Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phần máu, đàm giả định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

VÕ NGỌC NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM MÁU, ĐÀM
GIẢ ĐỊNH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT
LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số
: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

VÕ NGỌC NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM MÁU, ĐÀM
GIẢ ĐỊNH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT
LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số

: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2017


i

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN HỮU TÂM
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
Chữ ký:……….......................................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Chữ ký:…………………………………………………………………………...
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 5 năm 2017
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
2. Phản biện 1: PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
3. Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
4. Ủy Viên: TS. HOÀNG MỸ DUNG
5. Thư ký: TS. HOÀNG ANH HOÀNG
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: VÕ NGỌC NGUYÊN

MSHV: 1570768

Ngày, tháng, năm sinh: 20/12/1983

Nơi sinh: Cà Mau

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định phục vụ công
tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Nhiệm vụ : Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định phục vụ công
tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng.
 Nội dung : Khảo sát và xác định các loại bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường

gặp tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Nghiên cứu xây dựng quy trình
tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định ở quy mơ phịng thí
nghiệm.Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, áp dụng quy trình sau tối ưu sản xuất mẫu
ở qui mơ phịng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: ngày 16/01/2017
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: ngày 18/6/2017
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. TRẦN HỮU TÂM
Tp. HCM, ngày 11 tháng 5 năm 2017
1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. TRẦN HỮU TÂM

2

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


iii

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi xin cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung tâm
Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP. HCM, đặc biệt là TS. Trần Hữu Tâm, Giám đốc Trung tâm
vừa là người thầy, là người anh kính mến. Thầy đã quan tâm, chỉ dẫn, truyền đạt nhiều
kiến thức, kinh nghiệm, kỷ năng sống, làm việc quí báu và tạo điều kiện tốt nhất để tơi

có thể hồn thành luận văn và cơng việc được giao. Đồng thời, Tôi cũng không quên
cảm ơn đến tập thể khoa Sinh phẩm đã góp nhiều cơng sức, truyền nhiều cảm hứng và
mọi người cùng nhau hỗ trợ, thực hiện thí nghiệm để hồn thành đúng tiến độ nghiên
cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn q thầy, cơ bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật
Hóa học, trường đại học Bách khoa TP. HCM nhất là PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương,
cô luôn quan tâm, rất tâm huyết để truyền đạt cho tôi và nhiều thế hệ học viên nhiều kinh
nghiệm, kiến thức, kỹ năng và niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Con cảm ơn ba mẹ, người đã hy sinh cả đời để nuôi dạy con khôn lớn và thành
người. Em cảm ơn các anh, chị đã yêu thương, động viên, hỗ trợ em rất nhiều trong suốt
thời gian em đi học và cho đến hôm nay.
Anh gửi đến em, Nguyễn Thị Vân lời yêu thương. Em là hậu phương vững chắc,
giúp anh thêm nhiều niềm tin để vượt qua nhiều khó khăn, hồn thành tốt việc học và
nhiệm vụ.
Trân trọng.
VÕ NGỌC NGUYÊN


iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Tiếng Việt:
Nội dung và kết quả đề tài bao gồm 3 chuyên đề từ việc khảo sát và lựa chọn được
2 loại mẫu bệnh phẩm thường gặp ở các Phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là mẫu đàm
với 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii và mẫu máu
với 2 chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii.
Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman sàng lọc các yếu tố lý, hóa ảnh hưởng đến
nồng độ vi khuẩn trong 15 ngày bảo quản ở điều kiện phịng thí nghiệm. Kết quả lựa
chọn được các yếu ảnh hưởng đến nồng độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên mẫu
đàm là K2HPO4 (mg/ml), sodium glycerophoasphate (mg/ml), sodium thioglycolate

(mg/ml) và nồng độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trên mẫu máu là sodium
glycerophosphate (mg/ml), glycerol (% w/w), pH. Sau đó, tối ưu hóa các yếu tố ảnh bằng
phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) và thiết kế tâm đối xứng (CCD). Kết quả tối ưu hóa
của mẫu đàm chứa vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa đạt cao nhất 9,80 log và của mẫu
máu chứa vi khuẩn Acinetobacter baumannii đạt cao nhất 7,24 log với mức tối ưu các
yếu tố tương ứng theo thứ tự K2HPO4 2,5 (mg/ml), sodium glycerophoasphate 7 (mg/ml),
sodium thioglycolate 1,8(mg/ml) và sodium glycerophosphate 13,22 (mg/ml), glycerol
14,3 (% w/w), pH 5 7,3. Đánh giá sự tương thích giữa mơ hình tối ưu và thực nghiệm vi
khuẩn Pseudomonas aeruginosa đạt 9,81 log và vi khuẩn Acinetobacter baumannii đạt
7,26 log.
Chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất mẫu chi tiết gồm 4 giai đoạn và
cũng như đã sản xuất mẫu ở qui mô phịng thí nghiệm, đánh giá đạt độ đồng nhất, độ ổn
định. Qua kết quả nghiên cứu và áp dụng thực tế, quy trình nghiên cứu đã tạo ra được
mẫu bệnh phẩm giả định hồn tồn thích hợp cho việc sử dụng đánh giá chất lượng xét
nghiệm vi sinh lâm sàng, tập huấn nâng cao tay nghề nhân viên xét nghiệm, góp phần
đảm bảo chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng.


v

Tiếng Anh:
The contents and results of study included 3 specific subjects from surveying and
selecting of 2 types of specimen presenting frequently in microbiology laboratory such
as sputum sample with 2 strains bacteria Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii, and blood sample with 2 strains of specified bacteria Staphylococcus
epidermidis, Acinetobacter baumannii.
The design optimum multifactorial experiments Plackett – Burman was used
estimating level effect of physical and chemical factors on bacterial concentration during
15 days in laboratory condition. As the result, K2HPO4 (mg/ml), sodium
glycerophoasphate (mg/ml), sodium thioglycolate (mg/ml) were identified as significant

factors for sputum sample with strain bacteria Pseudomonas aeruginosa and sodium
glycerophosphate (mg/ml), glycerol (% w/w), pH were identified as significant factors
for blood sample with strain bacteria Acinetobacter baumannii. After screening, these
factors were subsequently optimized using the response surface method (RSM) – Central
Composite Design (CCD). Pseudomonas aeruginosa‘s concentration 9,80 log and
Acinetobacter baumannii ‘s concentration 7,24 log in blood sample was the highest with
the optimal levels were K2HPO4 2,5 (mg/ml), sodium glycerophoasphate 7 (mg/ml),
sodium thioglycolate 1,8 (mg/ml) and sodium glycerophosphate 13,22 (mg/ml), glycerol
14,3 (% w/w), pH 5 7,3, respectively. Testing the model obtained with Pseudomonas
aeruginosa‘s concentration 9,81 log and Acinetobacter baumannii‘s concentration 7,26
log.
We created the detailed process for manufacturing samples with 04 stages and
also practical tested in laboratory volume and evaluate homogeneity and stability of these
samples. Throughout the study results and practical application, the study process makes
stimulated samples quite suitable for using in quality control of clinical microbiological
testing, in training for laboratory staffs, contribution in quality assurance of clinical
microbiology.


vi

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Võ Ngọc Nguyên, học viên cao học chun ngành cơng nghệ sinh học,
khoa Kỹ thuật Hóa học, trường đại học Bách khoa Tp. HCM. Tôi xin cam đoan đây là
cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.


vii

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................................. x
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................................ xi
DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................................................ xiii
PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................1

2.

Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................................2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 5
1.1.

Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng ........................................................................................5

1.1.

Bệnh phẩm đàm ........................................................................................................ 5

1.2.

Bệnh phẩm máu ........................................................................................................ 6

1.3.

Bệnh phẩm phân ....................................................................................................... 6

1.4.

Bệnh phẩm mủ .......................................................................................................... 7

1.5.

Bệnh phẩm nước tiểu .............................................................................................. 7

1.2.

Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng .........................................................9

1.3.

Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng .................10

1.3.1.

Trên thế giới ........................................................................................................ 10

1.3.2.

Tại Việt Nam ...................................................................................................... 11

1.4.

Mẫu ngoại kiểm Vi sinh ..............................................................................................12

1.5.

Tối ưu hóa ...................................................................................................................14

1.5.1.

Ma trâ ̣n Plackett-Burman .................................................................................... 14

1.5.2.

Phương pháp RSM-CCD .................................................................................... 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 18
2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................... 18
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị. ............................................................................................... 18
2.2.1. Chủng vi khuẩn ATCC............................................................................................... 18
2.2.2. Hố chất và mơi trường ni cấy ................................................................................18
2.2.3. Trang thiết bị và cơ sở vật chất ...................................................................................19
2.3.

Phương pháp và nội dung thí nghiệm .........................................................................20

2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................................20
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn các dạng mẫu bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp ...20


viii

2.3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mơ phịng thí
nghiệm. ..................................................................................................................................23
2.3.3.1.

Xây dựng sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất và các bước thực hiện .............. 23

2.3.3.2.

Xây dựng nội dung kiểm tra và tiêu chí kiểm tra ở các cơng đoạn ................. 23

2.3.3.3.

Lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm tra trong lô sản xuất ......................................... 23

2.3.3.4.

Kiểm tra độ đồng nhất ..................................................................................... 23

2.3.3.5.

Kiểm tra độ ổn định......................................................................................... 24

2.3.3.6.

Định danh vi khuẩn ......................................................................................... 25

2.3.3.7.

Xác định nồng độ vi khuẩn trên mẫu bệnh phẩm giả định.............................. 25

2.3.4. Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mơ phịng thí
nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu.........................................................26
2.3.4.1.

Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman ............... 26

2.3.4.2.

Thiết kế thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất
......................................................................................................................... 29

2.3.4.3.

Thiết kế tối ưu hóa mơi trường bảo quản theo RSM - CCD ........................... 30

2.3.4.4.

Đánh giá mức độ tương thích của mơ hình tối ưu trên thực nghiệm .............. 31

2.3.4.5. Áp dụng quy trình tối ưu sản xuất và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của
mẫu ở quy mơ phịng thí nghiệm ...................................................................................... 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................ 33
2.1. Khảo sát bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại các PXN Vi sinh lâm
sàng 33
2.1.1.

Kết quả thống kê mẫu bệnh phẩm phòng xét nghiệm thường gặp ..................... 33

2.1.2.

Kết quả thống kê chủng vi khuẩn phòng xét nghiệm thường gặp ...................... 35

2.2.

2.1.2.1.

Mẫu bệnh phẩm đàm ................................................................................... 37

2.1.2.2.

Mẫu bệnh phẩm máu ................................................................................... 38

Xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mô phòng thí nghiê ̣m .41

2.2.1.

Quy trình tổng quát ............................................................................................. 41

2.2.2.

Xây dựng chỉ tiêu kiểm tra vi khuẩn ................................................................... 43

2.2.3.

Xây dựng chỉ tiêu kiểm tra môi trường cơ chấ t bê ̣nh phẩ m ............................... 44

2.2.4.

Kết quả xây dựng chỉ tiêu kiểm tra mẫu thành phẩ m ......................................... 44

2.3. Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mơ phịng thí
nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu.........................................................45
2.3.1.

Kết quả sàng lọc yếu tố ảnh hưởng trong điều kiện sản xuất mẫu ..................... 46

2.3.1.1.

Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định .................................................................... 46


ix

2.3.1.2.
2.3.2.

Mẫu bệnh phẩm Máu giả định ..................................................................... 50

Kết quả thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất 54

2.3.2.1.

Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định .................................................................... 54

2.3.2.2.

Mẫu bệnh phẩm máu giả định ..................................................................... 55

2.3.3.

Kết quả thí nghiệm tối ưu môi trường bảo quản theo RSM – CCD ................... 57

2.3.3.1.

Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định .................................................................... 57

2.3.3.2.

Mẫu bệnh phẩm máu giả định ..................................................................... 60

2.3.4. Sản xuất mẫu ở quy mơ phịng thí nghiệm và đánh giá độ đồng nhất và độ ổn
định của mẫu ..................................................................................................................... 64
2.3.4.1.

Mẫu bệnh phẩm đàm giả định ..................................................................... 64

2.3.4.2.

Mẫu bệnh phẩm Máu giả định ..................................................................... 67

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 71
4.1.

KẾT LUẬN .................................................................................................................71

4.2.

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 72
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 76


x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ATCC

Americal Type Culture Collection

Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Hoa Kỳ

CFU

Colony forming unit

Đơn vị khuẩn lạc

EQAs

External Quality Assessment schemes

Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng

IQC

Internal Quality Control

Nội kiểm tra chất lượng

ISO

International Standard Organization

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
Phòng xét nghiệm

PXN
RSMCCD

Response Surface Method – Central
Composite Designs

Phương pháp đáp ứng bề mặt – thiết kế
tâm đối xứng

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới


xi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thiế t kế ma trâ ̣n Plackett-Burman 11 ́ u tớ ................................................ 15
Bảng 2.1. Hóa chất và môi trường nuôi cấy.................................................................. 18

Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................................ 19
Bảng 2.3. Tổng hợp các thành phần môi trường chuyên chở ....................................... 27
Bảng 2.4. Mười một yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm
theo ma trận Plackett-Burman ................................................................... 28
Bảng 2.5. Thí nghiệm thiết kế sàng lọc 11 yếu tố thí nghiệm theo ma trận
Plackett-Burman ........................................................................................ 28
Bảng 2.6. Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD ..................................................................... 30
Bảng 3. 1. Thống kê số lượng các loại mẫu bệnh phẩm ............................................... 33
Bảng 3. 2. Thống kê số lượng phòng xét nghiệm thường gặp các chủng vi
khuẩn trong mẫu bệnh phẩm ...................................................................... 36
Bảng 3. 3. Chủng vi khuẩn cho từng mẫu bệnh phẩm giả định .................................... 39
Bảng 3. 4. Nội dung công việc, thời gian và các hồ sơ liên quan đến sản xuất
mẫu ............................................................................................................. 42
Bảng 3. 5. Chỉ tiêu kiểm tra vi khuẩn ........................................................................... 43
Bảng 3. 6. Các chỉ tiêu kiểm tra môi trường cơ chất bệnh phẩm .................................. 44
Bảng 3. 7. Các chỉ tiêu kiểm tra mẫu thành phẩm ........................................................ 44
Bảng 3.8. Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu
Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa ......................................................... 47
Bảng 3.9. Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của
mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa ................................................. 48
Bảng 3.10. Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến
Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 49
Bảng 3.11. Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas
aeruginosa.................................................................................................. 50
Bảng 3.12. Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter
baumannii .................................................................................................. 50


xii

Bảng 3.13. Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu
Máu chứa Acinetobacter baumannii .......................................................... 51
Bảng 3.14. Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của
mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii .................................................. 52
Bảng 3.15. Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến
Acinetobacter baumannii ........................................................................... 53
Bảng 3.16. Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter
baumannii .................................................................................................. 54
Bảng 3.17. Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Staphylococcus
epidermidis ................................................................................................. 54
Bảng 3.18. Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Đàm chứa P. aeruginosa ................. 55
Bảng 3.19. Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với
mẫu đàm chứa Pseudomonas aeruginosa .................................................. 55
Bảng 3.20. Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Máu chứa Acinetobacter
baumannii .................................................................................................. 56
Bảng 3.21. Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với
mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii .................................................. 56
Bảng 3.22. Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu đàm chứa
Pseudomonas aeruginosa .......................................................................... 57
Bảng 3.23. Mâ ̣t đô ̣ vi khuẩ n Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bê ̣nh
phẩ m đàm giả đinh
̣ ở 100 ml và 500ml ..................................................... 60
Bảng 3.24. Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu máu chứa
Acinetobacter baumannii ........................................................................... 61
Bảng 3.25. Mâ ̣t đô ̣ vi khuẩ n Acinetobacter baumannii trong mẫu bê ̣nh phẩ m
máu giả đinh
̣ ở 100 ml và 500 ml .............................................................. 63
Bảng 3.26. Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả
định để đánh giá độ đồng nhất ở quy mơ phịng thí nghiệm ..................... 64
Bảng 3.27. Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả

định trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phịng thí nghiệm ........................ 66
Bảng 3.28. Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả
định để đánh giá độ đồng nhất ở quy mơ phịng thí nghiệm ..................... 68
Bảng 3.29. Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả
định trong 15 ngày bảo quản ở quy mơ phịng thí nghiệm ........................ 69


xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Tổng quan kỹ thuật chung thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh ............... 9
Hình 2.1. Mẫu phiếu khảo sát ....................................................................................... 22
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ phần trăm từng loại mẫu bệnh phẩm ........................ 35
Hình 3.2. Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đàm ..................... 38
Hình 3.3. Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm máu ..................... 39
Hình 3. 4. Quy trình tổng quát sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ............................... 41
Hình 3.5. Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên mơi trường Cetrimide ................. 47
Hình 3. 6. Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường MacConkey ............. 51
Hình 3.7. Mặt đáp ứng nồng độ Pseudomonas aeruginosa theo tỷ lệ Sodium
thioglycolate, Sodium glycerolphosphate và K2HPO4 .............................. 59
Hình 3.8. Mặt đáp ứng nồng độ Acinetobacter baumannii theo tỷ lệ Sodium
glycerolphosphate, Glycerol và pH ........................................................... 62
Hình 3.9. Mẫu bệnh phẩm đàm giả định chứa vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa sau khi phân phối vào lọ ở quy mơ phịng thí nghiệm ............ 65
Hình 3.10. Biểu đồ Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bệnh phẩm đàm giả
định trong thời gian bảo quản 15 ngày ...................................................... 67
Hình 3.11. Mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa vi khuẩn Acinetobacter
baumannii sau khi phân phối vào lọ ở quy mơ phịng thí nghiệm............. 68
Hình 3.12. Acinetobacter baumannii trong mẫu bệnh phẩm đàm giả định
trong thời gian bảo quản 15 ngày .............................................................. 70

1

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tại Quyết định 316/QĐ-TTg ngày 27/2/2016 của Thủ tướng Chính phủ về việc
Phê duyệt Đề án Tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học
giai đoạn giai đoạn 2016-2025, trong đó xác định mục tiêu là nâng cao chất lượng xét
nghiệm y học để đảm bảo kết quả chính xác kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở liên thông,
công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở y tế thực hiện xét nghiệm. Ngồi ra, tại
thơng báo số 99/TB-VPCP của Văn phịng Chính phủ ngày 26/3/2015, Thủ tướng kết
luận một trong những nhiệm vụ trọng tâm sắp tới của ngành y tế là nâng cao chất
lượng xét nghiệm, tiến đến liên thông kết quả. Muốn đạt được điều này, cần phải thực
hiện các biện pháp đảm bảo chất lượng xét nghiệm [13]. Vấn đề đảm bảo và kiểm tra
chất lượng xét nghiệm y khoa là một trong những vấn đề cần phải thực hiện, được Bộ
Y tế, Sở Y tế quy định thành những yêu cầu bắt buộc đối với các phòng xét nghiệm,
trong những vấn đề về đảm bảo chất lượng xét nghiệm thì ngoại kiểm tra chất lượng
là công cụ đánh giá quan trọng bên cạnh nội kiểm tra và đã được quy định, hướng
dẫn chi tiết trong thông tư 01/2013/TT-BYT do Bộ Y tế ban hành [1], [3].
Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM là cơ quan được giao chức năng
thực hiện triển khai ngoại kiểm tra chất lượng để giúp các phòng xét nghiệm y khoa
nâng cao chất lượng và tiến đến đạt các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế. Trung tâm
lần đầu tiên đã triển khai chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh
cho các phòng xét nghiệm y khoa từ năm 2008 – 2009, qua ghi nhận đã có những tác
động tích cực đến kết quả xét nghiệm vi sinh thực hiện trên bệnh nhân [8]. Tuy nhiên,
trong q trình chuẩn bị mẫu cịn một số vấn đề chưa giải quyết được như: sự đồng
nhất của mẫu, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản và thay thế các yếu tố môi
trường bằng nguồn nguyên liệu giá rẻ, vì vậy cần tiến hành nghiên cứu sản xuất mẫu
bệnh phẩm giả định để làm rõ các luận cứ khoa học trước khi sản xuất hàng loạt và

áp dụng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh tại các phòng xét nghiệm theo
thường quy hoặc kiểm tra đột xuất.


2

Xét nghiệm vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm quan trọng
trong xét nghiệm y khoa, kết quả xét nghiệm vi sinh là căn cứ để đưa ra các quyết
định về phương hướng điều trị, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch bệnh
trong cộng đồng, vì vậy địi hỏi kết quả xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện, phòng
xét nghiệm phải tin cậy. Một trong những công cụ để đánh giá độ tin cậy của xét
nghiệm là ngoại kiểm tra chất lượng, cần phải có các mẫu kiểm chuẩn [9].
Do đó, việc nghiên cứu sản xuất các mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục
vụ cho công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là vô cùng cấp thiết,
nhất là các mẫu bệnh phẩm máu và đàm giả định vì các mẫu này có tầng suất thực
hiện nhiều, phổ biến tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Vì vậy, chúng tơi
thực hiện nghiên cứu đề tài: ”nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả
định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng” nhằm:
 Kiểm tra năng lực và giúp nâng cao chất lượng, khả năng xét nghiệm của
phòng xét nghiệm.
 Nâng cao chất lượng phòng xét nghiệm, giúp kết quả xét nghiệm vi sinh lâm
sàng tin cậy.
 Tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các phịng xét nghiệm, giúp tiết
kiệm chi phí và thời gian cho người bệnh.
 Giúp phịng xét nghiệm có cơ hội tiếp cận, diễn tập với nhiều tình huống, nhiều
chủng loại vi khuẩn có nguy cơ tiềm ẩn các dịch bệnh, ln trong tình trạng
sẵn sàng ứng phó với các dịch bệnh nguy hiểm cho cộng đồng.
 Cung cấp dữ liệu tham mưu cho cơ quan quản lý trong việc xây dựng các tiêu
chuẩn, quy chuẩn chất lượng xét nghiệm.
2. Mục tiêu nghiên cứu

-

Lựa chọn các loại mẫu bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất tại
các phòng xét nghiệm.

-

Xây dựng quy trình tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả
định, các tiêu chuẩn kiểm tra nguyên vật liệu và mẫu bệnh phẩm giả định.


3

-

Xây dựng công thức tối ưu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định; sản
xuất mẫu ở qui mô phịng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của
mẫu.

3. Nội dung nghiên cứu
3.1.

Khảo sát và xác định các loại bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường
gặp tại các phòng xét nghiệm.

3.2.

Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm
máu, đàm giả định ở quy mơ phịng thí nghiệm.

3.3.

Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, áp dụng quy trình sau tối ưu sản xuất
mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định ở qui mơ phịng thí nghiệm, đánh
giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu:

-

Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman

-

Thiết kế thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất

-

Thiết kế tối ưu hóa mơi trường bảo quản theo RSM - CCD

-

Đánh giá mức độ tương thích của mơ hình tối ưu trên thực nghiệm

-

Áp dụng quy trình tối ưu sản xuất và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của
mẫu ở quy mơ phịng thí nghiệm

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Quy trình và cơng nghệ sản xuất mẫu ngoại kiểm được các công ty cung cấp
mẫu ngoại kiểm trên thế giới bảo mật rất chặt chẽ vì đây là vấn đề thương mại của

các cơng ty, tại Việt Nam chưa có bất kỳ hướng dẫn hoặc quy trình nào về sản xuất
và tiêu chuẩn mẫu ngoại kiểm sử dụng trong đánh giá độ thành thạo của phịng xét
nghiệm. Do đó việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm tra chất
lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng có tính mới và ý nghĩa về khoa học và thực tiễn
như sau:
 Tạo ra quy trình kỹ thuật chế tạo mẫu bệnh phẩm giả định phục vụ công tác
kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, cùng với tiêu chuẩn kiểm
nghiệm, giám sát tồn bộ các cơng đoạn của việc chế tạo mẫu, đảm bảo độ
đồng nhất và độ ổn định của mẫu.


4

 Mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định lần đầu tiên có quy mơ nghiên cứu sản
xuất có hệ thống ở Việt Nam, giúp chủ động các mục tiêu và kế hoạch triển
khai kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng.
 Thông qua công tác kiểm tra chất lượng, kết quả xét nghiệm vi sinh ngày càng
tin cậy, nâng cao chất lượng, tạo sự thống nhất trong xét nghiệm, hướng đến
sự tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các bệnh viện, phòng xét
nghiệm ở Việt Nam nói chung, trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng.
 Bên cạnh việc phục vụ cơng tác đánh giá - kiểm tra, mẫu bệnh phẩm giả định
còn giúp các phịng xét nghiệm có thể diễn tập, chuẩn bị đối phó với các tình
huống dịch bệnh có thể xảy ra.


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng
Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm cơ bản và

trọng yếu trong các xét nghiệm cận lâm sàng, là căn cứ trong việc đưa ra quyết định
về phương hướng điều trị lâm sàng, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch
bệnh trong cộng đồng, vì vậy địi hỏi xét nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện, phịng xét
nghiệm phải tin cậy, chính xác. Những yếu tố tác động quyết định kết quả xét nghiệm
bao gồm nhân sự, điều kiện môi trường làm việc, kỹ thuật xét nghiệm, phương pháp
xét nghiệm, trang thiết bị,.... do đó, cần phải thực hiện kiểm sốt, kiểm tra chất lượng
xét nghiệm nhằm đảm bảo được sự tin cậy của các kết quả, từ đó giúp cho cơng tác
điều trị, dự phịng, được tốt, góp phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe người bệnh [7].
Các dạng bệnh phẩm thường gặp trong xét nghiệm Vi sinh lâm sàng mà các
phòng xét nghiệm thường tiếp nhận bao gồm [12],[18],[30],[34],[35]:
1.1.

Bệnh phẩm đàm

Xét nghiệm đàm rất quan trọng để chẩn đoán các bệnh đường hô hấp, thông
dụng nhất là dùng để kiểm tra trực khuẩn Koch, xác định bệnh lao phổi, trong trường
hợp này xét nghiệm đàm trở thành một yếu tố quyết định có giá trị hơn cả lâm sàng
và X-quang.
Đối với các bệnh của bộ phận lân cận như gan, tim, áp xe gan có lỗ rị sang phổi,
viêm màng phổi,… xét nghiệm đàm cũng cho thêm các yếu tố chẩn đốn bệnh chính
xác hơn.
Bệnh phẩm đàm thường có màu trắng, vàng, hoặc hơi xanh, khơng có mùi hay
có mùi đặc trưng, chứa các vi khuẩn thường gặp như:
Heamophilus influenzae;
Streptococcus pneumoniae;
Moraxella catarrhalis;
Staphylococcus aureus;

6

Klebsiella pneumoniae;
Các trực gram (-) dễ mọc khác;
Các Enterobacteriaceae khác.
1.2.

Bệnh phẩm máu

Máu là một thành phần tổ chức rất quan trọng của cơ thể vì máu liên hệ mật
thiết với mọi bộ phận, cơ quan trong cơ thể. Do đó về mặt bệnh lý, máu chịu tác động
của tất cả các bệnh lý từ các cơ quan đó, đồng thời có những bệnh riêng của các cơ
quan tạo máu (ung thư tủy xương, bệnh leucemi,…). Bệnh phẩm máu thường có màu
đỏ, mùi tanh đặc trưng, trong các trường hợp nhiễm khuẩn huyết, phòng xét nghiệm
thường phân lập được các vi khuẩn:
Staphylococcus aureus;
Streptococci tiêu huyết α, β;
Enterococci;
Neisseria meningitidis;
Neisseria gonorrhoeae;
Enterobacteriaceae ngoại trừ Shigella;
Pseudomonas spp.;
Hemophilus influenzae;
Yersinia pestis;
Brucella spp.;
1.3.

Bệnh phẩm phân

Xét nghiệm phân có giá trị để chẩn đốn các bệnh đường tiêu hóa, kết quả xét
nghiệm phân là một trong các yếu tố chẩn đốn một số bệnh tồn thân có liên quan
đến rối loạn chức năng tiêu hóa.
Bình thường, phân hơi mềm và có dạng như hình ống, có màu tuỳ thuộc bệnh
và vi khuẩn gây bệnh, một số vi khuẩn của bệnh phẩm phân:


7

Salmonella sp., Shigella sp.;
Các Escherichia coli gây bệnh;
Staphylococcus aureus (có enterotoxin);
Vibrio cholerae và các Vibrio khác;
Campylobacter jejuni và các Campylobacter sp. khác;
Yersinia enterocolitica và các Yersinia khác;
Clostridium difficile (có toxin);
Các vi khuẩn difficile trong phân Plesiomonas sp., Aeromonas sp.
1.4.

Bệnh phẩm mủ

Mủ là chất ngoại tiết được tống ra trên hay trong mơ trong một q trình bệnh
lý. Bệnh phẩm mủ thường có màu trắng đục ngả xanh hay vàng đỏ tuỳ thuộc bệnh lý
và thường có khác vi khuẩn như:
Enterobacteriaceae
Pseudomonas
Streptococci (các loài khác)
Clostridium perfringens
Bacteroides

Staphylococci coagulase (-).
1.5.

Bệnh phẩm nước tiểu

Xét nghiệm nước tiểu giúp cho chẩn đoán một cách tương đối chính xác các
bệnh về gan, thận, tuyến nội tiết, chuyển hóa các chất trong cơ thể, thai nghén, sự bài
tiết các chất thuốc đưa vào cơ thể, nhiễm khuẩn và ký sinh trùng.
Bình thường, nước tiểu mới ra trong hoặc hơi vàng, các vi khuẩn thường có
trong các mẫu bệnh phẩm nước tiểu như:


8

Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus
spp.…);
Enterococcus spp.;
Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus;
Staphylococcus epidermidis;
Staphylococcus saprophyticus;
Candida albicans;
Mycobacterium tuberculosis.
Ngồi ra cịn các dạng bệnh phẩm khác như dịch não tuỷ, dịch màng phổi, dịch
màng bụng, dịch tai,…tất cả các dịch từ bộ phận cơ thể bị nhiễm khuẩn đều có thể
được lấy mẫu bệnh phẩm để thực hiện xét nghiệm vi sinh phục vụ cho chẩn đoán và
điều trị.


9

Hình 1. 1. Tổng quan kỹ thuật chung thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh
1.2. Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng
Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh là một phần của đảm bảo chất lượng
trong phòng xét nghiệm xét nghiệm Vi sinh. Kiểm tra chất lượng xét nghiệm có hai
cơng cụ quan trọng là ngoại kiểm tra và nội kiểm tra:
Nội kiểm tra chất lượng (IQC) do phòng xét nghiệm tự làm thường quy theo
một quy trình khoa học xác định, mang tính chủ quan nhằm mục đích [5]:
 Phát hiê ̣n sai sớ , xác đinh
̣ loa ̣i sai số và tính sai số toàn bô ̣;


10

 Tìm nguyên nhân gây ra sai số và đề xuất biê ̣n pháp khắ c phu ̣c;
 Đánh giá đô ̣ tin câ ̣y của kế t quả xét nghiệm, từ đó quyế t đinh
̣ trả kế t
quả xét nghiệm hay làm la ̣i xét nghiệm đó;
 Đánh giá thiế t bi,̣ phương pháp, hóa chấ t xét nghiệm;
 Đánh giá tay nghề của nhân sự thực hiê ̣n xét nghiệm.
Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) mang tính khách quan, là công cụ kiểm tra
chất lượng song song với nội kiểm tra. Chương trình ngoại kiểm tra do một đơn vị
bên ngồi tổ chức để các phịng xét nghiệm đăng ký tham gia thực hiện, nhằ m mu ̣c
đích [6], [35]:
 So sánh chấ t lươ ̣ng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm khác nhau
của mô ̣t thành phố , mô ̣t khu vực, mô ̣t nước (quố c gia), nhiề u nước
(quố c tế );
 Tìm nguyên nhân gây sai số và đề xuấ t biê ̣n pháp khắ c phu ̣c;
 Làm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c công nhâ ̣n đa ̣t chấ t lươ ̣ng quy đinh
̣ và

chuẩ n hóa các phòng xét nghiệm.
1.3. Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng
1.3.1. Trên thế giới
Chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng được thực hiện tại hầu hết các
nước trên thế giới với nhiều mức độ khác nhau từ sơ bộ cho đến rất chuyên biệt. Tại
châu Phi, các bệnh truyền nhiễm tạo thành một vấn đề y tế công cộng rất quan trọng
và sự bùng phát đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe [36]. Các bệnh này ảnh hưởng rất
lớn đến nền kinh tế và xã hội và cần được nhắm mục tiêu thông qua kiểm sốt dịch
bệnh tích cực, phịng ngừa và các hoạt động giám sát [20].
Do đó vào năm 2002, 36 phòng xét nghiệm thuộc 29 quốc gia châu Phi tham
gia vào chương trình ngoại kiểm vi sinh do WHO triển khai nhằm đánh giá khả năng
chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh có nguy cơ tiềm ẩn trong các bệnh viêm não, tiêu chảy
và dịch bệnh. Ngoài ra, 43 quốc gia và Tiểu vương quốc thuộc khu vực Trung Đông