Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận acid glucuronic trên môi trường nước dừa già

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ THIÊN HƯƠNG

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN
ACID GLUCURONIC TRÊN MÔI TRƯỜNG
NƯỚC DỪA GIÀ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60420201

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ THIÊN HƯƠNG

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN
ACID GLUCURONIC TRÊN MÔI TRƯỜNG
NƯỚC DỪA GIÀ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ : 60420201

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. Hồ Chí
Minh, 268 Lý Thường Kiệt, phường 14, Q.10, TP. Hồ Chí Minh.
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Thúy Hương

Ủy viên phản biện 1: PGS. TS Lê Văn Việt Mẫn

Ủy viên phản biện 2: TS. Nguyễn Hữu Phúc

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại Học Quốc Gia Thành
phố Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 08 năm 2015.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng
2. TS. Huỳnh Ngọc Oanh
3. PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
4. TS. Nguyễn Hữu Phúc
5. TS. Võ Đình Lệ Tâm
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Hà Thiên Hương

MSHV: 13310809

Ngày, tháng, năm sinh: 12/06/1990

Nơi sinh: tỉnh Long An

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:
“Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận acid glucuronic trên môi trường nước dừa
già”
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Xác định điều kiện lên men thích hợp để thu nhận acid glucuronic trên môi trường
nước dừa già.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid glucuronic trên môi trường
nước dừa già.
- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid glucuronic bằng phương
pháp quy hoạch thực nghiệm.

II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015.
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/06/2015.
IV. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG.
TS. NGUYỄN THỊ BÍCH HỒNG.
Tp. HCM, ngày … tháng … năm 2015
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành chương trình cao học. Tơi đã học được nhiều điều
quý báu ở cô về kiến thức, nhiệt huyết, tình u thương và tinh thần trách nhiệm.
Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học –
Trường Đại học Bách Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt
nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn tất cả quý thầy cơ đã tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức và
kinh nghiệm, giúp tơi có được hành trang hữu ích để phát triển nghề nghiệp.
Xin cảm ơn chị Lý Huỳnh Liên Hương – học viên cao học ngành Công nghệ Sinh
học khóa 12 đã ln chia sẻ và nhiệt tình hỗ trợ tơi thực hiện thí nghiệm. Xin cảm ơn
bạn các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 13 và các bạn sinh viên
đã giúp đỡ và động viên tơi trong q trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân u đã ln khích
lệ và ủng hộ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu
này.

i


TÓM TẮT
Nước dừa già là một trong những sản phẩm nông nghiệp được thải ra từ công
nghiệp sản xuất các sản phẩm xuất khẩu từ dừa. Nước dừa già có thành phần khá đa
dạng và là cơ chất điển hình lên men chủng vi khuẩn acetic. Bên cạnh đó, thành phần
dinh dưỡng đa dạng của nước dừa già cũng thích hợp cho chủng vi khuẩn lactic phát
triển. Việc tối ưu hóa các điều kiện lên men kết hợp giữa hai chủng vi khuẩn acetic và
lactic trên cơ chất nước dừa già nhằm mục đích thu nhận acid glucuronic hàm lượng cực
đại với giá thành thấp. Hai chủng giống vi khuẩn sử dụng trong đề tài là chủng
Lactobacillus acidophilus có mã số đăng ký trên ngân hàng dữ liệu NCBI là
AB911464.1 và vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola có mã số đăng ký trên ngân hàng
dữ liệu NCBI là NR_041012.1. Sử dụng ma trận sàng lọc Plackett - Burman và phương
pháp đáp ứng bề mặt với phương án cấu trúc có tâm RSM-CCD để tối ưu hóa các yếu
tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid glucuronic sinh ra trong quá trình lên men nước dừa
già cho thấy có 4 yếu tố sau sàng lọc được xác định giá trị tối ưu là mật độ giống vi
khuẩn G. nataicola ban đầu là 4.79 log CFU/ml, mật độ vi khuẩn L. acidophilus ban đầu
là 5.34 log CFU/ml, 8.99% sucrose và nhiệt độ lên men 31.96°C. Các điểm tối ưu này
cho giá trị cực đại của acid glucuronic khi áp dụng mơ hình vào thực tế là 93.24mg/l đạt
96% sự tương đồng so với mơ hình lý thuyết.

ii


SUMARY

Mature coconut water is one of the agriculture by-products which is originated
from coconut products exportation industry. It has a diversity in components and is a
typical substrate of acetobacter’s fermentation. More over, the diverse nutritions of

mature coconut water are also suitable for the development of Lactic bacteria. In this
study, the process of mature coconut water fermentation by the complex of two bacteria
strains Gluconacetobacter nataicola and Lactobacillus acidophilus in order to get high
glucuronic acid concentration was eveluated. The two strains of bacteria was used in
this study are Lactobacillus acidophilus with NCBI ID AB911464.1 and
Gluconacetobacter nataicola with NCBI ID NR_041012.1. A Plackett – Burman matrix
and Response surface methodology (RSM) with Central composite design (CCD) was
designed to study the factors affect glucuronic acid formation. The results after
screening process indentified four factors with optimal value: 4.79 log CFU/ml G.
Nataicola inoculation density, 5.34 log CFU/ml L. acidophilus inoculation density, 8.99
% sucrose and incubation at 31.96○C, respectively. The highest value of glucuronic acid
concentration in practical model was 94.23 mg/l, by which 96% identical to the
hypothesis model.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng
được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMARY ...................................................................................................................... iii

LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................iv
MỤC LỤC .......................................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................................ix
TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................................x
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................3
1.1. NƯỚC DỪA GIÀ .....................................................................................................3
1.2. NHÓM VI KHUẨN ACETIC .................................................................................6
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn acetic ................................................................................6
1.2.2. Giống vi khuẩn Gluconacetobacter.......................................................................8
1.3. NHÓM VI KHUẨN LACTIC ................................................................................10
1.3.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic...............................................................................10
1.3.2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ....................................................................11
1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA ACID GLUCURONIC .......................................13
1.4.1. Acid glucuronic và cơ chế sinh tổng hợp acid glucuronic ..................................13
1.4.2. Ứng dụng của acid glucuronic trong phòng và điều trị bệnh .............................. 15
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN VỀ HƯỚNG
CỦA ĐỀ TÀI .................................................................................................................17
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................20
2.1. Vật liệu, hóa chất, mơi trường ................................................................................20
2.1.1 Nguồn giống vi sinh vật .......................................................................................20
2.1.2 Nguyên liệu...........................................................................................................21
2.1.3 Hóa chất, thiết bị ...................................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................23
2.2.1 Sơ đồ tổng quát .....................................................................................................23
v

2.2.2. Thiết kế thí nghiệm .............................................................................................. 24
2.3. Các phương pháp phân tích ....................................................................................28
2.3.1 Phương pháp vi sinh ............................................................................................. 28
2.3.2. Phương pháp định acid glucuronic bằng Kit K-uronic của hãng Megazyme .....30
2.3.3 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ..................................................................30
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33
3.1. Các nghiên cứu tiền đề ........................................................................................... 33
3.1.1. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ......................33
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola ................34
3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả năng thu acid
glucuronic trên cơ chất nước dừa già ............................................................................35
3.3 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành acid glucuronic trên cơ chất
nước dừa già ..................................................................................................................35
3.3.1. Kết quả khảo sát các đơn yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành acid
glucuronic ......................................................................................................................35
3.3.2. Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
thu nhận acid glucuronic trên mơi trường nước dừa già. ..............................................43
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 54
4.1. Kết luận...................................................................................................................54
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus .................................................................8
Hình 2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus .................................................................12
Hình 3. Cơng thức cấu tạo của acid glucuronic............................................................. 13

Hình 4. Sự oxy hóa glucose tạo thành acid glucuronic .................................................14
Hình 5. Sự tổng hợp acid glucuoronic ở sinh vật ..........................................................15
Hình 6. Mơ hình chung về sự đào thải độc tố của acid glucuronic ............................... 15
Hình 7. Sự chuyển hóa bilirubin ....................................................................................16
Hình 8. Quy trình tổng qt ........................................................................................... 23
Hình 9. Đường chuẩn acid glucuronic...........................................................................30
Hình 10. Mặt đáp ứng tương tác giữa tỷ lệ mật độ vi khuẩn G. Nataicola ban đầu và mật
độ vi khuẩn L. acidophilus ban đầu ...............................................................................52
Hình 11. Mặt đáp ứng tương tác giữa mật độ vi khuẩn G. Nataicola ban đầu và nhiệt độ
.......................................................................................................................................52
Hình 12. Mặt đáp ứng tương tác giữa mật độ vi khuẩn G. Nataicola ban đầu và sucrose
.......................................................................................................................................52
Hình 13. Mặt đáp ứng tương tác giữa mật độ vi khuẩn L. acidophilus ban đầuvà nhiệt
độ ...................................................................................................................................53

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa ............................................................... 4
Bảng 2.Thành phần vitamin của nước dừa ......................................................................4
Bảng 3.Thành phần khoáng chất của nước dừa............................................................... 4
Bảng 4. Thành phần acid amin của nước dừa .................................................................5
Bảng 5. Môi trường dinh dưỡng ....................................................................................22
Bảng 6. Ma trận sàng lọc các yếu tố ..............................................................................27
Bảng 7. Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa hàm lượng acid glucuronic
lên men trên cơ chất nước dừa già. ................................................................................27
Bảng 8.Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng hình thành acid glucuronic ..35
Bảng 9. Kết quả sàng lọc trên ma trận Plackett-Burman ..............................................44
Bảng 10. Độ tin cậy của các yếu tố ảnh hưởng dựa trên hàm lượng acid glucuronic ...45

Bảng 11. Kết quả thực nghiệm tối ưu hoá theo phương pháp RSM - CCD ..................47
Bảng 12. Độ tin cậy của các yếu tố tối ưu .....................................................................48
Bảng 13. Tọa độ các giá trị tối ưu thu nhận acid glucuronic ........................................51

viii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1. Đường cong sinh trưởng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus .....................33
Biểu đồ 2. Kết quả đường cong sinh trưởng vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola ...34
Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của mật độ giống G. nataicola ban đầu đến khả năng hình thành
acid glucuronic ..............................................................................................................36
Biểu đồ 4. Ảnh hưởng của mật độ giống L. acidophilus ban đầu đến khả năng hình thành
acid glucuronic ..............................................................................................................37
Biểu đồ 5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose bổ sung đến khả năng hình thành acid
glucuronic ......................................................................................................................39
Biểu đồ 6. Ảnh hưởng của pH lên men đến khả năng hình thành acid glucuronic .......40
Biểu đồ 7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng hình thành acid glucuronic
.......................................................................................................................................41
Biểu đồ 8. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng hình thành acid glucuronic
.......................................................................................................................................42
Biểu đồ 9. Mức ảnh hưởng của các yếu tố dựa trên hàm lượng acid glucuronic ..........45
Biểu đồ 10. Mức độ ảnh hưởng giữa các yếu tố hình thành acid glucuronic ................48

ix


TỪ VIẾT TẮT
Response surface methodology (Phương pháp đáp ứng bề mặt): RSM
Central Composite Designs (Thiết kế cấu trúc có tâm): CCD

d – saccharide acid – 1,4 lactone: DSL

x


MỞ ĐẦU
Acid glucuronic là một hợp chất thứ cấp do nhóm vi khuẩn acetic sinh ra. Đây là
hợp chất rất có lợi cho sức khỏe con người nên đã thu hút sự quan tâm và nhiều hướng
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới. Trong cơ thể con người, acid glucuronic
được tổng hợp qua chu trình vòng uronic. Acid glucuronic đóng vai trò quan trọng trong
chức năng gan. Nó đóng vai trò là chất liên kết khử độc - cơ chế khử độc chính của gan.
Acid glucuronic liên kết với bilirubin, cholesterol, phenol, alkcaloid và các hormone
steroid tạo thành các chất đơn giản, ít độc hại hơn. Sau đó, các chất này được thải ra
ngồi qua nước tiểu hay dịch mật [1,2,3]. Acid glucuronic còn có tác dụng phân giải
glycogen giúp điều hòa đường huyết, phòng chống cao huyết áp và bệnh tiểu đường [4].
Bên cạnh đó, nó có tác dụng chống các gốc tự do nên có lợi trong việc ngăn chặn q
trình sự oxy hóa giúp tăng cường sức khỏe [5]. Ngồi ra, acid glucuronic đóng vai trò
quan trọng đối với việc điều trị bệnh Gout bằng cách bằng cách giảm nồng dộ acid uric
trong máu [5,6]. Đặc biệt, năm 1996, các nhà khoa học Nhật nhận thấy acid glucuronic
làm thúc đẩy quá trình Apoptosis trong tế bào ung thư dạ dày và ruột. Phát hiện này đã
mở ra hướng nghiên cứu mới quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư
– một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.
Acid glucuronic là một hợp chất quan trọng đối với cơ thể. Trong cơ thể người, nó
được tổng hợp chủ yếu ở gan nhưng với lượng rất ít nên có thể khơng đủ giúp cơ thể
đào thải với lượng độc tố xâm nhập ngày càng nhiều từ môi trường như hiện nay . Ngoài
ra, acid glucuronic còn tồn tại trong động thực vật – một thách thức đối với quá trình
sản xuất hàng loạt nhằm ứng dụng dược tính của nó trong y học. Đến thời điểm hiện
nay, các nghiên cứu chủ yếu xoay quanh việc chứng minh lợi ích của hợp chất này, rất
ít nghiên cứu quan tâm vấn đề sản xuất ứng dụng. Các nghiên cứu về sản phẩm lên men
sinh acid glucuronic cũng không đề cập nhiều. Một số nghiên cứu trước đây chỉ chứng

minh vi khuẩn acetic tham gia chính trong q trình sinh acid glucuronic. Nghiên cứu
gần đây và trong đó có cả nhóm nghiên cứu của chúng tôi, cho thấy khi bổ sung thêm
vi khuẩn lactic vào môi trường lên men của vi khuẩn acetic sẽ làm tăng khả năng sinh
acid glucuronic [7,8].
Nhóm vi khuẩn acetic có khả năng lên men tốt trong nhiều mơi trường tự nhiên
khác nhau và điển hình là mơi trường nước dừa [9,10,11]. Ngoài ra, nước dừa già là một
1


trong những sản phẩm nông nghiệp rất dồi dào và ổn định ở nước ta. Ngoài ra, nước dừa
già là phế phẩm trong công nghiệp sản xuất cơm dừa nạo sấy xuất khẩu và cơng nghiệp
sản xuất xà phòng. Vì thế, trên thị trường, giá thành của nước dừa già tương đối thấp so
với các nguồn cơ chất khác. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già chẳng những
thích hợp với vi khuẩn acetic mà còn phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn lactic [12].
Vì vậy, sử dụng nước dừa làm cơ chất lên men thu nhận acid glucuronic vừa có ý nghĩa
kinh tế về mặt giá thành sản phẩm vừa góp phần giải quyết đầu ra của nguồn sản phẩm
nông nghiệp này.
Nghiên cứu lên men nước dừa dựa trên hệ vi sinh vật cộng sinh giữa vi khuẩn
acetic và vi khuẩn lactic thu acid glucuronic là hướng nghiên cứu mang tính chất kế thừa
các nghiên cứu trước mà chúng tôi đã công bố [8,13,14] và thăm dò trên môi trường cơ
chất giá thành thấp lên men thu acid glucuronic hàm lượng cao. Với mục đích này, chúng
tơi đề xuất nghiên cứu đề tài “Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận acid glucuronic
trên môi trường nước dừa già”.
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu các điều kiện lên men khi bổ sung chủng vi khuẩn
lactic nhằm bổ trợ chủng vi khuẩn acetic để tăng khả năng hình thành acid glucuronic
của hệ lên men cơ chất nước dừa già.
Đề tài được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với các nội dung sau :
- Xác định điều kiện lên men thích hợp để thu nhận acid glucuronic trên môi trường
nước dừa già.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid glucuronic trên mơi trường

nước dừa già.
- Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh acid glucuronic bằng phương
pháp quy hoạch thực nghiệm.

2


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NƯỚC DỪA GIÀ
Cây dừa có tên khoa học là Cocos nucifera L., là một loại cây lâu năm được trồng
phổ biến trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nhiệt đới. Việt Nam có điều kiện khí
hậu và thổ nhưỡng rất phù hợp cho cây dừa phát triển. Hiện nay, cây dừa được trồng
rộng rãi các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và khu vực duyên hải miền Trung.
Theo thống kê của các tổ chức khác nhau, diện tích trồng dừa của Việt Nam tuy
không lớn nhưng sản lượng lại cao và tăng dần đều theo các năm. Theo niên giám Thống
kê của Hiệp hội Dừa Châu Á - Thái Bình Dương, đến năm 2012, diện tích trồng dừa của
Việt Nam là 157 nghìn hecta và sản lượng hàng năm là 1,015,141 triệu quả tương đương
253,785 tấn dừa khô. Theo thống kê của ETC Group năm 2013, sản lượng dầu dừa xuất
khẩu của Việt Nam đứng thứ tư thế giới và Việt Nam cũng là nước xuất khẩu cơm dừa
nạo sấy và chỉ xơ dừa chủ yếu.
Cây dừa là loại cây cho trái quanh năm nên có khả năng cung cấp sản phẩm rất dồi
dào và ổn định. Các sản phẩm tiêu thụ rất đa dạng như dừa trái, cơm dừa sấy khô, bột
sữa dừa, dầu dừa, than gáo dừa, thạch dừa, chỉ xơ dừa…Các sản phẩm trên chủ yếu được
chế biến từ quả dừa và có giá trị kinh tế cao đối với cả trong và ngoài nước. Quả dừa
phục vụ trong q trình chế biến và đa dạng hóa sản phẩm gồm hai loại: quả dừa non và
quả dừa già. Quả dừa non hay dừa trái với giá trị dinh dưỡng cao phục vụ nhu cầu thức
uống. Quả dừa già bao gồm phần cơm dừa là thành phần chủ yếu để sản xuất cơm dừa,
sữa dừa, dầu dừa. Ngoài ra, phần vỏ dừa hay gáo dừa được tận dụng để sản xuất than
gáo dừa và chỉ xơ dừa. Bên cạnh đó, phần còn lại là nước dừa già được ứng dụng để sản
xuất thạch dừa. Tuy nhiên, do sản lượng dừa rất lớn và mặt khác, thạch dừa còn được

sản xuất từ mật rỉ đường nên lượng nước dừa già khơng được tận dụng hết và tồn đọng
lại. Vì thế, trên thị trường hiện nay, nước dừa già được xem là nguồn cơ chất có sản
lượng lớn và rất ổn định.
Quả dừa là một hệ kín vơ trùng với đầy đủ các thành phần dinh dưỡng như đường,
đạm, chất chống oxi hóa, các vitamin và khống chất. Q trình chín quả bao gồm hai
giai đoạn. Giai đoạn đầu, quả dừa còn non chủ yếu chứa thành phần đường khử là
glucose và fructose. Giai đoạn sau, khi quả dừa đã chín, thành phần đường của nước dừa
già mới xuất hiện sucrose [15]. Một số thành phần dinh dưỡng của nước dừa được trình
bày trong bảng sau.
3


Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa
Chất dinh dưỡng

Giá trị (g/100g)

Carbohydrate
Chất xơ
Đường tổng số
Lipid tổng số
Nước
Protein
Tro

3,71
1,10
2,61
0,20
94,99

0,72
0,39

[16]
Bảng 2.Thành phần vitamin của nước dừa
Giá trị (mg/100g)

Vitamin
Acid pantothenic

0,043

B1 (Thiamin)

0,030

B2 (Riboflavin)

0,057

B6 (Pyridoxin)

0,032

C (Acid ascorbic)

2,400

Niacin

0,080

[16]
Bảng 3.Thành phần khoáng chất của nước dừa
Chất khoáng

Giá trị (mg/100g)

Ca

24,000

Cu

0,040

Fe

0,290

K

250,000

Mg

25,000

Mn

0,142

Na

105,000

P

20,000

Se

1,000

Zn

0,100

[16]

4


Bảng 4. Thành phần acid amin của nước dừa
Giá trị (g/100g)

Acid amin
Acid aspartic

0,070

Acid glutamic

0,165

Alanine

0,037

Argine

0,118

Cystein

0,014

Glycine

0,034

Histidine

0,017

Isoleucine

0,028

Leucine

0,053

Lysine

0,032

Methionine

0,013

Phenylalanine

0,037

Proline

0,030

Serine

0,037

Threonine

0,026

Tryptophan

0,008

Tyrosine

0,022

Valine

0,044

[16]
Từ năm những năm 1960, nước dừa đã được biết đến và sử dụng để làm môi trường
nuôi cấy vi sinh [17]. Đặc biệt, nước dừa già được xem là mơi trường điển hình để ni
cấy vi khuẩn acetic [18,19]. Cho đến thời diểm hiện nay, rất nhiều nghiên cứu và công
bố cũng cho thấy nước dừa già là một trong những mơi trường thích hợp nhất cho nhóm
vi khuẩn acetic phát triển [9]. Bên cạnh đó, thành phần đa dạng chất dinh dưỡng của
nước dừa già cũng phù hợp cho các nhóm vi khuẩn khác phát triển. Hiện nay, đã có một
số cơng bố nhóm vi khuẩn lactic có khả năng sống và phát triển trên môi trường này.
Năm 2011, Kuswardani và cộng sự đã công bố vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus và
Streptococcus thermophilus có khả năng sống và phát triển trên mơi trường nước dừa
[20]. Ngồi ra, Seesuriyachan (2011) cũng cho thấy Lactobacillus bulgaricus TISTR
1498 có thể sử dụng các thành phần nước dừa mà không cần bổ sung thêm chất dinh
dưỡng nào để tạo thành các exopolysaccharide đơn giản [21]. Trong những năm gần
đây, một số nghiên cứu công bố khả năng lên men của nhóm vi khuẩn lactic trên mơi
5


trường nước dừa tạo sản phẩm có lợi cho sức khỏe. Năm 2010, Yuliana và cộng sự
nghiên cứu sản xuất thức uống lên men từ nước dừa bởi tổ hợp vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus [22]. Năm 2013,
Lee và cộng sự lên men hai giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus L10 và

Lactobacillus casei L26 trên môi trường nước dừa tạo thức uống probiotic [23]. Nói tóm
lại, nước dừa già có thể xem là nguồn cơ chất tự nhiên thích hợp cho các nhóm vi khuẩn
acetic và lactic sống và phát triển.
1.2. NHÓM VI KHUẨN ACETIC
1.2.1. Tổng quan về vi khuẩn acetic
Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm vi khuẩn được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp, đặc biệt là trong sản xuất thực phẩm. Từ rất lâu, nhóm vi khuẩn
acetic đã được ứng dụng để lên men sản xuất giấm ăn hằng ngày. Chúng cũng là nhóm
vi khuẩn điển hình tổng hợp cellulose. Gần đây, nhóm vi khuẩn acetic còn được quan
tâm với khả năng sinh acid glucuronic, một acid có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ
giải độc gan để đào thải các chất độc hại ra ngồi cơ thể. Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm
vi khuẩn hiện diện rất phong phú trong tự nhiên, chúng có thể được phân lập từ trái cây,
giấm, rượu, bia; trong đất, nước….
Về vi thể, vi khuẩn acetic là những trực khuẩn Gram âm. Chúng thường có dạng
hình que đến elip, đứng tách riêng lẻ hoặc một số xếp thành dạng chuỗi dài. Ngoài ra,
một số loài còn có tế bào hình cầu, xoắn, chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt tùy thuộc
lồi và điều kiện mơi trường ni cấy.
Trong mơi trường lỏng, vi khuẩn acetic có tốc độ sinh trưởng rất nhanh, từ 1 tế bào
sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào [24]. Trong quá trình sinh trưởng
và phát triển, chúng tiết ra acid acetic với nồng độ thấp có tác dụng kích thích sự
sinh trưởng. Ngồi ra, chúng còn có thể sinh acid glucuronic bằng quá trình pentose
phosphate [5]. Vi khuẩn acetic là loài ưa mát, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 20 30°C. Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại đến 38°C nhưng sinh trưởng rất chậm. Vi khuẩn
acetic có tính chịu acid cao, pH thích hợp là 3.5 - 6.2, một số lồi vẫn có thể phát triển
được ở pH 3.2 [24].
Nhóm vi khuẩn này khơng có khả năng tạo bào tử. Một số lồi có thể di động
nhờ tiên mao ở một đầu - đơn mao, hay chu mao, một số khơng có khả năng này. Đây
là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.

6

Trên môi trường thạch, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn,
nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như Acetobacter aceti,
Gluconabacter xylinus… có khuẩn lạc rất nhỏ (đường kính khoảng 1 mm), bề mặt trơn
bóng, có tâm sẫm màu. Một số lồi có khuẩn lạc lớn (đường kính khoảng 4 - 5 mm), bề
mặt trơn bóng, khơng có màu, mỏng và trong suốt. Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn
sâu vào mơi trường nên khó lấy ra bằng que cấy.
Trên mơi trường lỏng, vi khuẩn acetic tập trung trên bề mặt môi trường, nơi tiếp
xúc nhiều oxy, tạo thành lớp màng có cấu trúc khác nhau tùy theo lồi và điều kiện ni
cấy. Khi lắc đảo, lớp màng này chìm xuống và vi khuẩn tiếp tục tập trung vào nơi chứa
nhiều oxy để hình thành lớp màng mới. Bên cạnh đó, một số lồi lại tạo khối cellulose
chìm trong lòng mơi trường nuôi cấy. Khi nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, dung dịch mơi
trường phía dưới lớp màng cellulose trong suốt. Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện
động, cellulose được hình thành bị vỡ ra làm vẩn đục mơi trường nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn acetic phải đáp ứng đầy đủ các acid amin như acid
pantothenic, valin, alanin, prolin…, một số chất kích thích sinh trưởng như p aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe, S,
P,… có thể ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ.
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn acetic
dựa trên các tính chất sinh hố cụ thể sau: khả năng tạo catalase, khả năng tổng hợp các
chất ketol từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol, sorbitol… , khả năng oxy hóa
acetat thành CO2 và nước, khả năng oxy hóa glucose thành acid gluconic, khả năng sử
dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử dụng rượu etylic làm
nguồn carbon, khả năng tạo sắc tố nâu, khả năng tổng hợp cellulose. Trên cơ sở này,
Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydan, mesoxydan, oxydan,
peroxydan:

nhóm

suboxydan

gồm

các

lồi

Acetobacter

suboxydaz

và

Acetobacter melanogennum; nhóm mesoxydan gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter
aceti và Acetobacter mesoxydans; nhóm oxydan gồm các lồi khơng có khả năng tạo
các hợp chất ketol: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter
lovaniens;

nhóm

peroxydan

gồm

Acetobacter

pezoxydans

paradoxum khơng chứa catalase và khơng oxy hố được glucose [25].

7

và

Acetobacter


1.2.2. Giống vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.2.1. Giới thiệu
Phân loại Gluconacetobacter
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadiace
Họ: Acetobacteraceae
Giống: Gluconacetobacter [25]
Họ Acetobacteraceae bao gồm các giống Gluconacetobacter, Acidomonas,
Acetobacter, Gluconobacter, Asaia và Kozakia. Trong đó, giống Gluconacetobacter và
Acetobacter là có khả năng tổng hợp cellulose hiệu quả nhất. Vì thế, đây là hai giống
tiêu biểu được ứng dụng rộng rãi nhất trong các chủng vi khuẩn acetic. Gần đây, các
nhà nghiên cứu còn phát hiện chúng đóng vai trò chính trong hệ lên men hình thành acid
glucuronic.
Vi khuẩn Gluconacetobacter có thể được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau trong
tự nhiên. Đặc biệt, vi khuẩn này dễ dàng phân lập từ giấm, thạch dừa, trà kombucha do
chúng đóng vai trò chính trong các hệ lên men này.

Hình 1. Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus [25]
1.2.2.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que thẳng hoặc
hơi cong, kích thước khoảng 0.3-0.6 x 1.0-8.0μm thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng
riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc khơng, khơng sinh bào tử. Chúng là
vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa mơi trường lỏng và

mơi trường khí. Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi
chất nhầy tạo thành váng cellulose, váng này có bản chất là hemicellulose nên bắt màu
xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric.
8


Khi phát triển trên môi trường khắc nghiệt, Gluconacetobacter biến đổi thành dạng
có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc khơng phân
nhánh và dần dần sẽ gây thối hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể.
Nhóm vi khuẩn này sinh trưởng tốt ở nồng độ pH thấp. Trong quá trình hoạt động
và biến dưỡng, chúng sinh ra acid acetic, nồng độ acid aectic sinh ra có thể trên 4.5%.
Tuy nhiên, khi acid acetic sinh ra quá mức giới hạn hạn cho phép sẽ ức chế lại chính
hoạt động của chúng.
Gluconacetobacter có khuẩn lạc nhỏ, trịn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa
khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và tâm có màu sẫm hơn, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Sau 5 ngày
ni cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm. Khi nuôi cấy trong môi trường thạch,
Gluconacetobacter phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các
tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy. Trong môi trường lỏng, sau
24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp váng đục trên bề mặt, sau 36 - 48h sẽ hình thành một
lớp màng trong và ngày càng dày [26].
1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý của Gluconacetobacter
Gluconacetobacter oxy hóa ethanol thành acid acetic, acid acetic sẽ tiếp tục bị oxy
hóa thành CO2 và nước. Chúng có khả năng tổng hợp cellulose, cho phản ứng catalase
dương tính nên tạo bọt khí trong dung dịch lên men. Hầu hết Gluconacetobacter không
tăng trưởng trên môi trường Hoyer và khơng tạo sắc tố nâu. Chúng có thể chuyển hóa
glucose thành acid gluconic và acid glucuronic, chuyển hóa glycerol thành
dihydroxyacetol [26].
1.2.2.4. Đặc điểm sinh trưởng của Gluconacetobacter
Đặc điểm nổi bật nhất của vi khuẩn Gluconacetobacter là khả năng sinh cellulose.
Lớp màng cellulose sinh ra sẽ ra ngăn cản sự tiếp xúc của tế bào vi khuẩn với oxy gây

ảnh hưởng đến khả năng biến dưỡng tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có tác dụng giữ
nước nên giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào
chống lại tia UV.
Gluconacetobacter có thể sử dụng được một hay nhiều nguồn carbon khác nhau
và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn. Chẳng hạn chủng G. hansenni BPR 2001 sử dụng
fructose tốt nhất, trong khi chủng G. xylinus TFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn...
Gluconacetobacter có thể chuyển hóa glucose thành acid acetic, acid gluconic và acid
glucuronic và đây cũng chính là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm
từ 1 đến 2 đơn vị trong q trình ni cấy.
9


Theo Hestrin (1947), Gluconacetobacter có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3
đến 8, tới ưu nhất là từ 5 đến 5.5. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp từ 12°C đến 35°C,
chúng không phát triển ở nhiệt độ cao ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Đặc
biệt, chúng có thể phát triển trong mơi trường có nồng độ ethanol lên tới 10% [27].
Khi nuôi cấy Gluconacetobacter trên môi trường thạch. Lúc ban đầu, khuẩn lạc
còn non và sinh khối ít nên mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3
đến 5 ngày. Khi tế bào già, sinh khối tăng lên nên các khuẩn lạc mọc dính lại thành cụm,
màu đục hơn và tập trung theo đường cấy giống. Chúng có khả năng chịu được pH thấp,
vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy
để hạn chế sự nhiễm khuẩn và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose [27].
1.3. NHÓM VI KHUẨN LACTIC
1.3.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là một trong những chủng vi khuẩn được biết đến và sử dụng rộng
rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào
tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi khuẩn này
khơng có khả năng tổng hợp nhân heme của các porphyrine nên chúng là vi khuẩn vi
hiếu khí bắt buộc. Chúng lên men theo hai kiểu là homofermentative (lên men đồng

hình) và heterofermentative (lên men dị hình).
Vi khuẩn lactic yêu cầu hàm lượng chất dinh dưỡng cao và phức tạp đối với mơi
trường sống. Chúng có khả năng tự tổng hợp được các acid amin và vitamin nhưng rất
hạn chế. Vì vậy, mơi trường sống u cầu cung cấp một số lượng lớn vitamin (riboflavin,
thiamine, acid folic, biotin và những vitamin khác), acid amin, acid pantotemic, acid
nicotic, purine và pyridine. Ngoài ra, sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic
còn phụ thuộc vào một số yếu tố như pH, nhiệt độ và sự tích lũy các sản phẩm chuyển
hóa tích lũy trong mơi trường sống [28].
Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng bao gồm nhiều giống, lồi. Tế bào dạng hình cầu
bao gồm: Streptococcus, Lactococcus, Entercoccus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc
hình que như Lactobacillus. Chúng thường sống ở những nơi sản xuất sữa (Lactobacillus
brevis, L. bulgaricus, L. casei, L. fermentum) và trong màng nhầy ruột của người và
động vật (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis,
Streptococcus salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae). Vi khuẩn lactic có hệ
thống vận chuyển lớn, phức tạp để vận chuyển các acid amin, dipeptide, tripeptide và
10


oligopeptide nhằm tích lũy dinh dưỡng từ mơi trường. Những hệ thống này nằm ở màng
tế bào chất. Quá trình trao đổi chất chính là q trình đường phân và chu trình pentose
phosphate. Trong hệ vi khuẩn lactic, NADH được oxy hóa thành NAD+. Từ con đường
này chúng chuyển đổi pyruvate thành lactate với việc sử dụng lactate dehydrogenase.
Ngoài ra, màng tế bào vi khuẩn lactic có enzyme protease có thể phân giải protein thành
những peptide nhỏ hơn. Trong tế bào, những peptide nhỏ này được phân hủy thành
những acid amin bằng enzyme peptidase [29].
Nhóm vi khuẩn lactic gồm nhiều dòng với các giới hạn nhiệt độ sống khác nhau.
Các dịng ưa ấm có giới hạn nhiệt độ sinh trưởng nằm trong khoảng 25 - 35°C, các lồi
ưa nhiệt có nhiệt độ sinh trưởng trong khoảng là 40 - 45°C, cịn các lồi ưa lạnh có thể
phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5°C hoặc có thể thấp hơn). Khi nhiệt độ lên tới 60
- 80°C thì hầu hết chúng khơng sống sót sau 10 - 30 phút.

Một số lồi có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác lại có khả năng đối
kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như
vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic thì các lồi này cịn sinh ra các hợp chất có
hoạt tính kháng khuẩn [30].
1.3.2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
1.3.2.1. Giới thiệu
Năm 1900, Moro lần đầu tiên phân lập Lactobacillus acidophilus từ phân su trẻ
em. Ơng đã mơ tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của
vi khuẩn này [29].
Phân loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Chi: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus acidophlilus [28].
Vi khuẩn L. acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Chúng
chủ yếu được ứng dụng lên men các sản phẩm từ sữa như sữa chua, một số loại phô mai
và đậu nành lên men. Một số thực phẩm lên men như dưa cải, kim chi, kombucha cũng
11