Nghiên cứu quá trình trích ly xanthones từ vỏ quả măng cụt (garcinia magostana l ) bằng chất lỏng siêu tới hạn báo cáo tổng kết kết quả đề tài khcn cấp trường msđt t kthh 2013 39

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
O
BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI KHCN CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU Q TRÌNH TRÍCH LY XANTHONES TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT
(GARCINIA MANGOSTANA L.) BẰNG CHẤT LỎNG SIÊU TỚI HẠN

Mã số đề tài:

T-KTHH-2013-39

Thời gian thực hiện:

12 tháng (từ 05/2013 đến tháng 05/2014)

Chủ nhiệm đề tài:

Hoàng Minh Nam
Nguyễn Thị Ngọc Tuyết

Cán bộ tham gia đề tài: Lê Thị Kim Phụng
Đào Công Thanh

Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 04/2014


Danh sách các cán bộ tham gia thực hiện đề tài
(Ghi rõ học hàm, học vị, đơn vị công tác gồm bộ mơn, Khoa/Trung tâm)

1.

GVC.ThS. Hồng Minh Nam – Bộ mơn Q trình và Thiết bị – Khoa Kỹ
thuật Hóa học

2.

PGS.TS. Lê Thị Kim Phụng – Bộ mơn Q trình và Thiết bị – Khoa Kỹ thuật
Hóa học

3.

CN. Nguyễn Thị Ngọc Tuyết – Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM
Cơng nghệ Hóa học và Dầu khí – Khoa Kỹ thuật Hóa học

4.

CN. Đào Cơng Thanh – Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM Cơng
nghệ Hóa học và Dầu khí – Khoa Kỹ thuật Hóa học


MỤC LỤC
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................................................... 1
1.1. Đại cƣơng về cây măng cụt Garcinia mangostana Linn. ........................................................ 1
1.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT PHƢƠNG PHÁP ................................................................................. 6
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ......................................................................................... 6
1.3. Trích ly sử dụng chất lỏng siêu tới hạn .................................................................................... 7
Chƣơng 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 15
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị và hóa chất ............................................................................ 15

2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................................... 15
2.1.2. Trang thiết bị ....................................................................................................................... 15
2.1.3. Hóa chất .............................................................................................................................. 15
2.2. Xây dựng quy trình phân tích α-mangostin bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ......... 15
Chƣơng 3: KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG XANTHONE .................... 19
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ALPHA MANGOSTIN .................................. 19
3.2.3.5. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ....................................... 23
Chƣơng 4: KHẢO SÁT CÁC PHƢƠNG PHÁP TRÍCH LY ALPHA MANGOSTIN TỪ VỎ
QUẢ MĂNG CỤT ........................................................................................................................ 26
4.1. KẾT QUẢ .............................................................................................................................. 26
4.2. NHẬN XÉT ........................................................................................................................... 27
Chƣơng 5: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN Q TRÌNH TRÍCH LY ALPHA
MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT BẰNG CO2 SIÊU TỚI HẠN .................................. 29
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 37


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Lá, hoa và quả măng cụt ................................................................................................. 1
Hình 1.2. Minh họa các lực tƣơng tác trong quá trình sắc ký ......................................................... 7
Hình 1.3. Minh họa quá trình tách chất trong sắc ký ...................................................................... 7
Hình 1.5. Giản đồ PVT của một cấu tử tinh khiết và hình chiếu lên mặt phẳng PT ...................... 8
Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu phân tích ở các tỉ lệ pha động MeOH – H2O khác nhau ...................... 19
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu phân tích ở các nhiệt độ buồng cột khác nhau ..................................... 20
Hình 3.3. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử ........................................................................... 22
Hình 3.4. Đƣờng biểu diễn sự tƣơng quan nồng độ và diện tích peak của α-mangostin .............. 24
Hình 3.5. Sắc ký đồ của các chuẩn α-mangostin với các nồng độ khác nhau .............................. 24
Hình 4.1. Kết quả hàm lƣợng α-mangostin, độ chọn lọc và % α-mangostin của các phƣơng pháp
khác nhau ...................................................................................................................................... 27
Hình 4.2. Hình chụp SEM của các mẫu ban đầu và sau khi trích ly với các phƣơng pháp khác
nhau ............................................................................................................................................... 28

Hình 5.1 Khảo sát thời gian trích ly bằng CO2 siêu tới hạn.......................................................... 29
Hình 5.2. Giá trị thực với giá trị dự đốn hiệu suất trích ly α-mangostin .................................... 31
Hình 5.3. Giá trị thực với giá trị dự đoán độ chọn lọc α-mangostin ............................................. 31
Hình 5.4. Hiệu suất trích ly α-mangostin theo P,Q ở T = 313K .................................................. 33
Hình 5.5. Hiệu suất trích ly α-mangostin trên theo P,Q ở T = 323K ............................................ 33
Hình 5.6 Hiệu suất trích ly α-mangostin theo P,Q ở T = 333K .................................................... 33
Hình 5.7. Độ chọn lọc α-mangostin theo P, T ở Q = 10 g/phút ................................................... 34
Hình 5.8. Độ chọn lọc α-mangostin theo P, T ở Q = 15 g/phút .................................................... 34
Hình 5.9. Độ chọn lọc α-mangostin theo P, T ở Q = 20 g/phút .................................................... 34
Hình 5.10 Tối ƣu hiệu suất trích ly α-mangostin .......................................................................... 36
Hình 5.11. Tối ƣu độ chọn lọc α-mangostin ................................................................................. 36
Hình 5.12. Tối ƣu hiệu suất trích ly và độ chọn lọc α-mangostin ............................................... 36


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần các chất xanthone đƣợc phân lập từ vỏ quả măng cụt[3] ........................... 1
Bảng 1.8. Tính chất vật lý của chất ở trạng thái khí, hơi và siêu tới hạn[1, 2] ............................... 8
Bảng 1.9. Đặc điểm của CO2 .......................................................................................................... 9
Bảng 1.10. Khối lƣợng riêng của CO2 ở các giá trị nhiệt độ và áp suất khác nhau (kg/m3) ........ 10
Bảng 2.1. Các điều kiện pha động đƣợc khảo sát ......................................................................... 16
Bảng 2.2.Pha dung dịch chuẩn α-mangostin................................................................................. 17
Bảng 3.3. Bảng khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động ................................................................ 19
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tính tƣơng thích hệ thống của α-mangostin chuẩn............................ 21
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính tƣơng thích hệ thống của α-mangostin trong mẫu ..................... 21
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại ........................................................................................... 23
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của α-mangostin .................................................................. 23
Bảng 3.8. Bảng kết quả xây dựng đƣờng chuẩn α-mangostin ...................................................... 24
Bảng 3.9. Bảng kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ............................... 24
Bảng 4.1. Bảng kết quả hàm lƣợng α-mangostin và độ chọn lọc của các phƣơng pháp khác nhau
....................................................................................................................................................... 26

Bảng 5.1. Kết quả khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng. .................................................................. 29
Bảng 5.2. Tổng hợp các giá trị quan sát........................................................................................ 30
Bảng 5.3. Kết quả đánh giá ý nghĩa phƣơng trình hồi quy ........................................................... 30
Bảng 5.4. Giá trị các hệ số hồi quy hàm đa thức bề mặt đáp ứng hiệu suất trích ly α-mangostin 31
Bảng 5.5. Hệ số hồi quy hàm đa thức bề mặt đáp ứng độ chọn lọc α-mangostin......................... 33



Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về cây măng cụt Garcinia mangostana Linn.
Măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana Linn. (G. mangostana L.), là
loài cây thuộc họ bứa (Clusiaceae), cũng là một loại cây ăn quả nhiệt đới. Cây gỗ vừa, có
thể cao đến 20 – 25 m, phân nhiều nhánh đối chéo nhau và nằm ngang. Thân cây non màu
xanh lục, mặt ngồi có nhiều khía dọc tiết diện hình chữ nhật. Thân cây trƣởng thành có
màu xám đen, sần sùi, có nhiều rãnh nứt dọc tiết diện trịn.

Hình 1.1: Lá, hoa và quả măng cụt
Những nghiên cứu về các hợp chất hóa học liên quan đến măng cụt chủ yếu hƣớng
về vỏ quả. Thành phần nghiên cứu chủ yếu là hợp chất xanthone. Hơn 200 loại xanthone
đƣợc biết đến trong tự nhiên thì có tới 50 loại xanthone đƣợc tìm thấy trong vỏ măng cụt.
Một số nghiên cứu đã xác định đƣợc một số loại xanthone từ các bộ phận của măng cụt
đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 1.1. Thành phần các chất xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt[3]
Tác giả nghiên cứu

Xanthone

Schmid (1855), Yates, Stout (1958),

α-Mangostin

Stout và Krahn (1968)
Dragendorff (1930), Yates, Bhat

β-Mangostin

(1968), Mahabusarakam et al.(1987)
Jefferson et al. (1970),

γ-Mangostin

Mahabusarakam et al. (1987), Jinsart
et al.(1992)
Chairungsrilerd (1996a), Suksamrarn

Mangostanol

et al. (2002, 2003), Huang et al.(2001)

Mangostenol

Suksamrarn et al. (2002, 2003)
Mahabusarakam et al. (1987), Jung et

1-Isomangostin

al. (2006)

Trang 1

1-Isomangostin hydrate

Mahabusarakam et al. (1987)
Huang et al. (2001), Mahabusarakam

3-Isomangostin

et al. (1987)

3-Isomangostin hydrate

Mahabusarakam et al. (1987)

1,6-Dihydroxy-7-methoxy-8-isoprenyl-60,60dimethylpyrano(20,30:3,2)xanthone
Toxyloxanthone A (trapezifolixanthone)

Suksamrarn et al. (2003)
Suksamrarn et al. (2002, 2003)
Mahabusarakam et al. (1987) và Sen

Calabaxanthonea

et al. (1980a)
Mahabusarakam et al. (1987),

Demethylcalabaxanthone

Suksamrarn et al. (2003)

Caloxanthone

A Iinuma et al. (1996)

Macluraxanthone

Iinuma et al. (1996)

1,7-dihydroxyxanthone

Iinuma et al. (1996)

Euxanthone

Gopalakrishnan et al. (1997)

Cudraxanthone

Jung et al. (2006)

8-hydroxycudraxanthone G

Jung et al. (2006)

Esmeatxanthone A

Jung et al. (2006)

Măng cụt có mùi thơm nhờ một số lớn các chất dễ bay hơi. Phổ sắc ký tinh
dầu trích ly phát hiện khoảng 50 hợp chất hữu cơ, trong số ấy hơn 30 chất đã đƣợc xác

định[4]. Nhiều nhất theo phần trăm là hexenol (27.27%), tƣơng đối ít hơn là octan
(14,76%), đứng trƣớc hexyl acetat (7.87%), α-copaen (7.28%), aceton (5.65%), furfural
(4.89%),hexanol (4.38%), methyl butenon (4.34%), toluen (2.80%). Những chất khác đều
dƣới 2% nhƣng góp phần với các chất trên cấu thành hƣơng vị của măng cụt. Ngoài hexyl
acetat và hexenyl acetat đặc biệt của măng cụt, mùi trái cây là do các chất hexenal,
hexanol, α-bisabolen mà ra, thêm vào mùi xoài với α-copaen, mùi hoa lài với furfuryl
methylceton, mùi huệ dạ hƣơng với phenyl acetaldehyd, mùi cỏ với hexenol, hexanal, mùi
cỏ héo với pyridin, mùi lá ƣớt với xylen, mùi hoa khô với benzaldehyd, mùi hồ đào với δcadinen. Aceton, ethyl cyclohexan đóng góp tính chất dịu ngọt trong lúc toluen, α-terpinol
đem lại mùi đƣờng thắng, methyl butenol, guaien mùi dầu, valencen đặc biệt mùi mứt cam.
Đáng để ý là nếu furfural methylceton là đặc trƣng hƣơng thơm dễ chịu thì furfural lại cho
thống vào một mùi hơi khó ngửi.
Thành phần chính của vỏ quả măng cụt đã đƣợc xác định là một loạt xanthone mà
những chất chính là mangostin[5-7], α-mangostin[8, 9], β-mangostin[5-7], γ-mangostin[6,
Trang 2


8],

các

isomangostin[10],

normangostin[7],

bên

cạnh

trioxyxanthon[11,

12],

pyranoxanthon[13], dihydroxy methyl butenyl xanthon[9], trihydroxy methyl butenyl
xanthon[8], pyrano xanthenon[14]. Các garcinon A, B, C, D, E [15, 16], mangostinon[9],
garcimangoson A, B, C [17], gartanin [7, 18, 19], egonol [8], epicatechin, procyanidin từ
măng cụt nguồn gốc Việt Nam[20], benzophenon glucosid[21]tuy số lƣợng ít cũng đã đƣợc
tìm ra. Cũng có một vài báo cáo trình bày thành phần hóa học của lá măng cụt. Bên cạnh
protein (7,8 %), tanin (11,2 %), đã đƣợc xác định là các trihydroxy methoxy methyl
butenyl xanthon[19], ethyl methyl maleimid glucopyranosid [22], cùng các triterpenoid
nhƣ cycloartenol, friedlin, β-sitosterol, betulin, mangiferadiol, mangiferolic acid,
cyclolanostendiol [23], hydroxy cyclolanostenon[24].
Từ ruột thân cây, tetrahydroxy xanthon và dẫn xuất O-glucosid của nó cùng
pentahydroxy xanthon, maclurin, cũng đã đƣợc tìm ra[25]. Cịn tử y thì chứa đựng
mangostin, các calaba xanthon, dihydroxy và trihydroxy dimethyl allyl xanthon [10].
* Hoạt chất kháng oxi hóa
Các hoạt tính kháng oxi hóa của xanthone đã đƣợc chứng minh bằng các phƣơng
pháp nhƣ phƣơng pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), phƣơng pháp ABTS (2,20azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), phƣơng pháp ferric thiocyanate.
* Tính kháng ung thư
Một vài nghiên cứu đƣợc thiết lập nhằm khảo sát hoạt tính kháng ung thƣ của các
hợp chất xanthone phân lập từ vỏ quả măng cụt. Các dòng tế bào ung thƣ biểu bì gan,
SKBR3 ung thƣ vú ở ngƣời, bệnh bạch cầu ở ngƣời đã đƣợc dùng cho việc thử nghiệm khả
năng kháng ung thƣ của các hoạt chất này.
Các kết quả trên cho thấy α– mangostin và các dẫn xuất là những dƣợc chất tiềm
năng trong các ứng dụng phịng ngừa và điều trị ung thƣ.
* Tính kháng viêm và chống dị ứng
Trong nhiều mơ hình thí nghiệm khác nhau, tính chất kháng viêm và chống dị ứng
của măng cụt đã đƣợc chứng minh, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 2.4
* Tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus
α-mangostin
Công thức phân tử

C24H26O6

Trang 3


Công thức cấu tạo

Tên theo danh pháp IUPAC

3,6,8-Trihydroxy-2-methoxy-1,7-bis(3-methylbut-2enyl)xanthen-9-one

Khối lƣợng phân tử

410.45 g/mol

Trạng thái

Tinh thể rắn màu vàng

Điểm nóng chảy

182 °C, 455 K, 360 °F

Mangostin là xanthonoid tự nhiên, một loại hợp chất hữu cơ đƣợc phân lập từ các
phần khác nhau của cây măng cụt (G. mangostanaL.). Nó là tinh thể rắn màu vàng với cấu
trúc vòng xanthone. Mangostin và các xanthone khác từ cây măng cụt đã đƣợc nghiên cứu
các đặc tính sinh học nhƣ khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn, … và hoạt tính chống
ung thƣ [26]. Trong các nghiên cứu trên động vật, mangostin đã đƣợc tìm thấy là một hệ
thống thần kinh trung ƣơng gây trầm cảm, an thần, giảm hoạt động của cơ [27].

Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về cây măng cụt Garcinia mangostan
Linn.
Các nghiên cứu trong nƣớc
Trong thập niên 1970 – 1980, một số nhà nghiên cứu nƣớc ta tìm cách sử dụng tinh
chất trích ly từ vỏ măng cụt để pha làm nƣớc nhuộm vải không bị phai màu. Năm 2011,
một nhóm nghiên cứu thuộc Bộ mơn Hữu cơ của trƣờng Đại học Cơng nghiệp Tp. Hồ Chí
Minh đã khảo sát quy trình nhuộm vải cotton, polyamide, tơ tằm và len với dịch chiết từ vỏ
quả măng cụt và đạt đƣợc các chỉ tiêu về độ bền màu[31].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu trƣờng Đại học Đà Nẵng đã thực hiện chiết tách và
xác định xanthone từ vỏ măng cụt. Kết quả đạt đƣợc là những tính chất vật lý của vỏ măng
cụt, so sánh điều kiện và các yếu tố ảnh hƣởng q trình trích xanthone trong ethanol bằng
phƣơng pháp chƣng ninh và Soxhlet. Phƣơng pháp xác định các xanthone là IR và LC –
MS [32].
Từ dịch ethanol của vỏ măng cụt, nhóm tác giả trƣờng Đại học Cần Thơ đã cô lập
đƣợc hai hợp chất α – mangostin và γ – mangostin. Nhận danh cấu trúc của các chất bằng
các phƣơng pháp phổ hiện đại. Các hoạt tính chống oxi hóa và kháng khuẩn của hai
xanthone cũng đƣợc khảo sát[33].

Trang 4


Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây của Trung tâm Sâm và dƣợc liệu, đại học Y
dƣợc thành phố Hồ Chí Minh, Viện hóa học,…[34, 35] hƣớng đến những tính chất dƣợc lý
của măng cụt đã nêu ở phần trên trong việc tạo ra một loại dƣợc phẩm mới hổ trợ điều trị
một số bệnh phổ biến hiện nay nhƣ ung thƣ, tiểu đƣờng, cao huyết áp,…
Các nghiên cứu ngoài nƣớc
6 hợp chất xanthones (3-isomangostin, 8-desoxygartanin, gartanin, α-mangostin, 9hydroxycalabaxanthone and β-mangostin) từ đã đƣợc Ji, Avula và cộng sự nghiên cứu
phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng cột pha đảo với RSD≤4.6%, độ thu hồi
trong khoảng 96.58% - 113.45%, LOD ≤ 0.248µg/mL [36]. Các hợp chất xanthones cũng
đƣợc trích với ethanol và bán tinh chế bằng sắc ký với hỗn hợp pha động heptane/ethyl

acetate/methanol/water (2:1:2:1, v/v/v/v) [37]. Phenolics đƣợc trích từ các phần khác nhau
của măng cụt bằng dung dịch acetone 70% (v/v). Hiệu suất trong khoảng 5.8% - 7.9%.
Tổng số phenolics quy về acid galic nằm trong khoảng 9.3 – 250 mg/g [38]. Mơ hình BoxBehnken đƣợc sử dụng để tối ƣu hóa các điều kiện trích ly: nhiệt độ (50-800C), thời gian
trích (2-4 giờ) và pH (2-4) để thu đƣợc hiệu suất pectic-polysaccharide cao nhất với hàm
lƣợng acid uronic và hoạt tính kháng oxy hóa cao từ vỏ quả măng cụt [39]. Cheok và cộng
sự đã tối ƣu hóa các điều kiện thời gian trích, tỉ lệ rắn:dung mơi, nồng độ methanol trong
q trình trích tổng phenolic từ vỏ quả măng cụt (G. mangostana L.) bằng phƣơng pháp
đáp ứng bề mặt. Kết quả nhận đƣợc cho điều kiện tối ƣu nhƣ sau: thời gian trích 2 giờ với
tỉ lệ rắn lỏng 0.05 và nồng độ methanol là 69.77% để đạt đƣợc hiệu suất cao nhất là 140.66
mg acid galic/g bột nguyên liệu [40]. Một số kháng thể có trong vỏ quả măng cụt (G.
mangostana L.) đã đƣợc trích có và khơng có ethanol ở 30Mpa và 500C với CO2 làm dung
môi siêu tới hạn (SC-CO2). Khả năng kháng oxy hóa của dịch trích SC-CO2 đƣợc xác định
bằng

thuốc

thử

2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl

(DPPH)

với

kết

quả

khá

cao

(IC50=41.8mg/mL), lipid peroxy (IC50=21.5mg/mL), gốc hydroxyl (IC50=23.1mg/mL)
[41]. Zarena và Udaya Sankar đã dùng chất lỏng siêu tới hạn để trích xanthones từ vỏ quả
măng cụt dƣới các điều kiện: áp suất (20, 25 và 30 Mpa) và nhiệt độ (40, 50 và 600C). Hiệu
suất trích ly 7.56% thu đƣợc dƣới điều kiện 30Mpa và 600C. Đồng thời, để định lƣợng các
xanthones, Zarena đã dùng HPLC/ESI-MS với pha động acetonitril:methanol:acid acetic.
Cấu trúc của các xanthones đƣợc xác định thông qua các nghiên cứu trên phổ NMR và MS
[42]. Đồng thời, Zarena cũng đã tối ƣu trích ly các xanthones bằng chất lỏng siêu tới hạn ở
các điều kiện: áp suất (180, 280 và 380 bar), nhiệt độ (40, 50 và 600C) và thời gian trích (28 giờ). Hiệu suất cao nhất 15% đạt đƣợc ở 280 bar, 500C và 8 giờ; trong khi khơng có cosolvent thì hiệu suất chỉ đạt đƣợc 7.5%. Zarena đã dùng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt để
Trang 5


xác định các điều kiện tối ƣu [43]. Cũng trong năm 2012, Zarena đã phân lập và định danh
đƣợc pelargonidin 3-glucoside từ vỏ quả măng cụt [44].
Độ hòa tan của xanthone và xanthene trong CO2 siêu tới hạn đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp động lực học dòng chảy kết hợp với phân tích khối lƣợng ở các điều kiện
308.15 và 328.15K trong khoảng áp suất 80 đến 300 bar. Kết quả nhận đƣợc, xanthene dễ
tan hơn trong CO2 siêu tới hạn hơn xanthone gấp 10 lần vì nó dễ bay hơi hơn. Độ tan đƣợc
mơ tả bằng phƣơng trình Peng-Robinson và tỷ trọng thực nghiệm dựa trên mơ hình
Chrastil trong khoảng áp suất và nhiệt độ khảo sát [45, 46].
1.2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT PHƢƠNG PHÁP
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên
kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Q trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ [53, 54]. HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để
phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hịa tan
vào trong dung mơi và sau đó dƣới tác dụng của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển

qua cột sắc ký. Trong cột hỗn hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng.
Pha tĩnh là một yếu tố quan trong quyết định bản chất của quá trình sắc ký và phân
loại sắc ký:
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha đảo và pha thuận.
- Nếu pha tĩnh là các chất đã đƣợc liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên
kết (pha thuận, pha đảo, trao đổi ion).
- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.
- Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử.
Cùng với pha tĩnh, để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha
động. Nhƣ vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C,… vào cột
tách, kết quả là các chất A, B, C . . . sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết
định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tƣơng tác: tƣơng tác giữa chất phân tích
và pha tĩnh, tƣơng tác giữa chất phân tích và pha động, tƣơng tác giữa pha tĩnh và pha động.

Trang 6


Hình 1.2. Minh họa các lực tương tác trong quá trình sắc ký
Tổng của 3 tƣơng tác này sẽ quyết định chất nào đƣợc rửa giải ra khỏi cột trƣớc tiên
khi lực lƣu giữ là nhỏ nhất, và ngƣợc lại. Đối với mỗi chất, sự lƣu giữ đƣợc tạo thành bởi 3
lực thành phần: F1, F2, F3. Trong đó F1, F2 là quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hƣởng
không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột. Nhƣ
vậy, các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột.

Hình 1.3. Minh họa q trình tách chất trong sắc ký
1.3. Trích ly sử dụng chất lỏng siêu tới hạn [1, 2, 56-61]
Các trạng thái vật lý khác nhau của một cấu tử tinh khiết đƣợc mô tả trong giản đồ
không gian ba chiều áp suất – thể tích – nhiệt độ (PVT) nhƣ hình 2.10. Các trạng thái rắn,
lỏng, khí tƣơng ứng với các giá trị đặc biệt của nhiệt độ và áp suất. Theo quy tắc pha, hai

pha (rắn – lỏng, rắn – hơi, lỏng - hơi) của một chất tinh khiết chỉ có một độ tự do. Vì vậy,
áp suất cân bằng trong mỗi trƣờng hợp là một hàm của nhiệt độ. Hình chiếu PT của các
đƣờng cân bằng rắn – lỏng, rắn - hơi, lỏng – hơi đƣợc mô tả bên trái của hình 2.10.

Trang 7


Hình 1.5. Giản đồ PVT của một cấu tử tinh khiết và hình chiếu lên mặt phẳng PT
Đƣờng cân bằng lỏng - hơi bắt đầu từ điểm ba (TP) và kết thúc tại điểm tới hạn
(CP). Bản chất của điểm tới hạn có thể đƣợc hiểu theo những thay đổi tính chất của chất
lỏng dọc theo đƣờng cong áp suất hơi. Khi tăng nhiệt độ, khối lƣợng riêng pha lỏng giảm,
khối lƣợng riêng pha hơi tăng do áp suất hơi tăng. Cuối cùng, chúng hội tụ tại điểm tới hạn
và khi trên nhiệt độ tới hạn thì khơng cịn phân biệt giữa pha lỏng và pha hơi. Khi cả nhiệt
độ và áp suất trên giá trị tới hạn, đó gọi là vùng siêu tới hạn.
Nói chung, lƣu chất siêu tới hạn những tính chất trung gian của chất khí và chất
lỏng. Bảng 2.8. cho thấy tính chất vật lý của chất ở các trạng thái khác nhau. Bằng việc
thay đổi nhiệt độ và áp suất của lƣu chất, những đặc tính của lƣu chất siêu tới hạn có thể
trở nên giống chất khí hoặc giống chất lỏng. Lƣu chất ở trạng thái siêu tới hạn có thể
khuyếch tán xuyên qua chất rắn giống nhƣ khí và hịa tan ngun liệu giống nhƣ chất lỏng.
Thêm vào đó, khi gần tới điểm tới hạn một sự thay đổi nhỏ về áp suất hay nhiệt độ
cũng tạo nên một sự thay đổi lớn về mật độ, làm biến đổi nhiều đặc tính của lƣu chất siêu
tới hạn trong đó có khả năng hịa tan các chất. Sự thay đổi khả năng hòa tan này xảy ra chỉ
với một sự thay đổi nhỏ nhiệt độ và áp suất cho chúng ta tự do chọn lựa lƣu chất siêu tới
hạn thích hợp cho một mục đích cụ thể nào đó. Vì thế lƣu chất siêu tới hạn rất thích hợp
cho việc thay thế các dung môi hữu cơ trong lĩnh vực công nghiệp và trong phịng thí
nghiệm. Và kỹ thuật ứng dụng lƣu chất siêu tới hạn đƣợc gọi là công nghệ siêu tới hạn.
Hơn thế nữa, khơng có sức căng bề mặt ở lƣu chất siêu tới hạn cũng nhƣ khơng có
mặt phân cách lỏng-khí nên làm tăng đặc tính di động của dung mơi siêu tới hạn nó có thể
thâm nhập vào trong chất rắn có lỗ xốp nhỏ hiệu quả hơn chất lỏng dẫn đến sự truyền khối
và trích ly sẽ nhanh hơn.

Bảng 1.8. Tính chất vật lý của chất ở trạng thái khí, hơi và siêu tới hạn[1, 2]
Tính chất vật lý

Khí (Ta)

SCFs (TC, PC)

Lỏng (Ta)

Khối lƣợng riêng (kg/m3)

0.6 – 2

200 – 500

600 – 1600

Độ nhớt động lực μ (mPa.s)

0.01 – 0.3

0.01 – 0.03

0.2 – 3

Độ nhớt động học η (m2/s)

5 – 500

0.2 – 0.1

0.1 – 5

Hệ số dẫn nhiệt (W/mK)

0.01 – 0.025

Maximum

0.1 – 0.2

Hệ số khuyếch tán D (m2/s)

10 – 40

0.07

0.0002 – 0.002

Sức căng bề mặt σ (dyn/cm2)

-

-

20 – 40

Khối lƣợng riêng và độ nhớt của lƣu chất siêu tới hạn thấp hơn so với trạng thái
lỏng, tuy nhiên, độ khuếch tán của lƣu chất siêu tới hạn cao hơn so với chất lỏng. Lƣu chất
siêu tới hạn không những có độ nhớt trung bình đến cao mà cịn có khả năng nén cao khi ở

Trang 8


vùng tới hạn. Điều này có nghĩa, thậm chí chỉ một thay đổi nhỏ về áp suất cũng gây ra sự
thay đổi về tỉ trọng và vì vậy làm thay đổi khả năng hịa tan. Có thể so sánh khả năng hòa
tan của lƣu chất siêu tới hạn với chất khí và lỏng trên căn bản về tỉ trọng và độ nhớt.
Hệ số dẫn nhiệt tƣơng đối cao trong lƣu chất siêu tới hạn và rất lớn khi ở gần điểm
tới hạn. Nói chung, tính chất vật lý trong vùng tới hạn nâng cao khả năng truyền nhiệt và
truyền khối của các chất. Với những đặc tính nổi bật trên, dung môi siêu tới hạn đƣợc ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực và CO2 siêu tới hạn là một trong những dung mơi nhƣ
vậy.
Một trong những đặc tính quan trọng của lƣu chất siêu tới hạn là hòa tan đƣợc
nguyên liệu trong chất lỏng. Khả năng hòa tan của lƣu chất siêu tới hạn có xu hƣớng tăng
lêntheo sự tăng của tỉ trọng của lƣu chất (ở nhiệt độ cố định). Vì tỉ trọng tăng lên theo áp
suất nên khả năng hịa tan cũng có xu hƣớng tăng theo áp suất. Trong khi đó mối quan hệ
của nó với nhiệt độ ít phức tạp hơn. Với một mật độ cố định, khả năng hòa tan tăng theo
nhiệt độ. Tuy nhiên, khi gần với điểm tới hạn, mật độ có thể giảm mạnh khi nhiệt độ tăng.
Chính vì thế, khi gần với nhiệt độ tới hạn, khả năng hòa tan thƣờng giảm khi tăng nhiệt độ,
sau đó tăng trở lại.
Bảng 1.9. Đặc điểm của CO2
Tên gọi

Carbon dioxide

Cơng thức hóa học

CO2

Khối lƣợng phân tử

44,011 kg/kmol

Thể tích ở điều kiện chuẩn

22,263 m3/kmol

Hằng số khí

0,1889 kJ/(kg.K)

Khối lƣợng riêng khí ở 273,15K và

1,977 kg/m3

1,013bar
Nhiệt độ tới hạn

304,15 K

Áp suất tới hạn

73,83 bar

Khối lƣợng riêng tới hạn

466 kg/m3

Nhiệt độ thăng hoa

T = 192,25 K; P = 0,981 bar

Điểm ba

T = 216,15 K; P = 5,18 bar

Trang 9


Nhiệt độ phân hủy

Hình 1.6. Giản đồ pha của CO2

> 1473,15 K

Hình 1.7. Biểu đồ tỉ trọng của CO2theo áp
suất và nhiệt độ

Bảng 1.10. Khối lượng riêng của CO2 ở các giá trị nhiệt độ và áp suất khác nhau (kg/m3)

Bảng 1.10 và hình 1.11 mơ tả các pha của vật chất. Trong sơ đồ của áp suất-nhiệt
độ (hình 1.11) điểm sơi là nơi tách biệt ra pha khí và pha lỏng và kết thúc ở điểm tới hạn,
nơi mà pha khí và pha lỏng biến mất và trở thành một pha siêu tới hạn. Điều này có thể
đƣợc quan sát trong biểu đồ mô tả theo tỉ trọng-áp suất của CO2, nhƣ đƣợc mơ tả trong
hình 2.22. Ở dƣới nhiệt độ tới hạn ví dụ nhƣ 280k, khi áp suất tăng, khí nén lại và cuối
cùng (ở khoảng trên 40bar) cô đặc lại thành lƣu chất đặc hơn, tạo nên sự ngắt quãng của
đƣờng thẳng (đƣờng chấm dọc). Hệ thống gồm 2 pha ở trạng thái cân bằng, 1 chất lỏng cơ
đặc và 1 chất khí có khối lƣợng riêng thấp, Khi đến gần nhiệt độ tới hạn (300K), mật độ
của khí ở trạng thái cân bằng trở nên đặc hơn, và mật độ của chất lỏng thì thấp hơn. Tại
điểm tới hạn (304.1K và 7.38Mpa (73.8 bar)) không có sự khác biệt nào về tỉ trọng và 2
pha trở thành 1 pha lỏng. Vì vậy, ở trên nhiệt độ tới hạn 1 chất khí khơng thể đƣợc hóa

lỏng bởi áp suất. Ở nhiệt độ trên nhiệt độ tới hạn một chút (310K), khi lân cận với áp suất

Trang 10


tới hạn, đƣờng thẳng gần nhƣ thẳng đứng. Một sự thay đổi nhỏ về áp suất cũng gây ra một
sự thay đổi lớn về tỉ trọng của pha lỏng siêu tới hạn. Những tính chất vật lý khác cũng thay
đổi lớn khi áp suất gần với điểm tới hạn ví dụ nhƣ độ nhớt, tính thấm tƣơng đối và độ
mạnh của dung môi, mà tất cả đều liên quan đến tỉ trọng. Ở nhiệt độ cao hơn, chất lỏng trở
nên giống khí nhƣ theo hình 2.22 khi CO2 ở 400K, tỉ trọng tăng gần nhƣ tuyến tính với áp
suất.
* Ưu điểm của CO2 siêu tới hạn[1, 56, 58, 60-67]
a. CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần nhƣ ở nhiệt độ phịng, áp suất thấp) vì
vậy các hoạt chất ít bị oxy hoá hay phân huỷ bởi nhiệt độ và oxy hoà tan, ngoài ra vấn đề
thiết kế hệ thống trích ly đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn cũng dễ dàng hơn nên khả năng
ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp cũng thuận lợi.
b. Sản phẩm sau khi chiết khơng cịn tồn dƣ dung mơi vì CO2 dễ dàng chuyển sang
trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi giảm áp suất, nhiệt độ xuống dƣới điểm tới hạn.
Vì vậy hoạt chất đƣợc trích lytheo phƣơng pháp này rất phù hợp đối với các sản phẩm
dùng làm thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm.
Lƣu chất siêu tới hạn dễ dàng tách ra khỏi dịch trích ly khi hạ áp suất. Trong trƣờng hợp có
sử dụng dung mơi hữu cơ để hỗ trợ q trình trích đạt hiệu quả tốt hơn thì lƣợng dung mơi
hữu cơ cần khoảng 20 – 40 ml, ít hơn nhiều so với kỹ thuật trích ly nhƣ phƣơng pháp
Soxhlet (50 – 200 ml)
c. Khả năng trích ly có độ chọn lọc cao do:
- Độ tan của SC-CO2 thay đổi khi áp suất và nhiệt độ tới hạn thay đổi vì vậy nó sẽ hoà tan
chọn lọc các chất khác nhau ở nhiệt độ, áp suất tƣơng ứng. Thông thƣờng các tinh dầu dễ
bay hơi có thể đƣợc chiết ở áp suất dƣới 100bar, trong khi các chất béo đƣợc chiết ở áp
suất cao hơn.
- Dung môi SC-CO2 sẽ phân cực hơn khi đƣợc hồ trộn với các mơi phụ trợ (co-solvent)

phân cực nhƣ: methanol, ethanol vì vậy khả năng hồ tan các hợp chất sẽ đa dạng hơn. Tuy
nhiên các dung môi phụ trợ có thể làm thay đổi điểm tới hạn của CO2 do đó trong thực
nghiệm cần phải khảo sát tỷ lệ dung mơi phụ trợ thích hợp để ít ảnh hƣởng đến điểm tới
hạn.
Một trong những điểm thuận lợi của lƣu chất siêu tới hạn là khả năng xuyên qua và
khả năng solvate hóa mạnh. Ngồi ra, bằng cách thay đổi nhiệt độ và áp suất có thể điểu
chỉnh độ chọn lọc của dung môi. Khi so sánh với kỹ thuật trích ly thơng thƣờng, trích ly
bằng lƣu chất siêu tới hạn có độ chọn lọc cao hơn, giảm đƣợc các bƣớc xử lý sau khi trích.
Q trình trích ly nhiều giai đoạn làm tăng nồng độ của chất cần trích. Ví dụ, khi trích hoạt
Trang 11


chất chống oxy hóa Hierochlo odorata qua hai giai đoạn – giai đoạn 1 trích với 30 lít CO2
tinh khiết, giai đoạn 2 trích với 60 lít; ở điều kiện áp suất, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi hỗ trợ
lần lƣợt là 35 MPa, 313 K, 20%. Hỗn hợp thu đƣợc là 22,5% chất chống oxy hóa so với
8,8% khi trích một giai đoạn. Trong khi đó, phƣơng pháp trích ly bằng dung mơi thơng
thƣờng có thời gian từ vài giờ đến vài ngày. Bên cạnh đó, thời gian trích ly bằng lƣu chất
siêu tới hạn khoảng 30 phút, phụ thuộc vào lƣợng nguyên liệu. Ví dụ, trích ly hoa cúc
bằng lƣu chất siêu tới hạn trong 30 phút cho hiệu suất gấp 4,4 lần so với phƣơng pháp
trích ly bằng phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc trong 4 giờ.
d. Thời gian trích ly ngắn: Q trình trích ly dựa trên sự khuyếch tán vì vậy dung
mơi địi hỏi phải khuyếch tán vào trong hỗn hợp nền (lỏng hay rắn) và chất (nguyên liệu)
đƣợc trích ly phải khuyếch tán ra khỏi chất nền vào lƣu chất. Khả năng khuyếch tán của
SCF nhanh hơn so với chất lỏng bình thƣờng vì thế q trình trích ly diễn ra nhanh hơn. Và
vì khơng có sức căng bề mặt và độ nhớt thấp hơn nhiều so với chất lỏng thông thƣờng nên
dung môi có thể thâm nhập vào trong từng lỗ nhỏ trong chất nền mà q trình khơng thể
xảy ra đƣợc nếu là chất lỏng bình thƣờng. Cả hai yếu tố độ khuyếch tán cao và độ nhớt
thấp đã làm tăng đáng kể tốc độ của q trình trích ly (một sự trích ly bằng dung mơi hữu
cơ có thể mất vài giờ trong khi SFE chỉ mất khoảng 10-60 phút).
e. Bảo vệ đặc tính sinh học của chất trích

- Khơng thay đổi hoặc mất hƣơng thơm, màu sắc tự nhiên ban đầu của hoạt chất. Không
tạo ra mùi, vị lạ do SC-CO2 là chất trơ, không mùi vị và bay hơi hoàn toàn khi thay đổi áp
suất và nhiệt độ. Bảo quản những đặc tính của các hợp chất mang hoạt tính sinh học.
- Với điều kiện trích ly (nhiệt độ, áp suất) tƣơng đối thấp, trích ly bằng CO2 siêu tới hạn
thích hợp khi trích các thành phần dễ bay hơi cũng nhƣ các hợp chất không bền nhiệt. Hơn
nữa, hệ thống trích ly hồn tồn kín nên khơng có oxy và ánh sáng, vì vậy hạn chế đến
mức thấp nhất sự phân hủy cũng nhƣ bảo vệ đặc tính sinh học và đặc tính chống oxy hóa
của chất trích. Những yếu tố này có ý nghĩa quan trọng đối với các sản phẩm có nguồn gốc
từ thiên nhiên đặc biệt trong cơng nghiệp mùi và màu vì chúng dễ bị thủy phân khi chƣng
cất bằng hơi nƣớc. Ví dụ, hoạt chất chống oxy hóa trong chất trích từ hạt Coriandum
sativum bằng lƣu chất siêu tới hạn có thể so sánh với các sản phẩm thƣơng mại, trong
khi hàm lƣợng hoạt chất này trong cây hƣơng thảo Rosmarinus officinalis và cây xơ
thơm S. pretensis cũng đƣợc trích ly bằng lƣu chất siêu tới hạn cao hơn 5 – 6 lần. Ngồi ra,
điều kiện này có thể ngăn chặn đƣợc các phản ứng hóa học xảy ra trong q trình trích do
cô lập các tác chất hiện diện trong nguyên liệu. Ví dụ khi trích ly các loại thảo dƣợc thuộc

Trang 12


họ Solanaceae bằng lƣu chất siêu tới hạn thì chất trích ít bị triệt quang hóa (racemigation)
hơn là khi trích ly bằng dung môi thông thƣờng
f. Kháng khuẩn do hoạt động ở áp suất cao
- Một số báo cáo cho thấy, CO2 bị nén có tính chất diệt khuẩn. Ở điều kiện 7 MPa, 303,15
K (dƣới điểm tới hạn) trong 10 phút, màng tế bào của Lactobacillus plantarum bị hƣ hỏng.
Ambrosino và cộng sự cũng chứng minh sự kiềm hãm hoạt động vi khuẩn của CO2 siêu tới
hạn trong suốt quá trình. Áp suất cao làm tăng sự khuếch tán của CO2 vào trong tế bào chất
của vi khuẩn, giảm pH nội bào làm vô hoạt enzyme, màng tế bào chất thay đổi và cuối
cùng tế bào bị tiêu diệt. Một nghiên cứu khác cũng cho thấy ở 90 bar và 333 K trong 6 giờ
làm vơ hoạt hồn tồn các bào tử Bacillus subtilis, trong khi cũng cùng điều kiện đó nhƣng
khơng có CO2 siêu tới hạn thì khơng ảnh hƣởng.

g. CO2 khơng ăn mịn thiết bị, khơng gây cháy nổ trong q trình vận hành, an tồn,
thân thiện với mơi trƣờng, giá thành rẻ, dễ kiếm, ngồi ra có thể tái sử dụng trong thời gian
dài.
* Nhược điểm của CO2 siêu tới hạn[1, 64-67]
a. Chi phí đầu tƣ cao: Do thiết bị hoạt động ở áp suất cao nên chi phí cho chế tạo và
sửa chữa lớn và điều này quyết định phần lớn chi phí của quá trình trích. Tuy nhiên, chi phí
năng lƣợng sử dụng trong quá trình này thấp hơn so với chƣng cất bằng hơi nƣớc và trích
ly bằng dung mơi thƣờng. Theo đánh giá của Rosa và Meireles, chi phí của việc trích ly
tinh dầu từ cây đinh hƣơng bằng lƣu chất siêu tới hạn chiếm 9,15 đô la/kg, chỉ bằng một
phần tƣ giá thị trƣờng nên có lợi về mặt kinh tế. Trong chi phí đó khi trích ly hoạt chất từ
củ gừng là 99,80 đô la, gần bằng với giá thị trƣờng. Vì vậy, việc lựa chọn cẩn thận các hoạt
chất có giá trị khi trích ly bằng lƣu chất siêu tới hạn là rất cần thiết. Ngồi ra, thơng số trích
ly và kích thƣớc thiết bị trích cũng phải đƣợc nghiên cứu kỹ để đảm bảo chi phí thấp nhất.
b. Q trình tối ƣu phụ thuộc nhiều yếu tố
- Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng lên trích ly siêu tới hạn, cho nên đối với mỗi loại vật liệu đều
có một điều kiện tối ƣu riêng. Bên cạnh đó, khi trích ly cùng một loại vật liệu ở các điều
kiện áp suất, nhiệt độ, tỷ lệ dung môi hỗ trợ, thời gian trích khác nhau sẽ cho kết quả khác
nhau trong thành phần dịch trích. Seied Mahdi Pourmotazavi trích ly tinh dầu từ cây
Perovskia atriplicifolia cho thấy khi tăng áp suất từ 100 lên 300 bar ở nhiệt độ 308,15 K
thì nồng độ các thành phần chính gồm alpha-pinene, δ-3-carene, 1,8-cineole + limonene và
camphor giảm. Tƣơng tự, khi tăng nhiệt độ từ 308,15 lên 328,15 K, áp suất 100 bar
cũng làm giảm hàm lƣợng của các thành phần chính trong tinh dầu. Cũng theo nghiên cứu

Trang 13


này, trong tất cả các loại dung môi hỗ trợ thì hexane có độ chọn lọc cao nhất khi sử
dụng cho trích ly tinh dầu của Perovskia atriplicifolia.
- Tƣơng tự, một báo cáo nghiên cứu trích ly hai mẫu khơ và ƣớt từ vỏ cây Maclura
pomifera bằng CO2 siêu tới hạn với các điều kiện trích khác nhau cho kết quả khác nhau

về hàm lƣợng và loại flavanones và xanthones. Sự kết hợp các điều kiện áp suất, nhiệt độ
và chất hỗ trợ cũng đƣợc nghiên cứu khi trích ly các thành phần chống oxy hóa từ hạt cây
Tamarindus indica L (Tamarind). Kết quả cho thấy, CO2siêu tới hạn ở 300 MPa, 353,15 K,
đƣợc hỗ trợ bởi ethanol thì hiệu suất trích ly các thành phần chống oxy hóa cao hơn.
c. Phụ thuộc vào liên kết giữa chất nền - chất trích: Hiệu quả của việc trích ly bằng
lƣu chất siêu tới hạn phụ thuộc nhiều vào liên kết giữa chất nền và chất trích hơn những
phƣơng pháp thơng thƣờng khác. Các chất trích thƣờng đƣợc hấp thụ và phân tán bên trong
chất nền bằng các liên kết hóa học.
Tốc độ trích ly sẽ nhanh ở giai đoạn đầu vì giai đoạn này chất trích chủ yếu ở dạng tự do
trên bề mặt chất nền. Trong giai đoạn sau, tốc độ sẽ chậm hơn vì liên kết chặt giữa chất
trích bên trong vào chất nền. Khi liên kết này mạnh, hiệu quả trích ly sẽ thấp.
d. Khó khăn trong chuyển đổi quy mơ: Chuyển đổi quy mơ trong trích ly bằng lƣu
chất siêu tới hạn gặp nhiều khó khăn nếu không quan tâm đến tác động qua lại của chất nền
và chất trích; việc lựa chọn dung mơi hỗ trợ chính xác cũng rất cần thiết. Ngồi ra, phƣơng
pháp thu mẫu đóng vai trị quan trọng; nếu bỏ qua sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc chuyển
một chế độ tối ƣu từ thiết bị này sang thiết bị khác.

Trang 14


Chƣơng 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị và hóa chất
2.1.1. Nguyên vật liệu
Vỏ quả măng cụt dùng làm nguyên liệu trong thí nghiệm đƣợc mua tại chợ đầu mối
Bình Điền, thành phố Hồ Chí Minh. Vỏ măng cụt đƣợc sấy khô trong 3 ngày ở nhiệt độ
323 K [73] và đƣợc nghiền bằng máy nghiền búa nhằm tăng khả năng truyền khối giữa
nguyên liệu và dung mơi trong q trình trích ly. Bột măng cụt đƣợc giữ trong hộp kín và
bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh phục vụ cho các thí nghiệm sau này.
2.1.2. Trang thiết bị
Cân phân tích.

Hệ thống HPLC Agilent 1200 series:
Thiết bị trích ly Soxhlet, thiết bị trích ly với sự hỗ trợ vi sóng, thiết bị cơ quay chân
khơng, bể siêu âm, bể đun cách thủy, tủ sấy ở áp suất thƣờng và các thiết bị phụ trợ, dụng
cụ thí nghiệm khác.
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ hóa
học và Dầu khí - trƣờng Đại học Bách khoa.
2.1.3. Hóa chất
Dung mơi: MeOH, EtOH, n-hexan, ethyl acetate (Trung Quốc).
Dung môi dùng cho HPLC: MeOH (Merck), acid acetic, nƣớc cất siêu sạch dùng
cho HPLC.
α-mangostin chuẩn.
2.2. Xây dựng quy trình phân tích α-mangostin bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Chuẩn bị mẫu thử
Cân 01g mẫu, trích trong bồn siêu âm 15 phút với EtOH (5lần, 10mL/lần), tập
trung dịch thu đƣợc cho bay hơi trên bếp cách thủy đến dạng cao. Hòa cao với 5mL nƣớc
cất, chiết phân đoạn lỏng-lỏng lần lƣợt với hexan (5lần, 5mL/lần) và EtOAc (4lần,
5mL/lần), gộp các phân đoạn EtOAc và làm khan nƣớc với một ít Na2SO4, lấy dịch. Cơ
trên bếp cách thủy ở 600C đến cao. Quy vào bình định mức 10mL với MeOH và lọc qua
màng lọc 0.45 µm làm mẫu thử.
Khảo sát điều kiện sắc ký HPLC
Khảo sát thành phần, tỷ lệ pha động: mẫu sau khi xử lý đƣợc tiêm vào hệ thống sắc
ký HPLC với chế độ rửa giải đẳng dịng để dị tìm tỷ lệ dung mơi thích hợp nhằm xác định

Trang 15


điều kiện rửa giải theo chƣơng trình đẳng dịng dùng hệ pha động MeOH:H2O (0.1%
AcOH) ứng với tỉ lệ thay đổi từ 40-100% MeOH. Ta có bảng nhƣ sau:
Bảng 2.1. Các điều kiện pha động được khảo sát

STT

Thành phần pha động

Tỷ lệ

1

MeOH: H2O

100:0

2

MeOH: H2O

95:05

3

MeOH: H2O

90:10

4

MeOH: H2O

85:15

5

MeOH: H2O

80:20

Từ các kết quả bên trên ta xác định đƣợc điều kiện tối ƣu của HPLC đƣợc dùng cho
các phân tích sau này.
Thẩm định quy trình định lƣợng
* Khảo sát tính tương thích hệ thống
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn và mẫu thử trên theo các điều kiện sắc ký đã xác định.
Khảo sát các thông số: thời gian lƣu, hệ số phân giải, hệ số bất đối xứng, diện tích peak, số
đĩa lí thuyết. Tính RSD % cho từng thơng số.
Tính tƣơng thích hệ thống sắc ký đƣợc xác định bởi tiến hành tiêm lặp lại 6 lần trên
một mẫu thử, với các điều kiện sắc ký đã chọn ở trên.
* Khảo sát tính đặc hiệu
Dựa vào thời gian lƣu và hình dáng sắc nhọn, đối xứng của peak α-mangostin thu
đƣợc khi phân tích mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn, kết hợp so sánh phổ UV của peak mẫu
thử so với phổ α-mangostin chuẩn thu đƣợc khi quét phổ trên máy UV-Vis từ 210 – 800
nm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu thử thêm chất
chuẩn. Tiến hành triển khai HPLC các dung dịch vừa chuẩn bị. Quan sát các sắc ký đồ và
nhận định kết quả thu đƣợc.
* Khảo sát độ lặp lại
Thực hiện trên 6 mẫu trích ly khác nhau của cùng một lơ thử nghiệm để đƣợc 6
mẫu thử. Tiêm vào hệ thống HPLC. Kết quả đƣợc xử lí thống kê để xác định RSD % của
phép đo. Với phƣơng pháp sắc ký lỏng cho phép RSD%≤2%.
* Khảo sát độ đúng
Độ đúng đƣợc xác định bằng tỷ lệ phục hồi khi thêm một lƣợng chuẩn chính xác
vào mẫu vỏ quả măng cụt, tiến hành phân tích hàm lƣợng α-mangostin tổng của mẫu thử

thêm chuẩn với điều kiện sắc ký đã chọn.
Trang 16


Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mẫu thử thêm chuẩn:
- Thêm một lƣợng chính xác dung dịch chuẩn tƣơng ứng với khoảng 80%; 100%; 120%
hàm lƣợng α-mangostin có trong mẫu thử. Bơm vào hệ thống HPLC và ghi nhận diện tích
peak ở 320 nm. Xác định tỉ lệ phục hồi ở từng nồng độ rồi tính tỉ lệ phục hồi trung bình.
- Cách tiến hành: Hút chính xác 100µL, 125µL và 150µL dung dịch chuẩn α-mangostin
200ppm vào bình định mức 10mL đã chứa sẵn 5 mL dung dịch thử đã cô đến cắn. Thêm
10mL MeOH đến vạch. Lọc qua màng lọc 0.45 µm và bơm mẫu vào hệ thống HPLC. Xác
định hàm lƣợng α-mangostin để tính tỉ lệ phục hồi.
* Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) là lƣợng chất cần phân tích thấp nhất trong mẫu thử có
thể phát hiện bởi các phƣơng pháp phân tích trong điều kiện khảo sát nhƣng khơng nhất
thiết phải có tính định lƣợng.
Giới hạn định lƣợng (LOQ) là một đặc tính của các phƣơng pháp định lƣợng đối
với các chất hàm lƣợng thấp trong cùng hỗn hợp mẫu thử. Đó là lƣợng chất cần phân tích
thấp nhất trong mẫu thử có thể phát hiện bởi phƣơng pháp phân tích trong điều kiện thí
nghiệm khảo sát với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận đƣợc.
Cơng thức tính:
LOD
LOQ

3.3 x standard deviation
slope of the calibration curve
10 x standard deviation
slope of the calibration curve

(2.2)

(2.3)

* Khảo sát khoảng tuyến tính
Cân 5mg chuẩn α-mangostin tinh khiết cho vào bình định mức 25mL và định mức
bằng MeOH để thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc 200ppm. Để khảo sát khoảng tuyến tính ta
tiến hành khảo sát nhƣ sau:
Khoảng nồng độ α-mangostin khảo sát: 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm, 100ppm và
200 ppm.
Pha dung dịch chuẩn nhƣ sau:
Bảng 2.2.Pha dung dịch chuẩn α-mangostin
Thể tích dung dịch α-mangostin chuẩn 200ppm (mL)

1

2

3

4

5

10

Nồng độ α-mangostin (ppm)

20

40

60

80

100

200

Định mức bằng MeOH trong bình định mức 10 mL

Trang 17


Khảo sát các phƣơng pháp trích ly α-mangostin
Nhiều phƣơng pháp trích ly khác nhau đã đƣợc khảo sát nhƣng do những điều kiện
cho phép nghiên cứu này chỉ tiến hành khảo sát trên 4 phƣơng pháp: phƣơng pháp ngâm
dầm, Soxhlet, siêu tới hạn và hỗ trợ vi sóng.
Phƣơng pháp ngâm dầm
Cân 20 g nguyên liệu cho vào một becher 500 ml, cho 200 ml EtOH vào
becher;bọc kín becher để yên trong 24 giờ. Sau 24 giờ lấy dung môi ra vàtiếp tục cho thêm
EtOH vào để yên trong 24 giờ. Dung dịch thu đƣợc lần đầu có màu nâu đỏ và nhạt dần
trong những lần thêm dung môi tiếp theo. Thời gian thực hiện thí nghiệm là khoảng 7
ngày. Khi dung mơi khơng cịn màu của ngun liệu thì gộp chung lại các dung dịch thu
đƣợc để lọc và cô quay loại EtOH thu cao N1.
Phƣơng pháp Soxhlet
Cân 20g mẫu và tiến hành trích Soxhlet với 250mL EtOH trong 24 giờ.Khi dung
mơi khơng cịn màu của ngun liệu thì gộp chung lại các dung dịch thu đƣợc để lọc và cơ
quay loại EtOH thu cao S1.
Phƣơng pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng
Cân 1g mẫu cho vào liner (4 liner) và tiến hành trích bằng thiết bị trích ly với sự hỗ

trợ vi sóng ở cơng suất 50 W, tỉ lệ lỏng dung môi : nguyên liệu 25 mL/g, với thời gian 25
phút. Sau đó các dung dịch thu đƣợc tiến hành cô quay loại EtOH thu đƣợc cao MAE0. Thí
nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần để đảm bảo độ lặp lại.
Phƣơng pháp trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn
Cân 20g mẫu và tiến hành trích bằng thiết bị trích ly CO2 siêu tới hạn ở áp suất 300
bar, nhiệt độ 323 K, tốc độ dòng 15 g/phút, dung môi bổ trợ 5% EtOH với thời gian 300
phút. Sau đó tiến hành cơ quay loại EtOH thu đƣợc cao SFE0. Thí nghiệm đƣợc tiến hành
3 lần để đảm bảo độ lặp lại.

Trang 18


Chƣơng 3: KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG XANTHONE
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ALPHA MANGOSTIN
a. Khảo sát các điều kiện sắc ký
Khảo sát thành phần pha động
Mẫu đƣợc tiêm vào hệ thống HPLC sử dụng cột C18 với các điều kiện nhƣ sau: tốc
độ dòng 1mL/phút, bƣớc sóng phát hiện 320 nm, nhiệt độ cột 350C. Mẫu chuẩn bị đƣợc
khảo sát với các thành phần, tỷ lệ pha động thay đổi và đạt đƣợc kết quả nhƣ hình 3.2 và
bảng 3.3.
MeOH100

90
60
30
0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

MeOH95

90

Do hap thu (mAU)

60
30
0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

MeOH90

90
60
30
0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

MeOH85

90
60
30
0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

MeOH80

90
60
30
0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Thoi gian (phut)

Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu phân tích ở các tỉ lệ pha động MeOH – H2O khác nhau
Bảng 3.3. Bảng khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động
STT
1

Thành phần pha động
MeOH: H2O

Tỷ lệ

Kết quả

(v/v)
100:0

Các peak sắc ký không tách ra khỏi nhau.

Trang 19