Sàng lọc và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp lactase của lactobacillus acidophilus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

CAO XUÂN YẾN

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG
HỢP LACTASE CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Chuyên ngành : .Công Nghệ Sinh Học
Mã số:………………

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương....................
Cán bộ chấm nhận xét 1 : ...........................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2 : ...........................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 01 năm 2013

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ..............................................................

2. ..............................................................
3. ..............................................................
4. ..............................................................
5. ..............................................................

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA…………


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Cao Xuân Yến .................................................MSHV: 10310949 ...........
Ngày, tháng, năm sinh: 06/01/1983 ..........................................Nơi sinh: Đồng Nai .........
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học ....................................... Mã số : ........................
I. TÊN ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
LACTASE CỦA LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
1. Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase cao.
2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp lactase.
3. Tối ưu các điều kiện tổng hợp lactase từ giống vi sinh vật tuyển chọn.
4. Thu nhận enzyme lactase thô

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):
PGS..TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
.............................................................................................................................................

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 20....
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA….………
(Họ tên và chữ ký)


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

CAO XUÂN YẾN

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP LACTASE CỦA
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học
Mã số:………………

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013

i


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương ....................

Cán bộ chấm nhận xét 1 : ...........................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2 : ...........................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 01 năm 2013
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ..............................................................
2. ..............................................................
3. ..............................................................
4. ..............................................................
5. ..............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA…………

ii


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành tốt luận văn này, tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn lịng biết
ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, người đã hướng dẫn, gợi mở đề tài,
chỉnh sửa, dìu dắt, động viên, khích lệ, tạo nhiều điều kiện và giúp tơi trưởng thành
hơn sau thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã dạy
dỗ, truyền đạt những kiến thức chuyên ngành và kinh nghiệm sống giúp tôi tự tin hồn
thành tốt đề tài mình theo đuổi; cán bộ ba phịng thí nghiệm của Bộ Mơn Cơng Nghệ
Sinh Học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi có thể sử dụng các trang thiết bị và
dụng cụ thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến hai em Tính, Hồng Anh, chị Ngọc, anh Truyền
và các em SV lớp SH08, đặc biệt là các bạn ở phòng 102B2 đã đồng hành, giúp đỡ,
chia sẻ những kinh nghiệm và niềm vui, nỗi buồn trong quá trình làm luận văn; Anh
Đại, anh Quốc, chị Tuyến, chị Lệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong cơng việc để tơi có
thể hồn tất cơng việc và việc học.
Và tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến Quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã
dành thời gian quý báu đọc và nhận xét luận văn.

iii


TÓM TẮT
Tên đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp lactase của Lactobacillus
acidophilus”
Nội dung đề tài:

1. Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase cao.
2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp lactase.
3. Tối ưu các điều kiện tổng hợp lactase từ giống vi sinh vật tuyển chọn.
4. Thu nhận enzyme lactase thô
Kết quả:
1. Đã tuyển chọn và sàng lọc được một chủng Lactobacillus acidophilus có hoạt tính
enzyme lactase cao trong bộ sưu tập vi khuẩn lactic. Enzyme lactase của chủng
L.acidophilus là enzyme nội bào. Vị trí của enzyme lactase: ở periplasmic (17,84%),
cytoplasmic (47,92%), màng tế bào (34,24%) và không hiện diện trong vách tế bào.
2. Về điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme lactase:
 Tỷ lệ cấy giống tối ưu là 10% (v/v)
 Thời gian nuôi cấy thu nhận lactase từ sinh khối L. acidophilus là 18 giờ
nuôi cấy.
 Thành phần môi trường tối ưu cho tổng hợp lactase là: Lactose 27,6 g/L;
Peptone 10 g/L; Cao nấm men 5,84 g/L; Cao thịt 12,9 g/L; Sodium acetate
8g/L; MgSO4.7H2O 1,2 g/L; K2HPO4 5 g/L; Ammonium citrate 4 g/L.
Trong đó, 3 yếu tố lactose, cao nấm men, cao thịt ảnh hưởng cao nhất đến
lượng sinh khối tạo thành và hoạt tính của enzyme lactase.
 Nhiệt độ và pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp lactase của
L.acidophilus tại 35 – 40oC, pH 5,5 -8,0, tối thích tại 37oC, pH 7,5.
3. Về enzyme thơ:
 Nhiệt độ và pH thích hợp cho hoạt động của enzyme lactase là 55oC và pH
6,0
Hoạt tính thủy phân oNPG của enzyme thơ thu được là 1357,2 U/mg protein tại
55 oC, pH6,0.

iv


MỤC LỤC

MỤC LỤC

Trang

Mở đầu
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

1

Lactose và triệu chứng triệu chứng không dung nạp lactose

1

1.1.1

Lactose

1

1.1.2

Hội chứng không dung nạp đường lactose

2

1.2.

Enzyme lactase

4

1.2.1 Cơ chế thủy phân lactose

5

1.2.2 Cơ chế vận chuyển lactose ở vi khuẩn Gram (+)

8

1.2.3 Sự hoạt hóa và ức chế β-galactosidase từ các nguồn khác nhau bởi

11

các cation.
1.2.4 Ứng dụng của β-Galactosidase

12

1.2.5 Các nguồn sản xuất β-galactosidase

12

1.3. Vi khuẩn lactic

12

1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic

15

1.3.2. Phân loại

16

1.3.3. Một số loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp lactase

16

1.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

20

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

22

enzyme β-galactosidase
1.4. Thu nhận enzyme

24

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài

27

Chương 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

33

2.1. Vật liệu

33

v


2.1.1. Các chủng sinh vật

33

2.1.2. Môi trường.

33

2.1.3. Đệm và thành phần

33

2.1.4. Hóa chất

33

2.2 Nội dung nghiên cứu

34

2.3. Phương pháp

35

2.3.1. Phương pháp sàng lọc chủng vi sinh vật cho hoạt tính lactase

35

2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lactase với cơ chất ONPG

35

2.3.3. Phương pháp xác định nồng độ protein theo phương pháp Lowry

36

2.3.4. Thí nghiệm xác định đường cong tăng trưởng và hoạt tính enzym
của vi sinh vật

36

2.3.5. Phương pháp xác định vị trí enzyme lactase nội bào
2.3.6 Phương pháp phá tế bào giải phóng β-galactosidase nội bào

37

2.3.7. Thí nghiệm xác định các thơng số mơi trường ni thích hợp

38

2.3.8 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính lactase

38

của L. acidophilus.

42

2.3.9. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy L.acidophilus theo phương pháp qui
hoạch thực nghiệm

42

2.3.10. Đặc tính enyme lactase trong dịch thơ (nội bào)

44

2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu

45

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

45

3.1. Kết quả sàng lọc chủng vi sinh vật có hoạt tính lactase

46

3.2. Kết quả kiểm tra hình thái L. acidophilus

47

3.3. Kết quả khảo sát quá trình sinh trưởng của L.acidophilus

47

3.3.1. Khảo sát tỷ lệ cấy giống tối ưu

47

3.3.2. Đường quan hệ tuyến tính giữa OD600nm và mật độ vi sinh vật bằng
vi


phương pháp đếm khuẩn lạc

47

3.3.3. Các pha tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus

48

3.4 Xác định vị trí lactase

50

3.5. Kết quả khảo sát thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp

52

lactase
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn đường

52

3.5.2. Khảo sát nồng độ lactose tối ưu

53

3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

54

3.5.4. Khảo sát nồng độ peptone
55
3.5.5. Khảo sát nồng độ cao nấm men
56
3.5.6. Khảo sát nồng độ cao thịt
58
3.5.7. Xác định nồng độ ammonium citrate
59
3.5.8. Khảo sát hàm lượng sodium acetate
61
3.5.9. Khảo sát nồng độ K2HPO4

62

3.5.10. Khảo sát nồng độ MgSO4

66

3.6. Ảnh hưởng của điều kiện ni cấy đến sinh khối và hoạt tính lactase của
L. acidophilus.
3.6.1. Khảo sát nhiệt độ
3.6.2. Khảo sát pH

69

3.7. Tối ưu hóa mơi trường ni cấy L. acidophilus theo qui hoạch thực
nghiệm

69

3.7.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme
lactase thu được từ L.acidophilus

69

3.7.2. Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng lactase
3.8. Đặc tính của enzyme β-galactosidase trong dịch chiết enzyme thô
3.8.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ

69
74
75

vii


3.8.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lactase thô

77

3.8.3. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản ở nhiệt độ 10oC đến hoạt tính

74

enyme lactase thơ

75

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

77

4.1. Kết luận

79

4.2. Kiến nghị

79

TÀI LIỆU THAM KHẢO

80

PHỤ LỤC

81

viii


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 1.1 : Một số tính chất vật lý của lactose

1

Bảng 1.2. Tâm hoạt động và những đặc tính của β-galactosidase từ nhiều

7

nguồn vi sinh vật khác nhau (Zhou và Chen 2001) [44]
Bảng 1.3. Một số đặc trưng của enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình

8

Bảng 1.4. Các nguồn sản xuất lactase [16]

13

Bảng 1.5. Những đặc tính của lactase từ vi sinh vật (Gekas, López-Leiva 1985)

14

Bảng 1.6. Các sản phẩm lactase thương mại [19]

15

Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman

40

Bảng 2.2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman.

40

Bảng 3.1. Kết quả định tính hoạt tính lactase

43

Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể của Lactobacillus acidophilus

44

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy lên mật độ L. acidophilus

44

o

sau 24 giờ ni cấy ở 37 C.
Hình 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống lên mật độ

45

Lactobacillus acidophilus sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC
Bảng 3.4. Kết quả dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế

45

bào của Lactobacillus acidophilus
Bảng 3.5. Hoạt tính lactase tạo thành trong q trình tạo sinh khối của chủng

47

L.acidophilus
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính enzyme lactase nội

49

bào
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của lượng tế bào đến hiệu quả phá tế bào (khi thể tích
huyền phù tế bào là 3ml)
Bảng 3.8. Thể tích huyền phù tế bào ảnh hưởng đến hiệu quả phá tế bào giải
ix

50


phóng enzyme lactase khi hàm lượng tế bào 0.3g

50

Bảng 3.9. Nồng độ lactose ảnh hưởng đến sinh khối tạo thành và hoạt tính

51

lactase nội bào ở L.acidophilus
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các loại đường đến sinh khối tạo thành và hoạt tính

52

lactase nội bào ở L.acidophilus
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sinh khối tạo thành và hoạt

53

tính lactase nội bào.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sinh khối tạo thành và hoạt

53

tính lactase nội bào.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ cao men đến hàm lượng sinh khối tạo thành

54

và hoạt tính lactase nội bào.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cao men đến hàm lượng sinh khối tạo thành

54

và hoạt tính lactase nội bào
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến sinh khối tạo thành và hoạt

55

tính lactase nội bào
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của ammonium citrate đến sinh khối tạo thành và hoạt

57

tính lactase ở L. acidophilus
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ sodium acetate đến hàm lượng sinh khối

58

tạo thành và hoạt tính lactase
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ sodium acetate đến hàm lượng sinh khối tạo

59

thành và hoạt tính lactase
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của K2HPO4 đến sinh khối tạo thành và hoạt tính

60

lactase.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Mg2+, Mn2+ đến sinh khối tạo thành và hoạt tính

61

lactase ở L. acidophilus
Bảng 3.18. Nồng độ tối ưu của môi trường nuôi cấy theo thực nghiệm

63

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối tạo thành và hoạt tính lactase

64

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi đến sinh khối tạo thành và

65

x


hoạt tính lactase.
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lactase thơ

66

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lactase thơ

67

Bảng 3.23. Hoạt tính enzyme lactase theo thời gian bảo quản ở 10oC

69

xi


LỜI MỞ ĐẦU
Sữa là một chất lỏng sinh lý được tiết ra từ tuyến vú của động vật và là nguồn thức
ăn để nuôi sống động vật non. Trong sữa, hàm lượng đường lactose chiếm khoảng 45%, là chất làm cho một số người khi uống sữa bị cảm giác đầy bụng, khó tiêu, buồn

nơn,…
Ngun nhân là do hiện tượng không dung nạp được đường lactose trong sữa. -Dgalactoside galactohydrolase (E.C.3.2.1.23) còn gọi là -galactosidase hay lactase, là
enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân lactose thành glucose và galactose, có tiềm
năng rất to lớn trong ngành cơng nghiệp sữa (Domingues và cs, năm 2005, Montanari
và cs, năm 2000, Voget và cs, năm 1994).
Giá trị dinh dưỡng của lactose bị hạn chế do một phần lớn 50% dân số thế giới
thiếu enzyme lactase và không thể sử dụng lactose gây ra bởi hiện tượng thủy phân
kém hoặc không dung nạp lactose (Vasiljevic và Jelen 2002, Furlan, 2000). Điều này
tạo ra một thị trường tiềm năng cho các ứng dụng của enzyme lactase. Các chế phẩm
thủy phân lactose có tác dụng có lợi trong việc đồng hóa các thực phẩm có chứa
lactose dành cho người khơng dung nạp lactose. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất
enzyme lactase và ứng dụng sản xuất sữa nghèo lactose tại Việt Nam là việc rất cần
thiết. Với những yêu cầu trên, đề tài “Sàng lọc và nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
lactase của Lactobacillus acidophilus” có ý nghĩa nhằm sàng lọc chủng vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp lactase cao, tối ưu hóa các điều kiện ni cấy để thu lactase
cao nhất, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sản xuất, tinh sạch và ứng dụng lactase vào
thực tiễn tại Việt Nam.

xii


Chương 1 Tổng quan

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Lactose và triệu chứng không dung nạp lactose
1.1.1 Lactose
Lactose là một disaccharide do một phân tử đường glucose và một phân tử
đường galactose liên kết với nhau tạo thành. Đường lactose chiếm vị trí hàng đầu trong
thành phần glucid của sữa. Trong sữa, đường lactose tồn tại dưới hai dạng là α-lactose

monohydrate (C12H22O11.H2O) và -lactose anhydrous (C12H22O11). Tỷ lệ hàm lượng
α-lactose monohydrate và -lactose anhydrous trong sữa phụ thuộc vào giá trị pH và
nhiệt độ của sữa.

β – lactose

α – lactose

Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo α và β – lactose
Bảng 1.1 : Một số tính chất vật lý của lactose
Đại lượng

Đơn vị đo

α-lactose

β-lactose

monohydrate

anhydrous

Phân tử lượng

Da

360

342

Nhiệt độ nóng chảy

o

C

202

242

Độ hịa tan ở 15 oC

g đường/ 100g nước

7

50

Góc quay cực [α]20

độ

+ 89,4

+ 35

Lactose là đường khử. Độ ngọt của lactose thấp hơn nhiều so với các
disaccharide và monosaccharide thường gặp. Nếu như độ ngọt của saccharose được
Trang 1

Chương 1 Tổng quan

đánh giá với chỉ số 100, maltose là 32, glucose là 74, fructose là 173 thì độ ngọt của
lactose chỉ đạt 16. Độ hòa tan trong nước cũng kém hơn.
Lactose có thể bị thủy phân tạo ra hai monosaccharide là glucose và galactose
bởi enzyme -galactosidase (lactase).
Các đường đơn giản như glucose, fructose, saccharose có nhiều trong thực vật
(hoa, trái cây các loại,…). Tuy nhiên chỉ có sữa động vật là nguồn chứa lactose duy
nhất trong tự nhiên. (Lê Văn Việt Mẫn 2010)
1.1.2 Hội chứng không dung nạp đường lactose
Sữa là một trong những sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao nhất.
Trong sữa có đầy đủ tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết và dễ được cơ thể hấp thụ.
Ngồi các thành phần chính là protein, lactose, các chất béo, muối khống cịn có tất
cả các loại vitamin, các enzyme, các nguyên tố vi lượng.
Protein của sữa rất đặc biệt, có chứa nhiều và hài hòa các acid amin cần thiết.
Hàng ngày, mỗi người chỉ cần dùng 100g protein sữa đã có thể thỏa mãn hoàn toàn
nhu cầu về acid amin. Cơ thể người sử dụng protein sữa để tạo thành hemoglobin dễ
dàng hơn bất cứ protein của thực phẩm nào khác.
Lactose được tìm thấy có nồng độ cao trong sữa và các sản phẩm bơ sữa, chiếm
4,5 – 5% trong sữa bò, hơn 1/3 thành phần pha rắn trong sữa, 20% trong kem và
khoảng 72% trong pho mai cứng, có vai trị sinh học quan trọng như thúc đẩy sự phát
triển của các vi khuẩn đường ruột và cung cấp galactose, thành phần dinh dưỡng cần
thiết cho quá trình tạo galato-oligosaccharide và galactolipid ở não.
Động vật có vú sinh được sinh ra đã có dư β-galactosidase. Nồng độ
galactosidase ở động vật trưởng thành, con người chỉ còn khoảng 1/10 so với lúc nhỏ.
Tuy nhiên có sự khác biệt ở một vài nhóm dân số, nồng độ β-galactosidase lúc nhỏ vẫn
duy trì đến lúc trưởng thành. Ở Bắc Châu Âu và Tây Bắc Ấn Độ, lactase có xu hướng
bảo tồn ở người lớn. Nguyên nhân là do việc sử dụng các sản phẩm từ sữa như pho
mát trong suốt mùa đông khi nguồn cung cấp lương thực cơ thể bị hạn chế. Do đó, có

thể kết luận rằng việc thiếu hụt lactase (được gọi là không dung nạp lactose hoặc

Trang 2


Chương 1 Tổng quan

alactasia) không phải là một bệnh, nhưng sự tồn lưu của lactase vào tuổi trưởng thành
là sự thích ứng sinh học với việc sử dụng các sản phẩm từ sữa.
Để cơ thể hấp thu được thì đường lactose cần phải được phân tách thành đường
glucose và galactose. Quá trình này xảy ra ở phần trên của ruột non bởi enzyme
lactase. Hình ảnh điển hình của hiện tượng khơng dung nạp lactose là khó chịu ngay
sau khi dùng sữa hoặc các sản phẩm từ sữa, kèm theo các triệu chứng bị đau bụng,
buồn nôn, cảm giác đầy hơi ngắn, nhanh và tiêu chảy.
Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật ra là do trong cơ thể thiếu enzyme
lactase để chuyển hóa lactose. Nếu thiếu men lactase ở ruột non thì đường lactose
khơng được phân tách và sẽ khơng được hấp thu vào máu mà bị tồn đọng ở ruột, dẫn
đến những rối loạn tiêu hóa. Đây là nguyên nhân làm cho ta không uống được sữa.
Nhiều người nhầm lẫn giữa bất dung nạp đường lactose và dị ứng sữa. Bản chất của dị
ứng sữa là do hệ miễn dịch của cơ thể phản ứng với protein có trong sữa dẫn đến
những rối loạn. Bất dung nạp đường lactose khơng liên quan đến hệ miễn dịch, chỉ vì
cơ thể thiếu lactase để tiêu hóa lactose vì thế lactose sẽ bị cơ thể tống ra ngoài dưới
dạng tiêu chảy. Ở người, vấn đề khó khăn trong tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, ở
độ tuổi thanh thiếu niên chiếm khoảng 70% số thanh thiếu niên của thế giới (Paige,
2005).
Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến sự bất dung nạp lactose: Do di truyền, thiếu
lactase thứ phát, chưa khả năng hoàn thiện khả năng sản xuất enzyme lactase.
- Do di truyền
• Thiếu enzyme lactase nguyên phát: là bệnh lý di truyền gây thiếu hụt enzyme
lactase. Triệu chứng có thể xuất hiện ở bất kỳ lứa tuổi nào, tuy nhiên ít khi xuất hiện

trước 6 tuổi.
• Thiếu enzyme lactase bẩm sinh: Thiếu hụt hoàn toàn enzyme lactase từ ngay sau
sinh. Triệu chứng xuất hiện ngay từ khi bé được cho ăn sữa.
- Thiếu lactase thứ phát: Xảy ra khi những tế bào niêm mạc ở phần trên của ruột non
(là những tế bào sản xuất ra enzyme lactase) bị tổn thương. Hiện tượng này hay gặp ở
trẻ em và thường xảy ra sau khi cơ thể bị tiêu chảy, viêm dạ dày, ruột hoặc có thể do
hóa trị liệu.
Trang 3


Chương 1 Tổng quan

-

Chưa hoàn thiện khả năng sản xuất enzyme lactase: Sau khi sinh ra trẻ cần một

khoảng thời gian để có thể sản sinh một lượng đủ enzyme lactase. Trẻ đẻ non thường
có lượng lactase thấp dẫn đến thiếu hụt enzyme lactase tạm thời. Hiện tượng trên sẽ
hết khi trẻ lớn dần lên.
Trong hệ tiêu hóa ở người có hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có
hơn 400 lồi vi sinh vật khác nhau (Peterson et al, 2002), chúng được xếp vào 2 loại:
vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật có ích. Các loài vi sinh vật sống chung với nhau tạo
thành hệ sinh thái ổn định, cân bằng và là hàng rào bảo vệ, giúp cơ thể chống lại các
tác nhân gây bệnh đường ruột cũng như duy trì một số hoạt động chuyển hóa của cơ
thể. Vi sinh vật có ích càng nhiều thì cơ thể càng khỏe mạnh.
Để tăng khả năng dung nạp lactose, phương pháp lý tưởng nhất là tăng khả
năng sinh tổng hợp enzyme lactase ngay trong cơ thể. Con đường này rất khó khăn và
cần rất nhiều thời gian. Do đó, việc sử dụng enzyme từ các nguồn khác là một giải
pháp tất yếu, trong đó enzyme từ nguồn vi sinh vật là phương pháp khả thi và kinh tế
nhất.

Hiện nay lactase được nghiên cứu khá đầy đủ và các sản phẩm lactase thương
mại chủ yếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyverromyces lactics,
Kluyverromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces
fragilis, Candida pseudotropicalis,…. Ngồi ra, lactase cịn được sản xuất từ vi khuẩn
(chủ yếu là Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus và vi
khuẩn Gram âm E.coli ), nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp,…)
1.2 Enzyme lactase
Lactase là tên gọi thông thường của enzyme β-D-galactosidase hoặc đầy đủ hơn
là β-D-galactoside - galactohydrolase. β-galactosidase là một trong những enzyme
thủy phân đầu tiên được phát hiện. β-galactosidase không chỉ xúc tác thủy phân lactose
tạo glucose và galactose mà còn xúc tác phản ứng transglycosyl tạo thành galactooligosaccharides (Prenosil et al, 1987).
Cơ chất tự nhiên của lactase là lactose, phân tử đường chính trong sữa, chiếm
khoảng 4,5 – 5%.
Trang 4


Chương 1 Tổng quan

1.2.1. Cơ chế thủy phân lactose
Wallenfels và Malhotra (1961) đã miêu tả cơ chế thủy phân lactose bằng lactase
thu được từ E.coli hoặc từ nấm men. Trong đó có hai cơ chế: thủy phân lactose tạo
glucose và galactose; phản ứng chuyển nhóm galactosyl cho một hợp chất mang nhóm
OH.
Cơ chế phản ứng đầu tiên được đề xuất cho rằng phần hoạt động của βgalactosidase chứa các gốc xúc tác cysteine mang nhóm sulfhydryl hoạt động như chất
cho proton và histidine mang nhóm imidazole là chất nhận electron đóng vai trị là
tác nhân chính tạo điều kiện thuận lợi cho phá vỡ liên kết glycosidic, phản ứng chính
diễn ra trong suốt quá trình thủy phân. (Mahoney 1998, Zhou và Chen 2001). Cơ chế
thủy phân lactose bởi β-galactosidase thành glucose và galactose được trình bày ở hình
1.2.

Hình 1.2: Cơ chế thủy phân lactose bởi β-galactosidase. Nhóm sulfhydryl hoạt động như chất
cho proton và nhóm imidazole hoạt động như chất nhận proton. (Richmond et al. 1981)

Trong phản ứng hình thành GOS, phức hợp enzyme-galactosyl được hình thành
(hình 1.2) và chuyển nhóm galactosyl đến chất nhận có chứa nhóm hydroxyl (hình
1.3).

Hình 1.3. Cơ chế phản ứng xúc tác chuyển đổi galactosyl bởi β-galactosidase tạo
thành hợp chất galactosyl (Richmond et al. 1981)

Trang 5


Chương 1 Tổng quan

Cơ chế xúc tác mới của β-galactosidase được đề xuất và được chấp nhận rộng rãi.
Trong đó đóng vai trị xúc tác là hai axit glutamic (Zhou và Chen 2001). βgalactosidase từ nhiều nguồn vi sinh vật đều có hai axit glutamic xúc tác này, chẳng
hạn như Glu482 và Glu551 lactase của nấm men. Một nhóm đóng vai trị là nhân tố cho
proton và nhóm đóng vai trị là tác nhân nền khi hình thành phức hợp cơ chất enzym
hoạt hóa trong phản ứng enzyme.

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân lactose đồng thời galactosyl hóa hợp chất chứa nhóm -OH bởi enzym
β-galactosidase từ nấm men trong đó có sự tham gia của hai gốc xúc tác Glu482 và Glu551

(Zhou và Chen 2001).
Khi nồng độ lactose trong dung dịch thấp, phân tử nước cạnh tranh mạnh hơn
với chất nhận mang nhóm -OH, do đó khơng xảy ra bước galactosyl hóa, galactose
được hình thành và giải phóng khỏi vùng hoạt động. Nhưng khi nồng độ lactose cao,
phân tử lactose trở thành chất nhận, lactose kết hợp với phức hợp enzyme-galactose để
hình thành các galacto-oligosaccharide (GOS). (Zhou và Chen 2001)

Hoạt tính phân hủy lactose của lactase được xác định bằng 2 cách là thông qua sự
mất đi của cơ chất là lactose, hoặc thông qua sự tạo thành của sản phẩm đặc trưng cho
phá vỡ liên kết 6-glycoside. Thông thường người ta thường dùng cơ chất đặc hiệu

Trang 6


Chương 1 Tổng quan

ONPG (o-nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác định lượng ONP (o-nitrophenyl) tạo
thành.
Các lactase khác nhau có dải hoạt động pH khác nhau, từ axit yếu đến trung tính
(từ 4,0 – 6,5), tùy thuộc vào nguồn gốc. Lactase của nấm sợi có pH hoạt động axit hơn,
cịn lactase của các vi khuẩn và nấm men ưa pH gần trung tính hơn.
Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-45oC (nhiệt độ trung bình),
một số khác từ 45-65 oC (ưa nhiệt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở nhiệt
độ lạnh 4 oC. Đặc biệt một số enzyme đòi hỏi ion kim loại để hoạt hóa.
Mặc dù các enzyme có nguồn gốc từ các vi sinh vật khác nhau có tính chất khác
nhau, chẳng hạn như khối lượng phân tử, chiều dài chuỗi protein và vị trí các vùng
hoạt động, nhưng kiểu xúc tác của β-galactosidase tương tự nhau bởi sự tham gia của
từng cặp axit glutamic xúc tác, thể hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tâm hoạt động và những đặc tính của β-galactosidase từ nhiều nguồn
vi sinh vật khác nhau
Nguồn gốc enzyme

K.lactis

E.coli

E.coli

A.niger

Khối lượng phân tử (Da)

117618

116351

118016

119160

Chiều dài (AA)

1025

1023

1031

1006

Chất cho proton

Glu482

Glu461

Glu449

Glu200

Nucleophile/ base

Glu551

Glu537

Glu512

Glu298

(Zhou và Chen 2001)

Người và động vật có khả năng dung nạp lactose là do trong thời kỳ mới sinh,
ruột non có khả năng tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose trong sữa mẹ, thành phần
thức ăn chính của con non.
Đến tuổi trưởng thành các gen này hầu như ngưng hoạt động do vậy cơ thể tiêu
hóa lactose rất kém. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự dung nạp latose có thể được hỗ trợ bởi
hệ vi sinh niêm mạc ruột non, trong đó có vai trị của các vi sinh vật lên men lactose
như Lactococcus và Bifidobacterium. Đây chính là cơ sở của việc đưa các vi sinh vật
này vào một số dòng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa.
Trang 7


Chương 1 Tổng quan

Bảng 1.3. Một số đặc trưng của enzyme lactase ở một số lồi vi sinh điển hình

Nguồn

Giá trị pH tối ưu

Giá trị nhiệt độ

Trọng lượng

tối ưu

phân tử

Ion hoạt hóa

A.niger

3,0 – 4,0

55 – 60

124

A.oryzae

5,0

50 – 55

90

Mn2+, K+

K.fragilus

6,9 – 7,3

37

201

Mn2+, Na+

7,2

35

135

K+, Na+

E.coli

6,2 – 7,1

40

540

L.thermophilus

3,4 – 4,3

55- 57

530

C.inaegualis

6,0

30-55

B.circulans

6,8

60 – 65

Bacillus sp

6,5 – 7,5

65

K.lactis

L.burgaricus
S.thermophilus

Hoạt động cao ở

sữa không béo

42 – 45
55

500 - 600

(Gikas and López-Leiva 1985)

1.2.2. Cơ chế vận chuyển lactose ở vi khuẩn Gram (+)
Hầu hết các tế bào vi khuẩn có khả năng sử dụng một vài carbohydrate như
nguồn carbon và nguồn năng lượng. Tế bào sở hữu các protein vận chuyển, enzyme
xúc tác cho q trình dị hóa các carbohydrate khác nhau. Các hệ thống mà các phân tử
carbohydrate được vận chuyển có thể được chia thành 3 loại có sự khác biệt trong cơ
chế kết hợp năng lượng: (a) hệ thống vận chuyển sơ cấp, (b) hệ thống vận chuyển thứ
cấp, (c) hệ thống PEP-PTS (Phoshoenolpyruvate Dependent Phoshotransferase).

Trang 8


Chương 1 Tổng quan

1.2.2.1 Hệ thống vận chuyển sơ cấp
Hệ thống vận chuyển sơ cấp sử dụng năng lượng từ sự thủy phân liên kết giàu
năng lượng (chẳng hạn như ATP, hình 1.5) cho sự vận chuyển đường. Ở vi khuẩn
Gram (+), các chất vận chuyển cần ATP có rất nhiều loại trong hệ thống vận chuyển
sơ cấp. Những protein vận chuyển chất tan vào trong tế bào không chỉ gắn kết tương
thích với chất tan mà cịn cần ATP. Tương tự các protein vận chuyển này cịn có khả
năng loại thải những sản phẩm khơng cần thiết ví dụ như thuốc ra khỏi tế bào.

Raffinos

aga
Sucrose

Melibiose

Isomaltotriose

in

in

aga
Galactose

dexB
Glucose
Maltose
dexB

Pi

in

gtfA
Glc-6P

Leioir pathway

Glycolysis

+
Frutose
Glycolysis

Hình 1.5. Các ATPase vận chuyển hợp chất tan (trong đó có lactose) và chuyển
hóa nhiều loại đường khác nhau bởi các enzym: aga (α-galactosidase), dexB
(dextran glucosidase) và GftA (sucrose phosphorylase).
(Poolman 1993)
1.2.2.2. Hệ thống vận chuyển thứ cấp
Ở hệ thống vận chuyển thứ cấp, sự chuyển vị phân tử đường được thực hiện
theo gradient nồng độ và nếu phân tử khác có cùng kênh vận chuyển với carbohrydrate
theo gradient điện hóa thì sự vận chuyển đó đạt được bởi khuynh độ xi dịng của
Trang 9


Chương 1 Tổng quan

phân tử kia (hình 1.5). Ở Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cũng như ở
Streptococcus thermophilus (S.thermophilus), lactose được vận chuyển bởi chất vận
chuyển thứ cấp. Những chất vận chuyển lactose biến đổi đặc hiệu không chỉ với
lactose mà cịn với melibiose (α-galactoside), galactose... Những gen mã hóa protein
vận chuyển lactose (lacS) của S. thermophilus và L.bulgaricus đã được tạo dòng, cấu
trúc và chức năng được biểu hiện ở E.coli. Protein vận chuyển lactose hoạt động ở
cổng bên trong cùng với kênh đồng chuyển H+ . (Poolman 1993)

lacZ
Galactose

+

Glucose

ATP
galk

ATP

ADPGal-1-P

ADP

UDPglc
glk

galE

galT
UDPgal
Glc-6-P

Glc-1-p
pgm

Glycolysis
+

Hình 1.6. Kênh đồng chuyển galactoside H và con đường Leloir. lacZ, β-galactosidase;
galK, galactokinase; galT, UDPglucose: galactose 1-phosphate uridylyl transferase; galE,

UDPglucose 4-epimerase; pgm, phosphoglucomutase; glk, glucokinase.

(Poolman 1993)

Trang 10