Xây dựng và đánh giá phương pháp hiện ký sinh trùng trichinella trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

DƯƠNG THỊ HÂN

XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
KÝ SINH TRÙNG TRICHINELLA TRONG THỊT HEO
BẰNG KỸ THUẬT TIÊU CƠ KẾT HỢP KHUẤY TỪ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 02 năm 2012


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
----oOo---

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày tháng 02 năm 2012


Nhiệm vụ Luận văn Thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc.

-----------

---oOo---

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: DƯƠNG THỊ HÂN

Giới tính: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 20/02/1985

Nơi sinh: Hà Nam

Chuyên ngành: Cơng nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 80

Khóa: 2009
1. TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

KÝ SINH TRÙNG TRICHINELLA TRONG THỊT HEO BẰNG KỸ THUẬT TIÊU
CƠ KẾT HỢP KHUẤY TỪ.
2. NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
Nghiên cứu xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ.
Đánh giá xác nhận hiệu lực phương pháp mới xây dựng.
Xác định một số thông số của phương pháp mới.
Ứng dụng phương pháp mới vào phân tích tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng trong thịt heo
trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.
3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2011
4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 05/02/2012
5. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
Tp. HCM, ngày 05 tháng 02 năm 2012
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC


Lời cám ơn

LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước hết em xin gửi lời cám ơn đến TS.

NGUYỄN TIẾN DŨNG – Phó Trưởng Phịng Kiểm nghiệm, Trung tâm Chất lượng
Nông Lâm Thủy sản vùng 4. Anh vừa là người thầy, người cấp trên đáng kính. Anh
đã truyền đạt cho em những bài học, những kinh nghiệm thật bổ ích giúp em phát
triển trong công việc và trong nghiên cứu khoa học. Anh là người luôn động viên và
tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em hồn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung tâm Chất lượng
Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tơi cả về trang thiết bị,
vật tư hóa chất và thời gian để hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ Môn Công nghệ Sinh học,
Đại học Bách Khoa cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã truyền đạt cho em
những kiến thức nền tảng trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Anh, Chị, bạn đồng nghiệp bộ phận Vi
sinh đã luôn sát cánh và chia sẻ cùng tơi những khó khăn trong cơng việc và tận tình
giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Lời tri ân cuối cùng, con xin gửi đến Bố Mẹ, hai chị và em út, những người
luôn ủng hộ, động viên và tạo cho con động lực, niềm tin để học tập, lao động và
vươn lên trong cuộc sống.

Trân trọng

Dương Thị Hân


Tóm tắt

TĨM TẮT
Bệnh Trichinellosis thường được gọi là bệnh sán heo. Nguồn lây bệnh
trichinellosis cho người chủ yếu là do ăn thịt sống hoặc nấu chưa chín có chứa ký
sinh trùng Trichinella. Tỉ lệ mắc bệnh trên toàn thế giới là gần 10.000 trường
hợp/năm, tỉ lệ tử vong khoảng 0,2%.

Phương pháp thường được sử dụng để phân tích Trichinella hiện nay dựa
trên kỹ thuật làm tiêu cơ kết hợp khuấy từ. Phương pháp này đã được EU chấp nhận
như là phương pháp tiêu chuẩn sử dụng cho các phòng kiểm nghiệm vệ sinh an toàn
thực phẩm. Hiện nay, tại Việt Nam chưa có phương pháp chính thức phân tích ký
sinh trùng Trichinella trong thịt heo nói riêng và trong thực phẩm nói chung. Mục
tiêu của luận văn này là xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
nhanh, chính xác, phù hợp với điều kiện của các phịng thí nghiệm tại Việt Nam
trên nguyên tắc của phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ.
Đề tài đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích
như: pH, nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzym trong giai đoạn thủy phân mẫu. Từ đó
làm cơ sở cho việc đề xuất dự thảo phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
trong thịt heo dựa trên kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ. Đồng thời, đề tài cũng đã
thực hiện bước xác nhận hiệu lực và đánh giá hiệu quả phân tích của phương pháp
mới xây dựng trên các mẫu chuẩn Trichinella được cung cấp bởi Trung tâm Ký sinh
trùng động vật và Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm, thuộc Cơ quan Thanh
tra thực phẩm của Canada (CFIA’s CAP).
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp mới xây dựng có độ nhạy đạt
90,9%, độ đặc hiệu đạt 100%, độ chính xác đạt 94,1%, tỷ lệ dương tính giả là 0%,
tỷ lệ âm tính giả là 9,1%. Hiệu quả phân tích tương đương kết quả đánh giá của
CFIA’s CAP với độ tin cậy 95%.
Đề tài cũng đã áp dụng quy trình mới xây dựng để khảo sát các mẫu thịt heo
trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả phân tích cho thấy khơng phát hiện
ký sinh trùng Trichinella trong 50 mẫu thịt được thu thập từ các chợ và siêu thịt trên
địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh.


Abstract

ABSTRACT
Trichinellosis is also known as pig worm disease. Trichinellosis in human is

caused by eating raw or undercooked meat from Trichinella-infected animals.
Incidence of Trichinellosis in world is approximately 10,000 patients per year and
death rate approximately 0.2%.
The routine method for detection of Trichinella in meat or food is based on
The digestion principle and magnetic stirrer. This method is used for pooled sample
digestion is recommended as the reference method for Food-borne Laboratory
testing by EU. Up to now, there are not the official method for detection of
Trichinella in food or meat in Việt Nam. These thesis aims are researching to make
the method is based on digestion and magnetic stirrer principle for detection of
Trichinella in meat. The new method is has to rapid, accuracy, comformable with
larboratories conditions in Viet Nam.
In this thesis, several factors affect to analysis protocol such as pH,
temperature, time, digestive enzyme concentration are investigated. The
investigation results are used as the basic datas to make the new method for detetion
of Trichinella in pork. The new method is also validated by proficiency samples
from Centre for Food-borne and Animal Parasitology, Canadian Food inspection
agency (CFIA’s CAP).
The validation results of the new method show that the sensitivity, specificity,
accuracy, false positive rate and false negative rate are individually 90.9%, 100%,
94.1%, 0% and 9.1%. The analysis effective of new method for detection of
Trichinella in pork is equivalent to the reference method, the similarity of the
reference method and the new method is more than 95% of confidence.
We also applied the new method to analyse 50 pork samples are gotten from
the makets in Ho Chi Minh city. The analysed results show that Trichinella is not
detected in all samples.


Lời cam đoan

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác.

Dương Thị Hân


Mục lục

MỤC LỤC
Nhiệm vụ luận văn Thạc sĩ
Lời cám ơn
Tóm tắt
Abstract
Lời cam đoan của tác giả luận văn
Mục lục
Danh mục các Bảng
Danh mục các Hình
Danh mục các Sơ đồ
Danh mục từ viết tắt
PHẦN 1 MỞ ĐẦU ..................................................................................... 1
PHẦN 2 TỔNG QUAN .............................................................................. 5
2.1 Khái niệm chung về Trichinella spp. ................................................ 5
2.1.1 Vị trí phân loại............................................................................ 5
2.1.2 Đặc điểm sinh học của Trichinella spp. ...................................... 6
2.1.3 Bệnh do Trichinella spp. gây ra ................................................. 9
2.2 Giới thiệu về Pepsin ...................................................................... 12
2.2.1 Đại cương về pepsin ................................................................. 12
2.2.2 Đặc tính, thành phần cấu tạo ..................................................... 12
2.2.3 Sự tạo thành pepsin trong cơ thể ............................................... 13

2.2.4 Hoạt động xúc tác của pepsin ................................................... 13
2.2.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin .................... 14
2.3 Các phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella spp. trong thực
phẩm

....................................................................................................... 15
2.3.1 Phương pháp Trichinelloscopy ................................................. 15
2.3.2 Phương pháp tiêu cơ ................................................................. 16
2.3.3 Phương pháp miễn dịch ............................................................ 17
2.3.4 Phương pháp PCR ................................................................... 18


Mục lục

2.4 Cơ sở xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện ký sinh trùng
Trichinella spp. trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ ............... 19
2.4.1 Cơ sở lý thuyết ......................................................................... 19
2.4.2 Cơ sở lập luận........................................................................... 20
2.5 Xác nhận hiệu lực phương pháp ..................................................... 20
2.5.1 Sơ lược về xác nhận hiệu lực phương pháp ............................... 20
2.5.2 Các thông số kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực phương pháp ..... 21
2.5.3 Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp ..................... 22
PHẦN 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 23
3.1 Nguyên vật liệu .............................................................................. 23
3.1.1 Nguyên liệu .............................................................................. 23
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ chính ......................................................... 23
3.1.3 Mơi trường và hóa chất ............................................................. 24
3.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 24
3.2.1 Sưu tập các dòng Trichinella spp. ............................................. 24
3.2.2 Phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella bằng hệ thống 2

lần lắng theo hướng dẫn của Cơ quan thanh tra thực phẩm Canada ............... 24
3.2.3 Phương pháp tối ưu hóa các thơng số của quy trình .................. 26
3.2.4 Phương pháp xác nhận hiệu lực phương pháp .......................... 31
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 35
4.1 Kết quả phân lập nang ấu trùng Trichinella spp. ............................. 35
4.2 Kết quả khảo sát tối ưu hóa các thơng số của quy trình ................... 35
4.2.1 Kết quả khảo sát pH tối ưu ....................................................... 35
4.2.2 Kết quả khảo sát lựa chọn nồng độ pepsin tối ưu cho giai đoạn
thủy phân mẫu ................................................................................................ 40
4.2.3 Kết quả khảo sát để lựa chọn nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn thủy
phân mẫu

................................................................................................. 42

4.2.4 Kết quả khảo sát thời gian thủy phân tối ưu .............................. 45
4.3 Đề xuất dự thảo phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella spp.
trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ ......................................... 47


Mục lục

4.4 Xác nhận hiệu lực phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ đã xây dựng ..................... 52
4.4.1 Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp đã xây dựng ...... 52
4.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp đã được xây
dựng

................................................................................................. 55

4.5 Ứng dụng quy trình xây dựng phân tích mẫu thịt heo trên địa bàn

Thành phố Hồ Chí Minh .................................................................................... 57
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 60
5.1 Kết luận .......................................................................................... 60
5.2 Kiến nghị ........................................................................................ 61
PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................... 62
PHỤ LỤC


Danh Mục Bảng

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4-1: Hiệu suất thủy phân của pepsin tại các giá trị pH khác nhau .................. 36
Bảng 4-2: Hiệu suất thủy phân của pepsin tại các nồng độ enzym khác nhau. ........ 40
Bảng 4-3: Hiệu suất thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau. ...................................... 43
Bảng 4-4: Hiệu suất thủy phân của pepsin theo thời gian ....................................... 46
Bảng 4-5: Kết quả khảo sát khả năng phát hiện của phương pháp .......................... 53
Bảng 4-6: Giới hạn phát hiện của phương pháp ..................................................... 54
Bảng 4-7: Kết quả phát hiện Trichinella trong các mẫu gây nhiễm và không gây
nhiễm bằng phương pháp mới được xây dựng ....................................................... 55
Bảng 4-8: Tương quan kết quả phát hiện Trichinella spp. bằng phương pháp tiêu cơ
kết hợp khuấy từ với kết quả mẫu chuẩn CFIA’s CAP ........................................... 56
Bảng 4-9: Đánh giá các thông số kỹ thuật của phương pháp mới xây dựng............ 56
Bảng 4-10: Kết quả khảo sát tỉ lệ nhiễm Trichinella trên địa bàn Thành phố Hồ Chí
Minh...................................................................................................................... 58


Danh mục Hình

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2-1: Các giai đoạn trong chu kỳ sống của T. spiralis ..................................... 5

Hình 2-2: Vịng đời T. spiralis ................................................................................ 7
Hình 2-3: Nang ấu trùng, ấu trùng và T. spiralis trưởng thành ................................ 7
Hình 2-4: Trichinella trong tế bào cơ ....................................................................... 8
Hình 2-5: Trình tự chuỗi pepsin từ heo (A) và pepsin trong phức hợp với pepstatin
(B). ........................................................................................................................ 12
Hình 4-1: Mẫu chuẩn chứa nang ký sinh trùng T. spiralis từ CFIA’s CAP............. 35
Hình 4-2: Phần còn lại trên lưới lọc dịch sau thủy phân tại các pH khác nhau ....... 37
Hình 4-3: Kết quả lắng dịch sau thủy phân tại các pH khác nhau ........................... 37
Hình 4-4: Kết quả quan sát dưới kính hiển vi sau lắng tại độ phóng đại 40 lần. ..... 38
Hình 4-5: Một số ấu trùng và nang ấu trùng thu được khi thủy phân tại nồng độ 6
FIP-U/ml dịch thủy phân. ...................................................................................... 42
Hình 4-6: Phần cịn lại trên lưới lọc dịch sau thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau: 44
Hình 4-7: Qui trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella spp. trong thịt heo bằng kỹ
thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ................................................................................ 51
Hình 4-8: Ấu trùng và nang ấu trùng Trichinella phát hiện trong quá trình xác định
giới hạn phát hiện phương pháp. ............................................................................ 54
Hình 4-9: Ấu trùng và nang ấu trùng phát hiện trong các mẫu gây nhiễm. ............. 56


Danh mục Sơ đồ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3-1: Qui trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella bằng hệ thống 2 lần lắng
theo hướng dẫn của Cơ quan thanh tra thực phẩm Canada. .................................... 26
Sơ đồ 3-2: Qui trình khảo sát lựa chọn pH tối ưu cho hoạt động của pepsin........... 27
Sơ đồ 3-3: Qui trình khảo sát lựa chọn nồng độ pepsin tối ưu ................................ 28
Sơ đồ 3-4: Qui trình khảo sát lựa chọn nhiệt độ thủy phân tối ưu........................... 30
Sơ đồ 3-5: Qui trình khảo sát lựa chọn thời gian thủy phân tối ưu.......................... 31
Sơ đồ 3-6: Qui trình đánh giá phương pháp. .......................................................... 34
Sơ đồ 4-1: Qui trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong thịt heo bằng kỹ thuật

tiêu cơ kết hợp khuấy từ ........................................................................................ 50


Danh mục Từ viết tắt

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ISO

International Standardization Organization – Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

POS Positive – Dương tính
ND

Not Detected – Khơng phát hiện

WHO World Health Orgaization – Tổ chức y tế thế giới
OIE

World Organisation for Animal Health (Office International des Epizooties)

– Tổ chức thú y Thế giới
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations – Tổ chức Lương
Nông Thế giới
CFIA Canadian Food Inspection Agency – Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada
CAP Centre for Food-borne and Animal Parasitology – Trung tâm Ký sinh trùng
động vật và Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm
CFIA’s CAP Centre for Food-borne and Animal Parasitology, Canadian Food
inspection agency – Trung tâm Ký sinh trùng động vật và Bệnh truyền nhiễm qua
đường thực phẩm, thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada.

1

MỞ ĐẦU

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

Bệnh do nhiễm Trichinella spp. (bệnh Trichinellosis) ở người được ghi nhận
ở 55 quốc gia trên thế giới. Tỉ lệ mắc bệnh trên toàn thế giới là gần 10.000 trường
hợp/năm, tỉ lệ tử vong khoảng 0,2%. Bệnh Trichinellosis thường được gọi là bệnh
sán heo đã được ghi nhận ở động vật nuôi (chủ yếu là heo) trên 43 quốc gia, chiếm
21,9%, và trong động vật hoang dã trên 66 quốc gia, chiếm 33,3% [17].
Trichinella spp. là một trong hàng nghìn lồi giun sán gây bệnh ở người và
động vật. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 1/3 dân số trên thế giới bị
nhiễm các loại ký sinh trùng gây bệnh và đã có trên 300 triệu người mắc các chứng
bệnh nghiêm trọng từ các ký sinh trùng này. Những thiệt hại và ngân sách đầu tư
cho các chương trình phịng chống các bệnh ký sinh trùng của thế giới lên đến nhiều
tỷ USD mỗi năm.
Theo Quy định số 2075/2005 của Ủy ban châu Âu (EC): heo, ngựa, heo rừng
và động vật khác giết mổ tại 27 quốc gia thành viên và tại các quốc gia cung cấp thịt
cho thị trường EU phải được kiểm tra Trichinella spp.. Ngoài ra, mỗi nước thành
viên được khuyến cáo phải thực hiện một chương trình giám sát về tình trạng
nhiễm Trichinella spp. ở động vật hoang dã [17].
Ngày nay, thịt heo là nguồn chủ yếu lây truyền bệnh Trichinellosis cho người.
EU, Mỹ, Canada và một số nước khác yêu cầu phải kiểm tra Trichinella spp. trong
thịt trước khi cung cấp ra thị trường tiêu thụ kể cả trong nước và xuất khẩu. Do đó,
cần có một phương pháp phù hợp và đủ độ nhạy để phát hiện Trichinella spp. là rất
quan trọng. Ở Việt Nam hiện chưa có quy trình cho việc phát hiện ký sinh trùng

Trichinella trên sản phẩm thịt. Vì vậy việc xây dựng qui trình phát hiện Trichinella
trong thực phẩm là cần thiết.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp phát hiện Trichinella dựa
trên các nguyên tắc kỹ thuật khác nhau như: kỹ thuật PCR, ELISA hoặc kỹ thuật
tiêu cơ. Việc phát hiện ký sinh trùng Trichinella bằng phương pháp tiêu cơ kết hợp
với khuấy từ là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, khơng địi hỏi nhiều về thiết bị
và cơng thực hiện, lại cho kết quả khá nhanh.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


MỞ ĐẦU

2

Với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
nhanh, chính xác, phù hợp với điều kiện của các phịng thí nghiệm tại Việt Nam,
đồng thời phục vụ công tác kiểm dịch xuất nhập khẩu và chương trình kiểm sốt
chất lượng thịt heo trên địa bàn Thành Phố Hồ Chí Minh, được sự đồng ý của Bộ
môn Công nghệ sinh học - Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh và
cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng và
đánh giá phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong thịt heo bằng kỹ
thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ”.
Điểm mới của đề tài
- Hiện nay ở Việt Nam chưa có phương pháp đặc hiệu, đủ độ tin cậy cho việc
phát hiện ký sinh trùng Trichinella spp. trên thịt heo. Các đề tài nghiên cứu về
Trichinella spp. còn rất hạn chế, đặc biệt việc xây dựng và đánh giá phương pháp
phát hiện ký sinh trùng này trên sản phẩm thịt heo tại Việt Nam chưa được thực

hiện. Do đó việc nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella
bằng phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ là một hướng nghiên cứu mới trong lĩnh
vực an toàn vệ sinh thực phẩm tại Việt Nam.
- Đánh giá qui trình phân tích ký sinh trùng trong thịt bằng phương pháp tiêu
cơ kết hợp khuấy từ là một trong những vấn đề kỹ thuật mới tại Việt Nam. Nghiên
cứu này thành công sẽ tạo tiền đề cho việc đánh giá hiệu lực các phương pháp phân
tích ký sinh trùng khác sau này.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài sẽ nhằm vào các mục tiêu như sau:
1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella
trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ.
2. Đánh giá hiệu lực phương pháp đã được xây dựng nhằm xác định các
thông số kỹ thuật của phương pháp, phạm vi và điều kiện áp dụng.
3. Ứng dụng qui trình đã được đánh giá để phân tích các mẫu thịt heo tươi
thu nhận trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


MỞ ĐẦU

3

Nội dung nghiên cứu
Đề tài sẽ tập trung nghiên cứu các nội dung sau đây:
Nghiên cứu xây dựng dự thảo qui trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella
trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ.
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp: đánh giá các thông số của

phương pháp mới xây dựng: Giới hạn phát hiện, độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy,
tỉ lệ âm tính giả, tỉ lệ dương tính giả.
Áp dụng phương pháp đã xây dựng vào việc phân tích mẫu thu nhận tại lò
mổ, chợ và siêu thị trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh nhằm đánh giá mức độ
nhiễm Trichinella trong sản phẩm thịt đang lưu hành trên thị trường.
Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Đề tài “Xây dựng và đánh giá phương pháp phát hiện ký
sinh trùng Trichinella trong thịt heo bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ’’ tập
trung nghiên cứu các điều kiện nhằm xây dựng được qui trình phát hiện ký sinh
trùng Trichinella hoàn chỉnh và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trước khi
áp dụng vào các phòng kiểm nghiệm tại Việt Nam. Đây là đề tài đầu tiên trong lĩnh
vực an toàn vệ sinh thực phẩm nghiên cứu về quy trình phát hiện ký sinh trùng
Trichinella trong thực phẩm, đề tài thành công sẽ cung cấp cho các phịng kiểm
nghiệm quy trình phát hiện Trichinella đã được đánh giá các thông số kỹ thuật để
ứng dụng vào thực tế kiểm nghiệm Trichinella nhằm đảm bảo chất lượng, an tồn
vệ sinh các lơ hàng xuất nhập khẩu.
Đề tài cũng cung cấp được số liệu về tình hình nhiễm Trichinella trong thịt
heo trên địa bàn TP Hồ Chí Minh, giúp cho các cơ quan chức năng có cơ sở để đưa
ra những biện pháp quản lý nhằm kiểm soát chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm
về Trichinella.
Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài thành công sẽ được áp dụng tại các phịng kiểm
nghiệm phân tích các chỉ tiêu về an toàn vệ sinh thực phẩm, các Trung tâm kiểm

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


MỞ ĐẦU

4

nghiệm và quản lý an toàn dịch bệnh lan truyền theo đường thực phẩm, cung cấp
cho các cơ quan này cơng cụ để kiểm sốt Trichinella.
Phương pháp được nghiên cứu trong đề tài này là đơn giản, khơng địi hỏi
nhiều nhân lực, cho kết quả nhanh và có độ đặc hiệu cao, dễ dàng áp dụng tại hầu
hết các phịng thí nghiệm.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


5

TỔNG QUAN

PHẦN 2

TỔNG QUAN

2.1 Khái niệm chung về Trichinella spp.
Ký sinh trùng Trichinella được phát hiện vào năm 1835 bởi James Paget và
Richard Owen trong cơ vân của xác chết người ở London. Joseph Leidy cũng phát
hiện ký sinh trùng này trong cơ vân của heo vào năm 1846. [13]
2.1.1 Vị trí phân loại
Trichinella spp. là ký sinh trùng thuộc lớp giun tròn, chuyên cư trú tại cơ vân,
cơ tim kể cả trong mô não của ký chủ. Các thành viên của chi này thường được gọi
là Trichinella hoặc sâu sán heo. Trichinella trưởng thành có kích thước 1,5 - 3mm ì
36àm, u trựng ca Trichinella cú kớch thc 0,08mm × 7µm. [3]

Hình 2-1: Các giai đoạn trong chu kỳ sống của T. spiralis [12]
A: T. spiralis trưởng thành trong ruột.
B: Nang ấu trùng trong tế bào cơ vân được bao quanh bởi nang collagen (màu xanh).
C: Mặt cắt dọc của nang ấu trùng: M (midgut): phôi thai ruột, G (genital primordium): bộ
phận sinh dục, S(stichocyte): tuyến tế bào thực quản.

 Vị trí phân loại [5]
Giới:

Aminalia

Ngành :

Nematoda

Lớp:

Adenophorea

Bộ:

Trichurida

Họ:

Trichinellidae

Giống :

Trichinella

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


TỔNG QUAN

6

Đến nay đã phát hiện có 11 lồi được xác định là Trichinella spp., chia làm
hai nhánh [5], [12]:
- Có 5 lồi có khả năng tạo nang trong mơ cơ, chúng ký sinh trên động vật có
vú là:
T. spiralis (genotype Tl)
T. nativa (genotype T2)
T. britovi (genotype T3)
T. murrelli (genotype T5)
T. nelsoni (genotype T7)
Trichinella T6 (genotype T6)
Trichinella T8 (genotype T8)
Trichinella T9 (genotype T9)
Ba kiểu gen Trichinella T6, T8 và T9 cũng được ghi nhận trong chi này.
- Có 3 lồi khơng có khả năng tạo nang trong mơ cơ, chúng ký sinh trên động
vật có vú và chim là:
T. pseudospiralis (genotype T4)
T. papuae (genotype T10)
T. zimbabwensis (genotype Tl1)
2.1.2 Đặc điểm sinh học của Trichinella spp.

Trichinella spp. sống ký sinh nội bào, hiện diện trong người, heo, ngựa, động
vật hoang dã như: cáo, sói, gấu, chồn hơi, gấu trúc, chuột, động vật có vú nhỏ khác
[12].
Thực quản stichocyte của Trichinella spp. bao gồm các ngăn xếp của các tế
bào chạy theo chiều dài của cơ thể [12].
 Vòng đời
Trichinella spp. là sinh vật ký sinh bắt buộc, chúng sinh trưởng và hoàn
thành tất cả các giai đoạn phát triển trong ký chủ. Vòng đời của Trichinella spp. bắt
đầu khi một người hay động vật ăn thịt sống hoặc nấu chưa chín có chứa các nang
ấu trùng. Dịch tiêu hóa trong dạ dày là pepsin và acid hydrochloric thủy phân phần

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


7

TỔNG QUAN

nang của ấu trùng và giải phóng ấu trùng non. Ấu trùng non sau đó sẽ nằm ở phía
dưới hai phần ba của dạ dày phía trên ruột non. [3]
Ấu trùng vào cơ thể người
và động vật từ rau hoặc
thịt chưa chín kỹ
Nang ấu trùng bình
thường (đỏ) và
nang bị vơi hóa

Nang

ấu

Trong dạ dày,
ấu trùng đi ra khỏi nang

trùng

Ấu trùng đi vào
ruột non

hoàn chỉnh

Trưởng thành và
sống trong ruột non
Ấu
trùng
trưởng thành
trong cơ vân

Ấu trùng sơ
sinh xâm nhập
vào mạch máu
Ấu trùng sơ
sinh xâm nhập
vào cơ xương
Con cái sinh sản và ấu trùng
sơ sinh xâm nhập vào mao
mạch và mạch máu

GÂY BỆNH

Bệnh tim

Viêm não

Hình 2-2: Vịng đời T. spiralis [3]

Nang ấu trùng
Trichinella

Ấu trùng
Trichinella

T.spiralis
trưởng thành

cái

T.spiralis đực trưởng thành
Lưu ý: có thùy bám ở đầu

Hình 2-3: Nang ấu trùng, ấu trùng và T. spiralis trưởng thành [3]

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


8

TỔNG QUAN

Ấu trùng thay lông bốn lần liên tiếp trong khoảng thời gian 30 giờ, phát triển
và trưởng thành. Các con c cú kớch thc 1,5mm ì 36àm, con cỏi cú kớch thc
3mm ì 36àm. [3]
S sinh sn xy ra trong vòng năm ngày sau khi giao phối. Con cái trưởng
thành có thể sinh sản 500 – 1.500 ấu trùng sơ sinh trong suốt đời sống [20]. Ấu
trùng sơ sinh kớch thc 0,08mm ì 7àm. Trong vi tun, cỏc phn ứng miễn dịch
của cơ thể sẽ loại bỏ các ký sinh trùng trưởng thành ra khỏi cơ thể ký chủ theo
đường tiêu hóa. [3], [20]
Giai đoạn ấu trùng sơ sinh là giai đoạn duy nhất mà ký sinh trùng có một
sừng nhọn giống như dao găm nhỏ, nằm ở khoang miệng. Ấu trùng sơ sinh sử dụng
sừng đó để tạo ra một lỗ thủng và đi vào trong các tế bào đích. Ấu trùng xâm nhập
vào mao mạch hoặc vào trong máu. Hầu hết ấu trùng sơ sinh đi vào mạch máu và
được phân bố khắp cơ thể. [3]
Sau khi rời mao mạch ấu trùng sơ sinh xâm nhập vào các tế bào (Hình 2-4).
Các tế bào khơng có phản ứng giữ hay đào thải các ấu trùng xâm nhập, nhưng sự
xâm nhập này sẽ làm chết các tế bào. Tế bào cơ xương là ngoại lệ duy nhất. Tế bào
cơ xương không chỉ giữ lại các ấu trùng sơ sinh mà cịn có một loạt thay đổi. Chính
những thay đổi này là nguyên nhân biệt hóa các tế bào cơ cung cấp điều kiện để ấu
trùng sơ sinh sinh trưởng và phát triển. Quá trình này được gọi là sự hình thành
nang tế bào. [3]

A

B
Hình 2-4: Trichinella trong tế bào cơ
A: Ấu trùng Trichinella xâm nhập vào tế bào cơ
B: Nang ấu trùng hoàn chỉnh

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


9

TỔNG QUAN

Ký sinh trùng đi vào bên trong các tế bào không phải là tế bào cơ vân sẽ
không tạo ra nang ấu trùng, mà đi vào lưu thông chung hoặc chết. Khi đi vào lưu
thông các ký sinh trùng thường đi vào não hoặc tim gây bệnh hoặc gây chết cho
động vật ký chủ. Tế bào nang hình thành là kết quả của sự liên kết lâu dài và mật
thiết giữa ký sinh trùng và môi trường nội bào thích hợp của nó. Khi nhân tế bào
chủ sao chép và phân chia cũng đồng thời sao chép luôn bộ gen của các tế bào chất
mang bên trong tế bào nang này. Các tế bào nang của ký sinh trùng có thể tồn tại
suốt thời gian sống của tế bào chủ và được vơi hóa trong vịng vài tháng sau khi tạo
thành. Khi tế bào chủ (động vật ký chủ) chết và bị động vật có vú khác ăn thịt, chu
trình sống của ấu trùng sẽ tiếp tục. Ăn thịt thối rữa là tập tính thơng thường của
động vật có vú hoang dã và điều này làm duy trì Trichinella spp. trong vật chủ
tương ứng. [3]
2.1.3

Bệnh do Trichinella spp. gây ra [5], [17],[18]

Các bệnh do Trichinella spp. gây ra được gọi chung là bệnh Trichinellosis,
thường được gọi là bệnh sán heo. Bệnh Trichinellosis thường xảy ra rải rác, không
tập trung. Phần lớn các trường hợp nhiễm bệnh của con người là do T. spiralis và T.
murrelli gây ra.

Theo ước tính, liều tối thiểu gây nhiễm cho con người là 70 – 150 ấu trùng T.
spiralis. Và liều có thể dẫn tới tử vong là liều trên 500 ấu trùng trong 1 lần nhiễm.
Theo các báo cáo hiện nay, nguyên nhân nhiễm Trichinella spp. cho người là
từ động vật, chủ yếu là do ăn thịt heo, ngựa và các loại động vật hoang dã mang
mầm bệnh, chưa phát hiện về việc lây nhiễm từ người sang người. Bệnh
Trichinellosis và các triệu chứng lâm sàng của bệnh có thể chia làm 3 giai đoạn:
Giai đoạn nhiễm trùng ruột: Giai đoạn này bắt đầu ngay sau khi người ăn
phải thịt bị nhiễm Trichinella spp.. Trong tuần đầu tiên của giai đoạn đường ruột
xuất hiện các triệu chứng như khó chịu, đau bụng trên, tiêu chảy nhẹ, buồn nôn, nôn
và sốt nhẹ ở một số bệnh nhân. Nếu tiêu chảy dai dẳng và nôn mửa kéo dài hơn ba
tháng sẽ gây mất nước nghiêm trọng, cùng với viêm ruột non có thể là nguyên nhân
dẫn đến tử vong.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


TỔNG QUAN

10

Giai đoạn tiêm: giai đoạn này bắt đầu ngay sau khi ấu trùng xâm nhập vào
các bộ phận cơ thể, kéo dài 3 - 4 tuần. Các dấu hiệu trong giai đoạn này như phù mí
mắt, viêm kết mạc, xuất huyết kết mạc, suy giảm thị lực và có thể bị mù. Khoảng 17
- 100% bệnh nhân Trichinellosis bị phù quanh mắt; 5 - 20% bệnh nhân bị rối loạn
tim mạch và viêm cơ tim.
Giai đoạn nhiễm trùng cơ (tế bào): Giai đoạn này bắt đầu khi ấu trùng xâm
nhập vào cơ xương sau ít nhất bốn tuần nhiễm vào cơ thể. Trong giai đoạn cơ, phần
mắt, cơ lưỡi, thanh quản, cơ hoành, cổ và sườn của bệnh nhân thường bị đau. Cơn

đau có thể trở nên nghiêm trọng làm giới hạn chức năng của cánh tay và chân, gây
khó khăn cho việc đi lại, sự di chuyển của cơ lưỡi, nói, thở và nuốt. Trong giai đoạn
này hệ thống thần kinh trung ương, phổi, thận và da có thể bị ảnh hưởng.
Thơng thường, bác sĩ chỉ chẩn đốn bệnh nhân bị nghi ngờ bệnh
Trichinellosis nếu bệnh nhân bắt đầu xuất hiện các triệu chứng Trichinellotic, biểu
hiện của triệu chứng này là phù mặt, đau cơ và sưng, sốt trong khoảng 39 - 400C,
chán ăn, đau đầu, viêm kết mạc và nổi mề đay. Tuy nhiên, biến chứng chính của
bệnh này là viêm cơ tim và viêm não đe dọa tính mạng của bệnh nhân. Các triệu
chứng biến chứng tim mạch như đau ở vùng tim, nhịp tim nhanh và điện tâm đồ bất
thường. Các biến chứng tim mạch khác như tắc tĩnh mạch, tắc huyết khối, huyết
khối não thất có thể dẫn đến tử vong.
Theo ước tính khoảng 10 - 20% bệnh nhân mắc bệnh giun xoắn T. spiralis có
triệu chứng thần kinh trung ương và tỷ lệ tử vong khoảng 50% nếu bệnh nhân
không điều trị đúng và kịp thời.
Theo thông báo của WHO, tháng 3/2001, dịch giun xoắn đã xảy ra ở Italy
làm hàng ngàn người mắc bệnh và 50% số heo điều tra trong đợt dịch này bị nhiễm
giun xoắn. Năm 1976, ở Pháp 3.000 người đã mắc bệnh này do ăn phải thịt ngựa
nhiễm giun xoắn chưa nấu chín.
Ở Việt Nam, giữa năm 2008, 23 người dân ở tỉnh Sơn La đã nhiễm bệnh do
ăn tiết canh và gỏi thịt lợn có chứa ấu trùng Trichinella, trong đó có 2 trường hợp
đã tử vong. Ngoài ra 20 người ở tỉnh Điện Biên cũng đã bị nhiễm bệnh do
Trichinella spp. gây ra vào năm 2004.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN


TỔNG QUAN

11

Hai phương pháp chẩn đoán bệnh Trichinellosis được ưu tiên thực hiện trong
thời gian gần đây là thử nghiệm miễn dịch enzym (Enzyme ImmunoAssay-EIA) và
thử nghiệm tiêm bentonite (bentonite flocculation - BF), đây là hai phương pháp
được khuyến cáo áp dụng cho chẩn đoán và phát hiện bệnh giun xoắn. Thử nghiệm
EIA được dùng sàng lọc thường quy và tất cả mẫu bệnh phẩm cho kết quả EIA (+)
đều phải thử lại để xác định bằng BF. Một phản ứng (+) với cả hai thử nghiệm này
sẽ chỉ ra bệnh nhân đó đã nhiễm giun xoắn trong một vài năm.
Cách điều trị:
Hiện tại chưa có vac-xin phịng ngừa và thuốc đặc trị bệnh Trichinellosis.
Thuốc Mebendazole giúp giảm số lượng ấu trùng Trichinella spp. trong giai đoạn
đầu nhiễm trùng, tuy nhiên việc chuẩn đoán nhiễm trùng Trichinella spp. trong giai
đoạn đầu nhiễm trùng rất khó khăn. Khi bệnh nhân đã được chẩn đoán nhiễm
Trichinella spp., việc điều trị cần kết hợp nhiều loại thuốc: Corticosteroid chống
viêm, Anthelminthics kết hợp sử dụng steroid, thuốc hạ sốt và thuốc giảm đau như
aspirin hay acetaminophen. [3]
Cách phịng ngừa và kiểm sốt
Đối với gia súc, phải nuôi dưỡng tốt, không cho ăn các loại thức ăn không rõ
nguồn gốc, thịt động vật hoang dã, đặc biệt là chuột.
Đối với người tiêu dùng: bệnhTrichinellosis do T. spiralis có thể phịng ngừa
bằng cách nấu thịt đến nhiệt độ 62,20C hoặc bằng cách cấp đông ở -200C trong 6 12 ngày. Tuy nhiên, có sự khác biệt với các lồi khác của Trichinella spp., ví dụ gấu
trúc có protein đặc biệt trong các tế bào cơ ngăn chặn các tinh thể nước đá hình
thành trong thời kỳ ngủ đông cho phép sự tồn tại của ấu trùng ở nhiệt độ thấp hơn
nhiệt độ đơng lạnh. Do đó, cách duy nhất để phịng bệnh Trichinellosis là nấu chín
kỹ thịt trước khi ăn. [5]
Đối với công nghiệp thực phẩm và thương nghiệp: áp dụng quy phạm vệ sinh
thực phẩm trong sản xuất, bảo quản, vận chuyển, phân phối; kiểm tra sự nhiễm
Trichinella spp. trước khi đưa vào phân phối.

GVHD: TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG

HVTH: DƯƠNG THỊ HÂN