Nghiên cứu một số phương pháp tinh chế collagen trích ly từ da cá tra ( pangasius hypophthalmus)

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------------------

LÊ PHƢỢNG MAI
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP
TINH CHẾ COLLAGEN TRÍCH LY
TỪ DA CÁ TRA
(Pangasius hypophthalmus)
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2011


ii

CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học:
PGS.TS Phan Đình Tuấn
TS. Phan Ngọc Hồ
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. LÊ THỊ PHÚ
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM,
ngày 09 tháng 08 năm 2010
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1. PGS.TS. NGUYỄN XÍCH LIÊN (Chủ tịch hội đồng)
2. PGS.TS. NGƠ MẠNH THẮNG (Thư kí)
3. PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO (Uỷ viên)
4. TS. LÊ THỊ PHÚ (Uỷ viên)
5. TS. PHAN NGỌC HÒA (Uỷ viên)
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn

Bộ môn quản lý chuyên ngành


iii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC
---------------

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
--------------Tp. HCM, ngày 30 tháng 07năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: LÊ PHƯỢNG MAI
Ngày, tháng, năm sinh: 21-02-1986
Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống

Phái: Nữ

Nơi sinh: .TP.HCM
MSHV: 09110161

I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ COLLAGEN
TRÍCH LY TỪ DA CÁ TRA (Pangasius Hypophthamus)
II- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
Tổng quan thành phần da cá Tra và quá trình tách chiết collagen từ da cá.
Khảo sát quá trình kết tủa bằng NaCl
Khảo sát q trình thẩm tích collagen
Khảo sát q trình tinh chế collagen bằng dung mơi CO2 siêu tới hạn ở các áp suất,
lưu lượng, nhiệt độ, hàm lượng chất phụ trợ và thời gian khác nhau.
Phân tích các tính chất của collagen: trọng lượng phân tử, nhiệt độ biến tính, chụp
SEM xác định cấu trúc sợi, phân tích phổ hồng ngoại xác định các nhóm chức có mặt
trong collagen.
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/02/2011
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/07/2011
V- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN:
PGS.TS Phan Đình Tuấn
TS. Phan Ngọc Hồ
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)
PGS. TS. Phan Đình Tuấn
TS. Phan Ngọc Hịa

iv

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm, Khoa Kỹ
Thuật Hóa Học – Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã hổ trợ trang thiết bị, máy
móc, vật tư, phịng thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education) - JICA đã hổ trợ trong suốt
quá trình thực hiện đề tài B2-06 ‘Purification fish collagen extraction and application’
và xin gửi lời tri ân đến q PGS.TS Phan Đình Tuấn, TS. Phan Ngọc Hồ đã tận tình
hướng dẫn, hổ trợ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho em hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe và lời cám ơn chân thành đến q thầy cơ
trong nhóm nghiên cứu và tồn thể Bộ Mơn, các bạn lớp cao học K2009 – Bộ Môn
Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa kỹ thuật hóa học.

Xin cảm ơn


v

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Luận văn này là một phần trong cơng trình nghiên cứu trích ly và tinh chế
collagen từ da cá tra, 1 phụ phẩm có giá trị kinh tế thấp của công nghiệp chế biến thuỷ
sản nước ta . Luận văn tập trung vào các phương pháp tinh chế dịch trích ly collagen để
tăng độ tinh khiết của sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu của thực phẩm và mỹ phẩm.
Luận văn kế thừa nghiên cứu trước của nhóm về qui trình trích ly collagen thơ:
da cá tra được loại tạp chất bằng dung dịch LasNa 1% trong vòng 4 giờ ở nhiệt độ 4 oC
và tẩy màu bằng dung dịch H2O2 1% , NaOH 0,01M trong 4 giờ. Sau đó, da cá được
cắt nhỏ đến kích thước 5 x 5 mm và được chiết bằng acid acetic 0,75M, tỉ lệ da cá và

dung dịch acid acetic là 1/50, tốc độ khuấy trộn 200rpm, ở 5oC trong vòng 24 giờ. Dịch
chiết sau khi lọc loại bã khơng màu, hơi đục, có mùi acid acetic và tanh nhẹ, độ nhớt
cao, đạm tổng 4,62%, hàm lượng béo chiếm 6,34% và hydroxyproline 400,119mg/L.
Đối với quy trình tinh chế dịch trích ly collagen, luận văn tập trung nghiên cứu
3 giai đoạn: dùng dung dịch NaCl kết tủa thu nhận collagen, thẩm tích loại muối và
trích ly bằng dung mơi CO2 siêu tới hạn để loại béo. Kết quả collagen sau khi tinh chế
có dạng rắn, màu trắng, mùi tanh và mùi acid acetic giảm hẳn. Q trình kết tủa dịch
trích ly collagen với nồng độ muối NaCl tối ưu là 0,9M, collagen thu được có hàm
lượng hydroxyproline 37,843mg/g, đạm tổng 94,16%, hàm lượng chất hữu cơ là
94,09%. Quá trình thẩm tích bằng màng cellophane tối ưu ở 4 oC với tỷ lệ dịch
collagen/môi trường đệm acid acetic 0,1M là 1/10 (v/v), thay môi trường đệm 2 lần,
lần thứ nhất sau 16 giờ, lần thứ hai sau 14 giờ, tốc độ khuấy 120rpm, hàm lượng muối
trong collagen còn 0,695%, hàm lượng tro chiếm 0,69%, hiệu suất loại muối đạt
97,9%. Điều kiện tối ưu của q trình trích ly 0,5g collagen/mẻ bằng dung môi CO2
siêu tới hạn: áp suất 200 bar, nhiệt độ 42oC, lưu lượng 10 g/phút trong 30 phút, hàm
lượng béo còn lại 0,13%, hiệu suất loại béo đạt 97,27%.


vi

MỤC LỤC
TRANG BÌA
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
LỜI CÁM ƠN
TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỤC LỤC ..........................................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ...........................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................................x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... xii

ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN.............................................................................................2
1.1.

Collagen ................................................................................................................. 2

1.1.1.

Khái quát về collagen ..................................................................................... 2

1.1.2.

Đặc điềm cấu trúc của collagen ...................................................................... 4

1.1.2.1. Cấu trúc phân tử collagen .......................................................................... 5
1.1.2.2. Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen ............................................................ 8
1.1.3.

Tính chất lí hóa của collagen ........................................................................ 11

1.1.4.

Các yếu tố ảnh hưởng đến collagen .............................................................. 12

1.1.5.

Nguyên liệu tách chiết collagen .................................................................... 15

1.1.5.1. Các nguyên liệu tách chiết collagen ......................................................... 15
1.1.5.2. Ưu điểm và đặc tính của collagen trích ly từ da cá .................................. 15

vii

1.1.5.3. Một số đặc điểm của da cá ....................................................................... 17
1.2.

Các phương pháp tinh sạch dịch chiết collagen .................................................. 20

1.2.1.

Phương pháp kết tủa collagen ....................................................................... 20

1.2.2.

Phương pháp thu nhận tủa collagen .............................................................. 20

1.2.3.

Phương pháp thẩm tích ................................................................................. 21

1.2.4.

Sắc ký ............................................................................................................ 23

1.2.5.

Phương pháp tách béo bằng lưu chất siêu tới hạn ........................................ 24

1.2.6.

Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen ..................................................... 29

1.3.

Các nghiên cứu collagen trích ly từ da thuỷ hải sản đã cơng bố ......................... 30

1.3.1.

Các cơng trình nghiên cứu collagen trích ly từ thuỷ hải sản trên thế giới và

ở nước ta hiện nay ...................................................................................................... 30
1.3.2.
1.4.

Những vấn đề còn tồn tại và hướng tập trung nghiên cứu giải quyết........... 41

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 45

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............46
2.1.

Nguyên vật liệu .................................................................................................... 46

2.1.1.

Nguyên liệu ................................................................................................... 46

2.1.2.

Hoá chất ........................................................................................................ 46

2.1.3.

Thiết bị .......................................................................................................... 47

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 47


viii

2.2.1.

Phương pháp bảo quản.................................................................................. 47

2.2.2.

Phương pháp tiền xử lý ................................................................................. 47

2.2.3.

Phương pháp chiết collagen từ da cá ............................................................ 49

2.2.4.

Phương pháp tinh sạch dịch chiết collagen .................................................. 50

2.2.4.1. Kết tủa collagen........................................................................................ 51

2.2.4.2. Thẩm tích loại muối ................................................................................. 52
2.2.4.3. Tách béo bằng CO2 siêu tới hạn ............................................................... 54
2.2.5.

Phương pháp phân tích sản phẩm collagen .................................................. 58

2.2.5.1. Phân tích hàm lượng ẩm........................................................................... 58
2.2.5.2. Phân tích hàm lượng chất vơ cơ, chất hữu cơ .......................................... 59
2.2.5.3. Phân tích đạm tổng ................................................................................... 60
2.2.5.4. Phân tích hàm lượng chất béo .................................................................. 61
2.2.5.5. Phân tích hàm lượng muối NaCl .............................................................. 62
2.2.5.6. Phân tích hàm lượng hydroxyproline ....................................................... 63
2.2.5.7. Phương pháp sắc kí điện di ...................................................................... 68
2.2.5.8. Phương pháp xác định thành phần acid amin .......................................... 69
2.2.5.9. Phương pháp đo độ nhớt dung dịch collagen ........................................... 70
2.2.5.10. Xác định cấu trúc bề mặt collagen ........................................................... 71
2.2.5.11. Phổ hồng ngoại IR .................................................................................... 71


ix

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................72
3.1.

Giai đoạn xử lý da cá ........................................................................................... 72

3.1.1.

Thành phần da cá ban đầu ............................................................................ 72

3.1.2.

Thành phần da cá sau quá trình tiền xử lý .................................................... 73

3.1.2.1. Sau quá trình tách béo .............................................................................. 73
3.1.2.2. Sau quá trình tẩy màu ............................................................................... 74
3.2.

Thành phần dịch chiết collagen – acid acetic ...................................................... 75

3.3.

Kết quả khảo sát quá trình tinh sạch .................................................................... 76

3.3.1.

Quá trình kết tủa thu collagen ....................................................................... 76

3.3.2.

Q trình thẩm tích loại muối ....................................................................... 79

3.3.2.1. Chế độ tĩnh ............................................................................................... 79
3.3.2.2. Thẩm tích động ........................................................................................ 84
3.3.2.3. So sánh hàm lượng muối còn lại trong dịch collagen .............................. 90
3.3.3.

Độ nhớt và nhiệt độ biến tính collagen ......................................................... 91

3.3.4.

Quá trình tách béo bằng dung mơi siêu tới hạn ............................................ 94

3.3.4.1. Kết quả phân tích ANOVA và phân tích điện di xét riêng từng yếu tố .... 96
3.3.4.2. Kết quả phân tích ANOVA và phân tích điện di các mẫu tối ưu ........... 101
3.3.5.

Hình ảnh bề mặt và cấu trúc collagen ......................................................... 104

3.3.6.

Phổ IR ......................................................................................................... 107


x

3.4.

Kết quả collagen sau tinh sạch .......................................................................... 109

CHƢƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................112
4.1.

Kết luận.............................................................................................................. 112

4.2.

Kiến nghị ........................................................................................................... 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................114

PHỤ LỤC ........................................................................................................................119


xi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc da .......................................................................................................... 2
Hình 1.2: Cấu trúc phân tử collagen ................................................................................... 5
Hình 1.3: Cấu trúc của procollagen , tropocollagen và các liên kết ngang......................... 6
Hình 1.4: Cấu trúc bậc 2 ..................................................................................................... 7
Hình 1.5: Cấu trúc bậc 3 ..................................................................................................... 8
Hình 1.6: Cấu trúc bậc 4 ..................................................................................................... 8
Hình 1.7: Cấu trúc sợi của collagen .................................................................................... 9
Hình 1.8: Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi ................................................ 10
Hình 1.9: Hình (a) bó sợi và( b) sợi collagen.................................................................... 11
Hình 1.10: Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen trích ly từ cá và lợn . 17
Hình 1.11 : (a) Một loại cá da trơn sống ở vùng nước chảy của Hàn Quốc (torrent
catfish, Liobagrus mediadiposalis); (b,c) cấu tạo của da cá Liobagrus mediadiposalis
dưới kính hiển vi ............................................................................................................... 18
Hình 1.12 : Giai đoạn đầu và cuối của q trình thẩm tích .............................................. 22
Hình 1.15: Giản đồ pha cho biết liên quan giữa áp suất và nhiệt độ của CO2 .................. 24
Hình 1.16: Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và da cá ...................... 31
Hình 1.17: Biểu đồ sự phụ thuộc độ nhớt theo nhiệt độ ................................................... 34
Hình 1.18: Cấu trúc bề mặt collagen (a) và gelatin (b) ..................................................... 35


xii

Hình 1.19: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích peak và hàm
lượng acid amin ................................................................................................................. 36

Hình 1.20: Hình ảnh điện di collagen ASC và PSC từ da cá tra ....................................... 39
Hình 1.21: Qui trình tinh chế collagen của Jinhan Shon và cộng sự, năm 2011 .............. 40
Hình 2.1: Quy trình tiền xử lý da cá...................................................................................49
Hình 2.2: Quy trình tách chiết collagen bằng acid acetic ................................................. 50
Hình 2.3: Quy trình thu nhận và tinh sạch collagen.......................................................... 51
Hình 2.4: Thẩm tích bằng màng cellophane ..................................................................... 54
2

.11419 ............................................. 55

Hình 2.6: Sơ đồ quy trình CO2 siêu tới hạn mơ phỏng trên máy tính ............................... 56
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình phân tích hydroxyproline ........................................................ 66
Hình 2.8: Đồ thị đường chuẩn hydroxyproline ................................................................. 67
Hình 2.9: Máy diện di BIORAD LABORATORY .......................................................... 69
Hình 3.1: Da cá ban đầu (a) và sau khi tách béo (b) ..........................................................73
Hình 3.2: Da cá Tra sau quá trình xử lý ............................................................................ 74
Hình 3.3 : Đồ thị khảo sát hiệu suất thu nhận Hydroxyproline và đạm tổng khi tủa bằng
các nồng độ muối NaCl khác nhau ở 4oC, trong 12 giờ.................................................... 76
Hình 3.4:Kết quả phân tích điện di ................................................................................... 78
Hình 3.5 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích tĩnh lần 1
theo thời gian của các tỉ lệ thể tích dịch collagen và môi trường đệm khác nhau. ........... 80


xiii

Hình 3.6 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích tĩnh lần 2
theo thời gian của các tỉ lệ thể tích dịch collagen và mơi trường đệm khác nhau. ........... 82
Hình 3.7 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng muối trong môi trường đệm thẩm tích động lần
1 theo thời gian của các tỉ lệ thể tích dịch collagen và mơi trường đệm khác nhau. ........ 85
Hình 3.8 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích động lần

2 theo thời gian của các tỉ lệ thể tích dịch collagen và mơi trường đệm khác nhau. ........ 88
Hình 3.9: Đồ thị đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0,3% ..................... 92
Hình 3.10 : Kết quả phân tích điện di các mẫu ở áp suất khác nhau ................................ 97
Hình 3.11 : Kết quả phân tích điện di các mẫu sử dụng dung môi hỗ trợ - ethanol ở các
hàm lượng khác nhau ........................................................................................................ 98
Hình 3.12 : Kết quả phân tích điện di các mẫu có nhiệt độ trích ly khác nhau .............. 100
Hình 3.13 : Kết quả phân tích điện di các mẫu có áp suất, nhiệt độ, hàm lượng ethanol
tối ưu ............................................................................................................................... 101
Hình 3.14 : Kết quả phân tích điện di các mẫu có lưu lượng CO2 siêu tới hạn khác
nhau ở điều kiện áp suất, nhiệt độ, hàm lượng ethanol tối ưu ........................................ 102
Hình 3.15 : Kết quả phân tích điện di các mẫu có thời gian chiết béo khác nhau ở điều
kiện áp suất, nhiệt độ, hàm lượng ethanol tối ưu) ........................................................... 104
Hình 3.16: Hình ảnh chụp SEM bề mặt của collagen (ASC) và gelatin ......................... 105
Hình 3.17: Hình ảnh collagen ASC bị biến tính ............................................................. 106
Hình 3.18: Hình ảnh chụp TEM một bó sợi collagen ASC ............................................ 107
Hình 3.19: Phổ FTIR của collagen (ASC) da cá tra đang nghiên cứu ............................ 108


xiv

Hình 3.20: Phổ FTIR của ASC và PSC từ cá da trơn largefin longbarbel (Mystus
macropterusn) .................................................................................................................. 109


xv

DANH MỤC BẢNG
Bảng1.1: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide ........................................... 5
Bảng 1.2 :Thành phần amino acid của chuỗi α1 và α2 trong collagen loại I trích ly từ
da cá - catfish .................................................................................................................... 16

Bảng 1.3: Giá trị nhiệt độ và áp suất tới hạn của một vài hợp chất có thể sử dụng trong
phương pháp chiết siêu tới hạn. ........................................................................................ 26
Bảng1.4: Thành phần collagen sau khi tách chiết và tinh sạch ........................................ 41
Bảng 1.5: Tính chất của collagen sau khi tách chiết và tinh sạch ..................................... 41
Bảng 2.1: Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 46
Bảng2.2: Các chế độ thí nghiệm khảo sát q trình kết tủa .............................................. 52
Bảng2.3: Các chế độ thí nghiệm khảo sát q trình thẩm tích tĩnh .................................. 53
Bảng 2.4: Các chế độ thí nghiệm khảo sát q trình thẩm tích động ............................... 53
Bảng 2.5: Các chế độ thí nghiệm khảo sát quá trình tách béo bằng CO2 siêu tới hạn ...... 57
Bảng 2.6: Khảo sát theo lưu lượng ................................................................................... 58
Bảng 2.7: Khảo sát theo thời gian ..................................................................................... 58
Bảng 2.8: Độ hấp thu của hydroxyproline chuẩn ở bước sóng 557 nm............................ 66
Bảng 3.1: Thành phần da cá Tra ........................................................................................72
Bảng 3.2: Thành phần da cá Tra sau tách béo .................................................................. 73
Bảng 3.3: Thành phần da cá Tra sau tẩy màu ................................................................... 74
Bảng 3.4. Thành phần dịch chiết collagen – acid acetic ................................................... 75


xvi

Bảng 3.5 : Hiệu suất thu nhận Hydroxyproline và đạm tổng trong dịch chiết collagen ở
các nồng độ muối NaCl khác nhau ................................................................................... 76
Bảng 3.6 : Hàm lượng chất hữu cơ và tro của các mẫu collagen thu được khi tủa ở các
nồng độ muối khác nhau. .................................................................................................. 77
Bảng 3.7: Hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích tĩnh lần 1 theo thời gian ... 79
Bảng 3.8: Hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích tĩnh lần 2 theo thời gian ... 82
Bảng 3.9: Hàm lượng muối trong mơi trường đệm thẩm tích động lần 1 theo thời gian . 84
Bảng3.10: Hàm lượng muối trong môi trường đệm thẩm tích động lần 2 theo thời gian 87
Bảng 3.11 : Hàm lượng NaCl còn lại trong dịch collagen sau mỗi lần thẩm tích ở các
chế độ động và tĩnh ........................................................................................................... 90

Bảng 3.12 : Kết quả thẩm tích ở chế độ động và tĩnh của các mẫu có tỉ lệ thể tích dịch
collagen : mơi trường đệm khác nhau. .............................................................................. 90
Bảng 3.13. Độ nhớt dung dịch collagen 0,3% theo nhiệt độ ............................................ 91
Bảng 3.14. Nhiệt độ biến tính collagen của các lồi sống ở điều kiện mơi trường khác
nhau và hàm lượng hydroxyproline của chúng ................................................................. 93
Bảng 3.15. Hiệu suất tách béo bằng CO2 siêu tới hạn và dung môi hỗ trợ ....................... 94
Bảng 3.16. Kết quả phân tích LSD sự khác biệt của hiệu suất tách béo theo áp suất ...... 96
Bảng 3.17. Kết quả phân tích LSD sự khác biệt của hiệu suất tách béo theo hàm lượng
ethanol ............................................................................................................................... 98
Bảng 3.18. Kết quả phân tích LSD sự khác biệt của hiệu suất tách béo theo nhiệt độ ..... 99
Bảng 3.19. Kết quả tách béo collagen bằng CO2 siêu tới hạn theo lưu lượng ................ 102
Bảng 3.20. Kết quả tách béo collagen bằng CO2 siêu tới hạn theo thời gian ................. 103
Bảng 3.21: Thành phần collagen thành phẩm ................................................................. 109
Bảng 3.22 : Một số tiêu chuẩn collagen ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm ......... 109
Bảng 3.23. Thành phần acid amin của collagen trích ly từ cá Tra ................................. 111


xvii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ASC: Acid souble collagen
FTIR: Fourier transform infrared spectroscopy
FDA: The Food and Drug Administration
HYP: Hydroxyproline
INCI: The International Nomenclature of Cosmetic Ingredients
PSC: Pepsin souble collagen
TP.HCM: thành phố Hồ Chí Minh


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Collagen là một loại protein, đóng vai trị then chốt trong thành phần cấu tạo
của mô liên kết như da, xương, dây chằng…Collagen không những được ứng dụng
trong ngành mỹ phẩm với tác dụng duy trì sự trẻ trung mà nó cịn được dùng trong các
lĩnh vực khác như dược phẩm, thực phẩm. Hiện nay, nguồn nguyên liệu để sản xuất
collagen chủ yếu là từ da của động vật và các phụ phẩm cá như da, xương, vây.
Việt Nam là một nước đang phát triển rất mạnh về ngành thủy sản, đặc biệt là
cá tra và cá basa với giá trị xuất khẩu cao. Năm 2008, Việt Nam xuất khẩu 640.000 tấn
cá tra, cá basa đạt giá trị 1,45 tỉ USD. So với năm 2007, sản lượng cá tra và cá basa
xuất khẩu tăng 48% giá trị và 66% số lượng. Tuy nhiên, phần lớn là xuất khẩu dạng
phi lê. Điều này dẫn đến một lượng phụ phẩm rất lớn thải ra hàng năm và ngày càng
tăng cao. Phần phụ phẩm này chủ yếu được dùng chế biến làm thức ăn gia súc và phân
bón nhưng giá trị kinh tế rất thấp. Trong khi đó, collagen trong da cá nếu được tách
chiết sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn rất nhiều. Gần đây trong nước đã bắt đầu có
nhiều nghiên cứu về tách chiết collagen từ da cá tra thu được hiệu suất collagen trong
dịch chiết cao, do đó việc nghiên cứu tinh chế để có collagen có độ tinh khiết cao trở
nên cấp thiết. Sản phẩm collagen thơ có thành phần tạp chất chính gây ảnh hưởng đến
chất lượng là muối do quá trình kết tủa thu nhận collagen và lipid còn lại trong da cá
ban đầu. Vì vậy, luận văn này tập trung vào việc loại muối và lipid bằng hai phương
pháp là thẩm tích và trích ly bằng CO2 siêu tới hạn.
Mục tiêu nghiên cứu:
-

Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ muối NaCl khác nhau đến hiệu quả kết
tủa thu hồi collagen.

-

Khảo sát động học của q trình thẩm tích của các tỷ lệ dịch collagen và

mơi trường bên ngồi khác nhau.

-

Khảo sát quá trình tinh sạch bằng CO2 siêu tới hạn ở các áp suất, lưu lượng,
nhiệt độ, hàm lượng chất phụ trợ và thời gian khác nhau.


2

CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1.

Collagen

1.1.1. Khái quát về collagen
Collagen là một loại protein chiếm tới 25% lượng protein trong cơ thể người, có
chức năng chính là kết nối các mơ trong cơ thể lại với nhau. Nó được coi như là một
chất keo dính các bộ phận trong cơ thể con người thành một khối hồn chỉnh, nếu
khơng có collagen cơ thể người chỉ là các phần rời rạc. Chỉ riêng điều này cũng đủ chỉ
ra tầm quan trọng của collagen với sự sống của con người.

Hình 1.1: Cấu trúc da
Đối với da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở
lớp hạ bì của da. Nó đóng vai trị kết nối tế bào, kích thích q trình trao đổi chất, tạo
độ đàn hồi cho da. Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả
lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất:
làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khoé mắt, khoé miệng,
lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khn mặt bị chùng nhão và chảy xệ. Chính
vì vậy mà Collagen đóng vai trị là một trong những chất quan trọng hàng đầu của

ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng...[5]


3

Collagen là protein dạng sợi, đàn hồi được do đó bảo vệ cơ chống lại sự kéo
căng. Trong collagen không chứa tryptophan, cystine như các loại protein khác, còn
tyrosin, histidin, và các acid amin chứa lưu huỳnh mỗi loại hiện diện không quá 1%,
điều này làm vắng mặt các cầu nối disulfua (-S-S) trong cấu trúc collagen là nguyên
nhân cho tính mềm dẻo của nó so với keratin. Và collagen chứa đến 30% glycine, 10%
hydroxyproline, 12% proline, 11% alanine. Như vậy về thành phần collagen khơng
hồn tồn là một protein. Thành phần của acid amin có thể thay đổi theo thời gian, tuy
nhiên có thể đưa ra cơng thức trung bình của collagen là C102H149O39N31.[23]
Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị
tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có
nhiều mức cấu trúc. Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch
polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích
sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen.
Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể. Đã có 29 loại collagen được tìm
thấy và cơng bố trong các tài liệu khoa học.
Collagen loại I: trong da và xương.
Collagen loại II: trong sụn, thủy tinh thể của mắt.
Collagen loại III: trong thành mạch máu.
Collagen loại IV: có trong chất nền của màng ở các cơ quan trong cơ thể.
Collagen loại V: có trong dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô.
Collagen loại VI: có trong gan, thận, màng sụn.
Collagen loại VII: có trong sự nối liền của da và biểu bì.
Collagen loại VIII: có trong tế bào màng trong.
Collagen loại IX: có trong sụn.
Collagen loại X: có trong sụn bị khống hố và phình to.

4

Collagen loại XI: có trong sụn.
Collagen loại XII: có trong dây chằng, sợi liên kết collagen.
Collagen loại XIII: có trong biểu bì, nang tóc, tế bào gốc của móng.
Collagen loại XIV: có trong sợi liên kết collagen.
Collagen loại XV: có trong nhiều mô khác nhau, tương đồng với collagen loại
XVII.
Collagen loại XVI: cịn đang được nghiên cứu.
Collagen loại XVII: có trong da.
Collagen loại XVIII: có trong gan.
Collagen loại XIX: có trong mắt, não, tinh hồn, mơ trong thời kỳ đầu phát
triển.
Collagen loại XX-XXIX: còn đang được nghiên cứu.
90% collagen trong cơ thể người và động vật là collagen loại I, II, III. Collagen
loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân. Collagen
loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi
của động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 - 10%.
Những loại colagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc
biệt.
1.1.2. Đặc điềm cấu trúc của collagen [23, 26, 38]
Collagen là một loại protein tương đối đơn giản gồm ba chuỗi amino acid riêng
biệt xoắn lại với nhau như một sợi dây thừng. Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn
cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine, proline, hydroxyproline. Collagen khơng
chứa tryptophan, và là một trong số ít các protein chứa hydroxylysine. Các amino acid
sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau:

5

Bảng1.1: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide
Triplet

Tỉ lệ

Gly – X – X

0,44

Gly – X – I

0,2

Gly – I – X

0,27

Gly – I – I

0,09

Trong đó I là amino acid (proline và hydroxyproline), X là các amino acid khác.
Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều
đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ
nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với
nhau tạo thành một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi.
1.1.2.1.

Cấu trúc phân tử collagen [41]

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử collagen
Phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là những phần tử nhỏ, chúng sẽ
tập hợp thành các phần tử lớn hơn là các sợi, và hình thành các bó collagen. Mỗi phân
tử collagen dài khoảng 300 nm, đường kính 1.5 nm, được tạo thành bởi 3 chuỗi
polypeptide (alpha peptide) và do đó collagen có cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi có hình


6

dạng xoắn ống từ trái sang phải. Ba chuỗi này xoắn lại với nhau hình thành một cuộn
có hướng từ trái sang phải, gọi là triple helix.
Chuỗi α peptide gồm có 3 phần:
-

Vùng lớn nhất là vùng xoắn ốc nằm ở giữa: chuỗi amino acid Gly – X- Y, Gly –
pro – Ohpro.

-

2 vùng telopeptide ở hai đầu (gồm 16 ÷ 25 amino acid): phần lysine (các liên
kết đồng hóa trị).

Hình 1.3: Cấu trúc của procollagen , tropocollagen và sự hình thành các liên kết
ngang
Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi
hình thành nên bộ ba. Sau đó ba lần của bộ ba này sẽ bắt lấy nhau và xoắn xung quanh
một bộ ba hình thành một sợi siêu cáp. Mỗi sợi này cũng liên kết với nhau để tiến lại
gần nhau bằng các liên kết ngang. Sự kết hợp này được gọi là một collagen siêu

xoắn.[15]
Collagen có 4 bậc cấu trúc:


7

-

Bậc 1: chuỗi polypeptide được tạo ra từ khoảng 1050 amino acid khác nhau (có
khoảng 20 loại), cấu trúc phổ biến là Glycine – X – Y. Trong đó X, Y thường là
proline và hydroxyproline.

-

Bậc 2: là sự hình thành nên các chuỗi xoắn alpha nhờ các liên kết hydro với
nguyên tắc là cứ 4 amino acid sẽ có một liên kết hydro. Ngồi ra cịn có cấu
trúc bậc 2 dạng tấm.

Hình 1.4: Cấu trúc bậc 2
-

Bậc 3: là cấu trúc dựa trên cơ sở cấu trúc bậc 2 nhưng có thêm một số liên kết
ngay trên chuỗi peptide của nó như liên kết hydro, liên kết ion, liên kết
disulfide, liên kết Vander-Waals.


8

Hình 1.5: Cấu trúc bậc 3
-

Bậc 4: là cấu trúc của các phân tử collagen (còn gọi là tropocollagen). Tạo nên
từ ba chuỗi xoắn ốc alpha.

Hình 1.6: Cấu trúc bậc 4
1.1.2.2.

Đặc điểm cấu trúc sợi của collagen [4, 8]