Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam ở hồ xuân hương, đà lạt, lên cá sọc ngựa, danio rerio

C
hí Minh

Đại học Quốc gia
Thành Phố Hồ Chí Minh

h

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Tên đề tài ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘC TỐ VI KHUẨN LAM Ở HỒ XUÂN HƯƠNG,
ĐÀ LẠT, LÊN CÁ SỌC NGỰA, DANIO RERIO

Ngày ... tháng ...... năm ....

Ngày ... tháng ...... năm ....

Chủ tịch hội đồng nghiệm thu

Chủ nhiệm

(Họ tên, chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Bùi Lê Thanh Khiết

Ngày ... tháng ...... năm ....

Ngày ... tháng ...... năm ....

Cơ quan chủ quản

Cơ quan chủ trì
(Họ tên, chữ ký, đóng dấu)


TÓM TẮT
Hồ Xuân Hương, Đà Lạt là một thắng cảnh quốc gia, địa danh nổi tiếng và là địa điểm tham quan
du lịch góp phần tạo nên nét đặc sắc cho Đà Lạt. Tuy nhiên, hồ Xuân Hương cũng là nơi tiếp nhận
một lượng lớn nước thải từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp, sinh hoạt, sân golf . Do vậy, chất
lượng nước của hồ là một vấn đề đáng quan tâm. Ở nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các yếu tố
vật lý, hóa học, độc tố vi khuẩn lam microcystins và đánh giá ảnh hưởng cấp tính cũng như ảnh
hưởng lên tỉ lệ sống của phôi, cá con và tập tính của dịch chiết VKL lên cá sọc ngựa, Danio rerio.
Kết quả lý-hóa cho thấy pH có sự gia tăng đáng kể khi có sự bùng nổ VKL, tỉ lệ TN:TP không phù
hợp lắm cho sự phát triển của VKL. Phân tích độc học cấp tính cho thấy mẫu tảo ni trong PTN
khơng có ảnh hưởng lên tỉ lệ chết của sinh vật. Tuy nhiên, ảnh hưởng cấp tính lên cá sọc ngựa là
rất thấp, LC50-48 giờ = 0,0013%. Nồng độ microcystins trong nước lên đến 16 µg/lít, nồng độ
này là khá thấp và khơng phải là nguyên nhân chính gây nên sự chết cấp tính thấp như vậy. Phân
tích kim loại nước hồ cho thấy có sự xuất hiện của các kim loại độc gây ảnh hưởng đến sức khỏe
con người như Cr, Ni, Cd, As; đồng thời, hàm lượng sắt trong nước hồ ở mức khá cao (gần 5
mg/l). Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật cũng được tìm thấy bao gồm nhiều hợp chất thuộc nhóm
phosphor hữu cơ và clo hữu cơ. Nồng độ dịch chiết tảo nở hoa ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của phôi
lần lượt là 90%, 50% và 18% ứng với nồng độ 10 µg/l, 20 µg/l và 50 µg/l tương ứng. Nồng độ 10
µg/l làm cho tỉ lệ sống của cá con chỉ còn khoảng 58% sau 2 tuần thử nghiệm. Đồng thời nồng độ
này cũng làm thay đổi tập tính của cá sọc ngựa con, thể hiện đây là một marker sinh học đầy tiềm
năng cho việc quan trắc chất lượng nước.


ABSTRACT

Xuan Huong Lake, Da Lat is a national landmark, and tourist attractions contributes to the
character of Da Lat. However, Xuan Huong Lake is also place received a large amount of
wastewater from agricultural activities, domesmic and golf field. Therefore, the water quality of
the lake is a matter of concern. In this study, we investigated the effects of physio-chemical
parameters, cyanotoxin microcystin and the effects of crude extracts on the survival of embryos,
juveniles and behavior of zebrafish, Danio rerio. The physic-chemical results showed that pH
increased significantly when there was algal bloom; TN:TP ratio was not appropriate for the
development of cyanobacteria. The acute result was quite low, LC50-48h = 0,0013%. Microcystin
concentration was 16 µg/l, this concentration is not a major factor caused the low result of acute test .
Metal analysis of lake’s water showed that there were presences of toxic metals affecting human
health, such as Cr, Ni, Cd, As; in adddition, the iron concentration in the water was relatively high
(approximately 5 mg/l). Residues of plant protection products were also found including
organophosphorus and organochlorine groups. The concentrations of crude extracts affecting
survival of embryos were 90%, 50% and 18% correspond to 10 µg/l, 20 µg/l and 50 µg/l,
respectively. At 10 µg/l, the survival of juveniles decreased to 58% after two weeks of experiment.
In addition, this concentration also altered the behavior of juvenile, this is a potential biomarker
for monitoring water quality.


LỜI CÁM ƠN
Đề tài này được thực hiện trong hơn một năm, nhưng nhờ có sự hỗ trợ của nhiều người để có thể
thực hiện được. Trước hết tơi xin được cảm ơn sự tư vấn, hỗ trợ của TS. Đào Thanh Sơn, vì đã
mang lại cơ hội cho tơi thực hiện được đề tài này. Cám ơn vì những nỗ lực không mệt mỏi của anh
đã khiến cho tôi có thêm nguồn cảm hứng.
Tơi cũng xin cảm ơn ThS. Bùi Bá Trung, ThS Nguyễn Thanh Sơn đã hỗ trợ tôi trong việc lấy mẫu,
cũng như những tư vấn chuyên môn liên quan đến thủy sinh. Tôi cũng xin cảm ơn CN. Võ Thị Mỹ
Chi vì những hỗ trợ của em trong PTN.
Tôi cũng xin cảm ơn các đồng nghiệp trong PTN chất lượng môi trường đã tạo điều kiện cho tơi
thực hiện các phân tích lý-hóa cần thiết để thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn tất cả những người đã giúp đỡ tôi bằng nhiều cách khác nhau mà tên của họ

không được nêu ra ở đây.


MỤC LỤC
Chương 1 Tổng quan

5

1.1 Vi khuẩn lam có độc và độc tố vi khuẩn lam

5

1.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn lam

8

1.3 Tác động lên cá

9

1.4 Tổng quan về cá sọc ngựa

10

1.5 Một số nghiên cứu trong nước

10

1.6 Giới thiệu về hồ Xuân Hương

11

Chương 2 Vật liệu và phương pháp

13

2.1 Phạm vi nghiên cứu

13

2.2 Các yếu tố hóa lý mơi trường nước

13

2.3 Thu mẫu vi khuẩn lam

15

2.4 Ảnh hưởng của VKL lên cá sọc ngựa

16

Chương 3 Kết quả và biện luận

19

3.1 Kết quả hóa lý nước hồ Xn Hương

19

3.2 Thành phần lồi vi khuẩn lam

20

3.3 Thí nghiệm xác định LC50-48 giờ lên cá sọc ngựa con

25

3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết VKL lên phôi cá

27

3.5 Sự phát triển cá con

28

3.6 Ảnh hưởng lên tập tính của cá con

29

Chương 4 Kết luận và đề nghị

30

Tài liệu tham khảo

31


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Thành phần chất chuẩn cho phân tích TN

13

Bảng 2. Thành phần chất chuẩn cho phân tích ammonium

14

Bảng 3. Thành phần chất chuẩn cho phân tích nitrate

15

Bảng 4. Thành phần chất chuẩn cho phân tích phosphor

15

Bảng 5. Số liệu hóa lý các điểm lấy mẫu ở hồ Xuân Hương qua ba lần thu mẫu

19

Bảng 6. Thành phần loài vi khuẩn lam ghi nhận ở hồ Xuân Hương

21

Bảng 7. Số lượng lồi ưu thế có trong hồ Xuân Hương

21

Bảng 8. Sự xuất hiện của một số kim loại có trong nước hồ Xuân Hương

26

Bảng 9. Hàm lượng một số thuốc bảo vệ thực vật phát hiện thấy trong hồ Xuân Hương

26


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình A1: Một số vi khuẩn lam trong nước ngọt: (a) Arthrospira massartii; (b) Anabaena mucosa
và (c) Oscillatoria kawamurae

1

Hình A2: Một số VKL với đặc điểm sinh học cơ bản: (a) Microcystis với nhiều khí thể trong tế
bào; (b) Anabaena với bào tử (mũi tên); và (c) Anabaena với dị bào (mũi tên).

2

Hình 1: Cấu trúc hóa học của anatoxin-a (a), anatoxin-a(s) (b), homoanatoxin-a (c), PSP (d),
microcystins-LR (e), nodularin (f) và cylindrospermopsin (g).

6

Hình 2: Cấu trúc hóa học của lyngbyatoxin-a (a), aplysiatoxin (b), và lipopolysaccharide
endotoxin (c).
Hình 3: Sơ đồ thu mẫu tại hồ Xuân Hương, Đà Lạt

7
13

Hình 4. Nở hoa vi khuẩn lam Anabaena sp. ở hồ Xuân Hương, với ảnh chụp hiện trường (a) và
ảnh chụp trên kính hiển vi (b).

20

Hình 5. Kết quả phân tích HPLC mẫu vi khuẩn lam nở hoa ở hồ Xn Hương

25

Hình 6. Sự phát triển phơi cá sau 1 ngày phơi nhiễm ở 20 μg/mL dịch chiết mẫu tảo nở hoa

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
VKL: vi khuẩn lam
PTN: phòng thí nghiệm

28


MỞ ĐẦU
Vi khuẩn lam (cyanobacteria, cyanoprokaryota, cyanophyta, blue-green algae) là một trong những
sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất cách đây hàng tỷ năm và tồn tại cho đến ngày nay (Graham
và Wilcox, 2000). Chúng có mặt trong cả mơi trường đất, nước và khơng khí (Hình A1). Tuy
nhiên vi khuẩn lam (VKL) chủ yếu hiện diện trong các thủy vực như ao hồ, sông suối, cửa sông và
ven biển. VKL được tìm thấy ở những nơi có điều kiện khắc nghiệt, từ vùng băng tuyết đến sa
mạc và chịu đựng được nhiệt độ từ – 600C ở vùng cực đến 700C ở các suối nước nóng (Graham và
Wilcox, 2000; Vincent, 2000).

Hình A1: Một số vi khuẩn lam trong nước ngọt: (a) Arthrospira massartii; (b) Anabaena mucosa
và (c) Oscillatoria kawamurae.
Trong thủy vực, VKL nhờ những đặc điểm thích ứng với nhiều điều kiện sống như tế bào chứa khí

thể, có dị bào (Hình A2) với chức năng thể chuyển hóa nitơ trong khơng khí thành amonium
(Graham & Wilcox, 2000), nên có khả năng cạnh tranh rất lớn so với các nhóm rong tảo khác.
Trong tự nhiên, VKL khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển mạnh, nhanh chóng gây nên sự nở
hoa. Thường đa số các nở hoa (25 – 75%) của chúng đi kèm với sự sản sinh, tiết ra độc tố vào môi
trường nước (Repavich và cộng sự, 1990; Rapala và Sivonen, 1998; Sivonen và Jones, 1999;
Zurawell và cộng sự., 2005), gây nên những tác động xấu lên môi trường, tài nguyên thủy sản và
nguy hiểm đối với động vật sống gần các thủy vực, đặc biệt là con người.
Vi khuẩn lam và độc tố của chúng là những thành phần tất yếu trong tự nhiên. Tuy vậy, con người
đã và đang có những tác động xấu vào mơi trường tự nhiên nói chung và thủy vực nói riêng, làm
cho sự nở hoa của VKL ngày càng thường xuyên hơn với mức độ nghiêm trọng hơn. Độc tố VKL
bao gồm nhiều nhóm loại. Các độc tố này không màu, không mùi, không vị và bền với nhiệt độ.
Sinh vật và con người bị nhiễm độc qua tiếp xúc trực tiếp hoặc qua đường ăn uống. Tùy theo mức
1


độ nhiễm độc, loại độc tố, mà nạn nhân sẽ sẽ chịu những tổn thương từ tiếp xúc ngoài da, đến cơ
quan thần kinh, nội tạng bên trong như tim, gan, thận, phổi. Hoạt động của các cơ quan chức năng
bên trong sẽ bị rối loạn, tê liệt hoặc hoại tử. Các độc tố cịn kích hoạt hoặc trực tiếp gây ra ung thư
hoặc đột biến cho động vật. Cho đến nay, hàng chục lồi VKL có độc đã được các nhà khoa học
trên thế giới phát hiện (Cronberg và Annadotter, 2006). Đồng thời, đã có đến hàng trăm đồng phân
của các loại độc tố do chúng tạo ra được thống kê, xếp loại (Wiegand và Pflugmacher, 2005;
Dittmann và Wiegand, 2006) và con số này đến nay vẫn chưa dừng lại. Tổ chức sức khỏe thế giới
(WHO) đã đưa ra chỉ tiêu độc tố VKL vào trong qui định của nước uống với hàm lượng
microcystin, một loại độc tố vi khuẩn lam phổ biến nhất, rất thấp. Hàm lượng độc tố microcystin
này trong nước uống phải dưới 1 µg/lít (WHO, 1996).

Hình A2: Một số VKL với đặc điểm sinh học cơ bản: (a) Microcystis với nhiều khí thể trong tế
bào; (b) Anabaena với bào tử (mũi tên); và (c) Anabaena với dị bào (mũi tên).
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về VKL đặc biệt là VKL có độc và độc tố của chúng còn ở mức
khiêm tốn. Nguồn nước dùng xử lý cho sinh hoạt, sản xuất ở các thành phố, thị xã chủ yếu được

lấy từ nguồn nước mặt như hồ, hồ chứa, sông. Tuy nhiên, hệ thống xử lý nước dùng cho sinh hoạt
ở Việt Nam chưa thể loại bỏ hồn tồn độc tố VKL. Vì vậy, nguy cơ phơi nhiễm với độc tố VKL
của người sử dụng nguồn nước mặt cho ăn uống là rất cao.
Hồ Xuân Hương, Đà Lạt, là một thắng cảnh quốc gia, địa danh nổi tiếng và là địa điểm tham quan
du lịch góp phần tạo nên nét đặc sắc cho Đà Lạt. Đây là một hồ nước có dịng chảy và nước trong
hồ thường xuyên được cung cấp, thay đổi. Hồ có chu vi 5,5 km, diện tích mặt hồ khoảng 32 ha,
dung tích 0,72 triệu m3 và dịng chảy trung bình năm là 0,7m/s. Các nhánh suối đổ vào hồ vào
mùa mưa mang theo một lượng lớn hợp chất hữu cơ và dinh dưỡng từ thượng nguồn và từ các
2


hoạt động sản xuất nơng nghiệp (trồng rau xanh). Ngồi ra, hồ còn là nơi tiếp nhận nguồn nước
thải sinh hoạt của cư dân sống trong khu vực, nước từ hoạt động tưới của sân golf, vườn hoa và lò
mổ (UBND tỉnh Lâm Đồng, 2012). Với sự tiếp nhận chất thải liên tục từ nhiều nguồn khác nhau,
nước hồ Xuân Hương trở nên phú dưỡng hóa dẫn đến sự nở hoa của vi khuẩn lam xảy ra thường
xuyên hơn, với mức độ ngày càng nặng nề. Hậu quả của nở hoa vi khuẩn lam làm cho chất lượng
nước hồ càng trở nên tồi tệ hơn với mùi khó chịu (hơi, thối) và chết cá. Điều đó ảnh hưởng lớn
đến hoạt động du lịch trên hồ và môi trường sống của người dân địa phương. Đồng thời nước hồ
Xuân Hương là nguồn nước cấp cho thác Cam Ly nên nở hoa vi khuẩn lam và độc tố của chúng sẽ
theo dòng nước ảnh hưởng trực tiếp lên thắng cảnh du lịch Cam Ly (màu, mùi) và du khách tham
quan (tiếp xúc trực tiếp). Về phương diện chất lượng nước và hệ sinh thái, độc tố vi khuẩn lam có
ảnh hưởng rất lớn lên cân bằng hệ sinh thái thủy vực, đặc biệt khi có nở hoa vi khuẩn lam. Tuy
nhiên, việc xác định vi khuẩn lam gây độc và đánh giá mức độ độc của vi khuẩn lam trong hồ
Xuân Hương cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết. Vì vậy, nghiên cứu về độc tố vi khuẩn lam
trong hồ cũng như ảnh hưởng xấu của độc tố lên sinh vật là điều cấp thiết.

1.

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá độc tính của vi khuẩn lam ở hồ Xuân Hương, Đà Lạt, lên cá sọc ngựa (Danio rerio).

2.

Nội dung nghiên cứu

Đề tài bao gồm các nội dung như sau:
-

Xác định loài VKL có khả năng gây độc ở hồ Xuân Hương

-

Khảo sát một số yếu tố môi trường nước ở hồ Xuân Hương

-

Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên cá sọc ngựa

3.

Phương pháp nghiên cứu

-

Phương pháp khảo sát thực địa, kết hợp với lấy mẫu phân tích

-

Phương pháp thực nghiệm với việc phân lập mẫu và ni trong phòng thí nghiệm

-

Phương pháp phân tích mẫu bằng các thiết bị trong phòng thí nghiệm như kính hiển vi, chụp
ảnh bằng máy chụp hình kỹ thuật số, các thiết bị phân tích, đo lường hóa lý

-

Phương pháp thực nghiện trên cá sọc ngựa

-

Phương pháp xử lý thống kê bằng chương trình excel

4.

Kết quả đạt được

3


Nhóm thực hiện đề tài đã thu thập được số liệu quan trọng về một số yêu tố môi trường nước
(nhiệt độ, pH, độ trong, dinh dưỡng), thành phần loài và sinh khối VKL. Bên cạnh đó, đã phân lập
được hơn 10 chủng VKL từ hồ Xuân Hương. Thực hiện các thí nghiệm độc học đối với cá sọc
ngựa. Về đào tạo, đã có một luận văn thạc sĩ bảo vệ thành cơng mà nội dung có liên quan đến kết
quả nghiên cứu của đề tài này.
Báo cáo ở hội thảo, hội nghị trong nước:

Bài báo đăng/đã gởi xin đăng trên tạp chí trong nước:
Bùi Lê Thanh Khiết, Lê Thái Hằng, Võ Thị Mỹ Chi, Phạm Thanh Lưu, Tô Thị Hiền, Nguyễn Lý

Sĩ Phú, Đỗ Hồng Lan Chi, Đào Thanh Sơn, Nguyễn Thanh Sơn, Bùi Bá Trung (2014) ĐỘC TÍNH
HỒ XUÂN HƯƠNG THÀNH PHỐ ĐÀ LẠT. Tạp chí khoa học và công nghệ, T. 52 (4C): 11-18
Dao Thanh Son, Bùi Bá Trung, Võ Thị Mỹ Chi, Bùi Thị Như Phượng, Đỗ Hồng Lan Chi, Nguyễn
Thanh Sơn, Bùi Lê Thanh Khiết (2014). SUY GIẢM CHẤT LƯỢNG NƯỚC VÀ ĐỘC TÍNH
SINH THÁI VI KHUẨN LAM TỪ HỒ XUÂN HƯƠNG, ĐÀ LẠT. Tạp chí khoa học và cơng
nghệ, T. 52, S. 1

Sản phẩm đào tạo từ đề tài:
-

Luận văn thạc sĩ: Ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên sự thay đổi hình thái ở cà rốt
(Daucus carota L.) và xà lách (Lactuca sativa L.)”

4


Chương 1 Tổng quan
1.1 Vi khuẩn lam có độc và độc tố vi khuẩn lam

Cho đến nay, hơn 60 loài vi khuẩn lam (VKL) có độc đã được ghi nhận thuộc các giống
Microcystis, Cylindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria, Planktothrix,
Umezakia, Anabaenopsis, Arthrospira, Nostoc, Nodularia... (Banker và cs., 1997; Ballot và cs.,
2005; Baudin et al, 2006; Cronberg & Annadotter, 2006; Mohamed và cs., 2006). Trong số đó,
Microcystis là giống có độc phổ biến nhất trong số các VKL. Một lồi VKL có thể sản sinh ra
nhiều loại độc tố, ngược lại, một loại độc tố có thể được tạo ra từ nhiều lồi VKL khác nhau
(Sivonen & Jones, 1999).
Độc tố vi khuẩn lam có trong nước ngọt, nước lợ, nước mặn và trên đất ẩm. Tuy nhiên, sự hiện
diện của chúng chủ yếu là trong nước ngọt (Codd, 1999; Cronberg & Annadotter, 2006). Cho đến
nay, độc tố VKL được xếp thành nhiều nhóm khác nhau tùy theo quan điểm và lĩnh vực nghiên
cứu. Trên cơ sở độc học, các độc tố VKL được chia thành 5 nhóm chính: độc tố về thần kinh

(anatoxin-a, anatoxin-a(s), homoanatoxin-a, PSP), độc tố về gan (microcystinss, nodularin), độc tố
tế bào (cylindrospermopsin), độc tố gây dị ứng (lyngbyatoxin-a, aplysiatoxins) và nội độc tố
(lipopolysacccharide endotoxin) (Sivonen & Jones, 1999; Codd và cs., 2005; Cronberg &
Annadotter, 2006). Mỗi nhóm độc tố trên bao gồm nhiều độc tố có ảnh hưởng xấu mang tính chất
cấp tính hay mãn tính lên nạn nhân thơng qua các con đường như: ăn, uống, hít thở, tiếp xúc ngoài
da. Những tác động nghiêm trọng của độc tố VKL lên thực vật, động vật và con người đã được ghi
nhận ở rất nhiều nơi trên thế giới.
Nhóm độc tố gây tê liệt (PSP, hình 1d) được ghi nhận đầu tiên từ tảo giáp ở biển (Alexandrium
spp., Pyrodinium bahamense var. compressum, Gymnodinium catenatum) (Anderson và cs..,
1990; Kodama, 2000) và sau này cũng được xác định là từ dịch chiết của Aphanizomenon,
Anabaena, Cylindrospermopsis và Lyngbya (Sivonen & Jones, 1999). Cho đến nay, có khoảng 30
đồng phân của PSP đã được tìm thấy (Pearson và cs., 2010).
Microcystins (hình 1e) là nhóm độc tố VKL phổ biến nhất và được xác định là do nhiều loài VKL
sản sinh ra như Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Planktothrix, Nostoc, Synechocystis,
Anabaenopsis, Hapalosiphon (Carmichael, 1992; Sivonen & Jones, 1999), Arthrospira (Ballot và
cs., 2004) và Annamia toxica (Nguyen, 2007). Đến nay, trên 80 đồng phân của microcystinss đã
được tìm thấy và độc tính của chúng cũng có những khác biệt nhau (Dittmann & Wiegand, 2006).
Nodularin (hình 1f) là độc tố đặc trưng của loài VKL nước lợ Nodularia spumigera (Sivonen &
Jones, 1999). Cho đến nay, 7 đồng phân của nodularin đã được ghi nhận (Pearson và cs., 2010).
Cylindrospermopsin (hình 1g) được sản sinh ra bởi các giống VKL Cylindrospermopsis,
Umezakia, Aphanizomenon, Raphidiopsis, Anabaena, Lyngbya và Oscillatoria (Harada và cs.,
1994; Hawkins và cs., 1997; Sivonen & Jones, 1999; Preussel và cs., 2006; Spoof và cs., 2006;
Seifert và cs., 2007; Mazmouz và cs., 2010).

5


Hình 1: Cấu trúc hóa học của anatoxin-a (a), anatoxin-a(s) (b), homoanatoxin-a (c), PSP (d),
microcystins-LR (e), nodularin (f) và cylindrospermopsin (g).
Anatoxin-a (hình 1a) được sản sinh ra bởi các giống VKL như Anabaena, Oscillatoria,

Aphanizomenon và Cylindrospermum (Carmichael, 1992; Sivonen & Jones, 1999), Arthrospira
6


(Ballot và cs., 2004), Phormidium (Gugger và cs., 2005) và Raphidiopsis (Namikoshi và cs.,
2003). Anabaena spp. có thể sản sinh ra anatoxin-a(s) (hình 1b) (Mahmood & Carmichael, 1986;
Sivonen & Jones, 1999). Trong khi đó homoanatoxin-a (hình 1c) được tạo ra bởi Oscillatoria và
Raphidiopsis (Lilleheil và cs., 1997; Namikoshi và cs., 2003; Cronberg & Annadotter, 2006).
Lyngbyatoxin-a (hình 2a) và aplysiatoxins (hình 2b) được tạo ra bởi Lyngbya majuscula,
Schizothrix calcicola và Oscillatoria nigro-viridis (Cronberg & Annadotter, 2006).
Lipopolysaccharide (LPS, hình 2c) là thành phần cấu tạo vách tế bào của VKL (Sivonen & Jones,
1999) và đã từng được ghi nhận cùng với sự phát triển mạnh của các VKL Anacystis, Microcystis,
Anabaena và Oscillatoria (Cronberg & Annadotter, 2006).

Hình 2: Cấu trúc hóa học của lyngbyatoxin-a (a), aplysiatoxin (b), và lipopolysaccharide
endotoxin (c).
7


Bên cạnh những độc tố nói trên, VKL còn có khả năng sản sinh ra những hợp chất sinh học có
hoạt tính (bioactive compounds) như micropeptins, microviridins, cyanopeptolin, microcin,
aeruginosins, scyptolins, cyanostatin (Okino và cs., 1993, 1995; Jakobi và cs., 1995; Banker &
Carmeli, 1999; Ishida và cs., 1999; Matern và cs. 2001; Sano và cs., 2005). Cho đến nay, hàng
trăm các hợp chất này đã được tìm thấy ở Microcystis, Oscillatoria, Anabaena,
Cylindrospermopsis, Nostoc, Nodularia, Lyngbya, Westiellopsis, Scytonema, Hapalosiphon
(Namikoshi & Rinehart, 1996; Bury và cs., 1998; Czarnecki và cs., 2006; Welker & von Dohren,
2006). Một số hợp chất có độc tính mạnh hơn cả các độc tố VKL, một số khác có khả năng kháng
nấm hoặc được dùng nghiên cứu chữa trị bệnh ung thư (Sivonen & Jones, 1999).
1.2 Cơ chế tác động của độc tố vi khuẩn lam

Cơ quan chịu tác động của độc tố thần kinh là hệ thống thần kinh cơ, bộ xương ngoại vi và trao
đổi khí của cơ (Duy và cs., 2000). Độc tố anatoxin-a là một alkaloid, giống như cấu trúc của
acetylcholine, gắn vào thụ quan nicotinic-acetylcholine với một ái lực mạnh hơn acetylcholine
(Aronstam & Witkop, 1981) và không chịu sự thủy phân của enzyme acetylcholinesterase. Vì vậy,
độc tố gây ra sự co cơ và chuột rút kéo theo sự suy nhược, tê liệt và sau cùng là cái chết của nạn
nhân vì ngạt thở (Ressom và cs., 1994). Độc tố này có thể gây chết nạn nhân trong vòng vài phút
(Ressom và cs., 1994).
Độc tố anatoxin-a(s) là một chất ức chế không thuận nghịch enzyme cholinesterase và kìm hãm
enzyme acetylcholinesterase (Mahmood & Carmichael, 1986, 1987). Anatoxin-a(s) gắn vào
enzyme acetylcholinesterase, làm mất khả năng phân giải acetylcholine, gây nên sự kích thíhc quá
mức tế bào cơ và gây suy nhược. Triệu chứng gây nên bởi độc tố này nhìn chung giống như triệu
chứng do anatoxin-a gây ra nhưng kèm theo mất sự điều hòa, tiêu chảy, sùi bọt và lên cơn động
kinh (Mahmood & Carmichael, 1986; Cronberg & Annadotter, 2006).
Chất độc PSP là hợp chất đa vòng và ngăn chặn các kênh ion trong tế bào (Strichart và cs., 1986;
Ressom và cs., 1994). Nó kìm hãm các đầu nối thần kinh và ngăn chặn ion Na+ di chuyển
(Adelman và cs., 1982). PSP vơ hiệu hóa nơron thần kinh cơ và làm tê liệt tế bào cơ. Độc tố
microcystins ức chế enzyme protein phosphatases dẫn đến sự phosphor hóa quá mức của protein
(Eriksson và cs., 1990; Falconer & Yeung, 1992; Honkanan và cs., 1994), gây nên biến đổi của
gan (Hooser và cs., 1991a; Tencalla & Dietrich, 1997), làm rối loạn bộ xương tế bào (Eriksson và
cs., 1989) và làm biến dạng tế bào (Eriksson và cs., 1989; Falconer & Yeung, 1992; Runnegar và
cs., 1981). Microcystinss gây tụ huyết, tổn thương và hoại tử tế bào gan (Hooser và cs., 1991a,b;
Runnegar và cs., 1986). Ngồi ra, nó cịn gây xuất huyết khối u, làm giảm kìm hãm tiếp xúc tự
nhiên của sự phân bào trong cơ quan và được coi như là một chất kích hoạt u bướu (Falconer &
Yeung, 1992). Microcystins là một trong những yếu tố mạnh nhất thúc đẩy cho quá trình ung thư
gan và nó cũng được xem như là nhân tố gây nên quá trình tự chết của tế bào (NishiwakiMatsushima và cs., 1992; Mikhailov và cs., 2003).
Độc tố cylindrospermopsin là một alkaloid. Nó kìm hãm q trình sinh tổng hợp protein, gây tổn
thương ADN, tổn thương ruột, tế bào gan, biến dạng thận, phá hủy thận và gây xuất huyết (Terao
và cs., 1994; Humpage và cs., 2000; Duy và cs., 2000). Lyngbyatoxin-a và aplysiatoxins là
alkaloid, gây bỏng, ngứa cho động vật và con người (Sivonen & Jones, 1999; Codd và cs., 2005).
8

Các chất độc này có thể gây nên khối u và thúc đẩy các khối u phát triển (Fujiki và cs., 1981;
Sivonen & Jones, 1999). Lipopolysacchride (LPS) endotoxins là chất gây ngứa ở bất kỳ cơ quan
nào khi tiếp xúc (Wiegand & Pflugmacher, 2005). Độc tố này được cho là có liên quan đến những
tổn thương đường ruột. Tuy nhiên, cơ chế tác động của nó cho đến nay vẫn chưa được biết đến.
1.3 Tác động lên cá

Nở hoa VKL làm chết hàng loạt cá đã từng được ghi nhận ở hồ Loch Leven, song Leven và hồ
Kezar (Duy và cs., 2000). Cơ quan chính của cá bị ảnh hưởng bởi độc tố VKL là gan và thận
(Wiegand & Pflugmacher, 2005). Tuy nhiên, các cơ quan khác của cá như mang, cơ, ruột và não
cũng xảy ra tình trạng tích lũy độc tố khi phơi nhiễm (Andersen và cs., 1993; Williams và cs.,
1995; Cazenave và cs., 2005). Tích tụ microcystins trong thịt của cá ở vịnh Sepetiba, Braxin, đạt
đến mức rất cao, 39.6 µg/kg, là mối hiểm họa lớn cho người tiêu dùng (Magalhaes và cs., 2003).
Tích tụ sinh học độc tố vi khuẩn lam nodularin trong gan cá biển ở nồng độ cao (300 µg/kg) đã
từng được ghi nhận (Sipia và cs., 2002; Karlsson và cs., 2003).
Độc tố MC làm suy giảm hàm lượng glycogen và hoạt tính của enzyme protein phosphatase trong
gan cá vàng (Carassius auratus L.) (Malbrouck và cs., 2004). Phơi nhiễm với MC ở nồng độ 10
µg MC/lít làm giảm hàm lượng glutathione và gia tăng hoạt tính của enzyme kháng oxy hóa như
reactive oxygen species, superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxide trong tế bào gan
cá chép (Li và cs., 2003). Độc tố vi khuẩn lam (nội độc tố, LPS) làm suy giảm hoạt tính của cả
enzyme GST (nội bào và hịa tan) trong phơi của sọc ngựa, góp phần làm suy yếu khả năng giải
độc của cá đối với độc tố MC (Best và cs., 2002; Pietsch và cs., 2001).
Phơi nhiễm với độc tố MC sẽ tác động xấu lên gan như suy giảm chức năng, xuất huyết, hoại tử,
xuất huyết nội bào và tổn thương thận và mang (Kotak và cs., 1996; Fischer và cs., 2000; Fischer
& Dietrich, 2000). Độc tố MC làm biến dạng nhân, xuất huyết màng và hoại tử tế bào gan của cá
chép (Li và cs., 2007). Tế bào gan cá bị hoại tử ở nồng độ thấp của microcystin (10 và 100 µg/lit
và xuất huyết ở nồng độ cao hơn (1000 µg/lít).
Phơi cá và cá con bị biến dạng ở gan, tim, đầu, đuôi khi phơi nhiễm với độc tố VKL (Liu và cs.,
2002). Trong thí nghiệm chích độc tố vi khuẩn lam ở nồng độ thấp vào phôi cá, tác động xấu của

độc tố lên các cơ quan như ống tiêu hóa, ruột, bao tử của ấu trùng cá medaka (Oryzias latipes) đã
được ghi nhận (Huynh-Delerme và cs., 2005). Sức sống của phôi cá giảm đến 90% khi thực hiện
phơi nhiễm với nồng độ cao của độc tố vi khuẩn lam (Jacquet và cs., 2004).
Nghiên cứu của Osswald và cs. (2007) cho thấy, cá chép con chết sau 24 – 30 giờ phơi nhiễm với
mật độ cao của vi khuẩn lam có độc Anabaena sp. (107 tế bào/lít) chứa độc tố anatoxin-a. Độc tố
MC làm suy giảm đến 40% sức sống của ấu trùng cá sọc ngựa (Danio rerio) ở nồng độ 5 và 50
50µg/lít và làm giảm 10% tổng chiều dài cơ thể ấu trùng cá ở nồng độ 50µg/lít (Oberemm và cs.,
1997). Phơi nhiễm mãn tính với MC gây ảnh hưởng xấu lên sự phát triển của phôi và ấu trùng cá
sọc ngựa (Wiegand và cs., 1999). Ngoài ra, MC gây dị dạng và làm chết phơi cá sọc ngựa sau khi
chích độc tố và phơi (Wang và cs., 2005).
Trong thí nghiệm về thức ăn cho cá của Keshavanath và cs. (1994), cá rơ (tilapia) có xu hướng ăn
nhiều vi khuẩn lam khơng độc, ít chọn lựa ăn vi khuẩn lam có độc. Bên cạnh đó, sự hô hấp và cân
9


bằng thẩm thấu của cá bị tác động và hành vi của cá sọc ngựa cũng bị thay đổi do độc tố vi khuẩn
lam (Bury và cs., 1997; Baganz và cs., 1998; Best và cs., 2003).
1.4 Tổng quan về cá sọc ngựa

Từ những năm đầu của thập niên 70 của thế kỷ 20, TS. George Streisinger đã quyết định chọn cá
cá sọc ngựa (zebrafish, cá ngựa vằn, Danio rerio) như là một kiểu mẫu lý tưởng cho những nghiên
cứu về sự phát triển và di truyền của động vật có xương sống. Từ đó zebrafish được ni và cho
sinh sản trong nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới. Ngồi ra, cá sọc ngựa còn là sự chọn lưa tốt
nhất cho các phịng thí nghiệm ở các trường trung học nước ngoài với một số ưu điểm sau:
-

Khả năng chịu đựng với những ức chế và dao động về nhiệt độ, ánh sáng

-

Dễ nuôi trong điều kiện thiết bị rẻ tiền, có thể ni với mật độ cao

-

Lượng trứng đẻ đủ lớn để sử dụng cho thí nghiệm

-

Sự phát triển phơi cá tương tự những lồi khác

-

Sự sản sinh trứng có thể kích thích bằng việc điều khiển chế độ sáng/tối.

-

Trứng nở thành con trong thời gian ngắn, phát triển nhanh và lượng sinh vật cho thí
nghiệm ln có nhiều trong điều kiện nuôi
Cho đến nay, cá sọc ngựa được sử dụng cho các nghiên cứu về phát triển và bệnh lý. Cá sọc ngựa
có nhiều đặc điểm tương đồng với con người về mặt sinh học vì là động vật có xương sống. Điều
này là một lợi thế của cá sọc ngựa so với kiểu mẫu thí nghiệm ruồi dấm (Drosophilia). Bên cạnh
đó, với vòng đời ngắn và sự phát triển phơi nhanh chóng nên ở một số thí nghiệm, cá sọc ngựa
được ưa thích lựa chọn hơn so với động vật hữu nhũ là chuột (từ một hợp tử ban đầu phát triển
thành cá con diễn ra trong vòng 24 - 96 giờ, trong khi điều đó đối với chuột mất đến 21 ngày). Do
đó, cá sọc ngựa, đến nay, trở thành một trong những ưu tiên chọn lựa trong thí nghiệm trong lĩnh
vực độc học mơi trường nhằm nghiên cứu những ảnh hưởng của các chất độc bao gồm độc tố vi
khuẩn lam lên động vật có xương sống.
1.5 Một số nghiên cứu trong nước
1.5.1 Nghiên cứu về vi khuẩn lam có độc và độc tố vi khuẩn lam

Sự nở hoa hoặc tạo váng của vi khuẩn lam trong các thủy vực cũng được ghi nhận, công bố trên
các tạp chí, báo cáo và thơng tin đại chúng (như báo điện tử Vietnamnet, Vnexpress). Nở hoa của
vi khuẩn lam Microcystis xảy ra hàng năm ở một số hồ như hồ Tây, Hoàn Kiếm ở Hà Nội, hồ Núi
Cốc ở Thái Nguyên, Hồ Xuân Hương ở Đà Lạt, hồ Trị An ở Đồng Nai, hồ Hòa Mỹ ở Huế (Đặng
Hoàng Phước Hiền và cs., 2000; Nguyen, 2007; Dao, 2010; Dương Thị Thủy và cs., 2011) và
nguyên nhân chính được giả thuyết là do phú dưỡng hóa. Đồng thời, nở hoa của Trichodesmium
erythraeum, một loài vi khuẩn lam sống trong nước mặn, định kỳ xảy ra ở ven biển Bình Thuận
gây chết cá, thủy sinh vật và thiệt hại cho ngành du lịch địa phương. Hiện tượng này rất có thể có
liên quan chặt chẽ đến hiện tượng nước trồi ở vùng biển này.
10


Trong vài năm gần đây, độc tố vi khuẩn lam microcystin đã được nghiên cứu và phát hiện ở hồ
Thành Cơng, hồ Hồn Kiếm, Hà Nội bởi Đặng Hồng Phước Hiền và cs. (2000), Hummert và cs.
(2001). Nguyen và cs. (2007) đã có nghiên cứu và phát hiện độc tố vi khuẩn lam microcystin từ
các mẫu nở hoa và mẫu ni trong phịng thí nghiệm, phân lập từ các thủy vực khu vực thành phố
Huế. Tác giả này cũng đã ghi nhận được microcystin từ mẫu thu ở tám thủy vực tại Hà Nội, Đồng
Nai, Huế và Gia Lai với nồng độ lên đến 17,966 µg MC/lít (Nguyen và cs., 2010a). Gần đây nhất
là nghiên cứu của Dao và cs., (2010) đã phát hiện năm đồng phân của độc tố MC trong mẫu vi
khuẩn lam tạo váng ở hồ Trị An với hàm lượng từ 450 – 640 µg MC/g trọng lượng khơ. Ngồi ra,
độc tố cylindrospermopsin cũng đã được tìm thấy từ các mẫu phân lập từ các thủy vực ở Huế và
Gia Lai (Nguyen, 2007; Nguyễn Thị Thu Liên và cs., 2010b).
1.5.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn lam, độc tố vi khuẩn lam lên cá

Những sự cố chết cá do sự bủng phát hay nở hoa vi khuẩn lam ngoài tự nhiên đã từng được ghi
nhận (nở hoa vi khuẩn lam gây chết cá ở hồ Tây và hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội; hồ Dầu Tiếng, Tây
Ninh). Giả thuyết cho những ghi nhận này thường được giải thích với việc suy giảm oxy do nở
hoa, từ đó gián tiếp gây chết cá. Tuy vậy, nguyên nhân trực tiếp và cơng bố chính thức ở nước ta
vẫn chưa có.
Ở nước ta, việc ni cá sọc ngựa thương mại đã được bắt đầu từ hơn 10 năm trước. Hiện tại một

số đại lý, cửa hàng bán cá cảnh có cung cấp lồi cá này. Tuy vậy, những nghiên cứu, đặc biệt là
nghiên cứu về độc học sinh thái trên cá sọc ngựa vẫn chưa được quan tâm, thực hiện nhiều ở Việt
Nam. Năm 2007, nhóm nghiên cứu di truyền học ở trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã thành
công trong việc chuyển gene phát sáng của sứa vào phôi cá. Kết quả là cá con nở ra sau đó có khả
năng phát sáng trong bóng tối. Tuy vậy, cơng trình này đến nay vẫn chưa được cơng bố trên tạp
chí quốc tế. Gần đây, Đào Thanh Sơn và cs. (2011) đã tiến hành thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng
của kim loại (đồng và crom) lên cá sọc ngựa. Kết quả thí nghiệm xác định giá trị EC50-24h của cá
phơi nhiễm với đồng và crom cho thấy, giá trị EC50-24 giờ với cá sọc ngựa là 0,609 mg/L đối với
đồng và 1,076 mg/L đối với crom. Bên cạnh đó, cả đồng và crom đều có ảnh hưởng lên cá sọc
ngựa bao gồm hành vi bơi và sự hoạt động của cá. Tuy vậy, cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có
bất kỳ một cơng bố khoa học nào liên quan đến ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam lên cá nói
chung và cá sọc ngựa nói riêng.
1.6 Giới thiệu về hồ Xuân Hương

Hồ Xuân Hương, Đà Lạt, là một thắng cảnh quốc gia, địa danh nổi tiếng và là địa điểm tham quan
du lịch góp phần tạo nên nét đặc sắc cho Đà Lạt. Đây là một hồ nước có dịng chảy và nước trong
hồ thường xuyên được cung cấp, thay đổi. Hồ có chu vi 5,5 km, diện tích mặt hồ khoảng 32 ha,
dung tích 0,72 triệu m3 và dịng chảy trung bình năm là 0,7m/s. Các nhánh suối đổ vào hồ vào
mùa mưa mang theo một lượng lớn hợp chất hữu cơ và dinh dưỡng từ thượng nguồn và từ các
hoạt động sản xuất nơng nghiệp (trồng rau xanh). Ngồi ra, hồ còn là nơi tiếp nhận nguồn nước
thải sinh hoạt của cư dân sống trong khu vực, nước từ hoạt động tưới của sân golf, vườn hoa và lò
mổ (UBND tỉnh Lâm Đồng, 2012). Với sự tiếp nhận chất thải liên tục từ nhiều nguồn khác nhau,
nước hồ Xuân Hương trở nên phú dưỡng hóa dẫn đến sự nở hoa của vi khuẩn lam xảy ra thường
11


xuyên hơn, với mức độ ngày càng nặng nề. Hậu quả của nở hoa vi khuẩn lam làm cho chất lượng
nước hồ càng trở nên tồi tệ hơn với mùi khó chịu (hơi, thối) và chết cá. Điều đó ảnh hưởng lớn
đến hoạt động du lịch trên hồ và môi trường sống của người dân địa phương. Đồng thời nước hồ
Xuân Hương là nguồn nước cấp cho thác Cam Ly nên nở hoa vi khuẩn lam và độc tố của chúng sẽ

theo dòng nước ảnh hưởng trực tiếp lên thắng cảnh du lịch Cam Ly (màu, mùi) và du khách tham
quan (tiếp xúc trực tiếp). Về phương diện chất lượng nước và hệ sinh thái, độc tố vi khuẩn lam có
ảnh hưởng rất lớn lên cân bằng hệ sinh thái thủy vực, đặc biệt khi có nở hoa vi khuẩn lam. Tuy
nhiên, việc xác định vi khuẩn lam gây độc và đánh giá mức độ độc của vi khuẩn lam trong hồ
Xuân Hương cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết. Vì vậy, nghiên cứu về độc tố vi khuẩn lam
trong hồ cũng như ảnh hưởng xấu của độc tố lên sinh vật là điều cấp thiết.

12


Chương 2 Vật liệu và phương pháp
2.1 Phạm vi nghiên cứu

Khu vực nghiên cứu là hồ Xuân hương, với diện tích mặt hồ khoảng 32 ha, hồ nằm ngay tại trung
tâm thành phố Đà Lạt với dân số hơn 200.000 người (năm 2011). Nguồn ơ nhiễm chính cho hồ là:
nước thải sinh hoạt và nước thải nơng nghiệp.
Ba vị trí thu mẫu được chọn nhằm khảo sát các yếu tố hóa lý và sinh vật (Hình 3). Mẫu lấy được
kí hiệu lần lượt là HXH1 (đầu hồ), HXH2 (giữa hồ) và HXH3 (cuối hồ) và tiến hành thu 3 đợt
trong khoảng thời gian 1 năm sao cho các thời điểm lấy mẫu sẽ nằm trong khoảng mùa khô, mùa
mưa và chuyển mùa của Đà Lạt.

Hình 3: Sơ đồ thu mẫu tại hồ Xuân Hương, Đà Lạt
2.2 Các yếu tố hóa lý mơi trường nước

Các yếu tố hóa lý của nước mặt được đo trực tiếp ngoài hiện trường là pH (Metrohm 744), độ
trong (đĩa Sechi) và nhiệt độ (WTW oxi197i). Nước được thu vào can nhựa 2l và giữ lạnh ở 4oC,
sau đó được đem về phịng thí nghiệm để phân tích các thơng số NO3, NH4, TN, PO4 và TP.
Hút 400mL mẫu, cho dung dịch phân hủy (hỗn hợp nhiều hóa chất, khi cho vào, mẫu sẽ khơng có
màu xanh dương), đun lên cho đến khi dung dịch chuyển màu xanh dương trong suốt, và khơng
còn khói bay ra. Cho nước, dung dịch kiềm vào, để lên giàn chưng cất. Hấp thu bằng H3BO3

(Bảng 1). Chỉ thị hỗn hợp, đổi màu, chuẩn độ lại bằng H2SO4, tính tốn ra hàm lượng tổng nitơ.

Bảng 1. Thành phần chất chuẩn cho phân tích TN
13


Nồng độ (g/L)

Chất chuẩn
Dung dịch phân hủy:
K2SO4

134

CuSO4

7,3

H2SO4

134 (mL)

Dung dịch Sodium hydroxide-thiosulfate:
NaOH

500

Na2S2O3.5H2O

25

Dung dịch Borate buffer:
Na2B4O7.10H2O

9,5

NaOH (0.1N)

88 (mL)

Nồng độ của nitơ trong mẫu được tính như sau: NH3-N (mg N L-1) = (A – B) × 280 / mL mẫu.
Trong đó, A = thể tích H2SO4 dùng cho chuẩn độ cho mẫu nước, B = thể tích H2SO4 dùng cho
chuẩn độ mẫu trắng.
Ammonium được phân tích bằng phương pháp so màu theo hướng dẫn của 4500NH4+ (F), APHA
(2005). Phân tích ammonium: lấy 25mL mẫu, cho chất hiện màu vào (1mL phenol, 1mL sodium
nitroprusside), cho thêm 2.5mL dung dịch oxy hóa (oxidizing solution) (Bảng 2), để yên 2h sau
mới đo trên máy so màu Spectrometer (Hach DR/2010) ở bước sóng 640nm. Nồng độ mẫu được
tính tốn dựa trên đường chuẩn với chất chuẩn là NH4Cl.
Bảng 2. Thành phần chất chuẩn cho phân tích ammonium
Chất chuẩn

Nồng độ (g L-1)

Dung dịch Phenol: pha 11,1 mL phenol (> 89%) với 95 % (v/v) ethylene alcohol thành
100 mL dung dịch
Dung dịch Sodium nitrosuprusside :
Na2Fe(CN)5NO.2H2O

5

Dung dịch oxy hóa: pha 100 mL alkaline citrate với 25 mL dung dịch hypochlorite (5%)
Dung dịch Alkaline citrate:
Na3C6H5O7

200

NaOH

10

Nitrate được phân tích theo hướng dẫn ISO 7890-3 (1988). Lấy 25mL mẫu, cho 0,5mL NaN3
(sodium nitrua, Bảng 3) vào, nhằm ngăn quá trình chuyển NO2 thành NO3. Cho thêm 0.2mL acid
acetic vào. Đun cách thủy 800C đến khi cạn mẫu, để nguội. Cho 1mL sodium salicylate vào, lắc
đều. Đun cách thủy đến cạn, để nguội. Cho 1mL H2SO4 đậm đặc, lắc đều, cho 10mL nước cất vào,
14


thêm 10mL dung dịch kiềm (hỗn hợp), để nguội. Định mức (với nước cất) thành 25mL. Đo trên
máy so màu Spectrometer (Aligent 8453) ở bước sóng 415nm. NaNO3 được dùng làm chất chuẩn
để tính nồng độ nitrate trong mẫu nước hồ.
Bảng 3. Thành phần chất chuẩn cho phân tích nitrate
Chất chuẩn

Nồng độ (g L-1)

Dung dịch Sodium nitrua: NaN3

0.5

Dung dịch Sodium salicylate: C7H5O3Na

10

Sodium hydroxide:

25

NaOH

Tổng phosphor được phân tích theo phương pháp 4500P (D), APHA 2005. Lấy 50 mL mẫu, thêm
1 mL H2SO4 và 0,5g K2S2O8, (potassium persulfate), đun cạn còn 5 – 10 mL, để nguội. cho hiện
màu bằng (3 giọt) phenolphthalein. Dùng NaOH 6 N cho vào đến khi có màu hồng, định mức
thành 50 mL (bằng nước cất). Cho từng giọt hỗn hợp (H2SO4 + HNO3) cho mất màu hồng. thêm 2
mL molybdate (Bảng 4), 5 giọt SnCl2, chờ 8 – 12 phút, so màu bằng máy Aligent 8453 ở bước
sóng 690 nm. Orthophosphate được phân tích tương tự tổng phosphor, ngoại trừ giai đoạn oxy hóa
mẫu với acid.
Bảng 4. Thành phần chất chuẩn cho phân tích phosphor
Chất chuẩn

Nồng độ (g L-1)

Dung dịch Molybdate:
(NH4)6Mo7O24.4H2O

25

H2SO4

280 (mL)

Dung dịch acid: cho từ từ 300 mL H2SO4 vào 600 mL nước cất. sau khi làm nguội,
thêm 4 mL HNO3 và pha loãng thành 1 lít
Dung dịch Stannous chloride: hịa tan 2,5 g SnCl2.2H2O trong 100 mL glycerol
Giới hạn phát hiện của các yếu tố hóa học theo các phương pháp phân tích là 0,04 mg N L-1
(ammonium), 0,02 mg N L-1 (nitrate), 0,06 mg N L-1 (TN) và 0,05 mg P L-1 (cho cả
orthophosphate và tổng phosphor).
2.3 Thu mẫu vi khuẩn lam

Mẫu vi khuẩn lam được thu ngoài thực địa, bao gồm mẫu nở hoa và mẫu dùng để phân lập. Mẫu
vi khuẩn lam nở hoa và mẫu vi khuẩn lam dùng để phân lập được thu bằng vợt phiêu sinh có kích
thước mắt lưới 25 µm, cho vào bình và can và được giữ ở nhiệt độ mát (< 25oC) trong khi vận
chuyển về phịng thí nghiệm.

15


Vi khuẩn lam được quan sát dưới kính hiển vi (Olympus BX51) ở độ phóng đại 400 – 800 lần
Việc định danh được dựa trên cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại của Komárek &
Anagnostidis (1989, 1999, 2005), Komárek & Komarkova (2002, 2005). Mô tả VKL dựa trên
những quan sát mẫu cố định và mẫu nuôi. Xác định mật độ VKL bằng cách đếm bằng buồng đếm
Sedgewick-Rafter.
Vi khuẩn lam được phân lập bằng phương pháp hút pipet và rửa mẫu (Belcher và Swale, 1988) và
nuôi trong môi trường Z8 (Kotai, 1972).
Độc tố vi khuẩn lam (microcystin) từ mẫu nuôi và mẫu vi khuẩn lam nở hoa sẽ được xác định
bằng phương pháp ELISA (Uneo và cs., 1996) sử dụng kít của nhà cung cấp (cơng ty) Abraxis.
Việc ly trích tạo mẫu độc chất được tiến hành bằng cách cho sinh khối (một lượng xác định) và
nước cất hai lần, sau đó đơng lạnh sâu (ở nhiệt độ -70⁰C), rã đông và siêu âm phá vỡ vách tế bào.
Chu trình này được lặp lại 5 lần. Sau cùng, mẫu sẽ được ly tâm (5000 rpm) ở 4⁰C trong 10 phút.
Phần dịch trong sẽ được sử dụng cho phân tích trên bộ kit ELISA (trên bộ kit đã có các giếng
(well) chứa chất chuẩn MC cho việc thực hiện đường chuẩn độc tố). Nồng độ độc tố MC trong

mẫu ly trích sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn. Trong điều kiện cho phép (liên hệ cộng tác
thành công với chuyên gia làm việc ở nước ngoài + chi phí cho việc gởi và phân tích mẫu ở nước
ngồi), mẫu ly trích sẽ được gởi phân tích tại phịng thí nghiệm ở nước ngồi (Nhật Bản) bằng
thiết bị cao áp sắc ký lỏng (HPLC)/ kết hợp khối phổ (MS) nhằm tăng thêm độ chính xác của hàm
lượng độc tố trong mẫu thu từ hồ Xuân Hương
2.4 Ảnh hưởng của VKL lên cá sọc ngựa
2.4.1 Xác định LC50-48 giờ

Thí nghiệm xác định LC50 - 48h của độc tố vi khuẩn lam lên cá sọc ngựa được tiến hành theo hướng
dẫn của Standard Methods (APHA, 2005). Sinh vật thử nghiệm sử dụng ở đây có nguồn gốc từ cá
con được sinh ra từ D. rerio bố mẹ khỏe mạnh được nuôi trong điều kiện chuẩn của phịng thí
nghiệm Độc học mơi trường, Viện Môi trường và tài nguyên, Đại học quốc gia TP. HCM. Sinh
vật được tiến hành nuôi ở 28 ± 2oC bằng nước cất 2 lần sau đó được pha với hỗn hợp muối biển
(Tetra Marine, Đức) sao cho nồng độ muối sẽ nằm trong khoảng 2 – 3‰ với quang kì 12 giờ
sáng/12 giờ tối, cường độ sáng 100-1000 lx. Đối với một thử nghiệm độc học cấp tính sẽ có ít nhất
là 6 nghiệm thức (đối chứng + 5 nồng độ thử nghiệm). Các thí nghiệm được tiến hành trong cốc
thủy tinh 250 ml có chứa 200 ml mơi trường. Mỗi cốc dùng trong thí nghiệm được cho vào 5 con
cá sọc ngựa dưới 2 tuần tuổi. Mỗi nồng độ làm lặp lại 4 lần. Các bình chứa môi trường nuôi cá và
16


nồng độ độc tố vi khuẩn lam khác nhau. Một lô đối chứng (môi trường nuôi cá không chứa độc tố)
được tiến hành cùng lúc. Sau 48 giờ thí nghiệm, ghi nhận số cá con bất hoạt hoặc bị chết trong các
bình thí nghiệm. Giá trị LC50-48 giờ được tính dựa vào chương trình trên Excel và phần mềm
EPA 93.
2.4.2 Ảnh hưởng lên phôi cá

Cá sọc ngựa được nuôi và duy trì trong mơi trường nhân tạo tại PTN Độc học môi trường, Viện
môi trường và tài nguyên ở 28°C ± 2oC với quang kì 12 giờ:12 giờ sáng/tối. Để tiến hành sinh sản,
cá đực và cái trưởng thành được cho vào bể 4 l có rải lớp sỏi bên dưới và cho đẻ tự do. Sau khi dẻ

thành công, trứng sẽ rơi xuống lớp sỏi và sau đó các trứng này được thu nhận bằng ống hút. Sau
khi thu nhận, tiến hành rửa trứng bằng môi trường nhân tạo và chuyển trứng vào đĩa Petri có chứa
mơi trường ni cá. Trứng chết hay có chất lượng kém sẽ được loại bỏ. Trứng cịn lại sẽ được
dùng, thường thì q trình loại bỏ trứng chết và kém chất lượng sẽ diễn ra trong khoảng 2 giờ sau
khi nhận trứng, cho thử nghiệm độc học.
Thí nghiệm sẽ được tiến hành trong các đĩa 96 giếng. Trước khi cho trứng vào, dịch chiết VKL đã
được pha loãng (100, 50, 20, 10 μg/L nồng độ dịch chiết và đối chứng) (có hai loại dịch chiết: dịch
chiết từ mẫu tảo nở hoa tự nhiên và dịch chiết từ mẫu tảo nuôi) được cho vào các giếng. Phôi cá ở
giai đoạn 4-32 tế bào được thu nhận và chuyển vào các giếng thử nghiệm (1 phôi/giếng) bằng cách
hút bằng pipette nhựa ở miệng hút rộng nhằm giảm tối gia sự tổn thương trứng.
Sự phát triển phôi được quan sát hàng ngày (trong khoảng 48 giờ) bằng kính lúp, và bất kì sự phát
triển bất thường nào cũng được ghi nhận. Thử nghiệm được xem là hợp lệ khi tỉ lệ chết và các bất
thường về phát triển ở đối chứng chỉ xảy ra dưới 10%.
2.4.3 Ảnh hưởng lên cá con

Cá con nở ra từ thí nghiệm ảnh hưởng lên phôi cá (ấu trùng) được tiếp tục cho phơi nhiễm với dich
chiết mẫu tảo nở hoa ở nồng độ 10 µg/l hoặc ni trong mơi trường khơng có dịch chiết (đối chứng),
thí nghiệm kéo dài trong khoảng 2 tuần. 30 cá con (ấu trùng) sẽ được sử dụng cho mỗi lơ thí nghiệm
(đối chứng hoặc phơi nhiễm). Cá (ấu trùng) sẽ được ni trong bình thủy tinh (100 mL), cho ăn bằng
bột trứng và thức ăn thương phẩm (Tetramin, Đức) hàng ngày. Mỗi tuần thay nước 2 lần, mỗi lần thay
½ lượng nước trong bình thí nghiệm. Hàng ngày, theo dõi sự phát triển, sức sống của cá con (ấu trùng)
trong suốt thời gian thí nghiệm. Các thông số về tỷ lệ chết, thời gian cá chết... sẽ được ghi nhận hàng
ngày.
17


2.4.4 Ảnh hưởng lên hành vi cá

Cá con khoảng 2 tuần được sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn lam
lên hành vi của cá sọc ngựa được tiến hành trên thiết bị Toximeter (BBE, 2005). Cho cá con vào 2

buồng đo của Toximeter, mỗi buồng 6 (5- 7) cá thể. Cho thiết bị Toximeter hoạt động với nguồn
nước sạch (giống như nước trong bể ni cá) trong khoảng 5 giờ để có đường biểu đồ chuẩn và
đảm bảo cá sống khỏe. Sau đó cho dịch chiết mẫu tảo nở hoa (10 µg/l) vào và thí nghiệm được
tiếp tục tiến hành. Sự chuyển động của mỗi cá con sẽ được ghi nhận bằng bằng ảnh video, và sau
đó sẽ được chuyển sang dạng kĩ thuật số. Các kiểu tập tính sau được đo: tốc độ bơi, vị trí phân bố,
khoảng cách giữa các cá thể, số sinh vật còn hoạt động được ghi nhận bằng hệ thống Toximeter và
sau đó được tính tốn bằng phần mềm chuyên dụng của máy.

18