Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Nested RT-PCR trong chẩn đoán nhiễm Rubella trước sinh

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ỉ. Hoàng văn Ngọc. Nghiên cứa thực trạng bệnh thalassemia và một số yếu tố liên quan ở trẻ em dân tộc Tày và
Dao tại huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Y học. 2007.

2. Nguyễn Công Khanh. Một số đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh p Thalassemia ở người Việt Nam. Luận án
Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Đại học Y Hà Nội. 1985.

3. Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phư ng Mai, Nguyễn Tân Sinh, Dư ng Bá Trực, Bùi Văn Viện,
Nguyễn Thanh Liêm, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh alpha Thalassemia tại
Bệnh viên Nhi TW.Tạp chí Nhi khoa, tập 3, số 3,4 tháng 10/2010, tr.337­342.

4. Chui DH, Way JS. Hydrops fetal is caused by aỉpha­thalassemia: an emerging health care problem. Blood.1998, 91,
pp.2213­2222

5. Di ss roth A. t al Hemoglobin synthesis in somatic cell hybrid: independent segregation of the human alpha and
beta globin gene. Science 191,1976, p.1262.

6. Potrakul s. t al. Incidence of a Thalassemia in Bangkok. J.Med. Assoc, Thailan 1970,53, pp.250.

8. Told D.Lai MCS, Braga C.A, ISoo N.H. Alpha thalassemia in Chinese cord blood studies. Br J.Haematoi. 1969, 16,
pp.551­556.

9. Embury S.H. t a t Organization of the a globin gen in the chines a thalassemia syndromes. J.Clin.Inv sX. 1979,63.

NGHIÊN c ứ u ỨNG D NG KỸ THUẬT NESTED RT-PCR

TRONG CHÂN ĐOÁN NHIỄM RUBELLA TRƯỚC SINH

BS. Đặng Tiến Trường*; s v . Lê Hịa n*
s v . Nguyễn V ìấ Hiếu* BS. Nguyễn Thị Hà*
Ht âng dẫn; PGS. TS Nguyễn Duy Bắc*

T Ó M T Ẳ T

Sốtphátban RubellađovirutRubellagâynên, bệnh thường nhẹ, ít biến chứng.

Tại Việt Nam, chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phòng nhiễm Rubella; nhiều thai phụ nhiễm Rubella phài đ nh
chỉ thai nghén mà không rõ thai nhi có nhiễm Rubella khơng?. Việt Nam chưa có phương pháp chẩn đốn trước sinh CRĨ
đạt được các tiêu chí chính xác, sớm, rè, đòi hỏi phương tiện đơn giản. V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:

­ Hồn thiện quy trìnhphát hiện nhiễm virutRub llabằng kỹ thuậtnestedRT-PCR.

- Áp dạng kỹ thuật n st d RT-PCR trong chẩn đốn nhiễm virut Rub lla trước sình ở nh m đối tượng cổ nguy
c cao.

Đổi tượng và phương pháp nghiên cún:

60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella. 60 mẫu tác nhân khác gây các triệu chứng phát ban. 41 thai phụ được chẩn đoán
nhiễm virut Rubella bằng kỹ thuật huyết thanh học.

Phương pháp nghiên cứu:
­ Tách chiết ARN và ADN.

­ Tối ưu hóa phản ứng Nested RT­PCR: tối ưu hóa thành phần và chu tr nh nhiệt của phản ứng. Sau khi nhân ADN
đích, điện đi sản phầm ADN trên agarose gel 2% và phân tích kểt quả.

­ Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật: xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật, chẩn đoán trên 60 mẫu ARN của
virutRubella và 60 mẫu không nhiễm phải virut Rubella, tính độ nhạyvà độ đặc hiệu.

+ Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật: tiến hành chẩn đoán ưên các mẫu ARN pha loăng.
+ Giải tr nh tự sản phẩn phản ứng nested RT­PCR để xác định sản phẩm gen virutRubella.
­ Áp dụng kỹ thuật nested RT­PCR trong chẩn đoán trước sinh.

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

Kết quả nghiên cứu:

­ Tối ưu hóaphản ứng nested RT­PCR: đãtơi ưu hóa thành phần và chu tr nh nhiệtcùaphản ứng nested RT­PCR.

­ Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật: kỹ thuật xác định đương tính vói 60 mẫu virut Rubella và âm tính
vói 60 mẫu khác. Độ nhạy của kỹ thuật 100%; độ đặc hiệu của kỹ thuật 100%, khơng có phản ứng chéo với các loại
virat khác gây ưiệu chứng phát ban như Rubella.

­ Xác định được ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT­PCR là 10*6ng/fjl.

­ Kểt quà giải tr nh tự, Blast trên ngân hàng gen cho thấy, tr nh tự gen này của virut Rubella.

Trong 41 mẫu dịch ổi tiến hành xé£ nghiệm, 15/41 mẫu cho kết quả đương tính, 26/41 mẫu âm tính. Kết quả này tương
đồng với kết quàreal time­PCR và phù hợp vói kết quả xét nghiệmIgM máu cuống rốn của thai nhi khi đ nh chỉ thai nghén.

Kết luận và kiến nghị:

­ Đã tối ưu hóa quy tr nh kỹ thuật nested RT­PCR trong chẩn đoán nhiễm virat Rubella trước sinh với độ chính xác
cao. Kết q chẩn đốn trước sinh tương đồng với kết quả real time PCR và xét nghiệm IgM máu cuống rốn khi đ nh
chỉ chỉ thai nghén.

­ Kỹ thuật nested RT­PCR đơn giàn, giá thành thấp, chính xác, nên được triển khai áp dụng rộng rãi ở các bệnh viện vàcơ sở
xétnghiệm, giúp giảm số trẻmác CRS, giảm gánh nặng cho giađ nh và xã hội.

*Từ khóa: Virut Rubella; Nested RT­PCR.

Application o fn st d RT-PC R t chniqu m diagnosis o fpr natal rub lla vừĩis
Summary

Rubella typhus caused by Rubella virus, the disease is usually mild, less complications. However, pregnant women
infected with Rubella in the first trimester, 80 ­ 100 of fectus infected congenital Rubella infection ­ CRI and over 65%
of cases of congenital rubella syndrome ­ CRS. CRS has the following expression: mental retardation, congenita
deafness, cataracts, cardiovascular system defects...

In Vietnam, there is not a national immunization program of Rubella prevention. Now, there is no method for
prenatal diagnosis of CRI with precise, early, cheap and simple. So, we conducted subject to the following objectives:
establish of nested RT­PCR techniques for detection of rubella virus; application of nested RT­PCR technique in the
diagnosis of prenatal rubella virus infection in high­risk subjects.

Materials and method:

­ 60 samples infected with Rubella virus, technical diagnosed fay real time PCR and vims isolation. 60 samples
contaminated with bacteria and other viruses cause symptoms such as Rubella rash.

­ 41 women infected with rubella virus by serological techniques.
Method: Extraction of RNA and DNA.

­ Optimization of nested RT­PCR reactions

­ DNA products was electrophoresis on agarose gel 2% and analyze the results. DNA products of the reaction of the
nested RT­PCR is theoretically 143 bp

­ Evaluation of accuracy: using nested RT­PCR technique in the diagnosis of 60 RNA Rubella samples and 60 samples
contain other virus, 2 x 2 tabulation to calculate sensitivity and specificity of technique; dilution series of RNA Rubellavirus
from 100 ng/ịil to 10­8ng/jxl, for determine the detection threshold. DNA product was sequenced to comfum isolation from
rubellavirus.

­ Application of nested RT­PCR technique in the diagnosis of prenatal rubella virus: diagnosis on 41 samples of
amnioticfluid ofpregnant women infected with rubella in the first trimester.

Results:

AccomplishmentofnestedRT­PCR technique in the diagnosis ofrubellavirus.
Optimization ofRT­PCR and nested PCR.

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

Evaluation of accuracy: The sensitivity and specificity were 100%; no cross­reactivity with other viruses. Nested
RT­PCR technique can detect samples containing concentrations at lo^ng/jil, corresponding to 0.001 pg/fjl which
suggests that the level of detection of nested RT­PCR technique is very low. Results of sequencing, gene banks Blast
show that gene sequence were rubella virus.

Application of nested RT­PCR technique in the diagnosis of prenatal Rubella virus: In 41 amniotic fluid samples
the tests conducted 15/41 positive samples, 26/41 negative samples. The result was consistent with the results of real
iime­PCR and in accordance with IgM test results of fetal cord blood after abortion. Nested RT­PCR is a rapid
diagnostic method, with high sensitivity and specificity, able to detect RNA of rubella in many different types of
samples. Nested RT­PCR was more advantage than that of virus isolation methods for time, less complex requires
simpler equipment.

Condution:

~ Fully optimized nested RT­PCR technique in diagnosis of prenatal rubella virus infection with high accuracy
Prenatal diagnosis similarities to real time PCR results and cord blood IgM test after abortion.

­ Nested RT­PCR technique, was simple, low cost, accurate, should be deployed widely used in hospital and laboratory
facility, which helps reduce the number of children with CRS, reduce the burden on family and society Assembly.

* Key words: Rubella virus; Nested RT­PCR.
L Đ Ặ T V Ẳ N Đ

Sốt phát ban Rubella hay “sởi Đức” do virut Rubella gây nên, đặc trưng bời sốt, nổi ban và tổn thương

hạch bạch huyết [ỉ, 9]. Bệnh thường nhẹ, ít biển chứng. Tuy nhiên, phụ nữ mang thai nhiễm Rubella có thể
gặp nhiều biến chứng như: sảy thai, thai chết lưu, dị tật thai nhi... Thai phụ mang thai nhiễm Rubella, thai
nhi có nguy cơ bị nhiễm Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella Infection ­ CRĨ) và bị hội chứng Rubella bẩm
sinh (Congenital Rubella Syndrome ­ CRS). Người mẹ bị nhiễm Rubella trong 3 tháng đầu của thai kỳ 80­
100% thai nhi bị CRI và trên 65% mắc CRS (Congential Rubella Syndromes ­ CRS). CRS có những biểu
hiện chính như: Chậm phát triển trí tuệ, điéc bẩm sinh, đục thủy tinh thể, dị tật hệ thống tim mạch... Những
đị tật này gây nhiều vấn đề về sức khỏe và xã hội cần phải giải quyết. Theo thông báo của Tổ chức Y tế The
giới, trên tồn cầu có khoảng 800.000 người mắc Rubella mỗi năm và tỷ ỉệ mắc CRS hàng năm là 0 6­
2,2/1000 trẻ sổng. Thực íế, con số này cịn lớn hơn nhiều [3, 5, 9].

Tại Việt Nam, hiện chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phòng nhiễm Rubella; năm 2011, dịch Rubella
có xu hưởng lan rộng, số lượng ca phải dinh chỉ thai nghén đo thai phụ nhiễm Rubella tăng lên rất nhanh mặc đ i
chưa xác định được thai nhi có nhiễm Rubella hay khơng?. Theo Hồng Thị Thanh Thủy (2012), trong 6 tháng
đầu năm 2011, chỉ tính riêng ở Bệnh viện Phụ sản TW có tới 914 ca phải đ nh chỉ t iai nghén do thai phụ nhiễm
Rubella; trong đó, 285 thai phụ xin đ nh chỉ thai nghén mặc dù khơng có chỉ định [1].

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có phương pháp chẩn đốn trước sinh CRI đạt tiêu chí chính xác, sớm rẻ địi
hỏi phương tiện đơn giản. Chẩn đốn bằng huyết thanh học và lấy máu cuống rốn muộn, độ chính xác hạn
chê. Chẳn đoán bằng real time PCR cần phương tiện và hóa chất đắt tiền, nên giá thành cao. Trong các vụ
địch vừa qua, số ca phải đ nh chỉ thai nghén nhiều, mặc dù chưa có kết quả xét nghiệm xác định có bị CRI
hay khơng?. Để giải quyểt những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
Nested RT ­ PCR trong chẩn đoán nhiễm vi rút Rubella trước sinh” với mục tiêu:

Hồn thiện quy trình phát hiện nhiễm virut Ruh ỉỉa bằng kỹ thuậtn st d RT-PCR.

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

n . ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N c ứ u

2.1. Đổi tượng nghiên cứu

­ Tối ưu hóa phản ứng nested RT­PCR: 01 mẫu virut Rubella được phân lập từ mẫu bệnh nhiễm vinit Rubella do

Khoa Viruĩ, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp.

­ Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật nested RT­ PCR: 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella, được chẩn
đoán bằng kỹ thuật real time PCR và phân lập virut. 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm các loại vi khuẩn và yirut
khác, gây triệu chứng phát ban như Rubella.

­ Áp dụng kỹ thuật nested RT­PCR trong chẩn đoán trước sinh.

­ 41 thai phụ được chẩn đoán nhiễm virut Rubella bằng kỹ thuật huyết thanh học.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ARN

Tách chiết ARN của virut Rubella bằng bộ kit QIAamp@Viral RNA Mini kit, hãng QIAGEN, theo qui

X ' 0

tr nh của nhà sản xuât; ARN tách chiêt được lưu trữ ở ­80 c cho tới khi sử dụng.

Tách chiết ADN bằng bộ kít QIAamp® DNA Mini kit. ADN sau khi tách chiết được lưu trữ ở ­20°c cho
tới khi sử dụng.

2.2.2. Phản ứng khuếch đại gen nested RT-PCR

­ Phản ứng RT­PCR: ARN được chuyển thành cADN và nhân ADN đích nhờ phản ứng RT­PCR bằng bộ
Kit Qiagen onestep. Thể tích phản ứng gồm: 5x QIAGEN OneStep RT­PCR Buffer 10 ịil; hỗnhợp đNTP: 2
Ịil; Q solution: 10 ụ\; enzym mix 2 ịil; Primer R ulF 1 ụ\; Primer

R ulR 1 |il; mẫu ARN: 2 jil; H2O vừa đủ 50 |il. Chu tr nh nhiệt gồm các giai đoạn sau: chuyển đổi ARN
thành cADN ở 50°c trong 30 phút, sau đó biến tính 95°c ở ỉ 5 phút; thực hiện 30 chu kỳ gồm các giai đoạn:

duỗi xoắn ở 95°c trong 30 giây, bám mồi Ố0°c trong 30 giây, kéo dài 72°c trong 45 giây. Cuối cùng là giai
đoạn kéo dài 7 2°c trong 10 phút.

­ Phản ứng nested PCR: Thành phần phản ứng gồm: Buffer 10 X 5 |il; hỗn địch dNTP 0,8 ịil; Primer
Ru2F 1 pi; Primer Ru2R 1 Ịil; KAPA Tag Polymerase 0,2 Jil; 4 fxl sản phẩm của phản ứng RT­PCR; H20
vừa đủ 50 |U. Chu tr nh nhiệt gồm các giai đoạn: biến tính 95°c ở 15 phút; thực hiện 30 chu kỳ gồm các giai
đoạn:, duỗi xoắn ở 95 °c trong 30 giây, bám mồi 61°c trong 30 giây, kéo dài 7 2 °c trong 45 giây. Cuối cùng
là giai đoạn kéo dài 72°c trong 10 phút. Sau khi nhân ADN đích, điện di sản phẩm ADN trên agarose gel 2%
và phân tích kết quả. Sản phẩm ADN của phản ứng nested RT­PCR theo lý thuyết à 143 bp.

Bảng 1. Tr nh tự các primer phục vụ nhân ADN của virut Rubella

Ký hiệu Tr nh tự (5’­3’) Vị trí

Tm°c

Sàn phẩm

R11I­F CAACACGCCGCACGGACAAC 8807 ± 8826 66

185bp

Rul­R CCACAAGCCGCGAGCAGTCA 8991 ± 8972

66

Ru2­F CTCGAGGTCCAGGTCCYGCC 8826 ± 8845

68

143bp

Ru2­R GAATGGCGTTGGCAAACCGG 8968 ± 8949 64

2.3. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật
2.3.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuậỉ

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

2.3.2. Xác định ngư ng phát hiện của kỹ ỉhuật

Tách chiết ARN từ mẫu nuôi cấy virut Rubella, đo nồng độ ARN trên máy Nano drop; pha ỉoãng thành dung
dịch ARN có nồng độ 100 ng/fil. Tiên hành pha lỗng dàn mẫu ARN của virut Rubella có nồng độ 100 ng/(i
(tương đương 105pg/fil) theo hệ số 10 thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ngẠil, 10 ng/|il, 1 ngậđ, ỉõ ' ng/fjl,

10'2 ng/fil, 103 ng/fil, lo4 ng/|AỈ, 10 s ng/|il, 106 ng/|il, 10 7 ng/fil, 10‘8ng/jil. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật
RT­PCR và nested RT­PCR trên các mẫu được pha loãng để xác định ngưỡng phát hiện của kỳ thuật.

2.3.3. Giải trình tự sản phẩn phản úng nested RT-PCR

Đê chứng rninh sản nhẩn T bâ” ffep cửa «hả« ứĩ»ơ «e«í:eH P T ­P í^P Ịpr z tz z u .il vww jJiiUIl iivừlvU i v i i wiVl a liiiiii t ụ g viỉ VUU Viiul iVUUVÚÀ. UOlỉt>r ơ«»n ­"'IP vif’if
phâm của phản ứng nested RT­PCR được giải tr nh tự và so sánh trên genbank.

2.4. Á p đụng kỹ th uật nested R T­PC R tron g chẫn đoán trước sinh

Kỹ thuật nested RT­PCR được áp dụng chẩn đoán trên 41 mẫu dịch ối của thai phụ được xác định nhiễm
virut Rubella trong 3 tháng đầu của thai kỳ bằng phương pháp huyết thanh học. Kết quả chẩn đốn cùa kỹ
thuật nested RT­PCR so sánh vói kết quả real time­PCR và kết quả xét nghiệm IgM mấu cuổng rốn của thai
nhi sau khi đ nh chỉnh thai nghén.

2.5. Thiết bị, hóa ch t
2.5.1. Thiết b|

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng được sử dụng tại Trung tâm nghiên cứu Y học Quân sự ­ Học viện
Quân y gồm: máy luân nhiệt tự động GeneAmp PCR system 9700 ABI (Applied Biosystèms, Hoa Ky), may
ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Đức), máy soi và chụp gelDoc (Hoa Kỳ), bộ điện đi cùa Bio Rad.

2.5.2. Hóa ch t

Qiagen ARN mini kít, Kit Qiagen onestep, Primer do hãng ĩnvitrogen tổng hợp, nước khử ion, agarose, li ang

ADN chuẩn do hãng Sigma cung cấp và các vật tư tiêu hao khác.

ra . KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Hoàn thiện kỹ thuật nested RT-PCR trong chẩn đốn nhiễm virut Rubella.
3.1.1. Tối ưu hóa phản ứng RT-PCR và nested PCR

Sau nhiều lần tối ưu hóa các thành phần phản ứng và chu tr rih nhiệt của phản ứng ở giai đoạn RT­PCR
và giai đoạn nested PCR, chứng tôi thu được bảng thành phần phản ưng của giai đoạn RT­PCR và nested
PCR được tr nh bày chi tiết trong phần phương pháp nghiến cứu. Trong phần báo cáo tóm tắt này, chỉ h nh
ảnh tối ứu hóa nhiệt độ gắn primer được thể hiện và phân tích.

-Phản ứng RT-PCR:

IBipKililllllil

m

fs­ỉa.­iS ­5

Hình 1. Hình ảnh tối ưu hóa nhiệt độ gắn primer của phản ứng RT-PCR

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

Để lựa chọn nhiệt độ gắn primer tối ưu, chúng tôi thực hiện phản ứng ở các ống khác nhau với cùng thành
phần phản ứng và chu tr nh nhiệt như trên; chỉ khác nhau nhiệt độ gắn primer (Ta). Ta của primer phụ thuộc vào
nhiệt độ nóng chảy của primer (Tm). Thường Ta của primer hơn kém Tm 5 ­ 10°c. Căn cứ vào Tm cùa primer là

66°c, tiên hành thư ở nhiệtđộ 55°c, 57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c,

fc ,

65°c

Kết quả ờ h nh 1 cho thấy, ở dải nhiệt độ từ 55 ­ 65 °c đều xuất hiện băng sản phẩm. Tuy nhiên, các băng ờ
nhiệt độ gắn primer thấp có smear lớn hơn. Nhiệt độ tang, smear thu hẹp dần. Từ 60 ­ 65°c khơng cịn xuất hiện

smear nữa. Tuy nhiên, phản ứng PCR sẽ không ổn định ở nhiệt độ gắn primer cao, nên chúng tôi quyết định chọn
nhiệt độ gắn primer ở 60 °c. Điều này cho thấy, ờ nhiệt độ < 60°c sản phẩm PCR tạo ra nhiều, nhưng không xuất
hiện sản phẩm phụ. ở nhiệt độ cao, tính ổn định của hoạt tính emzym polymerase sẽ giảm theo thời gian. Ở 60°c,
băng sản phẩm khơng có smear và đậm nhất. Điều này có nghĩa ờ nhiệt độ này ta thu được sản phẩm đặc hiệu và
hiệu suất phản ứng cao nhất. Như vậy, nhiệt độ gắn primer của phản ứng RT­PCR là 60°c.

­ Phản ứng n st d PCR

H nh 2. Kêt quả tối ứu hóa nhiệt độ gắn primer của phản ứng nested PCR

M: marker 100; NC1: chứng âm của NC của phản ứng RT­PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2; 1­7 lần
lượt là các băng sản phẩm của phản ứng

ở

Ta lần lượt là57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c, 63°c, 64°c.

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả của phản ứng PCR như nhiệt độ gắn primer, thời gian gắn primer,
thời gian kéo dài chuỗi, hoạt động của enzym, nồng độ dNTP, nồng độ Mg2+... Khi tối ưu hóa phản ứng PCR,
cần phải tối ưu hóa tất cả những yếu tố đó để có kết quả tốt nhất. Tuy nhiên, công việc này mất nhiều thời gian,
cơng sức và hóa chất. V vậy, thực tể tối ưu hóa phản ứng PCR, thường tiến hành lựa chọn íhành phần phản ứng
tiêu chuẩn và tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ gắn primer (Ta) đầu tiên. Ta quyết định tới thành công hay thất bại của
phản ứng PCR. Trong nghiên cứu này, ban đầu chúng tôi iựa chọn thành phần phản ứng và chu tr nh nhiệt như
trên. Theo nguyên tắc dựa vào Tm của R2­F là68°cvà Tm của R2­R là64°c.Chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ tối
ưu hóa cho cặp primer của phản ứng nested PCR trong khoảng từ 57 ­

64°c.

Chúng tôi không đưa nhiệt độ Ta lên
q cao, v điều này khơng có lợi cho hoạt tính của enzym polymerase. Chúng tơi tiến hành chạy Ta ở nhiệt độ
57°c, 58°c, 59°c, 60°c, 61°c, 63°c, 64°c.

Kết quả trên h nh 2 cho thây, Taphản ứng Nested PCR ở 57°c, 58°c, 59°c,60°c(băng từ 1­4) đều có băng sản
phẩm phụ dài hơn sản phẩm chính. Ta ở

61°c, 63°c, 64°c

xuất hiện băng sản phẩm rõ nét và khơng có sản phẩm
phụ. Theo nguyên tắc ưu tiên sử đụng nhiệt Ta thấp, chúng tôi chọn Ta của phản ứng nested là 61°c. Sau khi xác
định Ta primer của phàn ứng nested PCR là 61°c, tiểp tục thay đổi thời gian gắn primer, thời gian kéo đài
chuỗi, lượng template đưa vào nhung hiệu quả của phản ứng nested không tốt hơn nên chu tr nh nhiệt được
giữ nguyên như cũ.

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

Kỳ thuật xác định dương tính với 60 mẫu virut Rubella và âm tính với 60 mẫu các loại n ếu khác. Độ nhạy của
kỹ thuật Se = [60:(60 + 0)] X100% = 100%; độ đặc hiệu của kỹ thuật: Sp = [60:(60 + 0)3X100% = 100%. Các
cặp primer của phán ứng nested RT­PCR khơng có phản ứng chéo vởi virut khác gây triệu chứng phát ban như
Rubella. Phản ứng chéo khơng xảy ra ở virut có bản chất ARN giống Rubella và ADN không giống Rubella. Các
nghiên cứu khác trên thế giới cũng cho thấy nested RT­ PCR có độ đặc hiệu cao (100%) [4].

­ Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT­PCR

Hình 3. Kết quả xác định ngư ng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR

M: marker 100; NC: chứng âm của NC cùa phản ứng RT­PCR; 1­11 lần lượt là các băng sản phẩm của các
mẫu 100ngẠiỉ, ÍOngẠiỉ, 1 ngẠil, lO^ngẠiỉ, 10"2ngẠil, lO^ng/gỉ, ỈO^ngẠil, lO^ngẠd, 10"7ng/|i], I0'8ngẠiI.

Kỳ thuật nested RT­PCR có thể phát hiện mẫu có chứa nồng độ ở mức lơ 6ngẠil, tựơng ứng 0,001 pgẠil, điều
này cho thấy ngưõng phát hiện của kỹ thuật nested RT­PCR rất thấp. Theo Thanapal AR và

cs

(2008), phương
pháp RT­PCR có độ nhạy và ổn định hơn so với phương pháp real time PCR [8]. Cũng theo Bosma và

cs

(1995)
RT­PCR có độ nhạy tương đương với 2 copies [4]. Trong khi đó, nghiên cứu của Kiyoko Okamoto và

cs

(2011)
khẳng định phương pháp real time PCR khi sử dụng kit Taqman và chạy trên máy của hãng ABI chỉ cho chẩn
đốn dương tính khi có tối thiểu 10 copies ARN của Rubella trong mẫu [6]. Điều này cho thấy kỹ thuật RT­PCR
ưu thể hom so với kỳ thuật real time PCR về độ nhạy.

Kết quả giải tr nh tự, Blast trên ngân hàng gen cho thấy, tr nh tự gen này là của virut Rubella. Phản ứng nested
RT­PCR đã nhân được đoạn gen của virut Rubella chứ không phải của virut khác.

3.2. ứng dụng kỹ thuật nested RT-PCR trong chẩn đốn nhiễm virut Rubella truớc sinh

Sau khi chuẳn hóa được quy tr nh trên mẫu chứng tiến hành áp dụng các bước tiến hành chẩn đoán trên 41
mẫu địch ôi của thai phụ bị nhiễm virut Rubella 3 tháng đầu.

3.2.1. Kết quả chẩn đoán trước sinh Rubella trên dịch ối và kết quả huyết thanh học của mẹ

Trong 41 mẫu địch ỐỊ tiến hành xét nghiệm, 15/41 mẫu cho kết quả đương tính, 26/41 mẫu âm tính. Kết quả
xét nghiệm ĩgM của mẹ cho 8 trường hợp dương tính và 33 trường hợp cịn lạĩâm tính. Bên cạnh đó, ket qua IgG
lại cho 39 trường hợp dương tính va chi có 2 trường âm tính. Điều này cho thấy, IgM và IgG khơng phan ánh
được thai nhi có nhiễm virut Rubella hay không. V vậy, không thể căn cứ vào kết quả xét nghiệm IgM và IgG
của máu mẹ để đưa ra chỉ định đ nh chỉ thai nghén.

3.2.2. So sánh kết quả kỳ thuật nested RT­PCR và kỳ thuật real time PCR

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>

15/41 mẫu dịch ối cho kết quả dương tính với nested RT­PCR đều đo được số coppies bằng phương pháp real
time­PCR. Tất cả các mẫu âm tính đều dưới ngưỡng hay khơng phát hiện được sự có mặt của ARN virut Rubella.
Các sản phụ có kết quả nested RT­PCR dương tính vói virnt Rubella đều được chỉ định dinh chỉ thai nghén.
Xét nghiệm IgM máu cuống rốn thai nhi vói vi rút ru virut Rubella. Kết quả cho thấy 15/15 số trường hợp đ nh
chỉ thai nghén nghi đo CRI đều cho kết quả IgM máu cuống rốn dương tính.

Nested RT­PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh, với độ nhạy và độ đặc hiệucao, định ARN của Rubella
trong nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau. Kết quả của xét nghiệm nhận được trong vòng 24 giờ kể từ khi nhận
mẫu, ngược lại, phương pháp phân lập virat phải mất 3 ­ 4 tuần. Như vậy, RT­PCR ưu việt hơn hẳn so với
phương pháp phân lập virut về thời gian, ít phức tạp hơn, địi hỏi thiết bị đơn giản hơn [7, 8]. Ưu điểm này giúp
kỹ thuật này có thể áp dụng ở nhiều bệnh viện, cơ sở xét nghiệm. Kỹ thuật huyết thanh học có nhiều nhược điểm
như chỉ có thể áp dụng ở tuổi thai > 22 tuần, tỷ ỉệ âm tính giả cao do nồng độ kháng thể thấp trong máu cuống rốn
của thai nhi, hơn nữa lấy máu cuống rốn là kỹ thuật phức tạp, chỉ tiến hành tại một số ít bệnh viện chuyên về sản
khoa [7].

Năm 2011, dịch sốt Rubella bùng phát phức tạp ở Việt Nam. Đặc biệt, bệnh lây lan rộng, nhiều phụ nữ
mang thai nhiễm bệnh. Do chưa có cơng cụ chẩn đốn nhanh, đặc biệt là chẩn đoán trước sinh nhiễm
Rubella bẩm sinh, kết hợp với cộng đồng íhiếu thơng tin về Rubelỉa đã gây tâm lý hoang mang, lo lắng.
Hơn nữa, có nhiều phụ nữ mang thai phải đ nh chỉ thai nghén do khơng có cơ sở chẩn đốn chính xác,
khoa học [1]. V vậy, yêu cầu cần một công cụ chẩn đốn nhanh, chính xácgiúp cho việckiểm sốt địch,

hạn chế việc đ nh chỉ thai nghén không cần thiết [7].

IV. K ẾT LUẬN

­ Đã tối ưu hóa quy tr nh kỹ thuật nested RT­PCR trong chẩn đoán nhiễm virut Rubella trước sinh và xác
định độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện 10"6 ngẠil (0,001 pg/ịil).

­ Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật nested RT­PCR phát hiện được 15/41 thai nhi nhiễm virut
Rubella, tương đồng vói kết quả real time PCR và xét nghiệm máu cuống rốn sau khi đ nh chỉ thai nghén.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyên Vãn Thưởng, Triệu Thị Thái, Phùng Nhã Hạnh, Nguyễn Vãn Bàng (2012), Hội chứng Rubelỉa bẩm sinh
tại Hà Nội sau vụ địch đầu năm 2011, Tạp chíNghiên cứu Y học.

2. Nguyễn Vũ Trung (2007). Vi rút Rubeỉla. V Sinh Y Học. Nhã xuất bản Y học, Hà Nội; tr. 304-307.
3. Banatva a J. E., Brown D. w . (2004), "Rub lla", Lancet, 363(9415), pp. 1127­37.

4. Bosma T. J., Corbett K. M., Eckstein M. B., O'Shea s., Vijayalakshmi p., Banatvala J. E., Morton K., Best J. M.
(1995), "Use of PCR for prenatal and postnatal diagnosis of congenital rubella", J Clin Microbiol, 33(11), pp. 2881­7.

5. Cutts F. T­, Robertson s. E., Diaz­Ortega J. L., Samuel R. (1997), "Control of rubella and congenital rubelia syndrome
(CRS) in developing countries, Pari Ỉ: Burden of disease from CRS", Bull World H alth Organ, 75(1), pp. 55­68.

6. Kiyoko o et al (2011). D v lopm nt of a nov l TaqMan r al tim PCR assay for d t cting rub lla virus RNA.
Journal of Virological M thods 168: pp. 267-271.

7. Kazumi K, Kaneko M, Sameshima H et al (2010). Rubella outbreak on Tokunoshima Island in 2004: a population­
based study of pregnant women. J Obst t Gyna col R s.36(5): pp. 938-43.

8. Thanapal AR et al (2008), Laboratory Confirmation of Cong nital Rub lla Syndrom inlnfanis: An Eye Hospital Based
Investigation.Journal ofM dical Virology 80:pp. 536-546.

</div>

<!--links-->