Tóm tắt luận án Tiến sĩ ngành Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------------------Nguyễn Thành Long
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ
CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP
TAN TRONG NƢỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
TỪ BÃ MEN BIA

Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 9 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2020


Cơng trình được hồn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Lê Quang Luân
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn

Phản biện 1: …
Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ...’, ngày … tháng

… năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
Luận án “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo
β-glucan khối lƣợng phân tử thấp tan trong nƣớ
oạt t n in
ọ từ
n ia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019
tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Viện
Sinh học Nhiệt đới.
1. Tính cấp thiết
β-glucan đã được biết đến rộng rãi như là chất kích thích miễn dịch
rất mạnh, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hịa lượng
đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da, v.v. βglucan cịn có tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và hạn
chế sự phát triển của khối u ở người nên có hoạt tính phòng chống rất
mạnh mẽ khối u giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư, và làm giảm
tác dụng phụ của hóa trị, v.v. Trong chăn ni, β-glucan có tác dụng làm
tăng cường hệ thống miễn dịch, giúp vật nuôi kháng được một số bệnh,
từ đó làm tăng năng suất và chất lượng sản sản phẩm mà không cần phải
dùng đến kháng sinh hoặc chất kích thích.
Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao và
khó hòa tan nên rất hấp thu kém nên gặp một số trở ngại khi ứng dụng
thực tiễn. Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp sẽ có hiệu
ứng sinh học tốt hơn β-glucan và β-glucan tan nước có Mw trong

khoảng từ 1-30 kDa đã cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao
hơn so với các β-glucan có Mw cao. β-glucan Mw thấp và tan trong
nước là những phân tử β-glucan dễ tan trong nước nên dễ dàng được hấp
thu và có hoạt tính sinh học cao do đó được sử dụng hiệu quả hơn. Để
có được β-glucan Mw thấp và tan trong nước thì cắt mạch bằng phương
pháp chiếu xạ được chứng minh là rất hiệu quả với những ưu điểm nổi
bật như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có thể điều chỉnh liều xạ để
thu được β-glucan có Mw như mong muốn, sản phẩm có độ tinh khiết
cao, không cần tinh chế lại và thân thiện với môi trường.
β-glucan là một trong những hợp chất chính cấu tạo nên thành tế bào
nấm men bia và cả nước hiện có trên 300 cơ sở sản xuất bia với cơng
suất thiết kế 1,7 tỷ lít/năm, trong đó lượng bã nấm men là ~1%. Bã thải


2
này hiện chỉ được sử dụng một phần và số cịn lại được xử lý và thải ra
mơi trường. Chính vì vậy, việc sử dụng nguồn bã thải nấm men bia để
tách tạo β-glucan làm nguyên liệu để chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp
và tan trong nước có hoạt tính sinh học cao là rất hiệu quả và thiết thực
nhằm tận dụng được nguồn phế thải để tạo sản phẩm có giá trị cao và góp
phần giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm môi trường.
Luận án này nghiên cứu hồn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ
thành tế bào bã nấm men bia và thiết lập quy trình cơng nghệ chế tạo chế
phẩm β-glucan Mw thấp và tan trong nước bằng phương pháp chiếu xạ
đồng thời nghiên cứu các hiệu ứng sinh học của β-glucan sau khi cắt
mạch bằng phương pháp chiếu xạ trong điều kiện in vitro và in vivo trên
động vật (gà và chuột) nhằm tạo ra chế phẩm β-glucan có Mw thích hợp
cho hiệu ứng sinh học cao phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực
phẩm chức năng hoặc chế phẩm bổ sung trong chăn ni.
2. Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng thành cơng quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm βglucan Mw thấp và tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm
men của các nhà máy sản xuất bia bằng phương pháp chiếu xạ.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia.
- Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60.
- Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương
pháp chiếu xạ.
- Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp và tan trong nước
bằng phương pháp chiếu xạ.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu tổng quan về β-glucan
Phần này giới thiệu tổng quan đặc trưng về cấu trúc và nguồn thu
nhận β-glucan.
1.2. Sơ lƣợc về nấm men Saccharomyces cerevisiae
Phần này tổng quan về tế bào nấm men S. cerevisiae và cấu trúc
của thành tế bào, trong đó nhấn mạnh β-glucan.


3
1.3. P ƣơng p áp t u n ận thành tế bào từ nấm men bia
Phần này trình bày các phương pháp thông dụng được sử dụng để
phá vỡ tế bào nấm men Saccharomyces thu nhận thành tế bào.
1.4. P ƣơng p áp tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bia
Phần này trình bày các phương pháp phổ biến phá vỡ tế bào, chiết
protein và tinh chế để thu nhận β-glucan.
1.5. Các p ƣơng p áp cắt mạch β-glucan
Phần này trình bày các phương pháp thơng dụng đã và đang được sử
dụng để cắt mạch β-glucan.
1.6. Hoạt tính sinh học của β-glucan
Trình bày đặc tính sinh học và cơ chế tác động của β-glucan.

1.7. Ứng dụng của β-glucan
Trình bày ứng dụng chính của β-glucan trong các lĩnh vực khác
nhau.
1.8. Ứng dụng của β-glucan Mw thấp
Trình bày các ứng dụng của β-glucan Mw thấp và tan nước trong
các lĩnh vực khác nhau.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
- Bã men bia (nhà máy bia Sài Gịn Bình Dương), mẫu chuẩn β-glucan
nấm men (Sigma, Mỹ), và KIT xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan
(Megazyme) và các hóa chất tinh khiết khác (Meck).
- Gà Lương phượng (Gallus gallus domesticus) (Đại học Nơng Lâm
Tp.HCM) và chuột nhắt trắng dịng Swiss (Viện Pasteur Tp.HCM),
kháng thể sơ cấp Anti-mouse IgG produced in goat và thứ cấp Anti-goat
IgG-Alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich, Mỹ) và đĩa ELISA 96 giếng
(Santa Cruz Biotechnology, Canada).
2.2. Nội dung và p ƣơng p áp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia
2.2.1.1. Thu nhận thành tế bào nấm men Saccharomyces:
Bã tế bào nấm men bia được ly tâm 5000 vòng/phút, rửa và tiến hành
tự phân trong 20 giờ ở 50oC. Ly tâm thu nhận phần không tan.
2.2.1.2. Tách chiết β-glucan tổng số


4
a. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Tiến hành ở 70, 90 và 100oC. 400
g thành tế bào được khuấy với 2000 mL NaOH 3%, đun trong 9 giờ và
ly tâm thu nhận phần rắn. Phần rắn được tiếp tục chiết 3 lần với 2000
mL dung dịch HCl có nồng độ lần lượt là 2,45; 1,75 và 0,94 M ở 750C
trong 2 giờ. Ly tâm 7000 vòng/phút thu phần không tan, rửa 3 lần với

cồn tuyệt đối và chiết 3 lần với diethyl ether. Sấy khơ và tính như sau:
𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝛽 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑎𝑛 𝑡ℎ𝑢 đượ𝑐
Hàm lượng β-glucan (%) = 𝐾𝐿 𝑘ℎô 𝑡ℎà𝑛ℎ 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑛ấ𝑚 𝑚𝑒𝑛 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢
x100
Mẫu β-glucan sau đó được kiểm tra hàm lượng protein (theo phương
pháp AOAC 987.04-1997) và β-glucan (bằng kít K-YBGL).
b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Các bước được tiến hành
tương tự như mục a. nhưng nồng độ NaOH thay đổi là 1, 2, 3 và 4%.
c. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết: Được tiến hành tương tự
mục a nhưng sử dụng nồng độ NaOH tối ưu từ mục b và thời gian chiết
được khảo sát là 3, 4, 6, 9 và 12 giờ.
d. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi: Các bước cũng được
tiến hành tương tự mục a nhưng thể tích dung dịch NaOH có nồng độ tối
ưu (từ mục b) sử dụng là 1200, 2000 và 2800 mL, với nhiệt độ và thời
gian phản ứng tối ưu đã được xác định tương ứng ở các mục a và c.
2.2.1.3. Đo phổ hồng ngoại: Mẫu β-glucan được nghiền nhỏ, trộn đều
với KBr và ép tạo viên nén. Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ hồng
ngoại model FT/IR-4700 (Jasco, Nhật Bản).
2.2.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma
2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu và chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp và tan
trong nước: Hòa 100 g β-glucan trong 100 mL nước cất để tạo hỗn hợp
huyền phù β-glucan 10% (w/v). Chiếu xạ ở các liều khác nhau trên
nguồn xạ gamma Co-60 với xuất liều 3 kGy/h.
2.2.2.2. Xác định hiệu suất β-glucan tan nước sau chiếu xạ: Mẫu βglucan sau chiếu xạ được ly tâm 11000 vòng/phút để thu dịch nổi. Tủa
dịch nổi với ethanol với tỷ lệ 1/9 (v/v), ly tâm thu tủa và sấy khô. Hàm
lượng của β-glucan tan nước được tính theo cơng thức:
KL 𝛽 − glucan tan
Hàm lượng β-glucan tan nước (%) = KL 𝛽 − glucan sấy khô ban đầu x100

5
2.2.2.3. Đo phổ UV-vis của β-glucan tan nước: Mẫu β-glucan được đo
trên máy quang phổ tử ngoại GENESY 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ) ở
nồng độ 0,025% và bước sóng từ 200-600 nm.
2.2.2.4. Xác định khối lượng phân tử của β-glucan: Mw của mẫu βglucan 0,1% (20 µL) được đo trên hệ máy GPC e2695 sử dụng cột
Ultrahydrogel (Water, Mỹ) ở 40oC và tốc độ bơm là 1 mL/phút.
2.2.2.4. Đo phổ hồng ngoại: Thực hiện như mục 2.1.2.3.
2.2.2.5. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H- và 13C-NMR của βglucan được đo trên máy Utrashield 500 plus (Brucker, USA) ở tầng số
lần lượt là 500 MHz và 125 MHz sử dụng D2O (Cambridge, USA) với
nồng độ mẫu là 5 mg/L.
2.2.3. Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng
phương pháp chiếu xạ
2.2.3.1. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa in vitro: Cho 1,5 mL dung
dịch β-glucan 100 ppm phản ứng với 1,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM.
Lắc đều để trong tối 30 phút. Đo OD ở bước sóng 517 nm (mẫu chứng
là nước cất). Hoạt tính bắt gốc tự do được tính như sau: H (%) = (1 –
A/Ao) x 100. Trong đó: A là OD của mẫu thử, Ao là OD của mẫu đối
chứng ở 517 nm.
2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vivo trên chuột: Chuột được
chia thành hai nhóm (mỗi nhóm 45 con gồm 5 NT, mỗi NT 3 con và lặp
lại 3 lần): Nhóm bình thường khơng tiêm CCl4 và nhóm gây độc gan
được tiêm phúc mô 3 lần bằng CCl4 với liều 10 mL/kg thể trọng chuột
(cho nhịn đói 15 giờ trước khi tiêm cách ngày). Sau tiêm 60 phút, cho
uống β-glucan (2 mg/con) liên tục 1 tuần. Chuột ĐC chỉ cho uống nước
cất. Sau 8 ngày, lấy máu để định lượng AST và ALT trên máy sinh hóa
BioSystem A15 (Bỉ).
2.2.3.3. Khảo sát công thức máu và miễn dịch ở chuột: Gồm 5 NT, lặp
lại 3 lần. Hàng ngày chuột được cho uống 100 µL dung dịch β-glucan
2% (2 mg/con). Sau 28 ngày, lấy máu để xét nghiệm công thức máu
(hồng cầu, bạch cầu tổng số (BCTS), bạch cầu trung tính (BCTT) và

lympho bào), IgG và IgM.
2.2.3.4. Khảo sát hoạt tính giảm lipid và glucose máu


6
a. Tạo chuột béo phì thực nghiệm: Nhóm ni béo bằng ăn thức ăn giàu
chất béo (HFD-high fat diet) và nhóm ăn thường được cho ăn thức ăn
tiêu chuẩn (ND-normal diet) trong 8 tuần, sau đó lấy máu xét nghiệm
các chỉ số glucose, cholesterol, triglycerid và LDL.
b. Khảo sát các chỉ số sinh hóa trên mơ hình chuột béo phì thực nghiệm:
Chuột béo phì được cho chuột uống hàng ngày với 100 µL β-glucan 2%.
Đối chứng chỉ cho uống nước cất. Theo dõi, lấy máu, kiểm tra chỉ số
sinh hóa ở 3 giai đoạn (Giai đoạn 1: Sau 20 cho uống β-glucan trong 20
ngày và vẫn cho ăn giàu chất béo; Giai đoạn 2: Tiếp tục cho uống thêm
β-glucan 20 ngày (sau 40 ngày); và Giai đoạn 3: Ngừng cho chuột uống
β-glucan trong 20 ngày (sau 60 ngày). Các chỉ số theo dõi: Cholesterol,
triglycerid, LDL và glucose máu.
2.2.3.5. Khảo sát hiệu ứng tăng trưởng và miễn dịch ở gà: Gồm 5 NT,
mỗi NT 18 con và lặp lại 3 lần. Gà được cho ăn thức ăn có bổ sung 500
ppm β-glucan có Mw khác nhau. Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Trọng
lượng bình quân (TLBQ), mức tăng trọng tuyệt đối, hệ số tiêu tốn thức
ăn (FCR), tỷ lệ nuôi sống tích lũy, các chỉ tiêu về sinh hóa (BCTS/1
mm3, tỷ lệ bạch cầu lympho và BCTT), hiệu giá các kháng thể (HGKH)
(kháng lại các bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm
và newcastle), và chất lượng thịt (tỷ lệ móc hàm, tỷ lệ quầy thịt, tỷ lệ ức
và tỷ lệ đùi).
2.2.4. Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp và tan trong nước
trong khoảng liều dưới 100 kGy
2.2.4.1. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở pH khác
nhau: Điều chỉnh pH của hỗn hợp β-glucan 10% về 3, 5, 7 và 9 trước

khi chiếu xạ như mục 2.2.2.1.
2.2.4.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện có
H2O2: Được tiến hành như mục 2.2.4.1 nhưng nồng độ hỗn hợp huyền
phù β-glucan là 5, 10 và 15% (w/v) trong 1% H2O2.
2.2.4.3. Đo giản đồ nhiễu xạ tia X: Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu βglucan được đo trên máy D8 Advance ECO (Bruker, Đức) sử dụng ống
phát bức xạ CuKα (lq= 1.5406 Å, U= 40 kV, I= 25 mA) ở góc từ 30100o (2θ) với kích thước bước 0,05o (2θ) và thời gian đếm là 0,5/s.


7
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel và thống kê theo phần
mềm SPSS 16.0. Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng phương
pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia
3.1.1. Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy bia
A

B

C

D

Hình 3.1. Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau khi rửa (C) và ảnh
SEM tế bào nấm men sau khi rửa (D)

Bã nấm men sau khi thu nhận được ly tâm 5000 vòng/phút để thu
nhận tủa, rửa và ly thu nhận phần tế bào mấm men (hình 3.1).
3.1.2. Tách và thu nhận thành tế bào nấm men

A
B
C
Tế bào nấm men sau khi
tự phân được tâm thu phần
khơng tan thì chủ yếu là
thành tế bào và có màu trắng Hình 3.2. Sản phẩm thành tế bào nấm men trước
(A) và sau khi ly tâm (B) và ảnh SEM (C)
ngà (hình 3.2).
3.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết βglucan từ thành tế bào nấm men Saccharomyces
3.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan
Nhiệt độ (oC) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%)
70
17,11 ± 0,22
85,31
2,28
90
16,13 ± 0,11
90,89
1,41
100
14,28 ± 0,16
91,12
1,08

Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi nhiệt độ càng tăng thì hiệu suất thu
nhận sản phẩm β-glucan tách chiết được càng giảm. Ở 70oC thì hiệu suất
thu sản phẩm β-glucan cao nhất với 17,11% và ở 100C hiệu suất sản
phẩm là thấp nhất với 14,28%. Tuy nhiên có thể thấy khi nhiệt độ phản

ứng càng cao thì hàm lượng protein cịn lại trong sản phẩm càng thấp và


8
độ tinh khiết của sản phẩm càng cao và nhiệt độ chiết 90oC là thích hợp
nhất.
3.1.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Kết quả bảng 3.2 cho thấy hiệu
suất sản phẩm β-glucan thu được giảm khi tăng nồng độ NaOH, hiệu
suất này là 17,55% khi tăng nồng độ NaOH lên 3% và thấp nhất
(16,82%) khi sử dụng 4% NaOH. Ngoài ra ở NT xử lý NaOH với nồng
độ 1 và 2% thì hàm lượng protein vẫn cịn cao (trên 2%) và độ tinh khiết
thấp (85,11%). Trong khi đó, ở NT xử lý NaOH với nồng độ 4%, hàm
lượng protein thấp và độ tinh khiết cao nhưng hiệu suất giảm mạnh. Do
đó để tách chiết β-glucan đạt hiệu suất cao, hàm lượng protein thấp và
độ tinh khiết sản phẩm cao thì NaOH 3% là lựa chọn tối ưu.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan
Nồng độ NaOH (%) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%)
1
18,68 ± 0,29
84,98
2,30
2
18,14 ± 0,14
85,11
2,00
3
17,55 ± 0,11
91,13
1,75
4

16,82 ± 0,22
91,99
1,73

3.1.3.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết: Kết quả bảng 3.3 cho thấy, hiệu
suất thu nhận β-glucan giảm dần theo thời gian phản ứng. Khi chiết 3-12
giờ thì hiệu suất tách chiết giảm 3%, trong đó ở NT 9 giờ và 12 giờ thì
hiệu suất thu được giảm đi đáng kể. Ngoài ra, hàm lượng protein còn lại
trong β-glucan khi tách chiết trong thời gian từ 3-12 giờ đều dưới 2% và
độ tinh khiết của sản phẩm xử lý 9-12 giờ là khá cao. Kết quả này cho
thấy thời gian chiết 9 giờ là hiệu quả nhất.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan
Thời gian chiết (giờ) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%)
3
17,97 ± 0,30
84,96
1,93
6
17,12 ± 0,30
86,15
1,49
9
16,13 ± 0,11
91,52
1,41
12
14,97 ± 0,10
92,08
1,34

3.1.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi: Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất
β-glucan giảm khi tỉ lệ chiết tăng. Hàm lượng β-glucan thu được khi xử
lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/3 cao hơn so với tỉ lệ 1/5 và 1/7. Ở NT xử lý với
tỉ lệ 1/7, hàm lượng β-glucan thu được là tương đương với NT xử lý với
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan
Tỉ lệ mẫu/dung môi (g/mL)
Tỷ lệ β-glucan (%)
Độ tinh khiết (%) HL protein (%)
1/3
17,42 ± 0,14
85,19
1,90
1/5
16,13 ± 0,11
92,01
1,41
1/7
16,15 ± 0,08
92,98
1,34


9
tỉ lệ 1/5 (~16%). Hàm lượng protein trong sản phẩm β-glucan thu được
đều dưới 2% nhưng độ tinh khiết sản phẩm khi xử lý ở tỉ lệ 1/5 và1/7 là
cao hơn. Có thể thấy tỷ lệ 1/5 là tối ưu.
3.1.3.5. Hồn thiện quy trình chế tạo β-glucan từ bã nấm men bia
a. Tách chiết β-glucan từ bã nấm men bia quy mơ 500 lít/mẻ: Từ kết quả
Bảng 3.5. Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mơ 500 lít/mẻ
Lần Thể tích dịch bã KL khơ tế bào

chiết nấm men bia (lít) nấm men (kg)
1
500
15,89
2
500
16,10
3
500
16,51
TB
500
16,17±0,32

KL khơ thành tế KL sản phẩm β- Hiệu suất
bào nấm men (kg)
glucan (kg)
(%)
4,44
0,7122
16,02
4,35
0,7285
16,76
4,77
0,7411
15,53
4,521±0,22
0,7273±0,01
16,11±0,62

trên, quy trình tách chiết mẫu β-glucan được hồn thiện và chế tạo thử
nghiệm với số lượng bã thải nấm men bia lớn hơn (500 lít/mẻ). Kết quả
thu nhận được từ 3 mẻ khác A
B
C
nhau ở bảng 3.5 cho thấy lượng
sản phẩm β-glucan thu được là
2,18 kg. Như vậy quy trình này
có hiệu suất tạo sản phẩm β- Hình 3.3. Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ
sau khi thu nhận (A),
glucan từ thành tế bào nấm men thành tế bào nấm men
sau khi sấy khô ở 60oC (B) và ảnh SEM (C)
trung bình ~16,1% (hình 3.3).
b. Xác định hàm lượng β-glucan: Hàm lượng β-glucan trong mẫu chế tạo
ở bảng 3.6 cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm β-glucan thu nhận được từ
quy trình là khoảng 91,78% β-glucan và có chứa một lượng nhỏ α-glucan.
Bảng 3.6. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết
Glucan tổng số (%)
α-glucan (%)
β-glucan (%)
93,34 ± 0,41
1,56 ± 0,07
91,78 ± 0,34

c. Xác định đặc trưng cấu trúc mẫu β-glucan sau khi chế tạo
Đặc trưng cấu trúc Sản phẩm β-glucan được khảo sát bằng phổ hồng
ngoại và so sánh với mẫu chuẩn cùng loại của Sigma. Kết quả từ hình 3.4
cho thấy các đỉnh chính xuất hiện từ 400-4000 cm-1 và được liệt kê ở bảng
3.7 cho thấy đỉnh xuất hiện ở 3333 cm-1 thuộc liên kết O-H xuất có

cường độ cao và vai rộng, đỉnh 2896 cm-1 có cường độ trung bình và vai
hẹp cùng với đỉnh có cường độ yếu ở 2088 cm-1 điều thuộc liên kết C-H.
Các đỉnh tại số sóng 1640 và 1079 cm-1 là đặc trưng của liên kết CO.


10

1156

TT
1
2
3
4

890

1371

1640

Abs

2896

3383

1040
1079

Trong khi đó các đặc trưng của liên kết CCH, C-O-C và CC được biểu
hiện ở các
đỉnh tương ứng
là 1371, 1156 và
1040. Có thể
thấy mẫu βglucan
tách
Mẫu chuẩn của Sigma
chiết được có
đặc trưng cấu
trúc khá tương
Mẫu tách chiết
đồng với mẫu β- 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
400
1/cm
glucan cùng loại Hình 3.4. Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm
men bia và mẫu β-glucan chuẩn của Hãng Sigma
của Sigma.
Bảng 3.7. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan
Đỉn ( -1)
N
ứ
TT
Đỉn ( -1)
N
ứ
3383
OH
5
1156

COC
2896
CH2
6
1079
CO
1640
CO
7
1040
CC
1371
CCH
8
890
CO của β-glucan

d. Thiết lập quy trình tách chiết β-glucan quy mơ 500 lít mẻ

Hình 3.5. Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia quy mơ 500 lít/mẻ


11
Từ những kết quả nhận được nói trên, quy trình tách chiết β-glucan
từ bã thải nấm men bia được hoàn thiện như mơ tả ở hình 3.5.
3.2. Cắt mạch β-glucan bằng p ƣơng p áp iếu xạ
3.2.1. Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp
chiếu xạ β-glucan
Hình 3.6 cho thấy hàm lượng β-glucan tan
thu được tăng tuyến tính theo sự gia tăng của

liều xạ, Cụ thể khi chiếu xạ ở 100 kGy thì hàm
lượng β-glucan tan thu nhận được là ~25,8%,
tại liều 200 kGy tăng ~23,2% so với liều 100
kGy, và ở liều 300 kGy thì hàm lượng thu
được là ~ 66,7%.
Hình 3.6. Hiệu suất thu nhận βglucan tan nước khi chiếu xạ hỗn
3.2.2. Sự suy giảm khối lượng phân tử
hợp β-glucan 10% ở các liều xạ
Hình 3.7 cho thấy Mw của β-glucan tan
khác nhau
nước giảm dần và tỷ lệ nghịch với sự gia tăng
của liều xạ. Ở khoảng liều chiếu xạ 100 kGy
thì Mw của β-glucan tan nước thu được giảm
mạnh (từ trên 64 kDa xuống cịn ~31 kDa) và
sau đó giảm chậm hơn và đạt khoảng 11 kDa
ở liều xạ 300 kGy.
Hình 3.7. Sự suy giảm Mw của βglucan tan theo liều xạ
3.2.3. Phân tích phổ UV

Hình 3.8. β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở
các liều xạ khác nhau

Hình 3.8 cho thấy các dung dịch β-glucan
tan thu được sau chiếu xạ có màu sắc thay đổi Hình 3.9. Phổ UV-vis β-glucan chế
tạo bằng phương pháp chiếu xạ
từ nâu đến nâu đậm. Kết quả từ
hình 3.9 cho thấy rằng ở mẫu khơng chiếu xạ thì hồn tồn khơng có sự
xuất hiện đỉnh trong dải bước sóng từ 200-400 nm do chưa có β-glucan.

12

1079

890

1371

1731
1640

2896

1156

3383

1040

Mw thấp trong dung dịch. Trong khi đó phổ của các mẫu β-glucan chiếu
xạ đều xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 273 nm.
3.2.4. Phân tích phổ FTIR
Kết quả từ hình 3.10 cho thấy đối với
mẫu β-glucan chiếu xạ hầu như không
thay đổi số lượng và vị trí đỉnh so với
mẫu khơng chiếu xạ. Tuy nhiên có sự
xuất hiện đỉnh 1731 cm-1 biểu hiện của
liên kết C=O trong phân tử sau khi cắt
mạch với cường độ theo liều xạ, trong khi
cường độ của đỉnh 1156 cm-1 biểu hiện Hình 3.10. Phổ IR của β-glucan chiếu xạ

nồng độ 10% ở các liều xạ khác nhau
của nhóm C-O-C (liên kết glucoside) của
các mẫu chiếu xạ giảm giảm dần theo sự
gia tăng của liều xạ. Nếu so sánh cường
độ của đỉnh này và đỉnh 1040 cm-1 biểu
hiện cho liên kết C-C vốn được xem là
bền với bức xạ cho thấy tỷ lệ giữa cường
độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1) và cường độ
đỉnh C-C (1040 cm-1) giảm khi liều xạ
tăng (hình 3.11). Điều đó cho thấy sự Hình 3.11. Sự-1 thay đổi tỷ lệ cường độ đỉnh C--1
O-C (1156 cm )/cường độ đỉnh C-C (1040 cm )
cắt mạch chủ yếu ở các liên kết của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ
glucoside
3.2.5. Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C
Phổ NMR-1H và 13C của mẫu
β-glucan tan nước có Mw~25
kDa (hình3.12a&b) cho thấy độ
dịch chuyển hóa học ở 4,48;
3,43; 3,59; 3,45; 3,47 và 3.82
ppm là lần lượt chuyển biểu thị
cho các liên kết H-1, H-2, H-3,
H-4, H-5 và H-6 trong phân tử βglucan sau khi chiếu xạ. Trong
khi độ dịch chuyển hóa học biểu
Abs

300kGy

250kGy

200kGy

150kGy
100kGy
0kGy

4000

3600

3200

2800

2400

2000

1600

1200

800

400

1/cm


13
thị cho các nguyên tử C-1, C-2,
C-3, C-4, C-5 và C-6 quan sát

được lần lượt ở 102,55; 72,32;
84,12; 68,14; 75,56
Hình 3.12. Phổ NMR- 1H (a) và 13C (b) của β-glucan
tan nước có Mw~25 kDa

và 60,73 ppm. Kết quả này cho thấy thành phần chính của mẫu là βglucan
3.2.6. P ân t
à lƣợng β-glucan
Bảng 3.8. Hàm lượng các loại glucan trong mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa
Loại glucan
Glucan tổng số
α-glucan
β-glucan

Hà lƣợng trong mẫu (%)
Trƣớc khi chiếu xạ
Sau khi chiếu xạ
93,34 ± 0,41
97,88 ± 0,89
1,56 ± 0,07
0,91 ± 0,36
91,78 ± 0,34
96,97 ± 0,25

Kết quả bảng 3.8 cho thấy, so với mẫu khơng chiếu xạ thì hàm lượng
glucan tổng số sau khi chiếu xạ đã tăng nhẹ (lên ~97,88%).
3.3. Hoạt tính sinh học của β-glucan tan nƣớc chế tạo bằng p ƣơng
pháp chiếu xạ

Hoạt tính kháng oxy hố, %

3.3.1. Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in
vitro
70
Kết quả hình 3.13 cho thấy hoạt tính
60
kháng oxi hóa của β-glucan tăng khi Mw
50
của β-glucan giảm. Ở cùng nồng độ 100
40
30
ppm, hoạt tính kháng bắt gốc tự do DPPH
20
của mẫu β-glucan có Mw > 64, 48, 25 và
10
11 kDa đạt lần lượt là 5,2; 47,6; 58,2 và
0
0
10
20
30
40
50
60
70
60,7%. Mẫu β-glucan không chiếu xạ (Mw
Mw, kDa
> 64 kDa) có hoạt tính kháng oxy hóa thấp Hình 3.13. Hoạt tính kháng oxi của β-glucan
có Mw khác nhau
hơn 9-12 lần so với β-glucan cắt mạch bức

xạ.
3.3.2. Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo


14
3.3.2.1. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên chỉ số men gan AST ở
chuột gây tổn thương gan:
200

(a)

Chuột thường

ĐC

160

120

80

40
ĐC

>64

48
Mw, kDa

25

11

>64

Mw, kDa
48

25

11

0

Mức thay đổi SVĐC, %

Chỉ số AST, U/L

Chuột gây độc gan

-20

-40

-60

Chuột thường
Chuột gây độc gan

(b)

-80

Hình 3.14. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC (b) ở nhóm chuột
thường (khơng tiêm CCl4) và chuột gây độc gan được cho uống β-glucan có Mw khác nhau

Hình 3.14a cho thấy chỉ số AST trong máu chuột ở các nghiệm thức
không gây độc là 58,47-84,24 U/L. Chỉ số AST trong máu chuột khi cho
uống β-glucan chiếu xạ đều có sự khác biệt có ý nghĩa. Chuột cho uống
β-glucan tan trong nước có Mw~25 và 11 kDa có chỉ số AST giảm
mạnh nhất (hình 3.14b). β-glucan tan trong nước có Mw~25 đã có tác
dụng làm giảm chỉ số AST trong máu chuột thấp nhất với 61,81 U/L
(tương đương nhóm ĐC khơng gây độc gan).
3.3.2.2. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên chỉ số men gan ALT ở
chuột gây tổn thương gan: Kết quả hình 3.15a cho thấy β-glucan chiếu xạ
cũng đã làm hạ chỉ số ALT và ở nhóm cho uống β-glucan có Mw~25 kDa
có chỉ số này thấp nhất. Ở nhóm gây độc gan, kết quả từ hình 3.15b cho
thấy chỉ số ALT có xu hướng giảm tỷ lệ thuận với Mw của β-glucan. NT
cho uống β-glucan tan trong nước có Mw~25 và 11 kDa có chỉ số ALT
thấp tương đương với nhóm chuột ĐC khơng gây độc gan.
130
Chuột thường

ĐC

90
70
50
30
ĐC

>64

48
Mw, kDa

25

11

>64

Mw, kDa
48

25

11

0

Chuột gây độc gan

Mức thay đổi SVĐC, %

Chỉ số ALT, U/L

(a)
110

-10
-20
-30
-40
-50

Chuột thường
Chuột gây độc gan

(b)

-60

Hình 3.15. Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC (b) ở nhóm chuột
thường (không tiêm CCl4) và chuột gây độc gan được cho uống β-glucan có Mw khác nhau

3.3.3. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến chỉ số miễn dịch ở chuột


15
3.3.3.1. Công thức máu và các tế bào miễn dịch:
Bảng 3.9. Số lượng hồng cầu, bạch cầu tổng số, lympho bào và bạch cầu trung tính trong máu
chuột khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau
Mw β-glucan
Hồng cầu (106 tế
BCTS 103 tế bào
Lympho bào (%) BCTT (%)
(kDa)
bào/mm3)
/mm3)

b
ĐC
5,44±0,22
4,95 ±0,18
57,23b±2,18
10,08b±1,04
> 64
5,46±0,12
5,05ab±0,13
59,92ab±1,91
14,70a±0,52
48
5,64±0,24
5,20ab±0,12
62,55ab±0,98
15,73a±1,43
25
5,6±0,28
5,50a±0,15
65,97a±1,84
16,37a±0,66
11
5,48±0,28
5,40b±0,16
64,42a±2,86
15,22a±0,67
ns




Trong cùng 1 cột với các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê. : P<0,05; ns:
không khác biệt; ĐC không bổ sung β-glucan

Kết quả từ bảng 3.9 cho thấy số lượng hồng cầu hầu như không khác biệt giữa
các lô, tuy nhiên số lượng bạch cầu tổng số (BCTS) thì có sự khác biệt. Chuột
cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ có BCTS cao hơn và đạt cao nhất khi cho
uống bổ sung β-glucan tan nước có Mw~25 kDa (5,5x10 3 tế bào /mm3).

3.3.3.2. Yếu tố miễn dịch dịch thể (IgG và IgG): Kết quả hình 3.16 cho
thấy giá trị OD đo được ở 405 nm của các lơ có cho uống bổ sung βglucan chiếu xạ có Mw từ 11-25 kDa cao hơn so với lô ĐC không cho
uống bổ sung và các lô khác.
1.0

0.4

(a)

(b)
0.3

OD405nm

OD405nm

0.9
0.8
0.7

0.2

0.1

0.6

0.0

ĐC

>64

48
Mw, kDa

25

11

ĐC

>64

48
Mw, kDa

25

11

Hình 3.16. Hàm lượng IgG (a) và IgM (b) trong trong máu chuột cho uống bổ sung β-glucan

3.3.4. Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ
trong điều kiện in vivo trên chuột
3.3.4.1. Tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Bảng 3.10. Thể trọng 2 nhóm chuột sau 8 tuần ni theo chế độ dinh dưỡng khác nhau
Tuần 0 (g/con)
Tuần 8 (g/con)
Mức tăng trọng lượng (%)
Mức tăng của nhóm HFD (%)

Nhóm ND
Nhóm HFD
19,45 ± 0,28
19,54 ± 0,23
32,53 ± 0,95
48,87 ± 0,71
↑ 67,23
↑ 150,15
↑ 124,24

Bảng 3.11. Một số chỉ số sinh hóa của chuột sau 8 tuần ni
Chỉ số
Cholesterol tồn phần (mg/dL)
Triglyceride (mg/dL)
LDL (mg/dL)

Nhóm ND
78,79±4,21
71,85±3,04
20,28±1,32

Nhóm HFD
145,04±6,21
121,78±6,27
31,73±2,69

Mứ tăng ủa nhóm HFD (%)
↑ 84,08
↑ 69,48
↑ 56,49


16
Glucose (mg/dL)

102,79±8,86

165,46±7,39

↑ 60,97

Kết quả từ bảng 3.10 và hình 3.17 cho thấy nhóm chuột HFD có trọng
lượng tăng 29,33 g/con (150,15%) và lớn hơn chuột nuôi thường là
16,34 g/con (tăng 124,24%). Kết quả xác định
chỉ tiêu lipid máu như cholesterol tổng số,
triglyceride, LDL và glucose trong máu chuột ở
bảng 3.11 cho thấy ở các lơ chuột ăn thức ăn có
hàm lượng chất béo cao đều có chỉ số lipid máu
cao hơn hẳn lơ chuột ăn thức ăn bình thường.
Hình 3.17. Nhóm chuột HFD (A)
Cụ thể là nồng độ cholesterol máu tăng84,1%,

và ND (B) sau 8 tuần nuôi
triglyceride máu tăng 69,5%, LDL tăng 56,5% và glucose máu tăng
61%.
3.3.4.2. Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ lên thể trọng và các chỉ số
lipid và glucose: Kết quả bảng 3.12 cho thấy sau 20 ngày thử nghiệm
bằng
Bảng 3.12. Trọng lượng chuột trước và sau 20 ngày cho uống β-glucan có Mw khác nhau
Mw β-glucan (kDa) Trƣớc khi thử nghiệm (g/con) Sau 20 ngày (g/con)
Mứ t ay đổi (%)
ĐC1
33,41 ± 0,71
34,84a ± 0,77
↑ 4,35a
c
ĐC2
45,12 ± 1,43
51,73 ± 1,03
↑ 15,17b
> 64
44,51 ± 1,01
47,51b ± 1,34
↑ 6,72a
b
48
44,85 ± 1,07
47,48 ± 0,7
↑ 6,14a
25
45,10 ± 0,78
47,16b ± 1,06

↑ 4,53a
11
44,71 ± 1,21
46,51b ± 1,02
↑ 4,22a
ns



β-glucan chiếu xạ và vẫn được cho ăn theo chế độ béo thì khối lượng
chuột ở tất cả các nghiệm thức đều tăng so với ban đầu. Tuy nhiên mức
thay đổi trọng lượng chuột ở các nghiệm thức uống β-glucan thấp hơn
rất nhiều so với NT ĐC2 (chuột béo phì). Kết quả bảng 3.13 cho thấy
các chỉ số mỡ máu ở nhóm chuột ĐC2 đều tăng đáng kể và cholesterol lên
đến 198,15 mg/dL, trong khi đó ở nhóm chuột được cho uống β-glucan
chỉ
Bảng 3.13. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 20 ngày cho uống bổ sung β-glucan có
Mw khác nhau
Sau 20 ngày thử nghiệm
Mw β-glucan
(kDa)
Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL)
LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL)
ĐC1
89,18a ± 5,44
85,27a±3,86
23,85ab±1,55
126,01b±6,92
d
b

c
ĐC2
198,15 ±5,46
164,82 ±6,32
38,53 ±2,80
212,31c±6,44
> 64
129,05c±2,96
90,16a±4,00
28,9b±2,82
139,74b±4,56


17
103,64b±4,01
79,62a±4,95
20,68a±2,06
124,72b±7,19
89,79a±3,54
83,10a±4,80
18,9a±1,69
106,8a ± 2,17
109,28b±4,29
88,68a ± 4,40
26,35ab±3,23
127,66b±6,63





ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì khơng cho uống β-glucan.
48
25
11

89,79-129,05 mg/dL. Chuột ở NT được cho uống β-glucan tan nước có
Mw~25 kDa cho chỉ số cholesterol thấp nhất và gần bằng so với chuột
Bảng 3.14. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 40 ngày cho uống bổ sung β-glucan có
Mw khác nhau
Sau 40 ngày thử nghiệm
Mw β-glucan
(kDa)
Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL)
ĐC1

88,14ab ± 5,62

86,67b ± 4,10

ĐC2
> 64
48
25
11

d

c

210,74 ± 9,05

119,54c ± 4,55
91,5ab ± 3,26
75,97a ± 2,36
96,08b ± 6,28


190,41 ±10,79
78,85ab ± 4,12
69,53a ± 1,77
62,58a ± 3,15
77,77ab ± 3,01


22,76b ± 1,62
c

38,48 ± 1,14
22,06b ± 1,56
19,09ab ± 1,23
17,25a ± 0,79
21,31ab ± 1,63


127,28c ± 7,77
239,74d±13,02
134,11c ± 6,03
97,98ab ± 2,42
86,13a ± 2,94
114,25bc ± 3,43


Mức thay đổi chỉ số cholesterol, %

thường. Kết quả hình 3.18 và bảng 3.14 cũng cho thấy NT sử dụng βglucan
có Mw~25 kDa vẫn cho kết quả giảm
45
20 ngày
40 ngày
60 ngày
cholesterol tốt nhất sau 40 ngày thử
25
nghiệm và ngang với chỉ số
5
cholesterol của chuột thường.ước có
-15
Mw~25 kDa cho chỉ số cholesterol
thấp nhất và gần bằng so với chuột -35
thường. Kết quả hình 3.18 và bảng -55 ĐC1 ĐC2 >64 48 25 11
Mw, kDa
3.14 cũng cho thấy NT sử dụng βHình 3.18. Mức thay đổi chỉ số cholesterol
glucan có Mw~25 kDa vẫn cho kết trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ
quả giảm cholesterol tốt nhất sau 40 sung β-glucan có Mw khác nhau. ĐC1: Chuột
thường khơng cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột
ngày thử nghiệm và ngang với chỉ số
béo phì khơng cho uống β-glucan.
cholesterol của chuột thường.
Bảng 3.15. Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 60 ngày cho uống bổ sung β-glucan có
Mw khác nhau
Sau 60 ngày thử nghiệm
Mw β-glucan

(kDa)
Cholesterol (mg/dL) Triglyceride (mg/dL) LDL (mg/dL) Glucose (mg/dL)
a
ĐC1
93,83 ± 3,87
98,61b ± 2,94
24,55b ± 2,49
135,24b ± 3,04
c
c
c
ĐC2
212,92 ± 7,71
195,43 ± 8,66
41,38 ± 1,03
245,39c ± 9,07
> 64
122,79b ± 3,80
82,79a ± 2,91
24,04ab ± 2,61
137,54b ± 3,68
48
99,78a ± 3,53
77,73a ± 3,74
19,76ab ± 1,46
110,81a ± 4,12


18
25

11

89,67a ± 3,18
103,95a±5,14


70,59a ± 3,17
79,52a ± 3,96


18,85a ± 0,92
21,82ab ± 1,16


105,90a ± 2,71
119,81a ± 3,01


Mức thay đổi chỉ số LDL, %

Mức thay đổi chỉ số triglyceride, %

Sau 20 ngày tiếp theo, ngừng cho uống β-glucan (chỉ cho uống nước
cất) kết quả từ hình 3.18 và bảng 3.15 cũng cho thấy sau 60 ngày, NT
cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa vẫn cho hiệu quả tốt nhất,
cholesterol chỉ còn 89,67 mg/dL. Bảng 3.13 và hình 3.19 cho thấy, sau
20 ngày, chỉ số triglyceride ở các NT cho uống β- glucan giảm 25,2733,14%, trong khi các nghiệm thức ĐC uống nước cất vẫn tăng18,62%
ở lô chuột thường và 35,84% ở lô chuột béo phì. Sau 40 ngày, chỉ số
triglyceride vẫn giảm đáng kể. Chuột chỉ uống nước cất, chỉ số
cholesterol cao hơn 3 lần so với các NT cho uống β- glucan. Sau 60

ngày, chỉ số triglyceride là 70,59-82,79 mg/dL ở các NT đã thử nghiệm
với β-glucan. Qua đó cho thấy dù ngưng cho uống β-glucan thì hiệu quả
hạ triglyceride vẫn được duy trì. Trong các giai đoạn thử nghiệm, chỉ số
triglyceride giảm nhiều nhất ở NT cho uống β-glucan tan nước có Mw~25
kDa. Đối với chỉ số LDL, sau 20 ngày, NT cho uống β-glucan có Mw~48
và 25 kDa cho khả
năng giảm chỉ số LDL tốt nhất. Chỉ số
20 ngày
40 ngày
60 ngày
60
LDL ở các NT thử nghiệm với glucan
40
chỉ còn 18,9-28,9 md/dL, trong khi NT
20
0
ĐC2 chỉ số này tăng tới 38,53 mg/dL.
-20
Sau 40 ngày, chỉ số LDL tại các NT
-40
cho uống β-glucan tiếp tục giảm gần
-60
bằng so với chuột thường. Khi ngừng
ĐC1
ĐC2
>64
48
25
11
Mw, kDa

cho uống β-glucan 20 ngày tiếp theo thì Hình 3.19. Mức thay đổi chỉ số triglyceride
kết quả thu được vẫn còn hiệu quả trong máu chuột so với trước khi cho uống bổ
sung β-glucan có Mw khác nhau.
(bảng 3.15). Mức giảm LDL tốt nhất
40
20 ngày
40 ngày
60 ngày
quan sát được ở 2 nghiệm thức cho
20
uống β-glucan với Mw~48 và 25 kDa
0
(hình 3.20). Kết quả bảng 3.13 và hình
3.21 cịn chỉ ra rằng ở các nhóm cho
-20
uống bổ sung β-glucan, nồng độ
-40
glucose trong máu chuột giảm15,62-60
ĐC1
ĐC2
>64
48
25
11
34,12% so với trước khi thử nghiệm.
Mw, kDa
Trong đó, NT sử dụng β-glucan tan Hình 3.20. Mức thay đổi chỉ số LDL trong


19

Mức thay đổi chỉ số glucose, %

máu chuột so với trước khi cho uống bổ
nước có Mw~25 kDa cho khả năng
sung β-glucan có Mw khác nhau.
giảm chỉ số glucose máu cao nhất
80
20 ngày
40 ngày
60 ngày
(34,12%) nhưng không khác biệt so với
60
NT sử dụng β-glucan có Mw~11 và 48
40
20
kDa. Sau 40 ngày sau thử nghiệm, chỉ
0
số này tiếp tục giảm ở các lô cho uống
-20
β-glucan, trong khi NT ĐC2, chỉ số này
-40
tăng cao đạt 239,74 mg/dL. Ở giai đoạn
-60
ĐC1
ĐC2
>64
48
25
11

60 ngày sau thử nghiệm, chỉ số glucose
Mw, kDa
tăng nhẹ so với 40 ngày và đạt 105,9 - Hình 3.21. Mức thay đổi chỉ số glucose trong
máu chuột so với trước khi cho uống bổ sung β137,54 mg/dL tại các nghiệm thức cho
glucan có Mw khác nhau
uống β-glucan có Mw khác nhau.
3.3.5. Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn
dịch ở gà Lương phượng
Bảng 3.16 cho thấy TLBQ của lơ có bổ sung β-glucan tan nước có
Mw~11-25 kDa đạt cao nhất (1260 & 1256 g/con) và lô ĐC thấp nhất
với chỉ 1013 g/con. Mức tăng trọng tuyệt đối ở gà ni có bổ sung βglucan tan nước có Mw~11-25 kDa vẫn đạt cao nhất. Lượng thức ăn
tiêu thụ và hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) ở lô bổ sung β-glucan tan nước
có Mw~25 kDa là thấp nhất nhưng chất lượng thịt lại đạt cao nhất (hình
3.22)..
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của β-glucan có Mw khác nhau lên sự tăng trọng và chất lượng thịt ở gà sau
8 tuần cho ăn bổ sung
Chỉ số
ĐC
> 64 kDa
49 kDa
25 kDa
11 kDa
Tỷ lệ sống (%)
61,1b ± 3,2
66,7b±6,4 72,2b ± 5,5 94,4a ± 5,6
94,4a ± 5,6

Mức tăng trọng tuyệt đối
16,3d±0,5
17,8cd±0,3

18,8bc±0,2
20,6ab±0,7
20,7± 0,9

Lượng thức ăn sử dụng
491,1a±5,4
508,3a±1,7 480,4ab±9,2 453,3b±4,4 479ab±15,7 
FCR (kg thức ăn/kg tăng trọng)
4,8b±0,7
3,8ab±0,4
3,7ab±0,2
3,1a±0,2
3,4a±0,2

Thể trọng (g/con)
1012,7d±10,3 1096c±6,7 1152,3b±17,1 1255,7a±5,7 1259,7a±21,1 
Trong cùng 1 hàng, các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên các chỉ số miễn dịch ở gà sau 8
tuần cho ăn bổ sung
Chỉ số
ĐC
> 64 kDa
49 kDa
25 kDa
11 kDa
BCTS (103/mm3)
29,3 ± 0,3
30,4 ± 0,1
30,4 ± 0,5
30,9 ± 0,3 31,1 ± 0,5

BCTT (%)
62,3 ± 1,2
61,0 ± 1,2
63,0 ± 1,2
63,7 ± 1
63 ± 1,2
Lymphocyte (%)
25 ± 1,2
28,7 ± 2
25,3 ± 3
30,7 ± 3,7
29,7 ± 2,2
HGKT Gumboro (Unit)
7980±12
13366±14
11903±35
14770±35
5613±22
HGKT viêm thanh khí quản
131,5±33,6
151,7±33,3
175,8±56,5 181,9 ± 7,3 156 ± 47,9
truyền nhiễm (Unit)
HGKT Newcastle (Unit)
13,3 ± 2,7
21,3 ± 5,3
21,3 ± 5,3
26,7 ± 5,3 21,3 ± 5,3

20
Tỷ lệ ni sống tích lũy của lơ ĐC là thấp nhất với 61,1%, và cao nhất ở
lô bổ sung β-glucan chiếu xạ có Mw ≤ 25 kDa với 94,4%. Kết quả
bảng 3.17 cho thấy số lượng BCTS
của gà khi cho ăn bổ sung β-glucan tan
nước có Mw≤25 kDa là 30,931,1x103/mm3, trong khi lơ ĐC là
29,3x103/mm3. Ngồi ra lơ có bổ sung
β-glucan có Mw~25 kDa cịn cho giá
trị cao nhất về tỷ lệ lympho bào
(30,7%) và hiệu giá kháng thể Hình 3.22. Ảnh hưởng của β-glucan có Mw
khác nhau đến quầy thịt ở gà
(HGKT) đối với bệnh gumboro, bệnh
viêm thanh khí quản truyền nhiễm và
bệnh newcastle.

10

80

9

60

8

Độ tan, %

Độ trương nước bảo hồ, g/g

3.4. Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nƣớc

trong khoảng liều xạ thấp
Từ kết quả thử nghiệm nêu trên chuột và trên gà đã cho thấy cho chế
phẩm β-glucan tan nước có Mw~25 kDa đã thể hiện hoạt tính sinh học
cao nhất cả in vitro và in vivo. Để chế tạo β-glucan tan nước có Mw~25
kDa từ mẫu β-glucan khơng tan nước tách chiết được có pH là khá thấp
(~3) và liều xạ cần thiết để tạo chế phẩm là còn khá cao (200 kGy) và
cần phải giảm liều cho hiệu quả.
3.4.1. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện pH
khác nhau
7
6
5

40
20

4
3

0

2
3

4

5

6
7

pH

8

9

10

3

4

5

6 7
pH

8

9

10

Hình 3.23. Độ trương nước bảo hịa và độ tan của mẫu β-glucan ở điều kiện pH khác nhau

Kết quả từ hình 3.23 cho thấy, β-glucan thu được hồn tồn khơng tan
trong nước ở pH~3 và có độ trương thấp nhưng tan nhẹ và độ trương tăng


21

70

100

pH ~ 3

pH ~ 5

pH ~ 7

pH ~ 9

Hàm lượng β-glucan tan , %

50

Mw, kDa

pH ~ 3

90

60

40
30
20
10

pH ~ 5

pH ~ 7

pH ~ 9

80
70
60
50
40
30
20
10

0

0

0

50

100

150

200

250

300

Liều xạ, kGy

Hình 3.24. Sự suy giảm Mw của β-glucan khi liều xạ
ở các điều kiện pH khác nhau

0

50

100

150
200
Liều xạ, kGy

250

300

Hình 3.25. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan
nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10% ở
điều kiện pH khác nhau

khi pH tăng. Hình 3.24 cho thấy ở pH~3
để có 25,9 - 66,7% lượng β-glucan tan
nước thì cần chiếu xạ từ 100 - 300 kGy.
Khi gia tăng pH lên thì hàm lượng βglucan tan tăng đáng kể và khi pH~9 thì
hiệu suất tạo β-glucan tan tăng mạnh và

đạt trên 70% chỉ với liều 40 kGy. Kết
quả nhận được từ hình 3.25 cũng cho Hình 3.26. Phổ IR của β-glucan tan nước có
ở các điều kiện pH khác
thấy khi chiếu xạ mẫu ở điều kiện pH Mw~25 kDa chiếu xạnhau
càng cao thì sự suy giảm Mw của mẫu βglucan càng nhanh và ở
pH~9 thì sự suy giảm Mw khá tốt (Mw~25 kDa chỉ với liều 40 kGy).
Hình 3.26 cho thấy hầu như khơng có sự thay đổi các đỉnh đặc trưng
trong
phổ đo từ các mẫu sau khi chiếu xạ ở pH khác nhau.
3.4.2. Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện
hiệu chỉnh pH và có H2O2
Kết quả hình 3.27 cho thấy khi chiếu xạ mẫu β-glucan có nồng độ khác
nhau ở điều kiện pH~9 kết hợp xử lý 1% H2O2 thì hàm lượng β-glucan
tan trong nước tăng lên theo liều xạ. Điều này có lẽ là do hiện ứng cộng
hợp tạo ra trong quá trình chiếu xạ. Có thể thấy từ hình 3.28 rằng để thu
được mẫu β-glucan tan nước có Mw~25 kDa thì cần chiếu xạ liều 10
kGy với mẫu β-glucan 5% trong 1% H2O2. Kết quả phân tích phổ FTIR
(hình 3.29) và giản đồ XRD (hình 3.30) cho thấy mẫu β-glucan tan nước
có Mw~25 kDa thu được khi chiếu xạ 10 kGy hỗn hợp 5% β-glucan ở


22
pH~9 và 1% H2O2 hầu như không khác biệt so với mẫu không chiếu xạ
hoặc chiếu xạ ở các điều kiện khác.
100

70
5%

10%

15%

60

80

50

70

Mw, kDa

Hàm lượng β-glucan tan, %

90

60
50
40
30

40
30
20

20
5%

10

10%

10

15%

0

0
0

20

40
60
Liều xạ, kGy

80

100

Hình 3.27. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan
nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ
khác nhau ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2

0

20

40
60
Liều xạ, kGy

80

100

Hình 3.28. Sự suy giảm Mw của β-glucan khi
chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng độ khác nhau
ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2

Hình 3.29. Phổ IR của β-glucan tan nước có
Hình 3.30. Giản đồ XRD của β-glucan tan nước
Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện pH khác nhau
có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện pH khác
và kết hợp xử lý H2O2
nhau và kết hợp xử lý H2O2


23
β-glucan dạng bột
Ngâm trương trong dung dịch H2O2 1% để tạo hỗn hợp βglucan 5% (w/v) và điều chỉnh pH~9 bằng NaOH

β-glucan dạng dịch
huyền phù 5%
Cho vào chai thủy tinh và chiếu xạ trên nguồn Gamma
Co-60 liều xạ 10 kGy

Dung dịch β-glucan cắt

mạch bức xạ
Ly tâm với tốc độ 11000 vòng/phút trong 20 phút và thu
nhận phần dung dịch nổi, điều chỉnh pH~7 bằng HCl

Dung dịch β-glucan tan
có Mw thấp và tan nƣớc
Tủa trong ethanol với tỷ lệ 9V ethanol/1V dịch nổi, ly tâm với
tốc độ 11000 vòng/phút trong 20 phút, thu nhận tủa, rửa tủa 3
lần với ethanol 90o, sấy khơ ở 60oC, nghiền nhỏ

Chế phẩm β-glucan có
Mw thấp tan nƣớc có
Mw~25 kDa
Hình 3.31. Sơ đồ khối quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nước bằng phương pháp chiếu
xạ ở điều kiện hiệu chỉnh pH và có H2O2 quy mơ 1 lít/mẻ

Quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan nước với Mw~25 kDa có
hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện hiệu
chỉnh pH và có H2O2 được thiết lập như hình 3.31.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Từ những kết quả nhận được, một số kết luận được rút ra như sau:
- Đã xây hồn thiện quy trình chế tạo β-glucan từ thành tế bào nấm
men từ bã thải nấm men bia quy mơ 500 lít/mẻ.
- Sản phẩm -glucan chế tạo được có hàm lượng  -glucan cao
(~91,8%), khơng tan trong nước, có khối lượng phân tử Mw lớn hơn 64
kDa. Đặc trưng phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) và phổ hồng ngoại
(FTIR) của sản phẩm  -glucan chế tạo được hầu như không khác biệt so
với mẫu chuẩn cùng dạng của hãng Sigma.