Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.17 MB, 5 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN

KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN

BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM

ThS. Đinh Thị Thu Hằng, ThS. Nguyên Thanh Việt
T - , í ~ * 1 ^ * I P A V n . ỉ Ị Ị M A w. 'jSm , /
ì t u n y ta m A rt* i f is ờ ỉiiti r Lsurvx* risjK* V /C Í I W u c m y

ThS. Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q u âtiy 1Ó3, Học viện Quân ý)

Hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thái sớ n
BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y
TÓM TẮT

Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là 
Bacillus anthracis đang được quan tẩm. Trong cơng trình này, gen vrrA trên nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA, 
cya, le f (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX 02) từ các chủng B. anthracis Việt Nam được tách dòng 
và giải trình tự hồn chỉnh. Đã xác đính được 1 đột biến thêm nucleotide A trên gen vrrA, 1 đột biến đồng nghĩa, 2 
đột biến sai nghĩa trên gen pagA và 1 đột biến đồng nghĩa trên gen cya. Đặc biệt, 1 đột biến sai nghĩa lần đấu tiên 
được phát hiện trên gen capA chủng B. anthracis Ba1. Cốc gen còn lại tương đồng 100% so với chủng tham 
chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đồng thời, một phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội tại được thiết kế để phát 
hiện chính xác B. anthracis. Đày là công bố đấy đủ chi tiết đầu tiên trong nước về trình tự các gen tiêu biểu của B. 
anthracis cũng như phát triển một cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đoán nhanh B. anthracis gây bệnh.

Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam,
SUMMARY

COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND 
DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN 
VIETNAM

Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet 
Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University

Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University
Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially 
Bacillus anthracis is interest in recent years. In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome), 
pagA, cya, le f genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX 02) o f ten B. 
anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed. One insertion mutation at 
nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA 
gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4). Interestingly, one missense mutation was first 
identified in the capA gene o f B. anthracis strain Ba1. The remaining genes had 100% similarity in comparison to 
the B. anthracis references. In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, 
capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed fo r detection o f virulent B. 
anthracis strains. This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some 
typical genes on virvlence plasmids pX 0 1 and pX 0 2 as well as develops a useful molecular tool for rapid 
detection o f virvlent B. anthracis in Vietnam.

Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam.

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

có thêm dữ liệu tương đối hoàn chình về một số gen
tiêu biểu của các chủng B. anthracis phân iập tại Việt
Nam. Trên cơ sở kếỉ quả phân tích trinh tự này, kết
hợp với các nghiên cứu trên thế giới để phát triển một
kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu
với ba gen đích lần lượt trên nhiễm sắc thể, pX01,
pX02 cùng chứng nội tại tái tổ hợp (IC) xác định chính
xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Như vậy,
cơng trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau:

Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên 
nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagẤ, cya, lef 
(plasmid pX01) và capA, capẻ, capC (plasmid pX02) 
của các chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam.

Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại 
tái tổ hợp xác định nhanh, chính xác B. anthracis gây 
bệnh trong tự nhiên.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứ u
V ậỉ liệu

Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B.
anỉhracis được phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết vì
bệnh than và mơi trường được cung cấp bởi Học viện
Quân y và Viện Y học Dự phòng Quân đội, Cục Quân
y (Ba1-Ba10). Trong đó, có 3 chủng B. aníhracis đầy
đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng B. anỉhracis chỉ
có pX01 (Ba

6

chủng còn lại là B. anthracis không
độc. Chủng B. cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi
chứng ắm.

Cac cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân toàn
bộ gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) và
capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm
primer3pius. Ba cặp mồi phát hiện qen vrrA, pagA,
capA trong phản ứng mPCR được the hiện chi tiết ở
bảng

1

Chứng nội tại (internal amplification conirol-IC):

Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 đã được thiết lập
trong nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả [3] và
đăng ký sáng chế (Phụ lục 2). Plasmid này được thiết
kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán
là capAF1/R1 (Bảng 1)7

Bảng 1. Các moi sử dụng trong phản ứng mPCR
chứa IC

Gen đích Trình tự (5'-3’)

Kích
thước

(bp)
vrrA

(nhiễm
sắc thể)

vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA
vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT

222

pagA

(plasmid
pX01)

pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA
pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT 751
capA

(plasmid
pX02)

PJET1.2-capA-ICI

capAFI :TGACG ATGACG ATGGTTGGT
capARI:

GCTTCCTGTCTAGGACTCGG

610

1000

Phương pháp

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực
nghiệm mơ tả, phân tích phịng thí nghiêm và trên thực
địa, sử dụng các kỹ thuậí vi sinh kinh điển và sinh tìọc
phân tử.

Các kỹ thuậỉ chính được tóm tắt như sau:

Tách dòng và giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than
được bấí hoạt ờ đieu kiện 121°C/20 phút sau đó tách
DNA tổng số theo quy trình của nhà sản xuất (QIAamp
DNA Mini Kit). Phản ứng PCR có độ chính xác cao
được thực hiện trên máy PCR Eppendorf Mastercycíer
pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity

(Thermo scientific). Sản phẩm PCR được tinh sạch
bằng kií GeneJet PCR purification và dịng hóa vào
vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific). Các piasmid
tái tổ hợp sau khỉ được kiểm tra có chứa gen mong
muốn được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên
máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit và
Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự tồn bộ các
gen đích, so sánh và phân tích trinh tự thu được với
các trình tự tham chiếu trên Genbank.

Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết quả giải
trình tự, một phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội tại
ổược thiết kế đề phát hiện chính xác các chủng B.
anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Chứng nội tại này
được bồ suríg vào mẫu trong q trình tách chiết DNA
với các nồng độ khác nhau để xác định lượng tối thiểu
vừa đủ có thể phát hiện được. Các thử nghiệm đều
được tiến hành song song với mẫu không chứa IC để
so sánh và mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm
soát ngoại nhiễm cũng như nhiễm chéo.

Phản ứng mPCR có thành phần như sau: 1X
Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases;
dNTPs 0,25 mM mỗi ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi
ngược mỗi loại, khoảng 10 ng DNA khuôn, điều chỉnh
H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific). Chu trinh
mPCR được thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, tiếp theo
!à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40
giây), sau đó hồn thành keo dài chuỗi ở 72° trong

6

phút. Sản phẩm mPCR được điện dí kiểm tra trên gel
agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide và
chụp ảnh dưới ánh sáng u v (UVP Eppendorf).

Công trình được thực hiện tại Trung tâm Nghiên
cứu ứng dụng Sinh Y Dược học và Bộ môn Khoa Vi
sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ
tháng 05/2014 đến tháng 02/2015.

KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

1. Nghiên cứu trình tự gen đặc trưng và gen

độc lực của B. anthracis

Gen vrrA (chromosome): Kết quả phân tích tồn bộ
gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis nghiên cứu cho
thấy gen vrrA giống nhau hoàn tồn về trình tự
nucleotide giữa các chủng B. arìthracis này và tương
đồng từ 99-100% so vởi các chủng tham chiếu. So với
chủng B. anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA của
các chủng phân lập ở Việt Nam chỉ sai khác 1
nucleotide (thêm nucleotide A ờ vị trí 346).

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

Ames Ancestor, BFV. Trong khi đó, gen ief có trình tự
giống nhau và tương đồng

100

% so vởỉ chủng tham
chiếu.

Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, một
đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới (A->G)1048 được

xác định ở gen capA chủng B. anthràcis Ba1 làm thay
đồi amino acid lysine íhành aiuíamic. Đây !à đột biến

trước đó chưa được tìm thấy trong các nghiên cứu
trên thế giới và có thể khẳng định đay ià đột biến mới,
phát hiện đầu tiên trên 1 chủng của Việt Nam (Ba1)
(Hình 1). Hai gen còn lại capB, capC cổ tính bảo tồn
cao, khong xảy ra đột biến ờ bất cứ điềm nào trên các 
chùng nghiên cứu.

1 0 1 0 1 0 2 0 Í 0 3 0 1 0 4 0 -.0 5 0 1 0 6 0 1 0 7 0 1 0 8 0 1 0 5 0 1 1 0 0

. . . . 1 . . . . í . - . . I --- 1 . . . . I . . . . I . . . . 1 . . . . I . . . . I --- 1 • • • • ! • • • • ! - • • • ! ■ ■ ' • < I i - i i : * - : 1
C P 0 0 7 S S 4 V o l l u m T M W T A T T C A RGM JGGJ.TCA C C M LÃ S C C aÕ T T Ã C C A G TC C A T T G C A T Ằ A A 7J.T C G TG T G T f.T C G T C M T T W .C A A W kC R ? A C M J C C W G G G TG C TC TATG

A A E B 0 1 0 Ũ 0 0 4 4 H H R U S A ...
B C 0 1 2 5 7 7 CDC Ể 8 4 ...
KZ- K N 0 5 0 6 5 3 A . B r . 0 0 3 ... ...
A Á Ẽ S 0 1 0 0 0 0 4 9 A u s t r a l i a 9 « ...
N Z C P 0 0 7 7 0 2 B F V O S A ... ...
J B I C 0 1 0 0 0 0 8 2 C a r b o s a p ... ... ...
C P 0 0 8 8 4 8 H Y 0 0 1 ... c ... ... ...
NZ ABDH02000062 T s t a n k o v s ... ... ...
« 2 ~ K M 0 5 0 S 5 0 Z im b a b w o 8 9 ... ... G ... ...
H C ~ 0 Ũ 3 9 8 I A 2 0 1 2 ... ...
HC~ 0 0 7 3 2 3 A m e s A n c e s t o r ... .. ... + T ...
B o l V i e t n a m ... .. ... .. ...<5... ...
B&3 V i e t n a m ... ... ...
B a 4 V i e t n a m ... ... ... * ... ...
1 0 3 0 lOXO 1 0 3 0 10' 10 1 0 5 0 1 0 6 0 5 0 7 0 ! 0 8 0 1 0 9 0 110 0

_____I . . . . I . . . . 1 . . . . i . . . . I . . . . 1 . . . . I --- Ì ---I . . . . I . . . . 1 . « > . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . . . I . . - - I . . . . i
C P 0 0 7 6 6 4 V o l l o t t T A iO ^ ÌA IT T C Ã A G A C G G A T C A C C A A A A C C a G ĨĨA C O A G T C C X T T C C A T A A A A A T C O T C T C T A T C G T C A A T T S A C A a A A G Ís T A C A T C C A A C G C T C C T C T A T C

i , I E ~ p K !■ V -i L' Ì-. - 0 K >f R V V R s i , ~ K r> f a is > f . - «
A A E R 0 1 0 0 0 0 4 4 K K A Ư 3 A ... ... ... ... . ... ... ...
1 ! i .. s !> K i- V ý: I . i> K R V < Si i ỉ T. T K Í ! !•'. K Vi

HC_012S77 coc 684 ... ... ... ...

L ~ V E -X - K V t >> ! i - u> s w R V V R •; i T K D •; £ K Ĩ , w
N Z K S 0 5 0 6 S 3 A . B r . 0 0 3 ... ... ... ... - ...

- 1. K •• ~ V K '■ V r '• !, 15 K :: R V 1 a T X a : * K t I.
A A E S 0 1 0 0 0 0 4 9 A u s t r a l i a 9 « ... ... .. ... ... ... ...

Ĩ ■} s ;; !' K ?■ V V

Ũ

I. o K s B V ■/ p. c- - T K

'•>

■' K - ~ «

N Z C Ẽ 0 0 7 7 0 2 B F V Ư S A ... - ...
" r o K s p K Ĩ V :■ E >. o K i: R V V H Q T K !j 1 K K ■; Si
J P I G 0 1 0 0 0 0 8 Z C i r b o s a p ... , - ... ... ...

L r 5 K

c

::

!•

K f- 9 •; c T. - K X- s V P- ’2 L T K & T n K

a

A ;i

C P 0 0 8 8 4 8 H Y O O l ... ... ...G ... - ...
V í Q K s !■ K t> V s ft i . I’r K t ỉ K V T « (,1 r, V K r . ¥ K -V
s z A B D N 0 2 0 0 0 0 6 2 T o l a n k o v s ... .. ...
“ L X' £ •: s r K ;■ V T n <\ o K R V R c- T K D ■' r i K ft V
N Z _ K N 0 5 0 6 5 0 2 ii B b a b w a 8 9 ... G ...

V T. V- r . :: e ?; r V i! h i c K R 1> V R Í •- 1’ K 0 y K A 2. n

K C 0 0 3 9 8 1 A Z 0 1 2 ... ... ... ... - ... ...

- ; i I 0 15 ÍỈ p K f- V r s T. o K ! í s V ' ỉ s Q - ~ K 2 ■ s K •: V.
N C 0 0 7 3 2 3 J U u b s A n c a s t o r , . . . ... - ^ - - ... ... ...

B a l V i e t n a m ... ...y ' ...1 ' * p .'. I ' * ... ... ’ ’
B o 3 V l « t n u m ... .. ... ... ...V... ... ... ...

Ỉ . : i z ■:> E r . r ỈT r V T A — D ĨC R V V B c- T K ữ 3 K v i A K
Ba4 V i e t n a m ... ...
(. i V. < !■ y. :• V ■. ! ì K •- H V V Fi i . ■( K i t ■■■ K s Í. >■

Hình 1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid cùa gen capA Ờ 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3, Ba4 VỚỈ12 chủng B. 
anthracis thạm chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có xẩy ra đột biến điểm). Các chủng tham chiếu được ký hiệu theo 
thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, nguồn gốc chủng, dấu chấm biểu thị nucleotide giống nhau, nếu có đọt biển se đưọ-c

biểu thị bằng các nucleotide.

Như vậy, qua phân tích trình tự tồn bộ các gen
vrrA (nhiễm sac thể), pagA, cya, lef (pXÒ1), capA,
capB, capC (pX02) cho thấy: Sự sai khác về trình tự
nucleotide của các gen đích trên giữa chủng nghiên
cứu và các chùng tham chiểu là không nhiều. Trinh tự
đầy đủ của các gen phân ịập đã được đăng ký trên
Genbank với mã sổ: KP2131Ò2, KP213103,
KP213104, KP213105-7, KP759885-7, KP759888-93
(Phụ lục 3 -1 7 ).

2. Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đa mồi

chửa chứng nội tại tái tổ hợp xác định B. anthracis

Để xác định B. anthracis có độc lực, cần chl ra
được chủng vi khuẩn than đó có chứa đồng thời cả

2

plasmid độc íực là pX01 và pX02. Phản ứng mPCR
đã được thiềt kế với 3 cặp mồi ià vrrAF1/R1,
pagAF1/R1 và capAF1/R1 để xác đính sự có mặt cùa
các gen tương ứng đặc trưng cho B. anthracis. Sản
phẩm mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B.
anthracis cỏ kích thước lần lượt là 222, 751 và 610 bp
xảc định các gen tương ứng vrrA, pagA và capA cùng
với sển phẩm khuếch đại plasmid IC (sử dụng chung

cặp mồi capAF1/R1, cho sản phầm có kích thước 1kb)
dề dàng phân biệt tren bản điển di (Hình 2).

IC 1000 bp

pagA 751 bp 
capA 610 bp

vrrA 222 bp

Hình 2. Xác định B. anthracỉs gây bệnh trong tự nhiên 
bằng mPCR chứa chứng nội tại

M: Marker 100 bp (Thermo scientific), ĐC {-): Đối chứng 
âm; ĐC(+): Đối chưng dượng sử dụng plasmid chứa cac

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

BÀN LUẬN

Việc phân tích trình tự các gen đặc írưng và gen
độc lực của các chủng B. anthracis phân lập ờ Việt
Nam rất quan trọng. Đây là công bố đay đủ nhất trong
nước về trình tự nucleotide gen vrrA và các gen đặc
trưng trên hai plasmid độc lực là pX01, pX02. Kết quả
cho thấy, sự sai khác về trình tự nucleotide của các
gen đích trên giữa chủng nghiên cứu và các chủng
tham chiếu là không nhiều. Mức tương đồng cao phản
ánh tính đa dạng di truyền thấp cùa các chủng B.
anthracis. Một phần kết quả này đã được cơng bố
trong cơng trình nghiên cửu gần đây của nhóm tác giả
[2], Đột biến xảy ra ít được lý giải do B. anthracis có
khả năng hỉnh thành bào tử, tồn tại írong đất qua
nhiều thập kỷ. Do đó, cơ hội để tích lũy các đột biến
DNA bị hạn chế, dẫn đến sự biến đổi dí truyền tương
đối íỉ [7]. Từ đó, việc thiết kế kỹ thuật PCR chẩn đoán
B. anthracis và thư nghiệm dựa írên các chủng phân
lập trong nước hồn tồn có thể chần đốn với chùng
từ các khu vực khác trên thế giới. Đột biến mới
(A->G)1Q48 được xác định ờ gen capA trên chủng B.
ànthracỉs Ba1 co íhề có ý nghĩa về đa dạng di truyền
gen capA, nên đưực quan tâm khi nghiên cứu, lựa
chọn chủng cho nhiều mục đích khác nhau.

Đến nay, rất ít cơng bố về các phương pháp chẩn
đoán phân tư đề cập đen chứng nội tại IC [

6

8

]. Chứng
nội tại ià cần thiết và gần như bắt buọc trong các phàn
ứng chẩn đoán dựa trên PCR. Một số cơng trình cũng

đã nghiên cứu IC nhưng thường ià bổ sung trong giài
đoạn phản ứng khuếch đại nên khơng kiểm sốt được
q trỉnh tách chiết acid nucleic [10,12]. Trong cơng
trình này, để kiểm sốt tồn bộ các cơng đoạn xềí
nghiệm, lị được bổ sung vào mấu trong quá trinh tách
chiết với một iượng tối thiểu có thể phat hiện được
nhằm loại bổ tối đa anh hưởng đến hiệu quả ỉẩch chiết
cũng như mPCR. Nồng độ ỈC được sử dụng ià
5x104copies/phản ứng (chi tiết quá trinh tối ưu mPCR
chứa IC đã được công bố trong bài báo gần đây cùa
nhóm nghiên cưu [4]). Sản phẩm IC xuấỉ hiện ở tất cả
các mẫu trên bản điện di, điều này chứng tổ quá trinh
tách chiết và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác
định là đáng tin cậy (Hình 2).

Có nhiều phương pháp từ đơn giàn đến phức tạp
được sử dụng để phát hiện B. anthracis. Nuôi cấy,
định danh trên môi trường thạch máu đòi hỏi nghiêm
ngặt về vấn đề an toàn sỉnh học. Một số phương pháp
mien dịch như phát hiện kháng nguyên và độc tố B.
anthracis có ứng dụng hạn chế do đọ nhạy và độ đặc
hiệu thấp. Phản ứng mPỊR trong cơng trình này được
thực hiện đơn giản đã cho phép xác định nhanh, chính
xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Điểm đặc
biệt ờ chỗ, mPCR có chứa ba cặp mồi dùng đề khuếch
đại đồng thời bốn sản phẩm gom ba gen đích vrrA,
pagA, capẠ của B. anthracis và một gen IC. Phản ứng
này đã khắc phục được hiện tượng đương tính gia
trong trường hợp chủng B. anỉhracis không đay đủ độc
lực, giúp giam giá thành và thời gian chẩn đoán so với

việc phai thực hiện các phản ứng đơn. Mặt khác, IC tái
ỉồ hợp được bổ sung vào mẫu trong quá trình tách
chiết ADN và khuếch đại đồng thời trong phản ứng

mPCR tối ưu cho phép xác minh kếí quả chẩn đoán,
loại bỏ hiện tượng am tính giả.

KẾT LUẬN_VA KIẾN NGHỊ

Kết luận: Trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA
(nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagA, ief, cya
(plasmid pX01) và capA, capB, cape (plasmid pX02)
của 10 Chung B. anthracis ở Việt Nam có sự sài khác
khơng nhiều so vởi thể giới. Một đột biến mới
(A-»G)1048 được xác định ở gen capA trên chủng B.
anihracis Ba1. Đòng thời, đã phát triển thành công kỹ
thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại tái íổ hợp xác
định nhanh, chính xác B. anthracis gẩy bệnh trong tự
nhiên.

Kiến nghị: Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ
thuật mPCR chứa IC xác định B. anthracis trên thực
địa và chế tạo bộ kit mPCR đa mồi chẩn đốn chính
xác B. anthracis.

Lời cảm ơn: Công trinh này được hoàn thành nhờ
sự tài trợ kinh phí cùa Chương trình CNSH phục vụ An
ninh, Quốc phỏng do Bộ Quốc phịng chủ quan thơng
qua nhiệm vụ “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác
định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và

dịch hạch”. Mã số: 2013.75.58.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn
Xuân Thanh. Nghiến cứu đặc điểm di truyền phan tư mội
số yếu tố độc lực cùa chủng Baciiỉus anthracis lưu hành ơ
khu vực mien núi phía Bắc Việt Nam. Hội nghị khoa học
Công nghệ Sinh họctọàn quốc 2013. 2013. pp. 594-8.

2. Đinh Thị Thù Hằng, Sơn Nguyễn Thái. Nghiên cứu
toàn bộ trình tự gen pagA trên một số chủng Bacillus
anthracis phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược
học Quân sự. 2015. 40(3), pp. 135-143.

3. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng
Tuyên và c s . Thiết kể chửng nội tại tái tổ hợp trong phản
ứng multiplex PCR chần đoán Bacillus anthracis. Tạp chí
Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26.

4. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thối Sơn, Minh
Nghiêm Ngọc, Phát triền phản ứng multiplex PCR chứa
chứng nội tại ỉái tổ hợp xác định đồng thời vi khuẩn
Bacillus anthracis và Yersinia pesíis. Tạp chí Y học Dự
phòng. 2015. XXV

(8

(168)), pp. 239-246. _

5. Candela, I . , Mock M., and Fouet A. CapE, a 47-
amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis
poiygiutamate capsule synthesis. J Bacterioi. 2005.
187(22), pp. 7765-72.

6

. Eíỉerbrok, H., Nattermann H.t Oze! M., et a!. Rapid
and sensitive identification of pathogenic and apathogenic
Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett.
2002. 214(1), pp. 51-9.

7. Hugh-Jones, M. and Blackburn J. The ecology of
Bacillus anthracis. Mol Aspects Med. 2009. 30(6), pp.
356-67.

8

. Kiee, s. R., Ozel M., Appel B., et a!.
Characterization of Bacillus anthracis-like bacteria isolated
from wild great apes from Cote d'Ivoire and Cameroon. J
Bacteriol. 2006. 188(15), pp. 5333-44.

9. Letant, s. E., Murphy G. A., Alfaro T. M., et a!.
Rapid-viabiiity PCR method for detection of live, virulent
Baciiius anthracis in environmental samples. Appl Environ
Microbiol. 2011. 77(18), pp. 6570-8. _

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR. J Clin
Microbiol. 2003. 41 (10) pp. .4873-5. _

11. Lovchik, J. A., Drysdale M., Koehler T. M , et aỉ.
Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus
anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of
inhalational anthrax. Infect Immun. 2012. 80(7), pp.
2414-25.

12. Ngan, G. J „ Ng L. M., Lin R. I . , et a!.

Development of a novel multiplex PCR for the detection
and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi
and Paratyphi A. Res Microbiol. 2010.161(4), pp. 243-8.

PHỤ LỤC

Phụ lục gồm:

Phụ lục 1. Các bài báo đã cơng bố liên quan đến cơng
trình

Đinh Thị Thu Hằng và Nguyễn Thái Sơn. Nghiên cứu
tồn bộ trình tự gen pagA ỉren một số chủng Bacilius
anthracis phân íập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược
học Quân sự. 2015.40(3), pp. 135-143.

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng
Tuyên và CS. Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản
ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis. Tạp chí
Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26.

Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc
Minh. Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội
tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus
a n i u i a ^ i S V O t o r s i n i c a p c ? d ik > . i <?ụ C m I Ỵ I t y i s U Ự f J i i U n y .
2015. XXV

(8

(168)), pp. 239-246.

Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế của Cục Sở hữu Trí tuệ
Việt Nam và Phiếu kết quả phân tích cua Viện Kiểm định
Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế

Phụ lục 3 -17. Trinh tự các gen giải trình tự của các
chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam được đăng ký
trên Genbank.

Phụ lục 18. Giấy xác nhận ứng dụng kết quả đề tài
(Phụ íục có minh chứng kèm íheo trong Báo cáo toàn
văn đầy đu)

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT

SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC

KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH

Ths. Ngô Thị Minh Châu, TS.Tôn Nữ Phương Anh, CN. Đ ỗ Thị Bích Thảo

Bộ môn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam

TS. Antoneila Santona, TS. Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli

Khoa Vi sinh lâm sàng và thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hịa Ý

TĨM TẮT

Nấm men là tác nhàn gây bệnh quan trọng ờ người, đặc biệt bệnh do nấm Candida sp. là bệnh phò biến. 
Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập ở Bệnh viện Trường Đại học Y 
Dược Huế và Bệnh viện Trung ương Huế.

Mục tiêu: Định danh loài một so chủng nấm men phân lập được từ câc bệnh nhàn được chẩn đoán nhiễm 
nấm nông hoặc nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với một số thuốc kháng nấm. Phương pháp nghiên cứu: 
Chúng tôi âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization

Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để định danh loài vi nấm. Kháng nấm đồ được 
thụ-c hiền bằng phương pháp khuếch tán trên đ a thạch. Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được, trong đó

C.albicans 43,80% và các lồi

c.

non albicans khàc gồm: C.ỉrópicalis 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata

7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%, 
c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83%. Ngồi ra chúng tơi cũng phân lập được 1 số loài nấm men khác 
như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65%. Đânh giá sự nhạy cảm của 6 lồi vi nấm Candida 
sp. có tần xuất phân lập cao trong nghiên cứu này ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B và nystatin. Tỷ lệ 
đề khàng của C. non albicans yà c. albicans với fluconazole và itraconazole lần lượt là 40,74%, 3,77% và 5,66%, 
50%. Kết quả của chúng tôi cũng ghi nhận 20,37%

c.

non albicans và 18,86%

c.

albicans đề kháng với 5- 
fluorocystocine. Tỷ lệ đề kháng với caspofungin của c. non albicans và c. albicans lần iưọt là 7,41% và 13,2%. 
Kết luận: Giống Candida sp. chiếm ƯU thế với lồi c. albicans có tỷ lệ cao nhất. Một số loài Candida non albicans 
biếm gặp được phân lập trong nghiên cứu này: c. orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, và 
c.mesorugosa. Ngoài ra cắc loài nấm men khác cũng được định danh gồm Geotríchum capitatum và 
Trichosporort asahii. Tất cả loài Candida sp. nhạy càm tot với amphotericin B và nystàtin, nhưng có một tỷ lệ 
đáng kề c. non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.

Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.

SUMMARY

APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION

ANTIFUNGAL SUSCEPTIBỈL YTI TESTING BY DISK DIFFUSION METHOD ' _ _ _ _

</div>