Tạo dòng gene mã hóa polysaccharide monooxygenase (PMO) trên vector pEX2B hướng tới biểu hiện trong aspergillus oryzae

NTTU-NCKH-04

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài: Tạo dịng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) trên
vector pEX2B hướng tới biểu hiện trong Aspergillus oryzae
Số hợp đồng: 2019.01.07/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp
Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT
Thời gian thực hiện: 9 tháng

TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2019

1


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------------------------------------------------Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019
Tên đề tài: Tạo dịng gene mã hóa Polysaccharide Monooxygenase (PMO) trên vector

pEX2B hướng tới biểu hiện trong Aspergillus oryzae
Số hợp đồng: 2019.01.07/HĐ-KHCN
Chủ nhiệm đề tài: Hồ Tá Giáp
Đơn vị công tác: Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT
Thời gian thực hiện: 9 tháng
Các thành viên phối hợp và cộng tác:
STT

Họ và tên

Chuyên ngành

Cơ quan công tác

1

Hồ Tá Giáp

Sinh học

Viện Kĩ thuật Công nghệ
cao NTT

TP. Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 09 năm 2019
ii

Ký tên


MỤC LỤC

PHỤ LỤC 1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................ V
PHỤ LỤC 2. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ..............................................................VI
PHỤ LỤC 2. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .......................................................... VII
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................... VIII
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 2
1.1.
1.2.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGHÀNH CÔNG NGHIỆP NĂNG LƯỢNG TÁI CHẾ ...... 2
TINH BỘT ......................................................................................................... 3

1.3.
ENZYME HOẠT TÍNH TRÊN TINH BỘT ............................................................... 4
1.3.1. Endoamylase và exoamylases ...................................................................... 4
1.3.2. Các enzyme cắt nhánh ................................................................................. 4
1.3.3. Transferase .................................................................................................. 5
1.3.4. Starch-active polysaccharide monooxygenases .......................................... 5
1.4.
1.5.

CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ......................................................................... 6
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE VÀO NẤM SỢI ............................................ 7

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 9
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................................... 9
2.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 9
2.2.1. Cách tiếp cận ................................................................................................... 9
2.2.2. Vật liệu ............................................................................................................ 9
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 10

2.3.1 Polymerase chain reaction (PCR).................................................................. 10
2.3.2. Nuôi cấy tế bào .............................................................................................. 11
2.3.3. Phương pháp tạo dòng DNA ......................................................................... 12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 13
3.1. THIẾT KẾ CẶP PRIMER NHÂN BẢN NCU08746...................................................... 13
3.2. KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA PHẢN ỨNG PCR VỚI CẶP MỒI NHÂN BẢN NCU08746
.................................................................................................................................... 15
iii


3.3. TẠO DÒNG NCU08746 LÊN VECTOR PEX2B ....................................................... 15
3.4. GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM VECTOR TÁI TỔ HỢP .................................................... 17
3.5. TẠO CHỦNG A. TUMEFACIENS MANG PLASMID PEX2B-NCU08746 .................... 20
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 23
PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................... ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
PHỤ LỤC 4. (HỢP ĐỒNG, THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG) .................................................. 27

iv


PHỤ LỤC 1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
-PMO

Polysaccharide monooxygenase

-CAZy

Carbohydrate-Active enZYmes

-PCR

Polymerase Chain Reaction

-NCBI

National Center for Biotechnology Information

-DNA

Deoxyribonucleic acid

-dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

-TAE

Tris-acetate-EDTA

-AA

Auxiliary Activities

-RE

Restriction enzyme

-NCBI

National Center for Biotechnology Information

v


PHỤ LỤC 2. DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1. Cấu trúc của tinh bột: từ mức hạt đến mức nguyên tử ........................................ 3
Hình 2. Các loại enzyme hoạt động trên tinh bột............................................................. 4
Hình 3. Hoạt tính của AA13 PMO trên tinh bột .............................................................. 6
Hình 4. Các bước cơng nghệ DNA tái tổ hợp .................................................................. 7
Hình 5. Vi khuẩn A. tumefaciens chuyển gene vào thực vật ........................................... 8
Hình 6. Phương pháp PCR ............................................................................................. 11
Hình 7. Bản đồ pEX2B và các marker ........................................................................... 13
Hình 8. Các vị trí cắt đặc hiệu cho RE của NCU08746 ................................................. 14
Hình 9. Kết quả điện di NCU08746 ............................................................................... 15
Hình 10. DH5α biến nạp ni trên LB agar ................................................................... 16
Hình 11. Kết quả điện di sản phẩm colony PCR các chủng DH5α ............................... 17
Hình 12. So sánh trình tự sản phẩm với trình tự NCU08746 ........................................ 19
Hình 13. Các chủng A. tumefaciens biến nạp nuôi trên LB agar ................................... 20
Hình 14. Kết quả điện di Sản phẩm colony PCR các chủng A. tumefaciens ................ 21
Hình 15. Quy trình chuyển gene vào A.oryzae AUT1-PID nhờ A. tumefaciens .......... 22

vi


PHỤ LỤC 2. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Danh sách hóa chất ............................................................................................. 9
Bảng 2. Danh sách thiết bị và dụng cụ ........................................................................... 10
Bảng 3. Các primer cho phản ứng PCR ......................................................................... 14

vii


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sán phẩm đăng ký tại thuyết

Sản phẩm thực đạt được
minh
Bài báo đăng trên tạp chí

Bài báo đăng trên tạp chí

Khoa học Cơng nghệ Nguyễn Tất

Khoa học Công nghệ Nguyễn Tất

Thành

Thành

Thời gian đăng ký : từ ngày 01/2019 đến ngày 09/2019
Thời gian báo cáo: 02/10/2019

viii


MỞ ĐẦU
Polysaccharide monooxygenase (PMO) là hệ thống enzyme được tổng hợp và

tiết bởi các vi khuẩn và vi nấm. Dựa vào khả năng phân hủy các polysaccharide bằng
các phản ứng oxy hóa khử tại liên kết glycosidic, hiện tại enzyme này được biết đến
với ba nhóm chính bao gồm: chitin, cellulose và tinh bột. Không giống như cấu trúc
đồng nhất của chitin và cellulose, cấu trúc bậc cao của tinh bột phức tạp. Tinh bột là
một hỗn hợp của amylose và amylopectin với tỷ lệ tương đối khác nhau tùy thuộc vào
nguồn gốc. Ngoài sự phức tạp trong cấu trúc của amylose và amylopectin, các xoắn
kép có thể hình thành giữa amylose và amylopectin trong tinh bột, làm phức tạp hơn
nữa cấu trúc. Do đó, việc phân giải tinh bột bằng các enzyme truyền thống có hiệu suất
thấp. PMO được khám phá với tiềm năng hỗ trợ trong việc phân giải tinh bột đã được
kiểm chứng, cụ thể, sử dụng PMO vào sản xuất β-amylase của maltose từ tinh bột có
thể tăng năng suất lên tới 100 lần. Năm 2014, hoạt tính của NCU08746, một họ
enzyme mới của PMOs (AA13), được chứng minh có khả năng phân giải amylose,
amylopectin và tinh bột. AA13 tính đến nay là họ PMOs duy nhất có hoạt tính tại α,1-6
glucosidic.
Hiện nay, PMO đang là đối tượng hấp dẫn các nhà Công Nghệ Sinh Học vì
những đặc tính quan trọng và mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới. Do đó, việc tạo dịng
biểu hiện PMO là nghiên cứu quan trọng trong việc cung cấp PMO phục vụ thí
nghiệm. Điển hình, Vu VV và cộng sự (2013) đã biểu hiện thành công một loại PMO
đặc hiệu tinh bột bằng hệ thống nấm sợi Neurospora crassa. Tuy nhiên, đề tài này tiếp
cận hệ thống biểu hiện bằng Aspergillus oryzae vì một số lý do: thứ nhất là A. oryzae là
chủng an toàn cho con người, chúng được sử dụng rộng rãi để sản xuất các loại thực
phẩm lên men truyền thống; thứ hai là A. oryzae có khả năng tiết một lượng lớn protein
ra môi trường, do đó chúng cũng được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme công
nghiệp như amylase, protease, lipase và phytase,…; thứ ba là dữ liệu genomic có sẵn
và dễ dàng truy cập.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Công nghệ sinh học và nghành công nghiệp năng lượng tái chế
Hiện nay, sự phát triển của xã hội hiện đại đòi hỏi mức tiêu thụ năng lượng ngày

càng tăng. Song song đó, các vấn đề ơ nhiễm mơi trường và biến đổi khí hậu do khí
thải CO2 đã thúc đẩy việc tìm kiếm nguồn năng lượng thay thế từ nguồn phế thải có thể
tái tạo thành năng lượng.1 Các loại sinh khối thực vật được tái sử dụng bao gồm để sản
xuất thực phẩm, vật liệu hoặc các nghành công nghiệp khác nhưng không phải là
chuyển đổi thành năng lượng. Thêm vào đó, nền kinh tế sinh học hiện đại đối mắt với
nhiều thách thức như tính bền vũng của nguyên liệu sinh khối thực vật, hiệu quả sử
dụng sinh khối thực vật có mang lại lợi ích nhiều hơn các nghành khác khơng và vấn
đề kinh tế khi triển khai chuyển đổi sinh khối thực vật thành năng lượng.2,3
Sinh khối thực vật và nguyên liệu có nguồn gốc thực vật có thể làm nguyên liệu
sản xuất xăng sinh học, năng lượng sinh học và chế phẩm sinh học. Dựa vào sinh khối
thực vật, có thể chia xăng sinh học thành hai loại: xăng sinh học thế hệ thứ nhất và thế
hệ thứ hai. Xăng sinh học thế hệ thứ nhất được sản xuất từ nguyên liệu là mía, ngủ cốc,
dầu thực vật, các loại củ…Đây là giải pháp giúp cải thiện ô nhiễm CO2 và an ninh năng
lượng quốc gia. Một vấn đề của xăng sinh học thế hệ thứ nhất là nguyên liệu sản xuất
liên quan đến thực phẩm. Do đó, hiện nay nguồn nguyên liệu để sản xuất chủ yếu là
phế thải từ nhà máy bia, vỏ các loại củ từ các nhà máy.1,4 Một giải pháp thay thế cho
vấn đề này là thay thế bằng xăng sinh học thế hệ thứ hai. Đây là giải pháp được đánh
giá cao hơn vì nguyên liệu sử dụng là cellulose, chủ yếu là tàn dư sau thu hoạch của
nghành nông nghiệp như rơm, bã mía…Mặc dù được đánh giá cao tuy nhiên nhiên chi
phí để chuyển đổi sinh khối chủ yếu là cellulose thành năng lượng rất khó khăn nên chi
phí sản xuất là cao.1,5 Ngoài ra, hai loại xăng sinh học thế hệ thứ ba và thứ tư đang
được nghiên cứu.6
Hiện nay, để xử lý sinh khối thực vật với cấu trúc là các polysaccharide thì
phương pháp sử dụng là phương pháp hóa học và sử dụng nhiệt. Một phương pháp
khác đầy hứa hẹn là sử dụng enzyme để phân giải sinh khối.7 Enzyme là cơng cụ tiềm

năng vì tính an tồn, không gây ô nhiễm nên thường được ứng dụng trong các ứng
dụng cơng nghệ sinh học xanh.7 Ngồi ra, enzyme có tính chọn lọc cao và điều kiện
phản ứng đơn giản là phụ thuộc nhiệt độ và pH.7 Vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu

2


chun sâu như tính đặc hiệu, các thơng số động học, tính ổn định của enzyme để có
thể ứng dụng vào quy mô công nghiệp.7
1.2.

Tinh bột
Tinh bột là một nguồn sinh khối dồi dào tự nhiên, được sản bởi hầu hết các loại

thực vật và được dự trữ tạm thời trong lá cây hoặc lưu trữ lâu dài trong rễ, củ và hạt.8,9

Hình 1. Cấu trúc của tinh bột: từ mức hạt đến mức nguyên tử10
Tinh bột là một loại Semi-crystaline (bán tinh thể) khơng hịa tan, có thành phần
bao gồm Amylose và Amylopectin. Amylopectin là thành phần chính của tinh bột với
tỷ lệ 70-80% trong hầu hết các loại thực vật.10 Amylopectin là phân tử phân nhánh cao
với mạch chính chứa các liên kết α-1,4 và mạch nhánh chiếm 5-6% được tạo thành bởi
liên kết α-1,6.9 Amylose cơ bản là một phân tử mạch thẳng với cấu trúc gồm các đơn vị
glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4.11 Cấu trúc tinh thể của tinh bột được hình
thành nhờ vào các chuỗi mạch đôi helical được tạo nên bởi amylopectin và vùng trung
gian của các cấu trúc này được gọi là amorphous.10 Amylose trong tinh bột có cấu trúc
bất định và được cho tồn tại trong các amorphous.8 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra
rằng amylose có thể tự liên kết lại với nhau tạo thành tinh thể12 và ở trong tinh bột, tỉ lệ
amylose cũng ảnh hưởng đến sự kết tinh của tinh bột.13

3

1.3.

Enzyme hoạt tính trên tinh bột

1.3.1. Endoamylase và exoamylases
Endoamylases là những enzyme có thể phân cắt liên kết α,1-4 glycosidic tại bên
trong cấu trúc của amylose và amylopectin. α-Amylase được biết đến là một loại
endoamylase và được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật.14 Sản phẩm cuối cùng của quá
trình cắt polysaccharide bằng amylase là các oligosaccharide với các kiểu hình khác
nhau bao gồm oligosaccharide mạch thẳng và dextrins (là một kiểu hình có nhánh).14
Nhóm enzyme thứ hai là exoamylase, đây là nhóm những enzyme có thể hoạt
động như các β-amylase có hoặt tính trên liên kết α,1-4 glycosidic, hoặc hoạt tính cả
trên α,1-4 và α,1-6 như amyloglucosidase, glucoamylase và α-glucosidase. Exoamylase
tác động từ bên ngoài mạch polysaccharide nên sản phẩm tạo ra là những glucose,
maltose và dextrins.15

Hình 2. Các loại enzyme hoạt động trên tinh bột15
1.3.2. Các enzyme cắt nhánh
Nhóm enzyme thứ ba trong nhóm các enzyme có hoạt tính trên tinh bột là các
enzyme cắt nhánh (debranching enzymes). Đây là nhóm enzyme duy nhất có haotj tính
thủy phân liên kết α,1-6 glycosidic bao gồm: isoamylase và pullanase type I. Sự khác
biệt chủ yếu giữa isoamylase và pullulanase là khả năng thủy phân của pullulanse, một
polysaccharide với sự lặp lại của các maltotriose với liên kết α,1-6.16 Pullulanases thủy

4


phân liên kết α,1-6 glycosidic của pullulan và amylopectin, trong khi isoamylase chỉ có

thể thủy phân liên kết α,1-6 glycosidic của amylopectin.15
1.3.3. Transferase
Một nhóm enzyme thứ 4 của nhóm các enzyme hoạt tính trên tinh bột là các
transferase, là các enzyme có hoạt tính phân cắt liên kết α,1-4 glycosidic của phân tử
cho cà chuyển phân tử cho đến glycosidic nhận và tạo thành liên kết glycosidic mới.
Các enzyme như các amylomaltase và cyclodextrin cosyltransferase tạo thành liên kết
α,1-4 glycosidic mới trong khi branching enzyme tạo thành liên kết α,1-6 glycosidic
mới.15
1.3.4. Starch-active polysaccharide monooxygenases
Nhờ công bố khoa học về phát hiện một nhóm enzyme mới có thể phân cắt
polysaccharide dựa vào hoạt tính oxy hóa,17 hệ thống dữ liệu CAZy đã mở rộng thêm
một lớp enzyme mới là nhóm enzyme có hoạt tính bổ trợ (auxiliary activities-AAs).18
Các họ enzyme AA hoạt động nhờ vào sự phối hợp với các GHs, PLs và CEs enzymes
để phân cắt carbonhydrates.18 Có thể phân loại PMOs thành 4 nhóm: nhóm 1 là PMOs
nguồn gốc từ nấm và có hoạt tính oxy hóa cellulose (tên gọi là GH61 và AA9)19; nhóm
2 là PMOs nguồn gốc từ vi khuẩn và có hoạt tính trên cả chitin17,20 và cellulose20,21 (tên
gọi là CBM33 và AA10); nhóm thứ 3 là PMOs nguồn gốc từ nấm và có hoạt tính trên
chitin (AA11)22; Nhóm thứ 4 là PMOs nguồn gốc từ nấm và có hoạt tính trên tinh bột
(AA13).23
PMOs hoạt tính tinh bột được phát hiện và công bố bởi Vu V. V và cộng sự.23
Họ enzyme AA13 PMOs được biết đến với khả năng oxy hóa để phân cắt tinh bột và
được sử dụng cùng với các amylase để lên men tinh bột.

5


Hình 3. Hoạt tính của AA13 PMO trên tinh bột
AA13 PMOs có thể oxy hóa tại vị trí C1 của liên kết α,1-4 glycosidic để tạo
thành malto-aldonic acids.23,24 Quá trình này tương tự như quá trình phân cắt tại vị trí
β,1-4 và β,1-3 glycans được biết đến của họ PMOs.19,25,26 Ngồi ra, AA13 PMOs cịn

được biết đến là họ enzyme duy nhất của gia đình PMOs có hoạt tính đối với liên kết
α,1-6.23
1.4.

Công nghệ DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp là công nghệ chủ yếu dựa trên DNA và đã mở ra

một kỷ nguyên mới cho công nghệ sinh học hiện đại. Với phương pháp này, một đoạn
gene hoặc nhiều đoạn gene được xác định và chèn vào bộ gene hoặc hệ thống khác.
Ứng dụng công nghệ này đã tạo ra insulin, một loại thuốc chữa bệnh đái tháo đường rất
phổ biến ngày nay.27
Khái niệm đầu tiên về công nghệ DNA tái tổ hợp được mô tả bởi Werner Arber,
cụ thể là về các enzyme cắt giới hạn có tác dụng cắt nhỏ các đoạn DNA ngoại lai. Từ
sự kiện này, các nhà di truyền học đã ứng dụng để cắt và chèn các đoạn DNA theo ý
muốn. Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp được đánh dấu bằng hợp tác của
Stanley Cohen và Herbert Boyer năm 1972. Họ đã đồng sáng lập ra công ty Genetech
năm 1976 với ứng dụng trên công nghệ DNA tái tổ hợp.27

6


Nhìn chung, cơng nghệ DNA tái tổ hợp có 5 bước: (1) cắt các đoạn gene cần,
(2) nhân bản các đoạn gene cần bằng PCR, (3) chèn gene cần vào vector, (4) chuyển
vector vào hệ thống biểu hiện, và (5) thu nhận sản phẩm của gene tái tổ tổ hợp (hình 4).

Hình 4. Các bước cơng nghệ DNA tái tổ hợp
Để biểu hiện PMOs, hai hệ thống biểu hiện có thể sử dụng là vi khuẩn hoặc nấm
sợi. Tuy nhiên, PMOs tự nhiên trải qua quá trình sửa đổi trong và sau dịch mã, ví dụ
như sự phân tách peptide tín hiệu để lộ ra histidine đầu N, q trình methyl hóa của
nhóm histidine đầu N, q trình glycosyl hóa nhóm O- và N-linker.28 Do đó, biểu hiện

PMOs trên các vi khuẩn gặp nhiều hạn chế.28 PMOs có thể được biểu hiện trên Pichia
pastoris, tuy nhiên kết quả lại không có sự methyl hóa histidine đầu N.29–31 Trong khi
đó, nấm sợi thể hiện là hệ thống biểu hiện tốt cho PMOs đã được chứng minh là đáp
ứng biến đổi hậu dịnh mã, điển hình là trên Aspergillus oryzae5 và Neurospora
crassa28. Do đó, đề tài hướng đến biểu hiện NCU08746 trên nấm sợi A. Oryzae.
1.5.

Các phương pháp chuyển gene vào nấm sợi

Hiện nay, một số phương pháp chuyển gene đang sử dụng như chuyển gene vào
tế bào trần (protoplast), chuyển gene bằng xung điện, chuyển gene bằng súng bắn gene
và chuyển gene nhờ vi khuẩn trung gian là Agrobacterium tumefaciens. Mỗi phương
pháp đều có các ưu, nhược điểm riêng và tùy thuộc vào từng đối tượng mà hiệu suất
chuyển gene khác nhau đối với từng phương pháp. Tuy nhiên phương pháp chuyển
gene vào nấm sợi được sử dụng phổ biến nhất là chuyển gene qua tế bào trần
(protoplast), chuyển gene bằng xung điện (electroporation) và chuyển gene nhờ
7


A.tumefaciens.32–35 Protoplast là phương pháp đòi hỏi các bước chuyển gene khá phức
tạp, tốn nhiều cơng sức, chi phí cao nhưng khơng ổn định, địi hỏi người thực hiện phải
có nhiều kinh nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phịng thí nghiệm vừa và nhỏ.
Đặc biệt protoplast phải được sử dụng ngay sau khi chuẩn bị.34,36 Chuyển gene nhờ A.
tumefaciens cho thấy là dễ thực hiện hơn và ít địi hỏi máy móc chi phí cao như
phương pháp Protoplast. Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩn A. tumefaciens sẽ
chuyển một phần DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật.
T-DNA sau đó được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gene.37,38 Lợi dụng cơ chế này, vi
khuẩn A. tumefaciens được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gene vào thực
vật từ những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng
thành công để chuyển gen vào nấm.33

Hình 5. Vi khuẩn A. tumefaciens chuyển gene vào thực vật

8


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: 9 tháng từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2019
Địa điểm nghiên cứu: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT, đại học Nguyễn Tất
Thành, MM2, Hoàng Diệu, phường 13, quận 4, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Cách tiếp cận
Sử dụng và phân tích các bài báo khoa học trong các tạp chí nước ngồi có uy
tín trong cộng đồng khoa học như Springer, Elsevier, Wiley, American Chemical
Society (ACS, Taylor & Francis, NCBI, nghiên cứu sử dụng mơ hình thích hợp để tạo
dịng gene mã hóa PMOs AA13 và chuyển vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens. Đề tài
sử dụng các hóa chất được cung cấp từ các hãng Sigma Aldrich, Macrogen, Bioline,
Neb với chất lượng cao và phù hợp mục đích sử trong sinh học phân tử.
2.2.2. Vật liệu
2.2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
NCU08746 thu nhận từ Neurospora crassa và A. tumefaciens AGL1.
2.2.2.2. Hóa chất
Bảng 1. Danh sách hóa chất
STT

Tên hóa chất

STT

Tên hóa chất
Phusion®

High-Fidelity

1

Nuclease free water

6

2

Gelred

7

BamHI-HF®

3

Agarose M

8

AflII

4

DNA ladder 100 bp, 1kb

9

T4 DNA Ligase

5

TAE 50X

10

Lysogeny broth

2.2.2.3. Thiết bị

9

Polymerase

DNA


Bảng 2. Danh sách thiết bị và dụng cụ
STT

Tên thiết bị, dụng cụ

1

Máy điện di

2

Máy ổn nhiệt nước

3

Máy Vortex

4

Máy ly tâm

5

Nồi hấp khử trùng

6

Tủ an toàn sinh học

7

Tủ lạnh 80°C

8

Micropipet các loại

9

Tủ sấy

10

Máy spin down

11

Máy ổn nhiệt khơ

12

Tủ lạnh 20°C

13

Lị vi sóng

14

Tủ lạnh 4ºC

15

Máy lắc ổn nhiệt

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Polymerase chain reaction (PCR)
PCR là một phương pháp mang tính chất như một cuộc cách mạng cho nghành

cơng nghệ sinh học, được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980. PCR hoạt
động dựa trên DNA polymerase để tổng hợp các đoạn DNA mới. Phản ứng được thực
hiện đơn giản bằng cách trộn các hỗn hợp bao gồm mẫu thí nghiệm DNA, dNTP,
primers và DNA polymerase. Khác với phản ứng in vivo, nhiệt độ cao trong phản ứng
PCR gây sự tách mạch của mạch đôi DNA thành hai mạch đơn. Tiếp đó, các primer bắt
cặp với mạch DNA mục tiêu một cách đặc hiệu. DNA polymerase sau đó kéo dài đoạn
primer trên mạch đích. Khi kết thúc phản ứng, đoạn gene đích được nhân bản lên theo
lũy thừa.
Thành phần chính xác PCR bao gồm:

10


Mẫu DNA: mẫu DNA là mẫu có chứa trình tự đích. Khi bắt đầu phản ứng, nhiệt
độ cao sẽ biến tính tách mạch đơi mẫu DNA thành mạch đơn.
DNA polymerase: đầu tiên, enzyme được sử dụng phổ biến nhất là taq DNA
polymerase thu nhận từ Thermophilus aquaticus. Pfu DNA polymerase thu nhận từ
Pyrococcus furiosus cũng được sử dụng rộng rãi bởi sự chính xác cao khi nhân bản
DNA. Những enzyme này có đặc điểm chung là có khả năng chịu nhiệt cao.
Primers: sợi DNA mạch đơn ngắn bắt cặp bổ sung với trình tự đích.
dNTP: đơn vị đơn của nucleic acid bases, bao gồm Adenine (A), Thymine (T),
Guanine (G) và Cytosine (C).

Hình 6. Phương pháp PCR
Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR để nhân bản NCU08746 sử dụng mẫu
DNA genome một lượng khoảng 100ng cho một phản ứng. Đối với phản ứng kiểm tra
sản phẩm trên plasmid, lượng plasmid sử dụng từ 1 ng đến 5 ng cho một phản ứng
PCR. Các thơng số PCR bao gồm biến tính 95oC trong 30 giây, bắt cặp 55oC cho cặp
mỗi nhân bản NCU08746 và 53oC cho cặp mồi kiểm tra trên plasmid; trong 30 giây và
kéo dài ở 72oC trong 1 phút 30 giây.

2.3.2. Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là một thành tựu to lớn của sinh học tế bào. Ni cấy tế bào là
q trình mà các tế bào in vivo được phát triển bên ngoài cơ thể trong điều kiện được
kiểm sốt. Thuật ngữ ni cấy tế bào được áp dụng cho tất cả các loại nuôi cấy bao
gồm tế bào thực vật, tế bào động vật, vi sinh vật và nấm. Tuy nhiên, sự ra đời của các
11


phương pháp nuôi cấy tế bào động vật và người dẫn đến những đột phá hơn trong công
nghệ sinh học y tế, bao gồm sản xuất vaccine, protein tái tổ hợp, kháng thể đơn dòng
(mAbs) và tế bào để cấy ghép. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro đã phát triển mạnh
mẽ hơn vào giữa thế kỷ XX. Ý tưởng các mơ và tế bào có thể được duy trì bên ngồi
cơ thể được hình thành khi nhà sinh lý học người Anh thế kỷ XIX, Sydney Ringer, có
thể duy trì trái tim động vật bị cơ lập trong các dung dịch muối có chứa natri, kali,
canci và muối magie. Sau đó, vào năm 1885, Wilhelm Roux đã loại bỏ và duy trì một
phần của đĩa tủy của một con gà phôi trong dung dịch nước muối ấm. Với thí nghiệm
này, Roux lần đầu tiên thiết lập nguyên tắc nuôi cấy tế bào để phát triển tế bào động
vật, cụ thể là tế bào động vật có thể được duy trì bằng nước muối trong điều kiện ấm
áp. Sau đó, Ross Granville Harrison đã cơng bố một số thí nghiệm của ông từ năm
1907 đến 1910, tiếp tục thiết lập phương pháp cho nuôi cấy mô. Kỹ thuật nuôi cấy tế
bào phát triển đáng kể trong những năm 1940 và 1950. Với những đột phá trong nuôi
cấy tế bào động vật, nuôi cấy và sản xuất virus cũng được phát triển. Vaccine đầu tiên
dựa trên virus được tạo ra thành công bởi Jonas Salk (vaccine bại liệt tiêm). Vắc-xin
này được phát triển bằng kết quả của kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiên phong bởi John
Franklin Enders, Thomas Huckle Weller và Frederick Chapman Robbins, người đã
được trao giải thưởng Nobel về nuôi cấy virus trong tế bào thận khỉ.
Là một kỹ thuật cốt lõi, nuôi cấy tế bào thường được sử dụng trong sản xuất các
sản phẩm sinh học, bao gồm enzymes, synthetic hormones, mAbs, interleukins,
lymphokines, anticancer agents và vaccines.
2.3.3. Phương pháp tạo dòng DNA

Phương pháp tạo dòng DNA đóng vai trị quan trọng nhất trong đề tài này, các
vật liệu chuẩn bị cho phản ứng tạo dòng bao gồm vector, đoạn gene NCU08746 và các
enzyme cắt nối. Trong nghiên cứu này, vector được cắt bằng cặp RE là AflII và BamHI
sau đó, sản phẩm được mang đi điện di kiểm tra kích thước sản phẩm cắt sau đó band
sản phẩm trên gel agarose được thu nhận và tinh sạch bằng bộ KIT tinh sạch gel của
NEB. Tương tự, đoạn gene đích cũng được chuẩn bị tương tự.
Cụ thể, tổng phản ứng tạo dịng là 20µl với thành phần bao gồm T4 DNA
Ligase buffer, Vector pEX2B (50ng), NCU08746 (18ng) và T4 DNA Ligase. Các
thành phần được ủ 16oC qua đêm sau đó được làm nóng lên 65oC để bất hoạt các
enzyme. Sản phẩm tạo dịng sau đó được biến nạp vào E. coli DH5α.
12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thiết kế cặp primer nhân bản NCU08746
Sử dụng cơ sở dữ liệu Uniprot (), trình tự NCU08746
được thu nhận để thiết kế primer cho nghiên cứu này. Tuy nhiên, sản phẩm là các đoạn
gene NCU08746 sẽ được sử dụng tạo dòng vào vector pEX2B do đó, cặp primer này
được thiết kế ngồi việc nhân bản NCU08746 thì phải gắn các RE tạo vị trí đầu và cuối
của trình tự NCU08746.

Hình 7. Bản đồ pEX2B và các marker
Dựa vào bản đồ pEX2B (hình 7), mục tiêu được xác định là chèn NCU08746
thay thế DsRed. Như vậy, primer phải đảm bảo gắn các vị trí cắt đặc hiệu cho PmlI
hoặc AflII tại đầu trình tự NCU08746 và SacI, SacII hoặc BamHI tại vị trí cuối trình tự
NCU08746. Vì vậy, trình tự NCU08746 được kiểm tra để đảm bảo không chứa các vị
13


trí

cắt

đặc

hiệu

của

các

enzyme

nêu

trên.

Cơng

cụ

NEBCutter2

( được sử dụng và thu được kết quả tại hình
8. Dựa vào kết quả kiểm tra này, trình tự NCU08746 sẽ được thiết kế gắn thêm AflII tại
đầu trình tự và BamHI tại cuối trình tự.

Hình 8. Các vị trí cắt đặc hiệu cho RE của NCU08746
Kết quả thiết kế primer nhân bản cho nghiên cứu này được thể hiện tại bảng 3.
Bảng 3. Các primer cho phản ứng PCR

Tên primers

Trình tự

BamHI_NCU08746_ rv 5'- ATATATGGATCCCTACTTCCACGACGACTCAAC -3'
AflI_NCU08746_fw

5'-ATATATCTTAAGATGAAGTTCTCCATCATCTCGGTTG 3'

SeqNCU08746_f

5'- GGAGGATAGCAACCGACAAC -3‘

SeqNCU08746_r

5'- GAGCTGACATCGACACCAAC -3‘

Cặp primers BamHI_NCU08746_ rv và AflI_NCU08746_fw được sử dụng
nhân bản NCU08746 từ genome của N.crassa. Cặp primer SeqNCU08746_f và
SeqNCU08746_r được sử dụng kiểm tra sự hiện diện của NCU08746 trên pEX2B.

14


3.2. Khả năng hoạt động của phản ứng PCR với cặp mồi nhân bản NCU08746
Genome của N.crassa được tách chiết sau đó sử dụng làm mẫu DNA cho phản
ứng PCR. Phản ứng PCR sử dụng khoảng 200ng DNA mẫu, 0.5 µM mỗi primer và 5
unit DNA polymerase, 5mM dNTP, 15mM MgCl2. Kết quả PCR được điện di trên gel
agarose 1% và nhuộm bằng gelred được thể hiện tại hình 9.

Hình 9. Kết quả điện di NCU08746
Sản phẩm PCR điện di được duy nhất 1 band tại vị trí 1,2kb, là kích thước của
NCU08746. Ngồi ra, chứng âm khơng có band. Sau đó, sản phẩm PCR sẽ được tinh
sạch nhằm mục đích tạo dịng về sau. Như vậy, bước đầu của nghiên cứu đã thành công
trong thiết kế primer và PCR nhân bản NCU08746.
3.3. Tạo dòng NCU08746 lên vector pEX2B
Sau khi tinh sạch sản phẩm gene đích và vector pEX2B, hai enzyme là BamHI
và AflII được sử dụng để cắt tạo đầu sole tại hai đầu đoạn gene đích và trên vector. Các
sản phẩm thu được sau đó sẽ đưuọc ghép nối đặc hiệu với nhau nhờ quá trình cắt của
enzyme cắt giới hạn, đề tài này sử dụng T4 DNA ligase để nối. Cụ thể, dựa trên thông
số chiều dài của vector và đoạn gene chèn vào, nồng độ vector sử dụng cho 1 phản ứng
ghép nối là 50 ng và gene chèn vào là 20 ng. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16ºC qua

15


đêm. Sản phẩm nối được bất hoạt bằng cách ủ 65ºC trong 10 phút sau đó sử dụng 2µl
để biến nạp vào DH5α. Môi trường LB agar bổ sung Kanamycin (100mg/L) được dùng
để nuôi các chủng đã biến nạp, kết quả thu được tại hình 10.

Hình 10. DH5α biến nạp ni trên LB agar
Thí nghiệp được thiết kế song song với đĩa đối chứng là DH5α không biến nạp
và kết quả là đĩa đối chứng khơng mọc. Điều này có nghĩa là các chủng mọc trên đĩa
biến nạp là các chủng có khả năng kháng Kanamycin. Tuy nhiên, để chắc chắn hơn,
phương pháp colony PCR được sử dụng để kiểm tra các chủng vi khuẩn này.

16


Hình 11. Kết quả điện di sản phẩm colony PCR các chủng DH5α

Kết quả colony PCR thu được 2 band sáng rõ trên colony số 3 và số 4. Colony
số 2 có band nhưng mờ hơn và colony số 1 có thêm band ký sinh. Chứng âm khơng
xuất hiện band và chứng dương cho band ngang bằng với sản phẩm của các colony.
Chứng dương được sử dụng là đoạn gene NCU08746. Như vậy, bước đầu có thể khẳn
định là đề tài đã tạo dịng thành cơng NCU08746 lên vector pEX2B.
Tuy nhiên, để khẳn định chắc chắn đã tạo dòng thành cơng NCU08746 lên
vector pEX2B thì cần giải trình tự plasmid sản phẩm. Do đó, Colony số 4 được chọn để
tăng sinh thu plasmid và giải trình tự.
3.4. Giải trình tự sản phẩm vector tái tổ hợp
Plasmid được gửi giải trình tự tại First BASE Laboratories ( Trình tự giải trình tự sau đó được so sánh bằng cơng cụ multiple sequence
alignment (MSA) của Tcoffee ( Trình tự giải trình tự của
plasmid thu nhận từ mẫu colony 3 tại kết quả hình 11 cho kết quả tương đồng 100%
với trình tự NCU08746 thu nhận trên Uniprot với mã số là EAA34371.

17