng hình dạng của phân tử TSP

Hình 4.20. Kết quả đo SAXS từ dung dịch TSP 0,5% trong nƣớc: a) Đƣờng tán xạ,
b) Biểu đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.21. a) Mơ hình cấu trúc phân tử của TSP xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học
(với n=4), b) Biểu đồ Kratky với các đƣờng tán xạ từ thực nghiệm (đƣờng đỏ)
và từ mơ hình cấu trúc phân tử (đƣờng đen)
Hình 4.22. Cấu trúc hóa học của TSPchiết tách từ hạt me thu hái tại Hải Phịng
Hình 4.23. Phổ IR của a) TSP và b) TSPS4
Hình 4.24. Phổ 13C-NMR của a) TSP b) TSPS4
Hình 4.25. Ảnh SEM của a)TSP và b) TSPS4
Hình 4.26 Kết quả đo SAXS của TSPS4 0,5% trong nƣớc: a) Đƣờng tán xạ, b) Biểu
đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.27. Phổ IR của: a) TSP và b) TSPA4
Hình 4.28. Phổ 1H-NMR của: a) TSP và b) TSPA4
Hình 4.29. Ảnh SEM của a)TSP, b) TSPA4
Hình 4.30 Kết quả đo SAXS của TSPA4 0,5% trong nƣớc: a) Đƣờng tán xạ, b) Biểu
đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier
Hình 4.31. Mối tƣơng quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa
tổng số với DS của TSPS
Hình 4.32. Mối tƣơng quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa
tổng số với DA của TSPA
Hình 4.33. Ảnh thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hình 4.34. Mối tƣơng quan giữa khả năng ly giải cục máu đông với DS của TSPS
xi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nƣớc ta có thảm thực vật phong phú và đa dạng, có truyền thống về sử dụng
các lồi thực vật làm thuốc chữa bệnh. Theo các số liệu thống kê mới nhất, Việt
Nam có trên 12000 lồi thực vật, trong đó hơn 3200 lồi đƣợc sử dụng làm thuốc
trong y học dân gian.

Những hợp chất tự nhiên phân lập từ thực vật đƣợc ứng dụng trong rất nhiều
ngành công nghiệp nhƣ dƣợc phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm. Cùng với sự phát triển
của khoa học kỹ thuật, việc khai thác và sử dụng những cây thuốc quý không còn
đơn thuần dựa vào kinh nghiệm mà còn dựa trên những cơ sở khoa học hiện đại.
Một trong những con đƣờng hữu hiệu để phát hiện ra các chất tiềm năng có hoạt
tính sinh học q có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con ngƣời, gia súc và
cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Các số liệu gần đây cho thấy có khoảng
60% dƣợc phẩm đƣợc dùng chữa bệnh hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn
gốc từ thiên nhiên.
Mặc dù các hợp chất thiên nhiên đã thu hút đƣợc sự quan tâm nghiên cứu của
các nhà khoa học, nhƣng nhiều cây đƣợc sử dụng làm thuốc vẫn chƣa đƣợc nghiên
cứu đầy đủ về mặt hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học mà chủ yếu dựa trên kinh
nghiệm dân gian, vì vậy chƣa phát huy hết đƣợc hiệu quả của nguồn tài nguyên q
giá này.
Trong vơ số lồi thực vật ở Việt Nam, cây me thuộc chi Tamarindus của họ
Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của cây me đều đƣợc dùng trong
cuộc sống hàng ngày. Cho đến nay tại Việt Nam chƣa có cơng trình nghiên cứu về
mặt hóa học của các thành phần có trong quả me, do vậy quả me là một đối tƣợng
nghiên cứu có nhiều triển vọng. Trong các bộ phận của cây me, quả me mà thành
phần hóa học chủ yếu là polysaccharide đã đƣợc sử dụng nhiều trong ngành công
nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm.
Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu
trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt với tính chất của
polysaccharide nói riêng và chất có hoạt tính sinh học nói chung. Hiện nay một
1


hƣớng nghiên cứu khác đang đƣợc quan tâm là tạo ra các dẫn xuất hóa học của hợp
chất thiên nhiên với mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao.
Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài luận án "

phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me
(Tamarindus indica

", nhằm góp phần mở rộng khả năng ứng dụng

của nguồn thực vật Việt Nam.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:
 Xác định thành phần hóa học, cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học
của Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) có trong hạt me.
 Điều chế đƣợc các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa có hoạt tính sinh
học cao hơn TSP tự nhiên từ đó góp phần làm sáng tỏ ảnh hƣởng của
mức độ sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học.
Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:
1. Thu thập mẫu quả me tại các vị trí địa lý khác nhau ở Việt Nam.
2. Tách chiết và tinh chế TSP từ các bộ phận khác nhau của quả me.
3. Xác định thành phần hóa học và cấu trúc của các TSP thu đƣợc.
4. Tạo các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của TSP với các mức độ
sulfate hóa và acetyl hóa khác nhau.
5. Khảo sát hoạt tính sinh học của TSP và các dẫn xuất.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Polysaccharide và lớp chất Xyloglucan
Saccharide, còn gọi là carbohydrate hay glucid, là các hợp chất hỗn chức của
polyhydroxyaldehyde, polyhydroxyketone và một số dẫn chất ngƣng tụ của chúng.
Thành phần nguyên tố của saccharide gồm có C, H, O. Chúng có cơng thức tổng
qt là Cm(H2O)n. Carbohydrate là một trong những thành phần quan trọng của cơ
thể sinh vật, chiếm tới gần 80% trọng lƣợng khô của thực vật và khoảng 2% của cơ

thể động vật [1,9] .
Polysaccharide là polymer sinh học mà monomer của nó là các gốc đƣờng
nối với nhau bằng liên kết glycoside. Thành phần đƣờng tạo nên các polysaccharide
có nguồn gốc từ một số loài thực vật đƣợc đƣa ra trên Bảng 1.1 [50,81].
Polysaccharide có thể có cấu trúc mạch thẳng hoặc mạch nhánh, mức độ phân
nhánh ảnh hƣởng đến tính chất vật lý nhƣ khả năng tan trong nƣớc, độ nhớt, khả
năng tạo gel [84]… Trong polysaccharide các nhóm hydroxyl chiếm đa phần và đơi
khi có thể thay bằng các nhóm thế khác bởi q trình ester hóa, acetyl hóa, sulfate
hóa, phosphate hóa hoặc ether hóa. Polysaccharide thơng thƣờng đƣợc phân lập từ
thực vật hoặc quá trình chế biến thực phẩm bằng phƣơng pháp chiết nóng với dung
mơi nƣớc và đƣợc kết tủa bằng ethanol hoặc aceton. Dung dịch polysaccharide
thƣờng có độ nhớt cao và chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ, kích thƣớc,
hình dạng phân tử, nhiều polysaccharide có khả năng tạo gel [99].
Bảng 1.1. Một số monosaccharide của polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật
Đơn vị đường
α-L-Rhap

Cơng thức

α-L-GulpA

Polysaccharide
Pectin

Alginate

3


3,6-Anhydro-α-L-Gal

Aga

3,6-Anhydro-α-D-Gal

Carrageenan

α-L-Fucp

Xyloglucan, Pectin

β-D-Fruf

Xyloglucan

α-D-GalpA

Pectin

β-D-Manp

Galactomannan;
glucomannan; xanthan

β-D-ManpA

Alginate

4

α-D-Manp

Xanthan

α-D-Xylp

Xyloglucan

β-D-Xylp

Xyloglucan

Xyloglucan (XyG) là polysaccharide có mạch chính là liên kết (1,4)- -DGlcp, mạch nhánh là

-D-Xylp và một số đƣờng khác nhƣ galactose, fucose….

Theo một số cơng trình đã cơng bố [31,50] có khoảng 19 mạch nhánh đã đƣợc ghi
nhận là tồn tại trong xyloglucan. Cấu trúc hóa học và danh pháp của các mạch
nhánh đƣợc mơ tả trong Hình 1.1[34]. Những mạch nhánh đƣợc mô tả bằng các
chữ cái và chúng đƣợc mở rộng để chứa những cấu trúc mới đƣợc phát hiện. Nhƣ G
kí hiệu cho glucose đƣợc thể hiện là mạch chính, X, L và F mơ tả liên kết glycoside
với các mạch nhánh tƣơng ứng là

-D-Xylp, -D-Galp-(1,2)- -D-Xylp và

-L-

Fucp-(1,2)- -D-Galp-(1,2)- -D-Xylp (Hình 1.2). XyG đƣợc tổng hợp hầu hết từ
thực vật hai lá mầm và cây hạt trần có chứa nhiều mạch nhánh khác nhau với mạch

chính là glucose [34].
Một số mạch nhánh của XyG có liên kết glycoside khác nhau nhƣng có cấu
trúc khơng gian giống nhau. Chẳng hạn nhƣ

-L-Galp-(1,2)- -D-Galp-(1,2)- -D-

Xylp (J) có trong hạt cây bụi và trong loài Arabidopsis thuộc họ cải chúng có cấu
trúc giống nhau F là 6-deoxy-Galp. XyG từ cây thạch tùng và cỏ đuôi ngựa chứa L-Arap-(1,2)- -D-Xylp (D) và

-L-Fucp-(1,2)- -L-Arap-(1,2)- -D-Xylp (E) là

mạch nhánh. Trong cấu trúc khác trong lồi Arabidopsis thuộc họ cải có hai mạch
nhánh là -D-GalpA-(1,2)- -D-Xylp (Y) và -L-Fucp-(1,2)- -D-GalpA-(1,2)- -D5


Xylp (Z). Một mô tả khác của mạch nhánh gồm -L-Araf-(1,2)- -D-Xylp (S) và L-Araf-(1,3)- -L-Araf-(1,2)- -D-Xylp (T) có trong nhiều loài khác nhau. Với mạch
nhánh A, B, C đƣợc tìm thấy trong tế bào của nhiều lồi cây với mạch chính là
glucose bao gồm cả hai liên kết tại vị trí O-6 và O-2. Mạch nhánh (M, N, P, Q)
đƣợc tìm thấy trong những thực vật vơ mạch nhƣ lồi Physcomitrella patens trong
khi U đƣợc tìm thấy trong hạt cây argan và cây Việt quất.

6


Hình 1.1. Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan

Xyloglucan đầu tiên đƣợc phát hiện trong hạt của cây Tòng chi (Hymenaea
courbaril). Cấu trúc hóa học của xyloglucan đã đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp
phân tích methyl hóa. Cấu trúc này cũng có trong hạt sen cạn, hạt lanh… và có cấu

7


trúc oligosaccharide là XXXXG. Nghiên cứu khác cho thấy XyG từ hạt của lồi
Tịng chi có cấu trúc và tính chất nhƣ xyloglucan đƣợc tổng hợp từ hạt me.
Từ rất nhiều các nghiên cứu ngƣời ta đã tìm ra các đặc trƣng của xyloglucan
nhƣ: có bốn gốc đƣờng trong cấu trúc của TSP có trong hạt me đã đƣợc xác định
theo William và cộng sự khi sử dụng tia X tại bƣớc sóng 2,06 nm [111].
Burchard và cộng sự [21] bằng phƣơng pháp tán xạ ánh sáng đa góc
(Multiangle laser light scattering -MALLS) đã cho thấy polysaccharide thuộc lớp
chất xyloglucan có trọng lƣợng phân tử của khoảng 8.8x105g. mol-1. Các tác giả đã
sử dụng phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động và tĩnh để nghiên cứu cấu trúc chuỗi và
các tƣơng tác trong phân tử, nghiên cứu chỉ ra rằng các chuỗi đơn có dạng bó xoắn
là nguyên nhân tạo nên độ cứng của hạt.
Hiện nay, ngƣời ta đã đƣa ra cấu trúc chính xác của dẫn xuất oligosaccharide
từ xyloglucan chiết tách từ các hoại hạt H. courbariland và T. indica thu thập tại
Brazil, kết quả cho thấy các xyloglucan thu đƣợc có sự tƣơng quan về hình dạng
phân tử [86].

1.2. Polysaccharide từ quả me
1.2.1. Vài nét về cây me

Cây me là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhƣng đƣợc phân bố rộng
rãi trên toàn thế giới với trên 50 quốc gia. Diện tích trồng phần lớn tập trung tại các
nƣớc châu Á nhƣ Ấn Độ, Thái Lan, Băng La Đét, Srilanka và Indonecia. Tại châu
Mỹ, Mexico và Costa Rica là nơi có sản lƣợng lớn nhất, tại châu Phi cây me đƣợc
trồng rải rác và không có sản phẩm thƣơng mại. Một số ít sản phẩm từ các quốc gia
của châu Phi nhƣ Senegal, Gambia, Kenya, Tanzania và Zambia, sau đó đƣợc trồng
phổ biến ở khắp các tỉnh nƣớc ta cũng nhƣ ở rất nhiều nƣớc nhiệt đới khác [6,74].
Cây me tên khoa học là Tamarind indica L. hay Tamarindus indica L. thuộc

họ Đậu Fabaceae. Các bộ phận của cây me đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau trong lĩnh vực thực phẩm hay dƣợc phẩm. Cây me cao 15 đến 30m, tán cây
rộng, nhiều lá. Lá cây me có dạng kép lơng chim chẵn, dài từ 8 đến 10cm, gồm 10
đến 20 đôi lá chét thn khơng cân xứng, chóp lõm, dài 20mm, rộng 2mm. Hoa
8


trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy
tận cùng. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12cm, rộng 25mm, dày 10mm.
Vỏ quả ngồi mỏng, cứng, giịn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau khi
loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt. Quả chứa 3-5
hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng. Mùa quả vào tháng 10-11 [6, 7].
Các bộ phận của cây me nhƣ quả, hạt, lá, hoa và vỏ cây me đều đƣợc sử dụng
với mục đích hóa học thực vật và dƣợc phẩm. Lá và hoa me có thể đƣợc sử dụng
nhƣ một loại rau trong bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc [3, 30]. Chúng đƣợc
sử dụng trong món cà ri, salat, món hầm và súp tại nhiều quốc gia, và hiện nay ngày
càng khan hiếm [31].
Đặt biệt là quả me và hạt me đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần
và tác dụng trong hóa học thực vật và dƣợc phẩm. Trong quả me có chứa chủ yếu
hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali
bitactrat 3,25%, đƣờng 12,5%, gơm 4,70%, pectin 6,25%. Ngồi ra cịn có 34,35%
xơ, nƣớc 27,55%. Trong hạt có glucozan, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ.
Trong đời sống quả me đƣợc sử dụng theo mùa vụ, nhƣ làm thực phẩm, tạo hƣơng
vị, gia vị trong món cà ri, súp và cũng là thành phần chính trong một số loại nƣớc
ép và đồ uống [98]. Ngƣời ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào
trong đồ uống, dịch chuyền và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo. Nƣớc quả me là
loại đồ uống bổ dƣỡng đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức
chế biến khác nhau. Tại một số quốc gia châu Phi nƣớc quả me đƣợc trộn với tro gỗ
để trung hòa vị chua của acid tartaric. Tuy nhiên phƣơng pháp phổ biến nhất là
thêm đƣờng để tạo vị ngọt cho đồ uống. Phần lớn sản phẩm đồ uống có nƣớc me

đƣợc sản xuất thƣơng mại. Đôi khi nƣớc quả me đƣợc cho vào trong đồ uống có cồn
[3,31].
Trong y học, theo đông y [3, 6, 7, 10], quả me có vị chua, tính mát, có tác
dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát,
có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa
(kiết lỵ, ỉa chảy..) và nấu nƣớc để ngậm chữa viêm lợi.

9


Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngồi da, lá me thƣờng đƣợc dùng để nấu
nƣớc tắm cho trẻ em đề phịng bệnh ngồi da vào mùa hè. Thịt me, lá và hoa đƣợc
kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau.
Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me cịn có tác dụng nhƣ: Quả
me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị
nơn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có
tác dụng chữa rơm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có tá dụng chữa táo, phịng và chữa
viêm lợi, viêm nha chu. Hạt me rang đƣợc coi là một loại gia vị trong thực phẩm.
Theo y học phƣơng Tây quả me đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng thuốc lợi tiểu
điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêm chảy, giúp hệ thần kinh hoạt độ
(hàm lƣợng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai trò quan trọng trong
các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp. Me là một nguồn cung cấp vi chất cho
cơ thể nhƣ Mg2+, Ca2+.Quả me là một trong những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất
trong các loại trái cây, giúp ngăn ngừa táo bón (hàm lƣợng chất xơ 20%). Chất xơ
có tác dụng điều hịa nhu động ruộ

ột loại thuốc nhuận tràng tự

nhiên và không gây tác dụng phụ. Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lƣợng
kali trong chuố

ểm soát huyết áp tố

quả me

Nƣớc me

ằng cách kiểm soát các tác động của natri

trong cơ thể, tránh để tình trạng lƣợng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng [3, 29].
Quả me cũng đƣợc biết nhƣ một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lƣợng
sắt 2,8%). Vì vậy, đây cũng là loại trái cây rất tốt cho phụ nữ mang thai. Giúp kiểm
soát mức cholesterol (hàm lƣợng niacin 1,2%) Me chứa khá nhiều chất niacin, một
loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe. Chất này có thể giúp giảm cholesterol
xấu và tăng lƣợng cholesterol tốt trong cơ thể. Thành phần của me bao gồm chất
ợng cho nên

riboflavin sẽ giúp chuyể
có thể c
có tác dụng hỗ trợ

ợng mà không gây béo (hàm lƣợng riboflavin 9%). Quả me
máu (hàm lƣợng calcium 7%). Quả me là một trong

những loại trái cây giàu canxi. Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai
trị rất quan trọng trong q trình đơng máu. Vì vậy, quả me đƣợc coi là loại quả có
tác dụng ổn định cơ chế đơng máu. Quả me cũng có tác dụng giảm sốt và bảo vệ
10

chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nƣớc dùng để uống). Quả me giúp cơ
thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phƣơng thuốc hiệu quả chống tiêu chảy
và bệnh lỵ.
Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và
đƣợc đƣa vào sử dụng trong cuộc sống. Tuy nhiên cây me vẫn cịn có rất nhiều tiềm
năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá
trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dƣỡng và dƣợc phẩm.
1.2.2. Cấu trúc hóa học và ứng dụng của polysaccharide từ quả me
Theo Patel và cộng sự [77], polysaccharide phân lập đƣợc từ quả me thuộc lớp
chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí C6 là liên
kết với

-D-xylopyranose và liên kết với

-D-galactopyranose-(1-2)- -D-

xylopyranose. Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG, bao gồm ba
nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và đƣợc phân cách bằng một
glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose đƣợc liên kết với
galactopyranose (L) theo Hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP)

Gần đây cấu trúc của TSP đƣợc mơ tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo
kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), và monosaccharide
(Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã đƣợc đề cập.

11

Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào
trọng lƣợng phân tử, một số polysaccharide có trọng lƣợng phân tử nhỏ đều có các
hoạt tính sinh học quý giá và đƣợc sử dụng trong y học. [12,13].
Trong hạt me có các chất tanin và chất nhuộm màu ở vỏ ngoài của hạt, do vậy
hạt me không thể dùng trực tiếp đƣợc. TSP là thành phần có trong bột hạt me (TKP)
đóng vai trị quan trọng khi đƣợc sử dụng trong ngành may mặc, giấy, sơ sợi hoặc
làm nguyên liệu thô để sản xuất polysaccharide dùng cho thực phẩm [40].
TSP chiết trong nƣớc có dạng gel và kết tủa trong dung mơi hữu cơ, TSP có
trọng lƣợng phân tử từ 700–2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me
phụ thuộc vào nguồn gốc [31]. TSP đƣợc sử dụng để kiểm sốt liều lƣợng thuốc và
khơng có bất kỳ phản ứng phụ nào và có thể tạo khuôn với natri alginate để làm bao
cho viên thuốc [16,28,41,90,100]. Ngƣời ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa
của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm
định [39,40,42].
Gần đây, TSP đã đƣợc xác định là chất không gây ung thƣ, là chất kết dính có
nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ thuốc cao. TSP đƣợc sử dụng
nhƣ chất kết dính ở dạng viên, dạng gel, tác nhân làm dày, nhƣ chất nhũ hóa và làm
chất ổn định trong thực phẩm, và đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp dƣợc
phẩm, thực phẩm [53,67,74, 83, 93, 96].
TSP từ hạt me dự kiến sẽ có các ứng dụng mới trong thực phẩm, nhƣ là một
chất làm đặc và chất ổn định, tác nhân gel hóa, chất làm ổn định nƣớc đá tinh thể và
thay thế tinh bột vì tính chất của nó tƣơng tự nhƣ tinh bột nhƣng ổn định hơn. TSP
đƣợc thử nghiệm trong nhãn khoa và có hiệu quả trong việc thử nghiệm áp lực nội
nhãn của sản phẩm nhỏ mắt có timolol và đã đƣợc nghi nhận trên thỏ. TSP đã đƣợc
thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và đƣợc sử dụng là chất
mang của thuốc chữa bệnh đại tràng [27,48].
Năm 1989 Iain C M Dea [43] đã nghiên cứu tạo dung dịch polysaccharide
với tỷ lệ dung môi khác nhau, nghiên cứu cho thấy có mối tƣơng quan giữa cấu trúc
và hoạt tính sinh học, một số polysaccharide có tác dụng tốt trong nhãn khoa.

12