Chiết tách hợp chất ecdysteroid từ thông đỏ và nghiên cứu khả năng gây lột xác trên cua (scylla paramamosain)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN VĂN TRÍ
CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT ECDYSTEROID TỪ THƠNG ĐỎ VÀ
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY LỘT XÁC TRÊN CUA
(SCYLLA PARAMAMOSAIN)
(Extraction Ecdysteroid compounds from Taxus wallichiana and research
potential moult of crab (Scylla Paramamosain))

Chuyên ngành:

Kỹ Thuật Hóa Học

Mã số:

60.52.03.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020


Cơng trình được hồn thành tại: Trung Tâm Sâm và Dược Liệu Tp. HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học 1:

PGS. TS. Phạm Thành Quân

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2:

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

PGS. TS. Bạch Long Giang

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

TS. Phan Thị Hoàng Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 01 năm 2020.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. Chủ tịch Hội đồng:

PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Phong

2. Cán bộ phản biện 1:

PGS. TS. Bạch Long Giang

3. Cán bộ phản biện 2:

TS. Phan Thị Hoàng Anh

4. Ủy viên:

TS. Nguyễn Thanh Tùng

5. Thư ký:

TS. Lê Vũ Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Văn Trí

MSHV: 1670679

Ngày, tháng, năm sinh: 18/03/1992

Nơi sinh: Đăk Lăk

Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học

Mã số: 60.52.03.01

TÊN ĐỀ TÀI: Chiết tách hợp chất ecdysteroid từ thông đỏ và nghiên cứu khả năng

gây lột xác trên cua (Scylla paramamosain)

I. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao lá thơng đỏ.
- Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao giàu ecdysteroid và chiết 500 gam cao ecdysteroid bán
thành phẩm ở quy mơ pilot. Từ đó làm ngun liệu bổ sung vào thức ăn viên cho cua.
- Nghiên cứu phối trộn chế phẩm thức ăn viên chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua.
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm thức ăn cua.
- Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/06/2019
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/12/2020
IV.CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1:

PGS. TS. Phạm Thành Quân

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2:

Tp. HCM, ngày 25 tháng 12 năm 2019
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin cảm ơn ba mẹ và anh, chị đã luôn bên con và tạo điều
kiện tốt nhất để con đạt được những thành quả của ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Phạm Thành Qn, người thầy đã ln
tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài.

Xin cảm ơn GS. TS. Phan Thanh Sơn Nam, PGS.TS. Lê Thị Hồng Nhan và các
thầy cô giảng viên cao học K2016 Khoa Kỹ Thuật Hóa Học trường Đại học Bách
Khoa Tp. HCM đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học.
Cảm ơn TS. Bùi Thế Vinh, ThS. Lâm Bích Thảo, KS. Nguyễn Nhật Minh và
các Thầy Cô, các Anh Chị em, bạn bè tại Trung tâm sâm và dược liệu Tp. HCM, bộ
mơn Hóa Hữu Cơ, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Tp. HCM đã
giúp đỡ tôi thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
.

Nguyễn Văn Trí


ii

TĨM TẮT LUẬN VĂN
Phân lập thành cơng hợp chất β-ecdysone từ cao lá thơng đỏ. Lựa chọn quy trình
chiết tách ecdysteroid là lắc phân bố với ethyl acetate cho hiệu suất (0,138%) cao hơn
so với chạy qua cột Diaion HP-20 (0,073%). Đã phối trộn được thức ăn cho cua dạng
cốm, có sự hiện diện của ecdysteroid.
Xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở cho cao thông đỏ và chế phẩm thức ăn cua
chứa ecdysteroid. Độ ẩm cao không quá 20%, độ ẩm thức ăn cua không quá 12%, nồng
độ β-ecdysone trong cao khơng thấp hơn 0,138%.
Kết quả ni thí nghiệm ban đầu cho thấy khi nuôi với thức ăn viên nhân tạo
45% đạm bổ sung 10 ppm ecdysone có khả năng kích thích cua lột xác, thời gian lột
xác của cua diễn ra sớm hơn, tập trung và đồng loạt vào khoảng 20 ngày.

ABSTRACT
β-ecdysone compound was successfully isolated from Taxus wallichiana.
Liquid-liquid extraction with ethyl acetate was selected as the extraction process of

ecdysteroid, which had higher efficiency (0.138%) than through the Diaion HP-20
column (0.073%). Food for nuggets of crabs has been mixed and has the presence of
ecdysteroid.
The standard for Taxus wallichiana extract and crabs’ food containing
ecdysteroid has been formulated. The moisture of the extract and crabs’ food do not
exceed 20% and 12%, respectively, and the concentration of β-ecdysone in the extract
is not lower than 0.138%.
Preliminary experimental results showed that when crabs were fed with artificial
pellets 45% protein supplemented with 10 ppm ecdysone has the ability to stimulate
crab molting, crab molting time takes place earlier, focused and simultaneously at 20th
day.
.


iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam kết luận văn này được hồn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu
của tơi và chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.
.
Học viên
Nguyễn Văn Trí


iv

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................i
ABSTRACT ....................................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... iii

MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................ix
Chƣơng 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 1
1.1. Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana) .............................. 1
1.1.1. Tên gọi ................................................................................................................... 1
1.1.2. Đặc điểm thực vật .................................................................................................. 2
1.1.3. Phân bố ................................................................................................................... 2
1.1.4. Sinh thái. ................................................................................................................ 3
1.1.5. Cơng dụng .............................................................................................................. 3
1.1.6. Độc tính .................................................................................................................. 4
1.2. Giới thiệu về ecdysteroid .......................................................................................... 4
1.2.1. Giới thiệu chung về β-ecdysone ............................................................................. 6
1.2.2. Công thức cấu tạo và danh pháp ............................................................................ 7
1.2.3. Tính chất vật lý....................................................................................................... 7
1.2.4. Ứng dụng của β-ecdysone ...................................................................................... 7
1.3. Giới thiệu sinh lý lột xác của cua .............................................................................. 9
1.3.1. Sinh lý lột xác của cua ........................................................................................... 9
1.3.2. Đặc điểm quá trình lột xác của cua ...................................................................... 11
1.4. Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ................................................................ 12
1.4.1. Sắc ký phân bố - sắc ký cột .................................................................................. 12
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ............................................................................ 13


v

Chƣơng 2: Thực Nghiệm ............................................................................................. 14
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 14
2.2. Vật liệu, hóa chất sử dụng ....................................................................................... 14

2.2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 14
2.2.2. Hóa chất. .............................................................................................................. 14
2.2.3. Thiết bị ................................................................................................................. 15
2.3. Quy trình thực hiện ................................................................................................. 15
2.3.1. Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao methanol ............................................... 15
2.3.2. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500g cao ecdysteroid bán
thành phẩm ở quy mô pilot ............................................................................................ 18
2.3.3. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua 21
2.3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao trung gian và chế phẩm đã phối
trộn ................................................................................................................................. 23
2.3.5. Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác cua ở mơ hình thí nghiệm.......................... 23
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................................... 26
3.1. Chiết tách, tinh sạch β-ecdysone từ cao tổng .......................................................... 26
3.1.1. Chạy cột sắc ký phân bố....................................................................................... 26
3.1.2. Sắc ký hấp phụ cột silica gel ................................................................................ 27
3.2. Nghiên cứu quy trình chiết xuất ecdysteroid và chiết 500 g cao ecdysteroid bán
thành phẩm ở quy mô pilot ............................................................................................ 30
3.2.1. Kết quả chạy cột Diaion HP-20 ........................................................................... 30
3.2.2. Lắc phân bố với ethyl acetate ............................................................................... 31
3.2.3. Định lượng β-ecdysone bằng phương pháp HPLC .............................................. 32
3.3. Nghiên cứu phối trộn chế phẩm chứa Ecdysteroid bổ sung vào thức ăn cho cua .. 40
3.3.1. Phối trộn cao chứa ecdysteroid vào thành phần thức ăn cho cua. ....................... 40
3.3.2. Đánh giá tính chất hóa lý của viên thức ăn thành phẩm ...................................... 40
3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao bán thành phẩm và viên thức ăn
thành phẩm có bổ sung ecdysteroid ............................................................................... 41


vi

3.4.1. Độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn.................................. 41

3.4.2. Định tính ecdysteroid bằng SKLM trong cao bán thành phẩm và viên thức ăn
thành phẩm có bổ sung ecdysteroid ............................................................................... 43
3.5. Khảo sát hoạt tính kích thích lột xác trên cua ở mơ hình thí nghiệm ..................... 47
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 53
4.1 Kết luận. ................................................................................................................... 53
4.2 Kiến nghị. ................................................................................................................. 53
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ..................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 56
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 60


vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cây thơng đỏ ..................................................................................................... 1
Hình 1.2 Một số cơng thức của ecdysteroids. [30] .......................................................... 6
Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo của β-ecdysone. [30] ........................................................... 7
Hình 2.1 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố cột A. ...................................................... 16
Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sắc ký hấp phụ cột B ............................................................. 17
Hình 2.3 Quy trình tiến hành sắc ký phân bố................................................................. 18
Hình 2.4 Quy trình lắc phân đoạn với ethyl acetate ....................................................... 19
Hình 3.1 SKLM các phân đoạn cột A. Hệ dung môi DCM - MeOH (80 : 20).............. 26
Hình 3.2 SKLM phân đoạn của cột B1. Hệ dung mơi DCM - MeOH (85:15).............. 28
Hình 3.3 SKLC phân đoạn của cột B2. Hệ dung môi DCM – MeOH (85:15) .............. 29
Hình 3.4 Kết tinh phân đoạn V ...................................................................................... 29
Hình 3.5 SKLM đối chứng kết tinh và chuẩn β-ecdysone ............................................. 30
Hình 3.6 Kết quả SKLM khi lắc phân bố với ethyl acetate ........................................... 31
Hình 3.7 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của quy trình phân tích. ................................. 32
Hình 3.8 Đường chuẩn và sắc ký đồ β-ecdysone chuẩn ................................................ 33
Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu cao ethyl acetate ............................................................... 35

Hình 3.10 Sắc ký của phân đoạn 40% ethanol .............................................................. 37
Hình 3.11 (1)Thiết bị chiết và (2) thiết bị lắc phân đoạn ............................................... 39
Hình 3.12 Mẫu cao sau khi phối trộn thức ăn và xát hạt (trước khi sấy) ....................... 41
Hình 3.13 Kết quả định tính ecdysteroid trong thức ăn cua và cao thơng đỏ ................ 43
Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu cao bán thành phẩm .............................................................. 44
Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cua ........................................................................... 45
Hình 3.16 Thức ăn chế biến dùng cho ni thí nghiệm ................................................. 48
Hình 3.17 Bố trí cua trong bể ni thí nghiệm .............................................................. 48
Hình 3.18 Sự tăng trưởng, tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ của cua ni ..................................... 50
Hình 3.19 Tỷ lệ lột vỏ của cua ở các nghiệm thức theo thời gian nuôi ......................... 52


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Tỉ lệ phối trộn phụ gia ................................................................................... 22
Bảng 2. 2: Kích thước cua và thức ăn bổ sung cho cua ................................................. 24
Bảng 3.1 Bảng số liệu kết quả chạy sắc ký cột Diaion HP-20 ....................................... 31
Bảng 3.2 Kết quả xác định khoảng tuyến tính ............................................................... 33
Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại ............................................................ 34
Bảng 3.4 Hàm lượng β-ecdysone trong cao EtOAc ....................................................... 36
Bảng 3.5 Hàm lượng β-ecdysone trong PĐ 40% ........................................................... 38
Bảng 3.6 So sánh hai phương pháp chiết xuất ............................................................... 38
Bảng 3.7 Bảng chiết cao quy mô Pilot ........................................................................... 40
Bảng 3.8 Kết quả độ ẩm của thức ăn sau khi trộn, sấy khô ........................................... 41
Bảng 3.9 Kết quả độ ẩm của cao bán thành phẩm và chế phẩm đã phối trộn ............... 42
Bảng 3.10 Kết quả phân tích độ tro tồn phần của cao bán thành phẩm và sản phẩm .. 42
Bảng 3.11 Kết quả phân tích β-ecdysone trong cao MeOH thơng đỏ .......................... 45
Bảng 3.12 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn ................................................ 46
Bảng 3.13 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn ban đầu ................................... 46

Bảng 3.14 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 3 tháng ...................... 46
Bảng 3.15 Kết quả phân tích β-ecdysone trong thức ăn cua sau 6 tháng ...................... 47
Bảng 3.16 Thành phần hóa học của các thức ăn cua (VCK) ......................................... 49
Bảng 3.17 Các chỉ tiêu môi trường ở các nghiệm thức trong suốt thời gian thí nghiệm
........................................................................................................................................ 49
Bảng 3.18 Tăng trưởng, tỷ lệ cua lột vỏ, tỷ lệ sống của cua nuôi ở các nghiệm thức ... 51


ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ tắt

Chữ nguyên

Ý nghĩa

Abs

Absorbance

Độ hấp thu

br

broad

Đỉnh rộng

13

13

C-Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

H-Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân
proton

1

C-NMR

H-NMR

1

Phổ tương quan 1H – 1H

COSY

Correlated Spectroscopy

d

doublet

n

dd

doublet of doublets

n

DD

Dung dịch

DĐVN

Dược điển Việt Nam

DCM

Dichloromethane

Dichloromethane

MeOH

Methanol

Methanol

EtOAc

Ethyl acetat

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

Cồn dược

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond
Correlation

Phổ HMBC

HSQC

Heteronuclear Single Quantum
Correlation

Phổ HSQC

J

coupling constant

Hằng số gh p J

m

multiplet

Nhiều đỉnh, đỉnh bội

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

p

Dung dịch

13

C


x

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

OD

Optical Density

Mật độ hấp thu

ppm

parts per million

Phần triệu

s

singlet

Đỉnh đơn

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng

tR

Retention time

Thời gian lưu

TT

Thuốc thử

UV

Ultra violet

(Phổ) tử ngoại

Rf

retention factor

Hệ số lưu giữ

UV365

Ultra violet, λ=365 nm

Đèn UV bước sóng 365 nm

VS

Vaniline - sulfuric

Thuốc thử Vanilin-sulfuric

XTT

Màu nhuộm tetrazolium thế
hệ II


1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây thông đỏ lá dài
1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Taxus wallichiana.
Tên thông thường: thông đỏ lá dài
Phân loại thực vật.
Giới (kingdom): Plantae.
Ngành (division): Pinophyta.
Lớp (class): Pinopsida.
Bộ (order): Pinales.
Họ (family): Taxaceae
Loài (species): Taxus baccata L. (Thông đỏ châu Âu), Taxus brevifolia Nutt.
(Thông đỏ Thái Bình Dương), Taxus canadensis (Thơng đỏ Canada), Taxus celebrica,
Taxus chinensis (Thông đỏ Trung Quốc), Taxus cuspidata Zucc. (Thông đỏ Nhật),
Taxus floridana (Thông đỏ Florida), Taxus globosa (Thông đỏ Mexico), Taxus
hunnewelli, Taxus jortunei, Taxus sumatrana (Thông đỏ Sumatra), Taxus wallichiana
Zucc. (Thơng đỏ Himalaya).

Hình 1.1 Cây thơng đỏ


2

ặc

1.1.2.

ểm t ực vật

Thông đỏ lá dài là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kích thước trung bình
hoặc nhỏ, chậm lớn (cây sinh trưởng cả trăm năm chỉ có đường kính khơng q 35
cm). Chiều cao: 20-30 m, đường kính ngang ngực: 1-1,5 m. Cây mọc đứng [9, 2].
Cành: Xòe rộng, cành non màu lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc
phân tán tùy theo điều kiện mơi trường.
Vỏ cây: Phía ngồi màu nâu đỏ nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mảng hay
từng tấm nhỏ, thịt màu nâu đỏ.
Lá: Mềm, xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuôn thành đỉnh nhọn, gốc
lá mọc xuống, mép lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí
xanh nhạt hơn ở hai bên gân giữa. Lá của các chồi chính có thể mọc dựng lên hơn là
xếp dãy.
Hoa: Phân tính khác gốc. Hoa cái đơn độc, có một hạt và được bao quanh nhưng
khơng bao kín bằng lớp áo hạt màu đỏ, chín trong 1 năm. Hoa đực tạo thành hàng ở
nách lá, nhỏ, hình trứng, dài 6 mm và rộng 3 mm, nhưng khơng có cuống hoặc cuống
rất nhỏ.
Hạt: Hình trứng, dài 7 mm và rộng 5 mm, màu đen khi chín.
1.1.3. Phân bố
Tháng 7/2006, tổ chức IUCN đã tìm thấy lồi thơng đỏ lá dài tại Afghanistan,
Bhutan, tây nam Trung Quốc (Sichuan, Xizang, Yunnan), Ấn Độ (Arunachal Pradesh,
Assam, Himachal Pradesh, Jammu-Kashmir, Manipur, Sikkim, Uttar Pradesh), phía
bắc Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Philippin, Việt Nam.
Ở Việt Nam, loài này được tìm thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai
(Hồng Liên Sơn), Khánh Hịa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc
Dương,…), Hà Giang (Thái An-Quản Ba), độ cao phân bố 1400-1600 m hoặc hơn.
Sự phân bố của thông đỏ khá đa dạng trong khu vực Lâm Đồng, nhưng số lượng

cá thể ở mỗi nơi lại ít. Số lượng cá thể nhiều nhất tại khu vực Núi Voi (100 cây), tại


3

đây cây không bị che phủ và phát triển tương đối tốt. Ở những nơi bị che phủ như Lán
Tranh thì số lượng cá thể ít (1 cây). Có nơi cây lại già cỗi, chẳng hạn như khu vực
Cổng Trời số lượng cá thể là 20 cây nhưng lại già cỗi, gần như không phát triển nữa.
1.1.4. Sinh thái
Phạm vi độ cao: 2000-3500 m so với mặt biển.
Dạng rừng: Rừng nhiệt đới thường xanh.
Cây càng lớn đòi hỏi ánh sáng càng cao. Trong tầng ưu thế sinh thái, nơi nào có
khoảng trống, lượng ánh sáng nhiều thì cây phát triển mạnh và ngược lại [2].
Khí hậu: Nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm 20-25oC, độ ẩm đất 3040%, độ ẩm khơng khí 85-90%.
Thổ nhưỡng: Thích hợp với đất có thành phần cơ giới nhẹ, thốt nước, phát triển
trên đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ trên đất bazan, độ pH đất 5,1-5,6.
Thảm thực vật: Ở Lâm Đồng, thông đỏ thường phân bố rải rác hỗn giao với các
loài cây lá rộng thường xanh và cây lá kim với kiểu rừng chính là hỗn giao cây lá rộngcây lá kim. Trong kiểu thảm này chúng phân bố ở tầng ưu thế sinh thái hợp với các loài
đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), kim giao nam (Nageia wallichiana), thông tre lá dài
(Podocarpus neriifolius), thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), du sam (Keteleeria
evelyniana) và một số loài thuộc Fagaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae,...
Hạt phát tán khơng xa (với bán kính 6-8 m so với từ tâm cây), nảy mầm và phát
triển nơi có độ ẩm cao, cường độ ánh sáng trung bình. Tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên
rất thấp so với số lượng hạt cây mang hàng năm.
Tái sinh tự nhiên: Ít gặp, cây mầm và cây non chịu bóng tốt.
1.1.5. Cơng dụng
Gỗ thơng đỏ chắc chắn, có tính co dãn, ít nứt nẻ, không cong vênh, không thấm
nước, là loại gỗ quý, thường dùng trong điêu khắc thủ cơng mỹ nghệ và đóng các đồ gỗ
gia dụng cao cấp [2].

4

Trong dân gian, lá thông đỏ được dùng để trị hen suyễn, viêm phế quản, các
bệnh về đường tiêu hoá; cành và vỏ dùng trị bệnh giun đũa; nước sắc của thân cây
thông non dùng trị bệnh đau đầu.
Thông đỏ chứa một hàm lượng lớn Taxol, là nguyên liệu quý giá cho điều trị
một số bệnh ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, cổ tử cung.
1.1.6.

ộc tính
Mặc dù là loại thảo dược quý hiếm nhưng thông đỏ lại chứa những độc tố mạnh

và có cường độ cao. Bằng những kiểm nghiệm khoa học, người ta đã chỉ ra rằng hầu
như trong mọi bộ phận của cây đều có chất độc ngoại trừ vỏ của hạt.
Độc tố trong thông đỏ được định danh gồm hơn 350 loại taxan khác nhau, có
sức bền tồn tại đến mức kể cả khi phơi hay sấy khơ vẫn có khả năng gây chết người.
Tất cả chúng đều có bản chất là các alkaloid. Taxan xuất hiện ở hầu hết mọi bộ phận
của cây, nhưng nhiều nhất là trong lá và vỏ cây.
Độc tính của taxan rất mạnh, có thể gây chết người. Cơ chế của chúng là gây
độc cho hệ tim mạch và thần kinh, dẫn đến hệ quả là huyết áp thấp, nhịp tim chậm,
giảm sức co bóp cơ tim. Sự giảm huyết áp xuống mức thấp và sự giảm nhịp tim đến
quá chậm làm thiếu máu ở tim, não và nhiều cơ quan trọng yếu. Trên hệ thần kinh,
taxan gây ra hiện tượng run, co giật, bất tĩnh khiến nạn nhân ngừng thở và tử vong [2].
1.2. Giới thiệu về ecdysteroid
Ecdysteroid là hormone lột xác ở cơn trùng trong đó bao gồm ecdysone và
đồng đẳng của nó như 20-hydroxyecdysone.
Các ecdysteroid đầu tiên, được phân lập từ tằm nhộng bởi các nhà khoa học
Đức, Butenandt và Karlson, vào năm 1954 [11]. Ecdysteroid đóng vai trị thiết yếu
trong tất cả các lồi côn trùng, bằng việc điều chỉnh sự lột xác, biến thái, sinh sản và

gián đoạn sự phát triển. Bên cạnh đó ecdysteroid cũng được tìm thấy có trong động vật
giáp xác như tôm [12], cua và từ thực vật. Cho đến nay, ít nhất 2% các lồi thực vật
trên thế giới đã được nghiên cứu cho sự hiện diện của ecdysteroid, nhưng chỉ hơn 300


5

hợp chất đã được xác định. Mức ecdysteroid trong đó thường từ 0,1 đến 3% trọng
lượng khô, cao hơn gấp 1000 lần so với côn trùng [10].
Ecdysteroid không tham gia nội sinh trong q trình chuyển hóa động vật có vú,
và khơng độc hại đối với động vật có vú LD50 = 20E (tương đương 6 g/kg thể trọng).
Ecdysteroid ở nồng độ rất thấp có khả năng gây rối loạn sự phát triển và sinh
sản của côn trùng, tiêu diệt cơn trùng gây hại mà ít hoặc khơng làm ảnh hưởng đến các
sinh vật khác. Loại thuốc trừ sâu này bền, thân thiện với mơi trường và có tiềm năng
phịng chống các loại dịch bệnh gây hại cho nông nghiệp, thay thế các loại thuốc trừ
sâu gây độc cho con người và hệ sinh thái như DDT.
Quan trọng hơn ecdysteroid cịn cho thấy tác động tích cực lên động vật có vú là
kích thích sự tổng hợp protein và đang được ứng dụng làm thuốc giúp tăng cơ bắp trên
thị trường hiện nay. Ngồi ra, nhiều nghiên cứu cịn cho thấy ecdysteroid cũng giúp
làm giảm lượng cholesterol trong gan, trị đái tháo đường, giúp mau lành vết thương
nhỏ, bỏng…[10], [14].
Các Ecdysteroid phổ biến như: α-ecdysone, β-ecdysone, 3-dehydroecdysone;
25-deoxyecdysone nhưng chỉ có 1 dạng có hoạt tính (dạng hoạt động) là β-ecdysone.
Một số công thức của ecdysteroid đã được xác định.


6

Hình 1.2 Một số cơng thức của ecdysteroids. [30]
1.2.1. Giới thiệu chung về β-ecdysone

β-ecdysone, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1966, là một steroid hormone
do động vật chân đốt (cơn trùng, nhện, tơm, cua,…) tiết ra, có tác dụng thúc đẩy sự lột
xác. Nó là một trong những nội tiết tố phổ biến nhất trong các loài động vật chân đốt.


7

1.2.2. Cơng thức cấu tạo và danh pháp
OH
OH
OH

HO
OH
HO
O

Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo của β-ecdysone. [30]
Công thức phân tử: C27H44O7.
Khối lượng phân tử: 480 (g/mol).
Danh pháp: 2-beta, 3-beta, 14, 20, 22, 25-Hexahydroxy-5-beta-cholet-7-en-6-one.
Tên thơng thường: β-ecdysone, ecdysterone, 20-hydroxyecdysone, crustecdysone.

1.2.3. Tính chất vật lý
β-ecdysone là hợp chất có dạng tinh thể màu trắng.
Tan trong MeOH, EtOH, C5H5N.
Nhiệt độ nóng chảy: 241-242,50C.
1.2.4. Ứng dụng của β-ecdysone
 Trong c ăn nu

tằm lấy tơ

Ảnh hưởng của β-ecdysone đã được kiểm tra trên loài tằm Bombyx mori (tằm
tơ) và một số lồi tằm ni với mục đích thương mại khác. Các nghiên cứu cho thấy βecdysone được thêm vào thức ăn với tỷ lệ thích hợp có tác dụng kích thích sự lột xác,
đẩy nhanh q trình trưởng thành của tằm, làm tăng trọng lượng kén tằm, rút ngắn thời
gian chăn nuôi tằm tạo kén mà không gây hại hay ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển
của tằm [18], [13].
Trong nuôi trồng thủy hải sản


8

β-ecdysone được trộn vào thức ăn tươi cho tôm, cua, ghẹ nhằm kích thích tơm,
cua, ghẹ lột xác nhanh, mau cứng vỏ. Nhiều sản phẩm thức ăn cho tôm, cua, ghẹ được
sản xuất trên thị trường có bổ sung thêm β-ecdysone. Đặc biệt, ghẹ lột là loại hàng
thương phẩm được thị trường trong nước và thế giới ưa chuộng, có giá trị cao về kinh
tế và dinh dưỡng,với hàm lượng canxi và photpho dễ hấp thụ, có tác dụng phục hồi
nhanh chóng tình trạng thiếu và mất canxi ở trẻ em và người cao tuổi.
Kỹ thuật nuôi ghẹ lột tương đối phức tạp và có nhiều phương pháp, như thay đổi
các yếu tố sinh thái (nhiệt độ, độ mặn, chất saponin) hay sử dụng các loại chất kích
thích (chitoxan, hormone 20E (20-hydroxyecdyson), chất kích thích lột vỏ molt &
grow). Hormone lột vỏ 20E được trộn vào thức ăn tươi cho ghẹ với nồng độ 1 ppm và
so sánh hiệu quả với các phương pháp khác. Sau 20 ngày nuôi, tỷ lệ ghẹ lột vỏ đạt 7175%. Kết quả đạt được cho thấy tỷ lệ sống, tỷ lệ lột vỏ của ghẹ cao và trong thời gian
ngắn hơn so với sử dụng các phương pháp thay đổi yếu tố sinh thái, và có hiệu quả
tương đương với các chất kích thích khác. Do đó, việc sử dụng chất kích thích
hormone 20E trong nuôi trồng thủy hải sản giúp tăng năng suất và tiết kiệm thời gian
sản xuất, nâng cao hiệu quả và giá trị kinh tế của thủy hải sản trên thị trường trong và
ngoài nước [7].
Tác dụng ối vớ cơ t ể người
Đối với cơ thể con người, β-ecdysone được cho là khơng gây độc hại, có khả

năng thúc đẩy sự tổng hợp protein, loại bỏ cholesterol, điều chỉnh đường huyết và lipid,
ngăn ngừa bệnh tiểu đường, chống rối loạn nhịp tim, chống mệt mỏi, hỗ trợ điều trị
viêm khớp dạng thấp.
β-ecdysone và các ecdysteroid khác được bán trên thị trường làm thực phẩm
chức năng trong thể thao, đặc biệt trong mơn thể hình, giúp tăng cường phát triển cơ
bắp. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu khoa học cụ thể nào chỉ ra hiệu quả thực sự đối
với cơ thể con người của β-ecdysone và các loại thực phẩm chức năng này [30].


9

1.3. Giới thiệu sinh lý lột xác của cua
1.3.1. Sinh lý lột xác của cua
Quá trình lột xác của giáp xác nói chung và cua nói riêng do hormone ecdysone
và hormone juvenile kiểm soát. Hormone ecdysone do tuyến X ở cuống mắt tiết ra còn
juvenile do tuyến Y nằm ở mặt bụng tiết ra. Chính tỉ lệ hai loại hormone này trong hệ
bạch huyết sẽ quyết định con vật có lột xác hay không.
Hormone ecdysone, quan trọng hơn cả là -ecdysone, được sản xuất bởi tuyến
Y có thể đáp ứng cho sự khởi đầu các giai đoạn dẫn tới sự lột xác. Nếu cơ quan Y bị
loại khỏi cơ thể cua, các con vật sẽ không trải qua bất kỳ sự lột xác nào nữa. Bằng
chứng về việc hormone ecdysone kiểm soát lột xác được chứng minh bằng việc cấy cơ
quan Y vào trong các cua thiếu những cấu trúc này, khi đó chúng có thể hồi phục khả
năng lột xác. Hoạt động tiết của cơ quan Y không chịu sự kiểm soát của hệ thần kinh
mà được xác định bởi sự hiện diện hay vắng mặt của hormone juvenile do máu mang
tới từ tuyến nội tiết cuống mắt (hormone ức chế lột xác, molt-inhibiting hormone,
MIH, juvenile hormone, JH). Khi tác động ức chế của JH bị loại, chẳng hạn như cắt bỏ
các cuống mắt, sự lột xác của giáp xác xảy ra nhanh chóng.
Tuy nhiên, sự lột xác có thể hoàn thiện, nếu các cơ quan Y bị loại sau các giai
đoạn D sớm (D0 và D1), như vậy chúng có vai trị quan trọng cho việc khởi đầu của
giai đoạn tiền lột xác nhưng lại không quan trọng với các giai đoạn sau.

Sự tái sinh các chi đã chứng tỏ tác động của hormone lột xác ở mức độ mô. Khi
một chân của cua tự gãy, một mầm chân phát triển sau đó. Tuy nhiên, “giai đoạn tăng
trưởng cơ bản” này bị giới hạn với mức độ tái tổ chức và phát triển ban đầu của các mô
mới, và khi giai đoạn này hoàn tất, sự tăng trưởng ngừng. Mầm chi khơng gia tăng kích
thước hơn nữa sau giai đoạn này hoặc là các cuống mắt của con vật bị loại để kích
thích cơ quan Y giải phóng hormone, biến đổi cơ thể cua một cách tự nhiên dẫn đến
giai đoạn tiền lột xác. Sau đó mầm chi bắt đầu gia tăng về kích thước khi con vật lột
xác.


10

Hormone cơ quan Y là cần thiết cho các giai đoạn khởi đầu của sự thành thục
tuyến sinh dục cũng như sự phát triển của mầm chi, ít nhất nó cũng được địi hỏi cho sự
phân chia tế bào.
Rất ít hormone được dự trữ trong cơ quan Y ở giai đoạn intermoult nhưng lại
hiện diện nhiều trong máu. Trong phần lớn giáp xác có cuống mắt, tuyến nội tiết cuống
mắt (tuyến xoang) nằm ở khoảng 2/3 của đường dọc theo cuống mắt và nằm trên mặt
lưng của hạch thị giác. Đó là nơi dự trữ và giải phóng hormone được tạo thành dọc
theo các trục thần kinh tới tuyến xoang với tốc độ vài mm mỗi ngày.
Các hormone được giải phóng bởi tuyến cuống mắt có thể có các vai trị sau: ức
chế lột xác; kiểm sốt trao đổi glucid; kiểm soát cường độ trao đổi chất; ức chế sự phát
triển tuyến sinh dục; kiểm soát sự phân bố sắc tố; kiểm soát sự trao đổi protein; kiểm
soát trao đổi chất nước và kiểm soát nhịp tim.
Rõ ràng sự khởi đầu đáp ứng của hormone đến từ cơ quan X, khi loại bỏ cơ
quan một X sẽ thúc đẩy sự hoạt động của cơ quan Y và đẩy nhanh sự lột xác một cách
khơng bình thường, và khơng q nhanh khi loại bỏ cả hai cơ quan X và tuyến xoang.
Việc cấy lại phức hợp tuyến xoang và cơ quan X vào những con cua thiếu cuống mắt
làm chậm sự lột sớm trên con vật. Các tế bào ở cơ quan X ngừng tiết 4 - 5 ngày trước
sự lột xác bình thường ở cua và bắt đầu hoạt động lại vài ngày sau khi lột xác.

Ở ấu trùng Decapod, tuyến xoang được thành lập khá trễ trong sự phát triển
(giai đoạn ấu trùng thứ 5 ở Palaemonetes). Do chưa có tuyến xoang nên ấu trùng trải
qua các lần lột xác liên tiếp một cách nhanh chóng mà khơng trải qua giai đoạn
intermoult. Việc cắt cuống mắt không ảnh hưởng đến cường độ lột xác. Kết quả này
cho thấy rằng các lồi thuộc hình thức lột xác thường xun (diecdycis) có thể cũng có
các cơ quan X khơng hoạt động, cho phép chúng trải qua nhanh chóng từ lần lột xác
này đến lần lột xác kế tiếp, cịn các hình thức lột xác theo mùa, năm (anecdycis) thì
ngược lại, cơ quan X hoạt động theo mùa, năm [8].


11

1.3.2.

ặc

ểm quá trình lột xác của cua

Quá trình lột xác của cua trải qua 4 giai đoạn chính:
Giai đoạn A: xảy ra ngay sau lột xác và cua không ăn, chia thành hai giai đoạn
phụ A1 và A2.
A1: vỏ quá mềm nên con vật không thể tự đứng trên những chân, khối lượng cơ
thể đang gia tăng vì nước được hấp thu vào cơ thể.
A2: sự khoáng vỏ bắt đầu và con vật có thể đứng nhưng vỏ vẫn cịn mềm. Khối
lượng đã ổn định. Hàm lượng nước trong cơ thể là 86%.
Giai đoạn B: là giai đoạn chính của sự khống hóa vỏ mới cua vẫn chưa ăn, chia
thành hai giai đoạn phụ là B1 và B2.
B1: sự tiết lớp vỏ trong đã bắt đầu, các đốt đùi và đốt bàn có thể uốn cong mà
khơng bị gãy. Hàm lượng nước 85%.
B2: sự tiết lớp vỏ trong tiếp tục, các đốt đùi trước, đốt bàn sẽ bị nứt khi bị uốn

cong. Hàm lượng nước 83%.
Giai đoạn C: vỏ cua đã cứng nhưng sự canxi hóa vỏ vẫn tiếp tục ở những giai
đoạn đầu của giai đoạn C, cua bắt đầu ăn tiếp tục trở lại và được chia thành bốn giai
đoạn phụ là C1, C2, C3, C4.
- C1: thời kì chính của sự sinh trưởng các mơ, các mặt phía trong của chân cịn
đàn hồi khi bị n n. Hàm lượng nước chiếm 80%.
- C2: sự phát triển các mơ đang được tiếp tục, vỏ chân vẫn cịn đàn hồi khi nén
nhẹ nhưng sẽ bị nứt khi bị nén quá mạnh. Hàm lượng nước chiếm 76%.
- C3: vỏ đã cứng nhưng sự canxi hóa vẫn chưa hồn tất phần bên và phần trước
mai. Hàm lượng nước chiếm 68%.
- C4: (intermoult): sự canxi hóa đã hồn tất và lớp màng đã được tiết ngay dưới
vùng đã được canxi hóa. Các vật chất dự trữ trong quá trình trao đổi chất đang được
tích lũy. Sự tăng trưởng mơ đã hồn tất. Hàm lượng nước 60%. Có thể là giai đoạn
ngừng lột xác vĩnh viễn (là giai đoạn kết thúc sinh trưởng của một lồi nào đó).


12

Giai đoạn D: là quá trình chuẩn bị cho sự lột xác tiếp theo, sự tái hấp thu canxi
xảy ra và các lớp ngoài của vỏ mới đang được tiết ra, và được chia thành bốn giai đoạn
phụ là D1, D2, D3, D4.
D1: dấu hiệu đầu tiên của việc báo hiệu lột xác đó là sự xuất hiện của gai mới
trong gốc của những gai cũ. Lớp vỏ ngoài được tiết bởi những tế bào biểu bì dưới vỏ.
D2: là lớp vỏ giữa (lớp sắc tố được tiết).
D3: sự tái hấp thu canxi xảy ra đều khắp từ vỏ cũ và điều này gây ra sự nứt ở
một số nơi, sự nứt này tạo khe cửa vỡ cho giáp xác lột xác.
D4: sự tái hấp thu canxi dọc theo các đường nứt đã hoàn tất, kết quả là tạo khe
cửa vỏ nhờ đó con vật có thể thốt ra ngồi, sự hấp thu nước bắt đầu [8].
Giai đoạn E: giai đoạn cua đã thoát ra khỏi vỏ cũ và hấp thu nước nhanh chóng,
gồm bốn giai đoạn phụ là:

- Giai đoạn tiền lột xác từ D1 – D4.
- Giai đoạn hậu lột xác từ A1 – C3.
- Giai đoạn gian lột xác là C4.
- Giai đoạn lột xác là E
1.4. Phƣơng pháp cô lập các hợp chất hữu cơ
1.4.1. Sắc ký phân bố - sắc ký cột
a) P a tĩn
Trong sắc ký phân bố, pha tĩnh (lỏng) được tẩm lên bề mặt hoặc được hút vào
trong các xoang của 1 giá xốp (chất mang). Một số chất mang phổ biển hiện nay như
diaion, cellulose, polyamide… trong đó phổ biến nhất là diaion. Nó là tên gọi chung
của nhựa polymer tổng hợp được điều chỉnh nhờ quá trình đồng trùng hợp giữa styren
và divinyl benzen do hãng Misubishi (Nhật) sản xuất. Diaion có 4 loại chính gồm
Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40, trong đó thơng dụng nhất là HP-20.
Diaion HP-20 ở dạng hạt nhẹ xốp, diện tích bề mặt khoảng 600 m2/g, đường