Nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase có sự hỗ trợ của sóng siêu âm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


LÊ THỊ DIỄM NGỌC

NGHIÊN CỨU THUỶ PHÂN COLLAGEN TỪ DA
CÁ TRA BẰNG ENZYM NEUTRASE CÓ
SỰ HỖ TRỢ CỦA SÓNG SIÊU ÂM

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã Số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Phan Đình Tuấn
TS. Phan Ngọc Hoà

Cán bộ nhận xét 1: TS. Nguyễn Hữu Phúc.
Cán bộ nhận xét 2: PGS.TS. Đống Thị Anh Đào.
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM
ngày 15/08/2012
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1.

PGS.TS. Nguyễn Xích Liên.

2.

PGS.TS. Đống Thị Anh Đào.

3.

TS. Nguyễn Hữu Phúc.

4.

TS. Phan Ngọc Hoà

5.

TS. Lại Quốc Đạt.

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm, Bộ

môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường Đại học Bách Khoa
TP.HCM đã hỗ trợ trang thiết bị, máy móc, vật tư, phịng thí nghiệm giúp em hồn
thành tốt luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phan Đình Tuấn, TS. Phan Ngọc
Hồ, những người đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất
cho em hoàn thành luận văn này.
Em xin cảm ơn các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm và các bạn lớp cao
học K2010 – Bộ Mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm, Khoa kỹ thuật hóa học đã đồng hành
cùng em trong thời gian thực hiện luận văn cao học tại trường Đại học Bách Khoa
TP.HCM.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và gia đình đã
ln ở bên cạnh u thương, chăm sóc và động viên tinh thần con trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2012
Học viên
Lê Thị Diễm Ngọc


i


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu thuỷ phân collagen bằng enzym
Neutrase với sự hỗ trợ của sóng siêu âm để thu nhận được các peptide có phân tử
lượng MWd 10 kDa.
Chúng tơi tiến hành khảo sát các thơng số thích hợp cho q trình thuỷ phân
collagen bằng Neutrase trước khi tiến hành kết hợp sóng siêu âm với enzym. Kết
quả thu được cho thấy điều kiện thuỷ phân collagen thích hợp nhất là: tỷ lệ cơ
chất/nước là 1:4, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ thuỷ phân là 50qC, tại pH

7,0 và thời gian thuỷ phân là 3 giờ. Mức độ thuỷ phân tại điều kiện tối ưu trên đạt
11,02%. Trọng lượng phân tử (MW) nhỏ nhất của các peptide thu được khi thuỷ
phân bằng Neutrase là 19kDa.
Khi thuỷ phân collagen bằng Neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời
gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, cường độ sóng siêu âm 30% Pmáy (150W/20ml
mẫu), DH thu được là 14,92%, tăng 35,39% so với khi chỉ thuỷ phân collagen bằng
Neutrase. Trọng lượng phân tử nhỏ nhất của các peptide thu được khi sử dụng kết
hợp enzym và sóng siêu âm là 10 kDa.
Collagen hydrolysate thu được có phân tử lượng phù hợp để sử dụng trong
thực phẩm hoặc mỹ phẩm nên chúng tôi tiến hành khảo sát một số tính chất chức
năng của CH để xác định hướng ứng dụng của sản phẩm. Kết quả cho thấy, CH có
khả năng tạo bọt, tạo nhũ và độ hoà tan cao hơn so với collagen ban đầu.

ii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................ ii
MỤC LỤC............................................................................................................. iii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... xiii
LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. Da cá ........................................................................................................... .3
1.2. Collagen ....................................................................................................... 4
1.3. Collagen hydrolysate (CH) ........................................................................... 9
1.4. Các phương pháp thuỷ phân protein ........................................................... 16

1.5. Enzym Protease .......................................................................................... 18
1.6. Sóng siêu âm (SSA).................................................................................... 23
1.7. Một số các nghiên cứu thuỷ phân collagen đã công bố ............................... 26
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 32
2.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 34
2.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 54
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 55
3.1. Tính chất hố lý của collagen nguyên liệu và hoạt tính enzym .................... 55

iii


3.2. Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến DH của quá trình thuỷ phân collagen
bằng enzym Neutrase ........................................................................................ 58
3.3. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase sau khi xử lý mẫu bằng
sóng siêu âm...................................................................................................... 67
3.4. Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase trước khi xử lý mẫu
bằng sóng siêu âm ............................................................................................. 71
3.5. Thuỷ phân collagen bằng enzym theo hai hướng khác nhau ....................... 72
3.6. Nghiên cứu tính chất của sản phẩm collagen hydrolysate ........................... 73
3.7. Tính năng cơng nghệ của collagen hydrolysate ........................................... 76
3.8. Xây dựng quy trình cơng nghệ tạo sản phẩm .............................................. 81
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 83
4.1. Kết luận ...................................................................................................... 83
4.2. Kiến nghị.................................................................................................... 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 85
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 92

iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc xoắn ba của collagen .................................................................. 5
Hình 1.2: Thứ tự bậc cấu tạo của collagen ............................................................... 5
Hình 1.3: Sự kích thích q trình đồng hố sụn của CH ......................................... 13
Hình 1.4: Vị trí tác động của các loại enzym khác nhau ......................................... 18
Hình 1.5: Liên kết hydro giữa các chuỗi trong phân tử collagen ............................ 20
Hình 1.6: Vị trí xúc tác của collagenase ................................................................. 20
Hình 1.7: Cơ chế xúc tác thuỷ phân collagen của collagenase................................ 21
Hình 1.8: Quá trình hình thành và phá vỡ bọt khí .................................................. 25
Hình 1.9: Trọng lượng phân tử của collagen và CH từ da hải sâm ......................... 29
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 34
Hình 2.2: Quy trình thu nhận collagen từ da cá Tra................................................ 35
Hình 2.3: Quy trình phân tích hàm lượng Hydroxyproline ..................................... 37
Hình 2.4: Đồ thị đường chuẩn Hydroxyproline ...................................................... 39
Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn Tyrosine ................................................................. 57
Hình 3.2: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất/nước đếb DH...................... 58
Hình 3.3: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH .................................... 60
Hình 3.4: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH ..................................... 62
Hình 3.5: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH đến DH ............................................. 63
Hình 3.6: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến DH ................... 65
v


Hình 3.7: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến DH của Alcalase,
PCE và Neutrase ở nồng độ enzym 1% và 5% ...................................................... 67
Hình 3.8: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của cường độ SSA đến DH ........................... 68
Hình 3.9: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian xử lý SSA đến DH................... 70
Hình 3.10: Đồ thị thể hiện sự khác nhau của DH khi áp dụng hai hướng khác nhau

để thuỷ phân collagen ............................................................................................ 72
Hình 3.11: Kết quả phân tích điện di của collagen ................................................. 73
Hình 3.12: Kết quả phân tích điện di của collagen hydrolysate .............................. 74
Hình 3.13: Đồ thị thể hiện khả năng hoà tan của collagen và CH tại pH 7,0 .......... 76
Hình 3.14: Đồ thị thể hiện khả năng nhũ hố của collagen và CH.......................... 78
Hình 3.15: Đồ thị thể hiện khả năng tạo bọt của collagen và CH ........................... 79
Hình 3.16: Quy trình cơng nghệ thu nhận CH ........................................................ 81

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Hàm lượng acid amin trong một số loại thực phẩm................................ 10
Bảng 2.1: Các loại hoá chất sử dụng trong nghiên cứu........................................... 32
Bảng 2.2: Độ hấp thu của hydroxyproline chuẩn ở bước sóng 557nm.................... 38
Bảng 2.3: Hệ số 1/α ở các nhiệt độ và pH khác nhau ............................................. 46
Bảng 3.1: Chất lượng collagen nguyên liệu ........................................................... 55
Bảng 3.2: Kết quả xác định đường chuẩn Tyrosine ................................................ 56
Bảng 3.3: Kết quả xác định hoạt tính của enzym Neutrase ..................................... 57
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất/nước đến DH .................. 58
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH ................................. 59
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH.................................. 61
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến DH ......................................... 63
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến DH ................ 65
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cường độ SSA đến DH........................ 67
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến DH.................. 69
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cường độ SSA đến DH (thuỷ phân
collagen bằng Neutrase trước khi xử lý mẫu bằng SSA) ........................................ 71
Bảng 3.12: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến DH (thuỷ phân
collagen bằng Neutrase trước khi xử lý mẫu bằng SSA) ........................................ 71

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS : 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
CH: Collagen Hydrolysate
DH : Degree of Hydrolysis
DPPH : 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl
EAI : Emulsion Activity Index
ESI : Emulsion Stability Index
EC: Emulsion capacity
FE : Foam Expansion
FS : Foam Stability
FDA: The Food and Drug Administration
GH : Gelatin Hydrolysate
MP : Metalloproteinase
MW: trọng lượng phân tử
NS: Nitrogen Solubility
PH: Protein Hydrolysate
SSA : Sóng siêu âm

viii


1

LỜI MỞ ĐẦU
Da cá Tra là một phế phẩm của ngành cơng nghiệp cá da trơn, có sản lượng
lớn, tập trung ở các tỉnh Tây Nam Bộ. Theo kết quả phân tích của Viện nghiên cứu

ni trồng thủy sản 2, hàm lượng protein trong da cá Tra chiếm khoảng 67% hàm
lượng chất khơ, trong đó khoảng 53% là collagen. Kết quả này cho thấy việc thu
nhận collagen từ da cá Tra hoàn toàn khả thi và là một định hướng đúng đắn nhằm
khai thác hiệu quả phụ phẩm của công nghiệp sản xuất phi lê cá Tra vốn đang phát
triển rất mạnh mẽ.
Collagen hydrolysate (CH) là sản phẩm từ collagen thuỷ phân. Nhiều tài liệu
đã chứng minh được khả năng chống lão hoá, cải thiện sức khoẻ và sắc đẹp của
collagen thuỷ phân. Vì vậy, các sản phẩm thực phẩm chức năng và mỹ phẩm có
thành phần collagen thuỷ phân đang rất được ưa chuộng trên thị trường. Việc
nghiên cứu sản xuất collagen thuỷ phân từ da cá Tra là bước nghiên cứu phát triển
thành quả của cơng trình nghiên cứu trích ly collagen từ da cá Tra của nhóm tác giả
trường Đại Học Bách Khoa (TP.HCM). Việc tạo được sản phẩm CH từ da cá Tra sẽ
mở rộng lĩnh vực ứng dụng của collagen, nâng cao giá trị sử dụng, giá trị kinh tế
của sản phẩm này. Đồng thời, góp phần phát triển kinh tế và bảo vệ mơi trường
vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm phương pháp và đề xuất điều kiện thích
hợp để thu nhận CH từ da cá Tra. Collagen là một protein đặc biệt, nó có cấu trúc
bậc bốn phức tạp với các chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau. Vì vậy, việc thuỷ
phân bằng enzym có hiệu quả thấp. để thu nhận sản phẩm CH có độ an tồn cao,
với tác nhân sinh học là enzym, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thuỷ phân
collagen bằng enzym Neutrase có sự hỗ trợ của sóng siêu âm”.
Nội dung chính của luận văn gồm:
 Thu nhận collagen từ da cá Tra và xác định tính chất hố lý của ngun liệu.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ

2
 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến DH của quá trình thủy phân collagen
bằng enzym Neutrase.
 Khảo sát quá trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase sau khi xử lý
mẫu bằng sóng siêu âm.
 Khảo sát q trình thuỷ phân collagen bằng enzym Neutrase trước khi xử lý
mẫu bằng sóng siêu âm.
 Khảo sát tính năng cơng nghệ của CH: khả năng hoà tan, khả năng tạo bọt,
khả năng tạo nhũ.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Da cá
1.1.1. Cấu tạo của da cá
Da cá là tổ chức khá phức tạp, mô da là một khối tổng hợp gồm 3 lớp: Biểu
bì, trung bì và hạ bì kết hợp chặt chẽ với nhau thành các lớp tổ chức bao phủ mang
tính chất co dãn, có tính nhớt, tính tạo hình, có các lớp biểu mô, các mô liên kết,
lông và gốc lông, thớ cơ, tận cùng các dây thần kinh, lưới mạch máu và bạch mạch.
1.1.2. Thành phần hóa học của da cá
1.1.2.1. Protein
Collagen: là thành phần chính của protein trong da. Cấu tạo và chức năng

của collagen sẽ được trình bày cụ thể ở phần 1.2.
Albumin: là protein tan được trong nước, dung dịch muối loãng, acid loãng
và kiềm loãng. Albumin bị kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa và bị đơng tụ
khi bị đun nóng. Q trình ngâm rửa ngun liệu sẽ loại được phần lớn protein này.
Globulin: là protein không tan trong nước nhưng tan được trong dung dịch
acid lỗng, kiềm lỗng và dung dịch muối trung tính (8 ÷ 18% NaCl), dễ đông tụ
hơn albumin khi bị đun nóng.
Keratin: là protein tạo chất sừng, trong mạch phân tử của keratin ngồi liên
kết ion và liên kết hydro cịn có liên kết disulfide. Các liên kết disulfide bị thủy
phân trong kiềm nhưng không bị acid thủy phân nên keratin bị phá hủy trong môi
trường kiềm và tương đối ổn định trong mơi trường acid.
Elastin: là protein có màu vàng, các sợi elastin có tính co giãn và có thể kéo
giãn khoảng 5%, không tan trong nước, tương đối ổn định trong môi trường kiềm và
acid, bị phân giải bởi enzyme elastase.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


4
Mucin và mucoid: protein trong niêm dịch, có thể hịa tan trong dung dịch
kiềm loãng. Trong dung dịch acid loãng, mucin bị kết tủa cịn mucoid thì khơng.
Trong nước chúng đều nở ra, chúng có thể hịa tan trong dung dịch muối lỗng
nhưng khơng tan trong dung dịch muối bão hòa.
1.1.2.2. Các thành phần khác
Lipid: là thành phần dễ bị oxi hóa, ảnh hưởng khơng tốt đến chất lượng của
collagen nên cần loại lipid trước khi trích ly.

Khống: thành phần khoáng trong da cá chủ yếu là phosphate calci
(Ca3(PO4)2) và carbonate calci (CaCO3). Thành phần này cũng có ảnh hưởng xấu
đến chất lượng của collagen, để loại khoáng, cần ngâm acid trước trích ly.
Sắc tố: ít tan trong nước và acid lỗng, có thể tan trong dung dịch kiềm
lỗng (như dung dịch KOH, NaOH…).
1.2. Collagen
1.2.1. Cấu trúc
Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật, là thành phần chính
của các mơ liên kết, có khả năng đàn hồi và chịu lực rất cao. Collagen chiếm 25%
tổng lượng protein của cơ thể người và chiếm khoảng 70% - 80% protein của da.
Collagen có cấu trúc rất phức tạp. Phân tử collagen hay còn gọi là
tropocollagen là những phần tử nhỏ, chúng sẽ tập hợp thành các phần tử lớn hơn là
các sợi, và hình thành các bó sợi collagen.
Tropocollagen là một protein hình trụ dài khoảng 2.800 Å và đường kính
14-15 Å (Foegeding et al, 1996). Nó được tạo thành từ ba chuỗi polypeptide (chuỗi
α) và do đó collagen có cấu trúc bậc 4. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành
một cuộn có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix, liên kết giữa các chuỗi là
liên kết hydro. Mỗi chuỗi α có chứa khoảng 1000 axit amin (Wong, 1989) và có
khối lượng phân tử khoảng 100 kDa. Tổng khối lượng phân tử của tropocollagen
khoảng 300 kDa (Foegeding et al, 1996).
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


5
Polypeptide của collagen có dạng xoắn ốc. Mỗi một chuỗi polypeptide trong
collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự, thông thường là Gly - Pro

- Y, hoặc Gly - X – Hyp. Trong đó, X, Y là những đơn vị amino acid khác. Proline
(Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3
chuỗi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm 1/2 chuỗi
collagen. Các amino acid còn lại chiếm 1/2. Tropocollagen liên kết với nhau theo
kiểu đầu nối đi hình thành collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau
hình thành sợi collagen siêu cấp – collagen fiber. Vì thế collagen rất chắc, dai, và
bền.

Hình 1.1. Cấu trúc xoắn 3 của Collagen

Hình 1.2. Thứ tự bậc cấu tạo của Collagen
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


6
1.2.2. Sự khác nhau của collagen – collagen cá so với các loại protein khác [20]
Collagen là protein đặc biệt so với các loại protein khác. Thành phần chủ yếu
của collagen là các acid amin không phân cực như Alanine, Valine, Leucine,
Isoleucine... và chứa hàm lượng lớn các acid amin khơng thiết yếu.
Collagen có chứa khoảng 20 loại acid amin, trong đó Glycine, Proline và
Hydroxyproline chiếm hơn 50% thành phần acid amin. Collagen chứa hàm lượng
Glycine (33%) và Proline (12%) với sự xuất hiện của 4-hydroxyproline (12%) và 5hydroxylysine (1%) (Burghagen, 1999). Tuy nhiên, collagen lại là protein không
chứa Tryptophan và Cystein. Hydroxyproline và Hydroxylysine là hai acid amin rất
hiếm gặp ở các loại protein khác hoặc có mặt với hàm lượng rất thấp. Đối với
collagen thì Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng trong thành phần hóa học.
Hàm lượng collagen trong cơ cá phụ thuộc vào lồi, q trình phát triển và

thức ăn của cá (Regenstein và Regenstein, 1991). Nói chung, hàm lượng collagen
trong cơ cá dao động từ khoảng 1 - 12% protein thô. Ở thịt cá tươi collagen chiếm
0,2 - 2,2% và 1,7 - 4,6% collagen trong da cá (Sikorski et al, 1990).
Nhiệt độ biến tính của collagen cá thấp hơn so với collagen từ da lợn (Nagai
và Suzuki, 2000) bởi vì collagen cá có chứa hàm lượng imino acid thấp hơn
collagen động vật có vú (Foegeding etal, 1996.). Mặt khác, nhiệt độ biến tính của
collagen từ cá nước lạnh thấp hơn nhiều so với các loài cá ôn đới và nhiệt đới
(Wang et al, 2008).
Nhiệt độ biến tính (Tmax) của các collagen thu được từ các phần khác nhau
của cá sẽ khác nhau như: collagen từ da (25,0 – 39,5ºC), collagen từ xương (29,5 30,0ºC) và collagen từ vây cá (28,0 - 29,1 º C), (Nagia và Suzuki, 2000). Những giá
trị này thấp hơn khoảng 7 - 12ºC so với collagen thu được từ da lợn.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


7
1.2.3. Tính chất hóa lý của Collagen [5, 41, 56]
Collagen là một loại protein cấu trúc dạng sợi nên nó có đầy đủ các tính chất
hóa lý của một protein như tính kị nước, tính hydrat hóa, bị biến tính dưới tác dụng
của nhiệt độ, pH... Ngồi ra, nó cịn có các tính chất đặc trưng của Collagen như:
Khả năng trương nở
Collagen khơng hịa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100 g
collagen khơ có thể hút được khoảng 200 g nước, trong đó khoảng 70 g là nước liên
kết và 20 g là liên kết vững chắc. Do nước phân cực nên làm suy yếu các liên kết
hydro trong phân tử collagen dẫn đến làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3
÷ 4 lần.

Sự gia tăng độ trương nở dưới tác động của acid là kết quả của sự giảm nồng
độ ion H+ tác động đến các anion acid, và tác động của bazơ gây ra bởi nồng độ
nhóm OH- giảm ảnh hưởng đến các cation bazơ.
Khả năng hòa tan:
Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước
lạnh. Nhưng khi thủy phân collagen thành những peptide có trọng lượng phân tử
nhỏ thì nó lại có khả năng hịa tan trong nước lạnh.
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến Collagen [19, 28, 40, 53]
 Ảnh hưởng của khơng khí
Ở các độ tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong ống nghiệm, khơng khí
có một vai trị quan trọng trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel và
Hansen, 1989). Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein, nguyên
nhân là do sự thay đổi về mặt hóa học.
 Ảnh hưởng của acid và kiềm
 Ảnh hưởng của acid
Acid acetic có thể làm collagen trương nở 50% và tăng khả năng peptid hóa
collagen hơn HCl ở pH 2,0. Điều đó chứng tỏ rằng acid yếu (ví dụ như acid acetic)
ở pH 2,0 cho phép phóng thích các proton từ nhóm cacboxyl của collagen.
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


8
Sự ảnh hưởng của HCl tới collagen: một số cation H+ kết hợp với anion –
COO-. Quá trình này tiếp tục cho đến khi tất cả nhóm –COO- đã được phóng điện
và tất cả nhóm cation đều ở dạng tự do.Vì vậy, pha nước bên trong cấu trúc
collagen sẽ chứa nhiều Cl- hơn H+. Sự phân phối ion khác nhau giữa hai pha tạo ra

sự khác nhau về áp suất thẩm thấu và khả năng tích điện. Để tạo trạng thái cân bằng
nồng độ ion giữa hai pha, nước chảy vào các phân tử collagen và gây ra sự trương
nở.
 Ảnh hưởng của kiềm
Trong trường hợp bazơ mạnh (như NaOH) khả năng trương nở của collagen
gia tăng đặc biệt là các hydroxide của ion kim loại hóa trị hai ở pH > 10, ở pH này
có sự chuyển hóa khơng thuận nghịch thành các ion. Sự phân hủy nhóm hydroxy
của các acid amin (serin và threonine) và sự thủy phân của liên kết keto - imide giữa
proline và hydroxyproline xảy ra trong suốt quá trình xử lý collagen bằng kiềm ở
pH 12 ÷ 14.
Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, collagen phân giải biến thành
gelatine, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau:

Lúc xử lý ở nhiệt độ cao trong nước, gelatine dễ tiếp tục thủy phân thành:

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
 Nhiệt độ thấp:
Collagen khơng hịa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g
collagen khơ có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen kết hợp với nước nở ra
trong nước, độ dày tăng lên chừng 25%, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên
2 – 3 lần.
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


9
 Nhiệt độ cao:

Nhiệt độ là nguyên nhân làm cho một số protein trong collagen bị biến tính.
Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho
mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tương đối nhỏ. Khi nhiệt
độ tăng lên trong khoảng 60 – 65qC collagen hút nước bị phân giải và nếu tiếp tục
đun collagen sẽ tiếp tục thủy phân thành gelatin. Sự ổn định nhiệt được xem là tỷ lệ
thuận với tổng lượng proline và hydroxyproline, collagen càng bền nhiệt khi lượng
proline và hydroxyproline càng nhiều.
Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao.
Khi ngun liệu đã khử hết chất khống, thì nhiệt độ phân giải sẽ giảm xuống.
 Ảnh hưởng của các chất khác :
Collagen trong dung dịch muối trung tính cùng với gốc –COOH và –NH2 tạo
thành các hợp chất muối. Tác dụng phân giải collagen của NaCl so với Na2SO4
mạnh hơn (độ điện ly của NaCl lớn hơn).
Collagen bị thuỷ phân chậm bởi trypsin và pepsin, trong khi đó gelatin dễ bị
phân huỷ hơn. Nhiều thực nghiệm cho thấy rằng tác dụng của trypsin đối với
collagen đã xử lý (như đun nóng, ngâm acid, kiềm, muối, tác dụng của pepsine, tác
dụng cơ học…) thì nó có tác dụng phân giải, với điều kiện thích hợp nhất là nhiệt
độ 37oC, pH = 8,1 – 8,2.
1.3.

Collagen Hydrolysate

1.3.1. Định nghĩa, thành phần và tính chất của CH
CH là một hỗn hợp các peptide có phân tử lượng thấp và các acid amin tự do
thu được từ quá trình thuỷ phân collagen bằng tác nhân hố học hay sinh học.
Về thành phần hóa học, CH có thành phần acid amin tương tự như
collagen. Có khoảng hai mươi acid amin trong đó glycine, proline và
hydroxyproline chiếm khoảng 50% tổng số.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc

MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


10
CH chứa proline và glycine nhiều hơn gấp 3 lần so với các loại protein khác.
Những loại amino acid này cần thiết cho sự tổng hợp collagen và ảnh hưởng đến sự
ổn định của cấu trúc collagen trong sụn.
Bảng 1.1. Hàm lượng acid amin trong một số loại thực phẩm
(g acid amin/100g thực phẩm) [53]
Amino acid

CH

Sữa

Thịt heo

Khoai tây

Bánh mì

Glycine

22,96

0,08

1,4

0,12

0,3

Proline

13,04

0,35

1,21

0,11

0,96

Hydroxyproline

11,1

-

-

-

-

Glutamic acid

9,58

0,75

3,9

0,46

3,15

Alanine

9,27

0,12

1,53

0,11

0,24

Arginine

7,45

0,12

1,53

0,12

0,31

Aspartic acid

5,63

0,28

2,34

0,43

0,39

Lysine

3,8

0,26

02,2

0,13

0,2

Serine

3,5

0,19

1,1

0,1

0,39

Leucine

2,74

0,35

1,92

0,14

0,59

Valine

2,1

0,23

1,42

0,13

0,39

Phenylalanine

1,98

0,17

0,98

0,10

0,42

Threonine

1,8

0,15

1,25

0,09

0,25

Isoleucine

1,4

0,21

1,27

0,10

0,38

Hydroxylysine

1,2

-

-

-

-

Methionine

0,76

0,08

0,72

0,03

0,13

Histidine

0,61

0,09

0,99

0,04

0,18

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


11
Tyrosine

0,3

0,17

0,91

0,08

0,21

Cystein

-

-

0,31

-

0,2

Tryptophan

-

0,05

0,31

0,03

0,08

Bảng 1.1 cho ta thấy rằng khi uống khoảng 2,8 lít sữa hoặc ăn 1,8 kg khoai
tây sẽ cung cấp được cùng một lượng Glycine được chứa 10g CH. Hàm lượng
Proline trong 10g CH tương đương với 110g thịt, 1,2 kg khoai tây hoặc 140g bánh
mì.
So sánh trên cho thấy rằng CH cung cấp một lượng các axit amin quan trọng
nhất giúp cho quá trình trao đổi chất của sụn hiệu quả hơn nhiều so với bất kỳ thực
phẩm nào khác có chứa protein.
Về tính chất, CH thương phẩm là những peptide có trọng lượng phân tử thấp,
có những đặc tính:
 CH có khơng mùi, vị trung lập nên khơng làm ảnh hưởng đến mùi vị khi bổ
sung vào sản phẩm thực phẩm.
 Độ nhớt thấp, khơng có khả năng tạo gel nhưng lại là chất nhũ hóa, chất
làm bền bọt.
 Dễ dàng hòa tan trong nước lạnh.
 Collagen tự nhiên rất khó tiêu hóa nhưng CH dễ dàng bị phân giải bởi các
enzyme protease có trong hệ tiêu hóa giúp cơ thể hấp thu tốt hơn.
 CH có hoạt tính sinh học cao.
1.3.2. Hoạt tính sinh học và cơ chế tác động của CH
CH là những peptide có phân tử lượng nhỏ. Tùy thuộc vào mức độ thủy phân
(DH) mà có thể thu được các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau. Các
phân đoạn nhỏ hơn 5 kDa thường được sử dụng để bổ sung vào thực phẩm chức
năng và dược phẩm.
Việc cung cấp đủ lượng Glycine và Proline là điều cần thiết để ổn định và tái
tạo q trình chuyển hóa sụn. Để tổng hợp một picogram (1 picogarm bằng 10-12 g)
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN

TS. PHAN NGỌC HỒ


12
collagen loại II, cần cung cấp hơn một tỷ phân tử Glycine và 620 triệu các phân tử
Proline. Với chế độ ăn nghèo protein, hoặc sau khi hoạt động quá sức, việc cung
cấp các axit amin đặc biệt không đủ làm cho quá trình tổng hợp sụn bị ảnh hưởng,
dẫn đến hiệu suất tổng hợp sụn sẽ giảm. Quá trình suy thoái sẽ chiếm ưu thế làm
giảm độ dày của lớp sụn. Trong khi đó, sự kích thích trực tiếp quá trình tổng hợp
collagen trong sụn bởi CH đã được chứng minh bởi Oesser năm 2003. [11, 48]
Phần sụn bao gồm collagen loại II, proteoglycans và một số protein đặc biệt
trong mạng lưới ngoại bào (ECM). Duy trì mức collagen bình thường trong xương,
sụn, gân và dây chằng là rất quan trọng để duy trì sức khỏe về khớp xương.
Khi q trình tái sinh tự nhiên khơng thể theo kịp với những hao mịn hàng
ngày, phần sụn có thể bị rạn nứt dẫn đến làm giảm lượng hoạt dịch, giảm tính đàn
hồi và mất tính trơn nhẵn gây khó khăn trong vận động hàng ngày. Không giống
như hầu hết các mơ khác trong cơ thể người, sụn khơng có mạch máu hay dây thần
kinh, nên một khi sụn bị tổn thương sẽ rất khó lành lại. CH là sản phẩm duy nhất có
bằng sáng chế của Mỹ cho nghiên cứu tái sinh sụn ở người. [38]
Khi vào cơ thể, xuống đến hệ tiêu hoá CH sẽ được các enzym phân cắt thành
các acid amin và những đoạn peptide đặc thù cực nhỏ, rồi mới được hấp thu qua
thành ruột để vào máu. Từ đó chúng di chuyển đến các vị trí cần thiết cho sự phát
triển hay sửa chữa các mơ. Theo S. Oesser và cộng sự, có đến 90% CH nhanh
chóng được tiêu hố và hấp thu vào máu sau khi uống. [11, 47]

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ

13

Hình 1.3. Sự kích thích q trình đồng hố sụn của CH
Năm 2001, nghiên cứu của hai nhà khoa học Mizuno và Kuboki đã chỉ ra
rằng CH kích thích việc tạo ra collagen nội sinh trong cơ thể. Ngoài ra, CH cịn kích
thích q trình đồng hóa của sụn, nhờ đó có thể giúp cải thiện sức khỏe khớp
xương.
Ngồi hiệu quả của CH đối với sức khoẻ xương khớp, các nghiên cứu lâm
sàng cũng chỉ ra một hiệu ứng tích cực của CH đối với việc cải thiện độ đàn hồi và
độ căng của da. Nghiên cứu của Nishimoto và cộng sự cho thấy CH tăng cường
hàm lượng hydroxyproline trong da, điều này liên quan đến sự tổng hợp collagen
(McAlindon và cộng sự, 2000).
Mặt khác, CH cịn có chứa các acid amin như Glycine, Arginine và
Glutamine với hàm lượng khá cao. Những acid amin này đóng vai trị chính để sản
xuất một hoocmon có tên là hGH (human growth hormone). Trong cơ thể, hGH
được tổng hợp ở tuyến yên. Khi cơ thể tổng hợp thiếu hGH của riêng mình thì các
triệu chứng như da bị nhăn và chùng xuống sẽ xảy ra. Do đó, việc sử dụng CH
thường xuyên sẽ giúp ổn định tổng hợp hGH của cơ thể dẫn đến làm giảm nếp nhăn
cho da. [47]

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


14

Khi sử dụng CH có thể cải thiện độ bền cơ học của da do làm tăng tỷ lệ
decorin. Decorin liên kết với collagen và ảnh hưởng đến quá trình tạo sợi collagen.
Gần đây, nghiên cứu của Matsuda và cộng sự cũng đã cho thấy rằng uống
CH với liều lượng 10g/ngày/người có thể làm tăng khả năng hấp thụ nước của da,
làm gia tăng mật độ nguyên bào sợi (là tế bào chính của lớp hạ bì), đồng thời tăng
cường tổng hợp các sợi collagen ở lớp hạ bì. Nguyên nhân là do khi sử dụng CH có
thể kích hoạt một hoặc nhiều hệ thống các enzym cần thiết cho việc sản xuất
sodium PCA (2-Pyrrolidone 5 Carboxilic-Acid), chất này làm tăng khả năng giữ
nước của lớp biểu bì ở da. [36]
Theo nghiên cứu thực nghiệm của Dr. Maker thì khi sử dụng CH đều đặn
trong sáu tháng với hàm lượng 5 – 10g/ngày, sẽ làm tăng 8,8% khối lượng cơ, đồng
thời giảm 14,4% lượng chất béo. Nguyên nhân là do khi sử dụng CH cơ thể sẽ tổng
hợp L – carnitine từ Lysine do CH cung cấp. L – carnitine là chất tham gia chuyển
hoá lipid nội bào thành năng lượng cung cấp cho hoạt động của cơ thể. L – carnitine
mang lại năng lực đáng kể cho hoạt động cơ bắp nhờ tăng cường các phản ứng E oxy hóa để tăng phân giải chất béo của cơ thể, tạo thêm năng lượng cho các tế bào,
đặc biệt là tế bào cơ tim và cơ bắp. Nếu cơ thể thiếu L - carnitine không phân giải
được chất béo để giải phóng năng lượng, thì chất béo sẽ tích tụ lại - đó chính là
ngun nhân của sự tích luỹ lipid trong cơ thể. [36]
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng việc sử dụng CH là hết sức cần
thiết để cung cấp đầy đủ các acid amin đặc biệt cần thiết cho quá trình tổng hợp sụn
trong cơ thể, giúp cải thiện sức khoẻ khớp xương, làn da và dinh dưỡng của cơ thể.
1.3.3. Ứng dụng của CH
CH được FDA cơng nhận là sản phẩm an tồn (GRAS). Tùy theo mức độ
thủy phân mà CH có những ứng dụng khác nhau.
Các phân đoạn từ 10 – 15 kDa được ứng dụng cho các sản phẩm nước uống
có độ nhớt cao.

HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


15
Phân đoạn từ nhỏ hơn 5 kDa được ứng dụng trong các thực phẩm lỏng giàu
protein, thực phẩm ăn kiêng, dinh dưỡng cho thể thao, sử dụng trong y học để chữa
bệng cơ xương khớp và mỹ phẩm.
 Trong thực phẩm
CH thường được sử dụng trong sản phẩm thực phẩm vì hoạt tính sinh học
nhiều hơn là vì tính năng cơng nghệ của nó.
Do tính chất dễ phối trộn của CH, nên thường được các nhà sản xuất bánh
kẹo sử dụng để phối trộn vào các sản phẩm dinh dưỡng chất lượng cao đáp ứng nhu
cầu ngày càng cao của người sử dụng, đặc biệt các dòng sản phẩm dinh dưỡng cho
người cao tuổi, người ăn kiêng và vận động viên thể thao.
Đối với người cao tuổi, do chế độ ăn uống và khả năng tiêu hóa ngày càng
giảm, nên việc sử dụng CH hàng ngày sẽ có tác dụng: giúp duy trì các cơ, giảm chất
béo gây tắc nghẽn động mạch, giảm các bệnh về khớp xương...
CH chỉ gồm các peptide và các amino acid nên được bổ sung vào các thực
phẩm ăn kiêng sẽ giúp tạo cảm giác no, ức chế sự thèm ăn, giúp giảm thiểu được
lượng thực phẩm ăn vào. Ngồi ra, nó cịn chứa các amino acid có thể kích hoạt gia
tăng sự hình thành tế bào cơ, điều này dẫn đến tỷ lệ trao đổi chất, tỷ lệ đốt cháy chất
béo nhanh hơn.
Trong dinh dưỡng thể thao, CH có thể nhanh chóng thúc đẩy sự phát triển cơ
bắp, giúp giảm thời gian hồi phục, xây dựng lại cấu trúc khớp bị hư hỏng mà không
cần phẫu thuật, giúp cải thiện tim mạch.
 Trong y học
Loãng xương là một loại bệnh phổ biến được xách định khi mật độ xương
thấp. Khi đó, xương sẽ giịn và khả năng gãy tăng cao. Theo một số nghiên cứu
khoa học, sử dụng CH dẫn tới một sự tăng trưởng đáng kể mật độ xương và giảm

gãy xương cho các trường hợp loãng xương. [45]
Năm 1996, một nghiên cứu của Adams được thực hiện trên người, trong
khoảng thời gian 4-24 tuần, nghiên cứu tiến hành đo lượng tăng mật độ xương của
HVTH: Lê Thị Diễm Ngọc
MSHV: 10110190

GVHD: PGS.TS.PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ