Nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme neutrase kết hợp với enzyme flavourzyme

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------------------

LÊ THỊ THANH VÂN

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA
BẰNG ENZYME NEUTRASE KẾT HỢP VỚI ENZYME
FLAVOURZYME
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã ngành: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2012


i

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS Phan Đình Tuấn
2. TS. Phan Ngọc Hồ
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Nguyễn Hữu Phúc
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Lê Quang Trí
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM, ngày 15
tháng 08 năm 2012
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS Đống Thị Anh Đào

- Chủ tịch

2. TS. Nguyễn Hữu Phúc

- Phản biện 1

3. TS. Lê Quang Trí

- Phản biện 2

4. TS. Lê Thị Thủy Tiên

- Thư ký

5. TS. Phan Ngọc Hòa

- Ủy viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn

Bộ môn quản lý chuyên ngành


ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

------------------------

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---------------------Tp. HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2012

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Lê Thị Thanh Vân
Ngày, tháng, năm sinh: 24/10/1986
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống

Phái: Nữ
Nơi sinh: Bình Dương
MSHV: 10110207

I. TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA
BẰNG ENZYME NEUTRASE KẾT HỢP VỚI ENZYME FLAVOURZYME
II. NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
Tách chiết và thu nhận collagen từ da cá tra
Khảo sát thành phần nguyên liệu collagen
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân collagen với enzyme
Neutrase và xác định phân tử lượng của sản phẩm thủy phân
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân collagen với enzyme
Flavourzyme và xác định phân tử lượng của sản phẩm thủy phân
Thủy phân collagen bởi enzyme Neutrase kết hợp với enzyme Flavourzyme, xác
định khả năng hòa tan và phân tử lượng của collagen hydrolysate.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2012
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/06/2012
V. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS.TS Phan Đình Tuấn

TS. Phan Ngọc Hồ
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)


iii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ
Thuật Hóa Học – Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã hỗ trợ trang thiết bị, máy
móc, vật tư, phịng thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Phan Đình Tuấn và TS. Phan
Ngọc Hịa, người ln gắn bó với khoa học, trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian
thực hiện đề tài. Đồng thời Thầy/Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn
thành tốt luận văn.
Em xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Nguyên đã hỗ trợ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất
cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ thực phẩm.
Em vơ cùng biết ơn ba mẹ, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp
em vượt qua mọi khó khăn để hồn thành tốt khóa học.
Cuối cùng, em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý thầy cô và các bạn lớp cao học
K2010 – Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa kỹ thuật hóa học.

Tp.HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2012
Học viên

Lê Thị Thanh Vân


iv

TĨM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn này nghiên cứu quy trình thu nhận collagen hydrolysate từ collagen
trong da cá tra nhằm mục đích tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ một loại phụ phẩm rẻ tiền
của ngành công nghiệp sản xuất phi lê cá tra xuất khẩu. Luận văn tập trung vào nghiên
cứu quá trình thủy phân collagen từ da cá tra bằng enzyme Neutrase kết hợp với enzyme
Flavourzyme để tạo ra collagen hydrolysate có phân tử lượng thấp, đáp ứng được yêu cầu
ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm.
Nguyên liệu để thủy phân tạo sản phẩm collagen hydrolysate là collagen được
trích ly từ da cá tra với dung dịch acid acetic 0,75M trong 24h ở 40C. Dịch chiết được kết
tủa bằng NaCl 0,9M ở 40C trong 12h, sau đó thẩm tích bằng màng cellophane trong mơi
trường acid acetic 0,1M ở 40C trong 30h. Collagen thô thu được bằng quy trình này có
phân tử lượng từ 115 ÷ 240 kDa.
Để thu được sản phẩm collagen hydrolysate có phân tử lượng thấp, có khả năng
hịa tan tốt trong nước, chúng tôi tiến hành thủy phân collagen thô với hai enzyme
Neutrase và Flavourzyme. Luận văn tập trung nghiên cứu: điều kiện tối ưu của quá trình
thủy phân collagen bởi enzyme Neutrase, enzyme Flavourzyme và sự kết hợp của
enzyme Neutrase với enzyme Flavourzyme.
Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân collagen với enzyme Neutrase để đạt
được mức độ thủy phân 11,02%: nồng độ cơ chất 200 g/L, nồng độ enzyme 39,45 UI/g
protein, nhiệt độ 500C, pH 7,0 và thời gian thủy phân là 3h. Dung dịch collagen sau khi

thủy phân với enzyme Neutrase có phân tử lượng từ 19 ÷ 31 kDa.
Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân collagen với enzyme Flavourzyme để đạt
được mức độ thủy phân 19,12%: nồng độ enzyme 46,8 UI/g protein, pH 6,5 và thời gian
thủy phân là 2h. Dung dịch collagen sau khi thủy phân với enzyme Flavourzyme có phân


v

tử lượng từ 17 ÷ 34 kDa.
Q trình thủy phân collagen bởi enzyme Neutrase kết hợp với enzyme
Flavourzyme được thực hiện ở điều kiện tối ưu của hai enzyme. Collagen hydrolysate thu
được có các phân đoạn peptide từ 6 ÷ 8,5 kDa và có khả năng hịa tan trong nước cao hơn
nhiều so với collagen ban đầu.


vi

MỤC LỤC
TRANG BÌA ....................................................................................................................... i
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ................................................................................. ii
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN ................................................................................................... iv
MỤC LỤC ......................................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................... xi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... xii
ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..............................................................................................3
1.1.

DA CÁ ...................................................................................................................3

1.2.

COLLAGEN ...........................................................................................................3

1.2.1.

Tính chất hóa lý ...............................................................................................3

1.2.2.

Các yếu tố ảnh hưởng đến collagen ................................................................5

1.2.3.

Tính chất chức năng ........................................................................................7

1.3.

COLLAGEN HYDROLYSATE ............................................................................9

1.3.1.

Cơ chế hấp thu collagen hydrolysate trong q trình tiêu hóa .......................9

1.3.2.

Cơ chế thủy phân collagen ............................................................................10

1.3.3.

Hoạt tính sinh học .........................................................................................12

1.3.4.

Nhu cầu và khả năng ứng dụng của fish collagen hydrolysate......................18

1.4.

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN PROTEIN ..............................................21

1.4.1.

Phương pháp hóa học.....................................................................................21

1.4.2.

Phương pháp sinh học ....................................................................................22

1.4.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân .............................................23

1.5.

ENZYME SỬ DỤNG ĐỂ THỦY PHÂN PROTEIN ..........................................24

1.5.1.

Neutrase ........................................................................................................27


vii

1.5.2.

Flavourzyme .................................................................................................28

1.6. CÁC NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN COLLAGEN TỪ THỦY HẢI SẢN ĐÃ
CƠNG BỐ.......................................................................................................................28
1.6.1. Các cơng trình nghiên cứu thủy phân collagen từ thủy hải sản hải trên thế
giới và nước ta hiện nay ..............................................................................................28
1.6.2.

Vấn đề tồn tại và hướng tập trung giải quyết ................................................32

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............34
2.1.

NGUYÊN VẬT LIỆU ..........................................................................................34

2.1.1.

Nguyên liệu ....................................................................................................34

2.1.2.

Hoá chất .........................................................................................................35

2.3. Thiết bị .....................................................................................................................36
2.2.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................37

2.2.1.

Mục đích nghiên cứu .....................................................................................37

2.2.2.

Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................38

2.2.3.

Chuẩn bị nguyên liệu .....................................................................................39

2.2.2.

Thủy phân collagen ........................................................................................41

2.2.3.

Phương pháp phân tích ..................................................................................47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................59
3.1. THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU COLLAGEN .....................................................59
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME ...................................................60
3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn tyrosine .................................................................60
3.2.2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme ...........61

3.3. KẾT QUẢ THỦY PHÂN COLLAGEN .................................................................61
3.3.1. Kết quả thủy phân collagen bởi enzyme Neutrase ............................................61
3.3.2. Kết quả thủy phân collagen bởi enzyme Flavourzyme .....................................73
3.3.3. Kết quả thủy phân collagen kết hợp enzyme Neutrase với enzyme
Flavourzyme ................................................................................................................80
3.4. SO SÁNH HIỆU QUẢ CÁC QUY TRÌNH THỦY PHÂN COLLAGEN .............83


viii

3.4.1. Mức độ thủy phân..............................................................................................83
3.4.2. Phân tử lượng ....................................................................................................84
3.5.

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ TẠO SẢN PHẨM ..........................85

3.5.1. Quy trình cơng nghệ ..........................................................................................85
3.5.2. Thuyết minh quy trình .......................................................................................86
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................88
4.1. KẾT LUẬN..............................................................................................................88
4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................................88
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................89
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................98


ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Collagen trong cơ thể có cấu trúc xoắn ba nhưng khi bị biến tính giống gelatin.

Thủy phân collagen biến tính bằng enzyme tiêu hóa tạo ra collagen peptide, gồm sự lặp
đi lặp lại chuỗi -Gly-X-Y-Gly-X-Y- và được sử dụng trong thực phẩm chức năng .........10
Hình 1.2. Trình tự chuỗi α1, α2 và vị trí phân cắt trong collagen bị, gà và người ...........11
Hình 1.3. CH kích thích q trình tổng hợp collagen và tái tạo sụn ..................................19
Hình 1.4. Tác dụng của endopeptidase và exopetidase lên cấu trúc protein .....................25
Hình 1.5. Thủy phân protein bằng các loại enzyme khác nhau .........................................27
Hình 1.6. Quy trình sản xuất collagen hydrolysate từ da mực...........................................30
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................38
Hình 2.2. Quy trình chuẩn bị collagen ...............................................................................39
Hình 2.3. Đồ thị đường chuẩn hydroxyproline ..................................................................54
Hình 2.4. Máy diện di BIORAD LABORATORY, 041 BR71844 ...................................58
Hình 3.1. Đường chuẩn tyrosine ........................................................................................60
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến DH .................................62
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH .............................................64
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH..............................................66
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến DH ......................................................68
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến DH ............................................70
Hình 3.7. Kết quả phân tích điện di của collagen thô (a) và collagen thủy phân bởi
enzyme Neutrase (b) ..........................................................................................................72
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH .............................................74
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến DH ......................................................76
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến DH ..........................................77
Hình 3.11. Kết quả phân tích điện di collagen thủy phân bởi enzyme Flavourzyme ........78
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn DH theo thời gian ..................................................................80


x

Hình 3.13. Kết quả phân tích điện di collagen thủy phân bởi enzyme Neutrase kết hợp với
enzyme Flavourzyme .........................................................................................................81

Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn DH theo thời gian của ba phương pháp thủy phân ...............83
Hình 3.15. Kết quả phân tích điện di. ................................................................................84
Hình 3.16. Quy trình thu nhận collagen hydrolysate từ da cá tra ......................................86


xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các peptide chống oxy hóa có nguồn gốc từ collagen ......................................14
Bảng 1.2. Các peptide ức chế cao huyết áp có nguồn gốc từ collagen .............................17
Bảng 2.1. Điều kiện thích hợp của các enzyme thủy phân ................................................34
Bảng 2.2. Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu......................................................35
Bảng 2.3. Độ hấp thu của hydroxyproline chuẩn ở bước sóng 557 nm .............................53
Bảng 2.4. Dãy nồng độ dung dịch chuẩn tyrosine .............................................................55
Bảng 3.1. Thành phần nguyên liệu collagen ......................................................................59
Bảng 3.2. Kết quả xác định đường chuẩn tyrosine ............................................................60
Bảng 3.3. Kết quả xác định hoạt tính của các enzyme.......................................................61
Bảng 3.4. Kết quả xác định DH theo nồng độ cơ chất .......................................................61
Bảng 3.5. Kết quả xác định DH theo nồng độ enzyme ......................................................64
Bảng 3.6. Kết quả xác định DH theo nhiệt độ thủy phân ..................................................66
Bảng 3.7. Kết quả xác định DH theo pH ...........................................................................68
Bảng 3.8. Kết quả xác định DH theo thời gian ..................................................................69
Bảng 3.9. Kết quả xác định DH theo tỷ lệ E/S...................................................................73
Bảng 3.10. Kết quả xác định DH theo pH .........................................................................75
Bảng 3.11. Kết quả xác định DH theo thời gian thủy phân ...............................................76
Bảng 3.12. Kết quả xác định DH theo thời gian thủy phân khi kết hợp hai enzyme .........80
Bảng 3.13. Kết quả xác định DH theo thời gian thủy phân của các phương pháp thủy
phân collagen khác nhau ....................................................................................................83

xii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACE

Angiotensin Converting Enzyme

CH

Collagen hydrolysate

DH

Degree of Hydrolysis

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

E/S

Enzyme/cơ chất

HYP

Hydroxyproline

SHR

Spontaneously hypertensive rats


1

ĐẶT
T VẤN
V N ĐỀ
Collagen là một loại protein, đóng vai trị then chốt trong thành phần cấu tạo
của mơ liên kết như da, xương, dây chằng… Collagen không những được ứng dụng
trong ngành mỹ phẩm với tác dụng duy trì sự trẻ trung mà nó cịn được dùng trong
các lĩnh vực khác như dược phẩm, thực phẩm. Hiện nay, nguồn nguyên liệu để sản
xuất collagen chủ yếu là từ da của động vật và các phụ phẩm cá như da, xương,
vây…
Việt Nam là một nước đang phát triển rất mạnh về ngành thủy sản, đặc biệt
là cá tra và cá basa với giá trị xuất khẩu cao. Năm 2010, xuất khẩu cá tra ở nước ta
đạt 1,4 tỷ USD với khối lượng các mặt hàng xuất khẩu đạt trên 600.000 tấn. Lượng
phụ phẩm trong quá trình chế biến cá rất lớn với định mức 2,6 kg nguyên liệu cho
ra 1 kg thành phẩm. Tính ra lượng phụ phẩm (như: đầu xương, da …) trong năm
2010 là 960.000 tấn. Như vậy, 600.000 tấn cá tra phi lê thì sẽ có khoảng 85.000 ÷
100.000 tấn da cá được thải ra. Phần phụ phẩm này chủ yếu được dùng chế biến làm
thức ăn gia súc và phân bón nhưng giá trị kinh tế rất thấp. Trong khi đó, collagen và
collagen hydrolysate được trích ly từ da cá lại là sản phẩm có giá trị cao, được ưa
chuộng trên thị trường thế giới nhờ những ưu điểm vượt trội của chúng. Đặc biệt,
một số collagen hydrolysate cịn có hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa,
kháng khuẩn, ức chế cao huyết áp… nên được sử dụng nhiều trong thực phẩm chức
năng hoặc thực phẩm dành cho những đối tượng đặc biệt.
Gần đây, các nhà nghiên cứu ở nước ta đã quan đến tách chiết và thủy phân
collagen từ da cá tra và đạt được những kết quả khả quan. Trong luận văn này,

chúng tôi xác định mục tiêu nghiên cứu là tạo ra sản phẩm collagen hydrolysate
thích hợp để bổ sung vào thực phẩm. Để đạt được mục tiêu này, sản phẩm phải có
phân tử lượng trung bình nhỏ hơn 10 kDa, phù hợp với đặc thù của thực phẩm là
tính an tồn và tính chất cảm quan đáp ứng u cầu người sử dụng. Với tiêu chí
trên, chúng tơi đề xuất quy trình thủy phân collagen trích ly từ da cá tra với xúc tác
sinh học là enzyme Neutrase và Flavourzyme.
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


2

Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tập trung thực hiện các nội dung sau:
-

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân collagen bởi
enzyme Neutrase và xác định phân tử lượng của sản phẩm thủy phân.

-

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân collagen bởi
enzyme Flavourzyme và xác định phân tử lượng của sản phẩm thủy phân.

-

Thủy phân collagen bởi enzyme Neutrase kết hợp với enzyme
Flavourzyme, xác định phân tử lượng và khả năng hòa tan của sản phẩm

thủy phân.

HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


3

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN
1.1. DA CÁ
Theo năm 2010, xuất khẩu cá tra ở nước ta đạt 1,4 tỷ USD với khối lượng
các mặt hàng xuất khẩu đạt trên 600.000 tấn.
Lượng phụ phẩm trong quá trình chế biến cá rất lớn với định mức 2,6 kg
nguyên liệu cho ra 1 kg thành phẩm. Tính ra lượng phụ phẩm (như: đầu, xương,
da…) trong năm 2010 là 960.000 tấn. Như vậy, 600.000 tấn cá tra phi lê thì sẽ có
khoảng 85.000 ÷ 100.000 tấn da cá được thải ra [72].
Theo các tác giả trước, hàm lượng collagen trong da cá tra là 73% chất khô
[1]. Vậy, da cá tra là một nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận collagen.
1.2. COLLAGEN
1.2.1. Tính chất hóa lý [22, 43]
Collagen là một loại protein cấu trúc chính vì vậy chúng cũng có đầy đủ các
tính chất lý hóa của một protein như sự biến tính, tính kỵ nước, khả năng kết tủa
thuận nghịch, khơng thuận nghịch, tính hydrat hóa, tính chất của dung dịch keo...
Ngồi ra, nó cịn có một số tính chất khác đặc trưng cho collagen như:
Khả năng trương nở:

Collagen khơng hịa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g
collagen khơ có thể hút được khoảng 200g nước, trong đó khoảng 70g là nước liên
kết và 20g là liên kết vững chắc. Collagen kết hợp với nước nở ra, độ dày tăng lên
chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen
tăng lên 2 ÷ 3 lần.
Do nước phân cực nên sẽ tác dụng lên liên kết hydro trong collagen, làm
giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 ÷ 4 lần. Khi nhiệt độ tăng cao, mạch
polypeptide sẽ bị yếu đi và bắt đầu đứt thành những mạch nhỏ hơn. Nếu nhiệt độ
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


4

tăng đến 60 ÷ 650C, collagen sẽ bị phân giải. Đây là những đặc điểm cần lưu ý
trong quá trình xử lý thu nhận collagen.
Sự gia tăng độ trương nở dưới tác động của acid là kết quả của sự giảm nồng
độ ion H+ tác động đến các anion acid, và tác động của bazơ gây ra bởi nồng độ
nhóm OH- giảm ảnh hưởng đến các cation bazơ.
Khả năng tạo nhũ tương:
Là một protein khơng tan, collagen có thể có ít dấu hiệu cho thấy là một chất
nhũ hóa. Tuy nhiên, collagen có nguồn gốc từ da sống được xử lý và biến tính ở
mức độ khác nhau nên có thể là một chất nhũ hóa tốt hơn sữa gầy.
Khả năng hòa tan:
Collagen tan trong glycerin, acid acetic, ure nhưng không tan trong nước
lạnh. Collagen được phân chia thành bốn lớp trên cơ sở tính hịa tan trong các dung
dịch đệm khác nhau: tan trong muối trung tính, tan trong acid, tan trong kiềm, và

không tan trong kiềm.
Phân tử collagen chứa cả nhóm amin và carboxyl nên collagen có tính chất
lưỡng tính, có thể tác dụng với acid lẫn kiềm.
Trong mơi trường acid và kiềm, collagen có khả năng hút nước cao hơn
trong nước nguyên chất do tác dụng của nước với các nhóm mang điện.
Dưới tác dụng của các acid và kiềm đủ mạnh collagen sẽ bị biến đổi, đây là
một biến đổi quan trọng trong quá trình thu nhận sản phẩm collagen. Acid và kiềm
sẽ cắt đứt các liên kết –NH3+...COO- làm đứt mạch peptide, phá vỡ các liên kết
hydro, phân hủy acid amin, giải phóng amoniac. Tác dụng thủy phân của acid và
kiềm tăng khi nhiệt độ mơi trường tăng. Do đó, trong q trình thu nhận collagen
cần phải khống chế nhiệt độ và thời gian thích hợp để đảm bảo chất lượng của thành
phẩm.

HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


5

Các thành phần tan trong acid thường bao gồm hai nhóm: một là nhóm β2
hoặc β11 gồm hai chuỗi α1, và hai là nhóm β1 hoặc β12 gồm một chuỗi α1 và một
chuỗi α2 liên kết bởi liên kết cộng hóa trị kiểu este. Collgagen hịa tan trong muối
bao gồm 90% các chuỗi α và 10% các chuỗi dạng β, trong khi collagen hòa tan
trong acid là khoảng 10% chuỗi α và 90% ở dạng β. Chỉ có 50% nhóm ion của
collagen hồ tan trong acid có trong collagen hịa tan trong muối. Các nhóm cịn lại
có thể tham gia vào mối liên kết chéo.
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến collagen [32, 43, 48, 66]

Ảnh hưởng của khơng khí
Ở các độ tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong ống nghiệm, khơng khí
có một vai trị quan trọng trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel và
Hansen, 1989). Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein.
Ảnh hưởng của acid và kiềm
Ảnh hưởng của acid:
Acid acetic có thể làm collagen trương nở 50% và tăng khả năng peptid hóa
collagen hơn HCl ở pH 2,0. Điều đó chứng tỏ rằng acid yếu (ví dụ như acid acetic)
cho phép phóng thích các proton từ nhóm cacboxyl của collagen.
Sự ảnh hưởng của HCl tới collagen: một số cation H+ kết hợp với anion –
COO-. Quá trình này tiếp tục cho đến khi tất cả nhóm –COO- đã được phóng điện
và tất cả nhóm cation đều ở dạng tự do. Vì vậy, pha nước bên trong cấu trúc
collagen sẽ chứa nhiều Cl- hơn H+. Sự phân phối ion khác nhau giữa hai pha tạo ra
sự khác nhau về áp suất thẩm thấu và khả năng tích điện. Để tạo trạng thái cân bằng
nồng độ ion giữa hai pha, nước đi vào các phân tử collagen và gây ra sự trương nở.
Ảnh hưởng của kiềm:
Trong môi trường bazơ mạnh (như NaOH) khả năng trương nở của collagen
gia tăng, đặc biệt là các hydroxyde của ion kim loại hóa trị hai ở pH > 10, ở pH này
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


6

có sự chuyển hóa khơng thuận nghịch thành các ion. Sự phân hủy nhóm hydroxy
của các acid amin (serin và threonine) và sự thủy phân của liên kết keto - imide giữa
proline và hydroxyproline xảy ra trong suốt quá trình xử lý collagen bằng kiềm ở

pH 12 ÷ 14.
Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen. Collagen phân giải biến thành
gelatine, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau:

Nếu xử lý ở nhiệt độ cao trong nước, gelatine sẽ dễ dàng thủy phân tiếp
thành:

Từ đó thấy rằng trong q trình trích ly collagen cần thiết phải khống chế
nhiệt độ và thời gian thích hợp để đảm bảo chất lượng của collagen.
Ảnh hưởng của nhiệt độ:
• Ở nhiệt độ thấp:
Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đối với collagen tương tự như khả năng trương
nở của collagen trong nước.
• Ở nhiệt độ cao:
Nhiệt độ là nguyên nhân làm cho một số protein trong collagen bị biến tính.
Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho
mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tương đối nhỏ. Trong
khoảng nhiệt độ 60 ÷ 65oC, collagen hút nước bị phân giải và nếu tiếp tục đun
collagen sẽ bị thủy phân thành gelatin. Độ bền nhiệt được xem là tỷ lệ thuận với
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


7

tổng lượng proline và hydroxyproline, collagen càng bền nhiệt khi lượng proline và
hydroxyproline càng nhiều.

Các chất khác:
Collagen trong dung dịch muối trung tính cùng với gốc –COOH và –NH2 tạo
thành các hợp chất muối. Tác dụng phân giải collagen của NaCl so với Na2SO4
mạnh hơn (độ điện ly của NaCl lớn hơn).
Muối trung tính ở nồng độ vừa phải (1M) ngăn cản sự trương nở, ở nồng độ
cao sẽ hiệu quả hơn. Các anion nhìn chung làm gia tăng độ trương nở hiệu quả hơn
các cation. Dịch collagen khi thêm cồn, aceton hoặc heparin thì sợi collagen dày lên
và kết tủa lại.
Collagen bị thuỷ phân chậm bởi trypsin và pepsin, trong khi đó gelatin dễ bị
phân huỷ hơn. Nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng tác dụng của trypsin
đối với collagen đã xử lý (như đun nóng, ngâm acid, kiềm, muối, tác dụng của
pepsin, tác dụng cơ học…) thì nó có tác dụng phân giải, với điều kiện thích hợp
nhất là nhiệt độ 37oC, pH = 8,1 ÷ 8,2.
1.2.3. Tính chất chức năng [21, 71]
Ngồi tính chất hydrat hóa cơ bản, như khả năng trương nở và khả năng hịa
tan, tính chất quan trọng nhất của collagen/gelatin có thể được chia thành 2 nhóm:
tính chất gel (sự tạo gel, tạo kết cấu, làm dầy và khả năng liên kết với nước) và tính
chất bề mặt (tính nhũ hóa, tính tạo bọt và bền bọt, tính kết dính, tính keo và khả
năng tạo màng).
Tính chất tạo gel và liên kết với nước
Sự tạo gel, độ nhớt và kết cấu là các tính chất được xác định chủ yếu dựa vào
cấu trúc, phân tử lượng và nhiệt độ của hệ.
Trong quá trình tạo gel hóa collagen, q trình tập hợp phân tử collagen và
tạo sợi diễn ra do sự thay đổi lực ion, pH và nhiệt độ, chủ yếu là phân tử collagen có
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ

8

cấu trúc bậc 2 và bậc 3. Sau đó, sự tập hợp bắt đầu với các tiểu đơn vị cho đến khi
đạt cân bằng. Quá trình tự sắp xếp collagen loại I của động vật có xương sống xảy
ra khi nhiệt độ gel hóa tăng từ 20 đến 280C.
Cơ chế tạo gel liên quan đến sự thay đổi cấu trúc xoắn ốc khi dung dịch
collagen bị làm lạnh dưới 300C. Q trình gel hóa của collagen là q trình thuận
nghịch nhiệt.
Tính chất bề mặt
Tính chất bề mặt của collagen/gelatin dựa vào sự có mặt của các nhóm tích
điện trong chuỗi protein và trong collagen vừa có acid amin ưa nước và kỵ nước. Cả
phần ưa nước và kỵ nước có xu hướng di chuyển về phía bề mặt, do đó làm giảm
sức căng bề mặt dung dịch, tạo thành màng tích điện bao xung quanh pha phân tán
và được tăng cường bổ sung bởi sự tạo gel.
Gelatin và collagen hòa tan có tính chất tạo bọt, thậm chí khơng tạo gel, bởi
vì chúng làm giảm sức căng bề mặt ở bề mặt lỏng/khí bằng cách tăng độ nhớt của
pha nhiều nước. Tính chất tạo bọt phụ thuộc đáng kể vào đặc tính của nguyên liệu.
Khi phân tử protein chứa vùng kỵ nước bị lộ ra ngoài, sẽ xảy ra sự hấp phụ ở bề mặt
khơng khí-nước và thuận lợi cho q trình tạo bọt, bền bọt.
Tính chất tạo màng
Gelatin được nghiên cứu rộng rãi về khả năng tạo màng và được sử dụng
như một màng bao bên ngoài để bảo vệ thực phẩm không bị khô khi tiếp xúc với
ánh sáng và oxy. Hơn nữa, xu hướng thế giới hiện nay là sử dụng màng bao có khả
năng phân hủy sinh học làm từ các polymer sinh học có thể ăn được từ nguồn phụ
phẩm để chống lại tác động mơi trường của chất thải nhựa.
Tính chất tạo màng của gelatin từ nguồn cá, được quan tâm gần đây bởi
Gómez-Guillén và cộng sự (2009). Sự phân bố phân tử lượng và thành phần acid
amin là yếu tố chính ảnh hưởng đến tính chất vật lý và cấu trúc của màng gelatin,
đóng vai trị then chốt trong tính chất cơ học và rào cản bảo vệ của màng bao. Màng

HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HOÀ


9

bao chứa phần lớn các phân đoạn có phân tử lượng thấp sẽ kém bền và dễ bị biến
dạng trong q trình chế biến gelatin. Sự biến tính protein xảy ra khi collagen bị xử
lý nhiệt và tạo thành gelatin.
1.3.

COLLAGEN HYDROLYSATE

1.3.1. Cơ chế hấp thu collagen hydrolysate trong quá trình tiêu hóa [21, 30,
46]
Collagen hydrolysate (CH) là collagen bị thủy phân từ xương, gân hoặc da
của các loại động vật hữu nhũ cũng như các loại thủy hải sản. CH là một hợp chất
polypeptide được ứng dụng trong mỹ phẩm, dược phẩm, thực phẩm chức năng và
phụ gia thực phẩm.
Các protein ngun thủy thường có cấu trúc khơng gian ba chiều, sẽ ảnh
hưởng đến tính chất chức năng. CH là các peptide nhỏ, cấu trúc phân tử ngẫu nhiên
hơn và ít xuất hiện cấu trúc bậc ba. Đối với cấu trúc bậc hai của protein, xoắn α và
xếp gấp β là quan trọng nhất. Các peptide nói chung khơng có độ dài thích hợp và
các cầu nối hydro để ổn định cấu trúc xoắn. Trong quá trình thủy phân protein, vùng
kỵ nước thường được giấu vào bên trong, cấu trúc xoắn sẽ lộ ra bên ngoài dẫn đến
kết quả là tính chất của protein thủy phân rất khác so với nguyên thủy. Do đó
collagen sau khi thủy phân sẽ thay đổi các tính chất chức năng.

Trong q trình tiêu hóa, chuỗi amino acid của CH bị phá vỡ trong quá trình
tiêu hóa bởi enzyme và acid. Từng amino acid được hấp thu qua thành ruột non và
đi vào máu đến gan. Từ đây, chúng được chuyển đến các vị trí cần thiết cho hầu hết
sự tăng trưởng hoặc sửa chữa mô.
Hơn 90% CH tiêu thụ qua đường miệng được hấp thu nhanh chóng bởi
đường ruột và xuất hiện trong huyết tương, có tính khả dụng sinh học cao. CH
khơng bị phá vỡ hồn tồn trong hệ tiêu hóa, nhưng một số phân đoạn peptide có
phân tử lượng từ 1 ÷ 10 kDa được hấp thu sau khi uống CH. Các nghiên cứu bổ
sung cho thấy rằng một lượng lớn collagen peptide được phát hiện trong da và mô
sụn sau khi uống CH, cho thấy sự tích tụ của các peptide này trong mô liên kết.
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


10

Hình 1.1. Collagen trong cơ thể có cấu trúc xoắn ba nhưng khi bị biến tính giống
gelatin. Thủy phân collagen biến tính bằng enzyme tiêu hóa tạo ra collagen peptide,
gồm sự lặp đi lặp lại chuỗi -Gly-X-Y-Gly-X-Y- và được sử dụng trong thực phẩm
chức năng.
1.3.2. Cơ chế thủy phân collagen [14, 49, 50]
Collagen có cấu trúc xoắn ba lặp đi lặp lại trình tự chuỗi tripeptide Gly-X1X2, với Gly là glycine, và X1 và X2 có thể là bất kỳ acid amin nào. Trong đó,
Glycine hướng trực tiếp về trung tâm xoắn ba, cịn X1 và X2 hướng ra ngồi, có
nghĩa là phần lớn chuỗi collagen tiếp xúc với dung môi, kể cả dung môi kỵ nước.
Sợi collagen bị thủy phân bởi enzyme được gọi là collagenase. Collagenase
chỉ thủy phân ở một vị trí duy nhất đặc trưng trong chuỗi tripeptide G-[I/L]-[A/L],
nằm khoảng 3/4 từ đầu N của protein. Có nhiều triplet trong mỗi phân tử collagen:

có 3 vị trí phân cắt trong chuỗi α1 của collagen loại I; 5 vị trí phân cắt trong chuỗi
α2 của collagen loại I; 6 vị trí phân cắt trong collagen loại II và 5 vị trí phân cắt
trong collagen loại III. Một trong những mục đích chính trong việc khám phá cơ
chế thủy phân collagen để hiểu tính đặc hiệu của vị trí phân cắt collagenase, hoặc
nói cách khác, tại sao chỉ có một vị trí bị phân cắt trong khi có nhiều vị trí phân cắt
tiềm năng.

HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


11

Hình 1.2. Trình tự chuỗi α1, α2 và vị trí phân cắt của collagen bò, gà và người [50]
Sợi collagen bị phân giải trong cơ thể sống bởi họ enzyme chứa Zn2+- và
Ca2+- được gọi là collagenase, thuộc họ matrix metalloproteinase (MMP). Hiện nay
có 23 loại thuộc họ MMP. Các enzyme này có trình tự vị trí hoạt động đồng nhất
(HExxHxxGxxH) trong đó ion Zn2+ xúc tác kết hợp ba histidine và một glutamate
để thủy phân liên kết peptide.
Collagenase tấn cơng các vị trí phân cắt bằng cách tháo collagen xoắn ba
trước khi phân cắt liên kết peptide (Overall 2002, Chung và cộng sự 2004).
Collagenase không chỉ thủy phân các liên kết có thể phân cắt trong collagen, mà
cịn thực hiện chức năng tháo xoắn, tháo cấu trúc xoắn ba của collagen. Do đó,
collagenase phải tháo xoắn collagen xoắn ba trước khi thủy phân collagen.
Mặc dù các nghiên cứu thử nghiệm cho rằng vấn đề tháo xoắn một phần
collagen không xảy ra tự nhiên, nhưng các nghiên cứu khác thấy rằng collagen
khơng bền ở vùng lân cận của vị trí phân cắt và collagenase có thể tháo xoắn một

phần. Do đó, collagen có thể tháo xoắn một phần trong vùng lân cận của vị trí phân
cắt bởi collagenase. Tiếp theo, sự thủy phân collagen xảy ra khi collagenase liên
kết, ổn định và phân cắt phần được tháo xoắn một phần này. Việc mô phỏng động
học của các peptide giống collagen thấy rằng collagen phù hợp với hai kiểu cấu tạo
khác nhau gần liên kết có thể phân cắt (Stultz, 2002). Một ứng với cấu trúc xoắn ba,

HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ


12

và một ứng với phần được tháo xoắn một phần. Sau đó, các tác giả thấy rằng cấu
trúc collagen ứng với cấu trúc này, tương đối dễ bị tấn công khi thủy phân collagen.
1.3.3. Hoạt tính sinh học [21, 42]
Protein thực phẩm là nguồn peptide có hoạt tính sinh học, nhưng ở dạng
protein gốc khơng thể hiện hoạt tính sinh học. Trong q trình tiêu hóa ở dạ dày,
chế biến hoặc lên men thực phẩm, chúng được phân giải thành các peptide có hoạt
tính sinh học và ảnh hưởng đến nhiều chức năng sinh lý của cơ thể. Nguyên liệu
collagen từ ngành công nghiệp chế biến gia cầm và phụ phẩm thủy hải sản là nguồn
sản phẩm thủy phân và peptide có giá trị với các hoạt tính sinh học. Những nguyên
liệu để thu nhận collagen này bao gồm da, vây, xương và vảy. Ngồi ra, các peptide
có hoạt tính sinh học quan trọng từ collagen và gelatin còn được tách chiết từ các
nguồn khác như sứa, ếch hoặc hải sâm.
Hầu hết các nghiên cứu về các peptide có nguồn gốc từ collagen và gelatin
peptide trong lĩnh vực khoa học và cơng nghệ thực phẩm liên quan đến hoạt tính
chống oxy hóa và ức chế chống cao huyết áp. Các peptide này lặp đi lặp lại trình tự

chuỗi Gly-Pro-Hyp, và tính chống oxy hóa, chống cao huyết áp liên quan đến thành
phần acid amin này (Kim & Mendis, 2006). Hơn nữa, các peptide có nguồn gốc từ
collagen và gelatin cịn thể hiện nhiều hoạt tính sinh học khác như: hoạt tính kháng
khuẩn, khả năng chelat với khống, tác dụng hạ lipid máu, hoạt tính điều hịa miễn
dịch và tác dụng có lợi cho da, xương hoặc đau khớp. Các hoạt tính sinh học chính
của collagen hydrolysate gồm:
Tính chất kháng khuẩn [18, 21, 54]
Gómez-Guillén và cộng sự (2010) đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn
trong các phân đoạn peptide từ gelatin da cá ngừ và mực ống trong phạm vi 1÷10
kDa và <1 kDa. Sản phẩm thủy phân được kiểm tra bằng cách sử dụng thử nghiệm
khuếch tán agar chống lại 18 chủng vi khuẩn (cả vi khuẩn gram dương và gram
âm). Việc giảm phân tử lượng của các phân đoạn peptide làm cho các acid amin
tiếp xúc và tích điện tốt hơn với màng tế bào vi khuẩn.
HVTH: LÊ THỊ THANH VÂN
MSHV: 10110207

CBHD: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN
TS. PHAN NGỌC HỒ