Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC











KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH
PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ
CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT
NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM






Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ ANH THẢO








Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC













PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH
PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ
CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT

NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM






Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
ThS. VƢƠNG THỊ VIỆT HOA TRẦN THỊ ANH THẢO









Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


iii


LỜI CẢM TẠ

Chúng tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bô Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi

trong suốt quá trình học tại trƣờng.
ThS Vƣơng Thi Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp.
Ks Nguyễn Minh Hiền đã tận tình giúp đỡ , tạo điều kiện cho tôi trong thời gian
thực tập tốt nghiệp.
Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học 29 và Bảo Quản 29 đã chia xẻ
cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi
trong thời gian thực tập.


iv


TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng
mắm đặc trƣng và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm” đƣợc tiến
hành tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến 7/2007 dƣới sự hƣớng dẫn
của Th.S Vƣơng Thị Việt Hoa nhằm tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng
thủy phân và gây hƣơng tốt để ứng dụng thử vào sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm
chay ngắn ngày từ nấm.
Đề tài tiến hành gồm 5 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện ƣu thế trong
chƣợp mắm trên môi trƣờng NA, NB, cơ bản và nƣớc chiết nấm rơm.
Thí nghiệm 2: khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc
ở thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm đƣợc bổ sung muối với nồng độ
tăng dần từ 0% đến 20%.dựa hàm lƣợng đạm formol sinh ra sau mỗi lần bổ sung
muối đƣợc đo bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol.
Thí nghiệm 3: khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được

từ thí nghiệm 1 và bố trí trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời
gian theo dõi sau 24 giờ, khảo sát khả năng hàm lƣợng đạm formol đƣợc sinh ra
bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol.
Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc từ thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian
theo dõi sau 3 ngày, ghi nhận kết quả qua phép thử cho điểm bằng phƣơng pháp
đánh giá cảm quan.
Thí nghiệm 5:Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc.
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 40
0
C-50
0
C.
Tỉ lệ phối trộn của dứa từ 15% đến 45%.


v


Sản phẩm nƣớc mắm chay có bổ sung vi khuẩn gây hƣơng Clostridium.sp và vi
khuẩn thủy phân Bacillus.sp đƣợc phân lập và tuyển chọn từ các thí nghiệm 1, thí
nghiệm 2, thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 để cho ra sản phẩm có giá trị cảm quan cao
nhất.
Kết quả thu đƣợc:
Tất cả các chủng đều có khả năng chịu mặn.
Chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 đƣợc chọn làm tác nhân thủy phân.
Chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 đƣợc chọn làm tác nhân sinh hƣơng.
Nghiệm thức 5 với công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu là 45% dứa
+ 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu

khí (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) + 10% vi khuẩn kị
khí (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) đƣợc chọn
làm công thức phối trộn để sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh.
Tp.HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2007
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học


vi


ABSTRACT

Subject “ Isolation, selection of microorganism that release protease and
create specific smell of fish sauce and applied to produce vegetarian fish sauce from
mushroom ” is excicuted in Microorganism Laboratory, Food Technology Faculty,
Nong Lam University from 3/2007 to 7/2007, is guided by MSc Vuong Thi Viet
Hoa to select bacteria can hydrolyze protein and create specific smell of fish sauce
well in order to produce experimentally vegetarian fish sauce from mushroom.
The subject has 5 experiments:
The 1
st
experiment: Isolation, selection of microorganism that is present
mainly in fish sauce grounds in NA, NB, Czapek and Volvariella volvacea extract
culture.
The 2
nd
experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that
isolated on Volvariella volvacea extract culture with salt concentration from 0% to
20%. Survey hydrolysis of protein by title of formol method.
The 3

rd
experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that
isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Survey hydrolys of
protein by title of formol method after 24 hours.
The fourth experiment: Survey possibility of hydrolysis of bacteria that
isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Result is evaluated
by sense organs method.
The fifth experiment: Producing experimentally vegetarian fish sauce from
mushroom.
T
0
opt
: 40
0
C – 50
0
C.
Ratio of pineapple: 15% - 45%.
Vegetarian fish sauce is supplemented Clostridium sp and Bacillus sp that are
isolated and selected from the 1
st
experiment, the 2
nd
experiment, the 3
rd
experiment
and the fourth experiment.

vii


Result:
All of bacteria have possibility of salt-resistant.
Hydrolytic agents are Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4.
Smell agents are Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2.
The fifth sample (include: 45% pineapple + 20% Volvariella volvacea + 20%
Pleurotus ostreatus + 15% salt + 10% Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 (ratio of
Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 is 1:1) + 10% Clotridium sp.1 and Clostrdium sp.2
(ratio of Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2 is 1:1)) is chosen the formula of
accomplished product.
Ho Chi Minh City, July 30
th
2007
Biotechnology Faculty


viii


MỤC LỤC

CHƢƠNG...................................................................................................... TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................iii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iv
Abtract ...................................................................................................................... vi
Mục lục ...................................................................................................................viii
Danh sách các bảng .................................................................................................. xi

Danh sách các sơ đồ, hình , đồ thị ..........................................................................xiii
1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài ................................................................ 2
1.2.1. Mục đích .......................................................................................................... 2
1.2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.2.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................. 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4
2.1. Khái quát về nƣớc mắm ..................................................................................... 4
2.1.1 Giới thiệu .......................................................................................................... 4
2.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm ........................... 4
2.1.3 Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm ................................................................... 7
2.2. Cơ chế hình thành nƣớc mắm ............................................................................ 7
2.2.1. Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin ................................................. 7
2.2.2. Quá trình tạo hƣơng thơm ............................................................................... 8
2.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ............................................................................ 8
2.3.1. Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày .......................................................... 8
2.3.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ..................................................... 10
2.4. Giá trị dinh dƣỡng của nấm ăn ......................................................................... 13


ix


2.5. Sự phân giải của enzyme .................................................................................. 18
2.5.1. Phân loại protease ......................................................................................... 18
2.5.2. Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng ............................................................ 19
2.5.2.1. Protease từ vi sinh vật ................................................................................ 19
2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin ..................................................... 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 21

3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 21
3.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 21
3.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 21
3.2.2. Vật liệu .......................................................................................................... 21
3.2.3. Môi trƣờng sử dụng ....................................................................................... 22
3.2.2. Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 22
3.3. Nội dung và phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm .............................................. 23
3.4. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy
phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm .......................................................... 23
3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện
trong chƣợp mắm .................................................................................................... 23
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 25
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm .............................................. 26
3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 27
3.5. Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc ......................................................................................................................... 29
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 32
4.1. Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các hủnh vi sinh vật có khả năng
chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm ................................. 32
4.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật .......................................... 32


x


4.1.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí ............................ 32
4.1.1.2. Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí ............................... 35

4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc ......................................................................................................................... 37
4.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................................. 40
4.1.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập
đƣợc ......................................................................................................................... 43
4.2. Kết quả sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập đƣợc .......................................................................................................... 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 56
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 56
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 57
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68
7. PHỤ LỤC


xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm ......................................................... 7
Bảng 2.2. So sánh thành phần nƣớc mắm ngắn ngày có dùng thêm chế phẩm
enzyme vi sinh vật và nƣớc mắm dài này theo phƣơng pháp thông thƣờng .......... 12
Bảng 2.3. Thành phần phân tích của một số nấm trồng phổ biến ........................... 14
Bảng 2.4. Hàm lƣợng vitamine và chất khoáng ...................................................... 14
Bảng 2.5. Thành phần acid amin trong nấm ........................................................... 14
Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi
sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ......................................................... 28
Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan nƣớc mắm ........................................................ 31

Bảng 4.1. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh
vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 0% ............................ 37
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh
vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 3% ............................ 38
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh
vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 10% .......................... 38
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh
vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 20% .......................... 39
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức ............. 41
Bảng 4.6. Bảng điểm đánh giá cảm quan về khả năng gây hƣơng của các chủng
vi sinh vật phân lập đƣợc từ chƣợp mắm ................................................................ 43
Bảng 4.7. Kết quả hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian .. 45
Bảng 4.8. Kết quả hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian .... 46
Bảng 4.9. Kết quả hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian ....... 47
Bảng 4.10. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 1 .................................... 48
Bảng 4.11. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 2 .................................... 48


xii


Bảng 4.12. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 3 .................................... 49
Bảng 4.13. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 4 .................................... 49
Bảng 4.14. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 5 .................................... 49

xiii


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH , ĐỒ THỊ

SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày ................. 9
Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ............ 11
Sơ đồ 3.1. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm .............................................................. 23
Sơ đồ 4.1. Quy trình đề nghị sản xuất nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm ........... 54
HÌNH TRANG
Hình 4.1. Khuẩn lac Bacillus sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 32
Hình 4.2. Khuẩn lac Bacillus sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 33
Hình 4.3. Khuẩn lac Bacillus sp.3 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34
Hình 4.4. Khuẩn lac Bacillus sp.4 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34
Hình 4.5. Khuẩn lac Bacillus sp.5 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 35
Hình 4.6. Khuẩn lac Clostridium sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36
Hình 4.7. Khuẩn lac Clostridium sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36
Hình 4.8. Hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh khuẩn lạc của những chủng
vi khuẩn có khả năng sinh protease trên môi trƣờng cơ bản bổ sung 10% sữa ...... 40
Hình 4.9. Sản phẩm nƣớc mắm chay ...................................................................... 55
ĐỒ THỊ TRANG
Đồ thị 4.1. Biến thiên khả năng sinh đạm formol của các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm theo nồng độ muối .............. 39
Đồ thị 4.2. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra do các chủng vi sinh vật
phân lập đƣợc từ chƣợp mắm trong các nghiệm thức... .......................................... 42
Đồ thị 4.3 Khảo sát hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời
gian. ......................................................................................................................... 45
Đồ thị 4.4. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời
gian .......................................................................................................................... 46
Đồ thị 4.5. Khảo sát hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian .... 47
Đồ thị 4.6. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan màu sắc giữa các nghiệm thức ...... 50


xiv

Đồ thị 4.7. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan mùi giữa các nghiệm thức ............. 50
Đồ thị 4.8. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan vị giữa các nghiệm thức ................ 51
Đồ thị 4.9. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan độ trong giữa các nghiệm thức ...... 51



1


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1.Đặt vấn đề.
Trung Quốc có nƣớc tƣơng, Việt Nam có nƣớc mắm. Từ lâu nƣớc mắm đã trở
thành một loại nƣớc chấm rất thông dụng và gần gũi với ngƣời dân Việt Nam,
những ai đi xa khi nhớ đến quê hƣơng thì không thể quên hƣơng vị của nƣớc mắm
quê nhà. Ngƣời nƣớc ngoài thì biết đến nƣớc mắm nhƣ món ăn truyền thống của
ngƣời Việt Nam, đã có bài báo so sánh nƣớc mắm đối với Việt Nam giống nhƣ
rƣợu cônhắc đối với nƣớc Pháp.Vừa đƣợc xem là loại gia vị vừa đƣợc xem là thực
phẩm giàu dinh dƣỡng, nó chứa nhiều acid amin không thay thế nhƣ lysin,
valin…các vitamine hoà tan trong nƣớc B1, B2, PP…và các nguyên tố Ca, P, S…
Khi xã hội phát triển,chất lƣợng cuộc sống ngày càng đƣợc nâng cao thì con
ngƣời luôn đòi hỏi đến các loại thực phẩm không chỉ về chất lƣợng và mùi vị, mà
còn phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhƣng vẫn giữ đƣợc giá cả hợp lý. Và
những yêu cầu này không loại trừ nƣớc mắm.
Ngoài ra vấn đề cạnh tranh giữa các hãng nƣớc mắm không chỉ trong nƣớc mà
còn ngoài nƣớc nhƣ Thái Lan thì các yêu cầu trên càng đƣợc quan tâm hơn. Trong
khi đó, công nghệ sản xuất nƣớc mắm ở Viêt Nam còn mang tính thủ công, hiệu
suất lên men thấp, thời gian lên men kéo dài và đây cũng là nhƣợc điểm lớn nhất. Vì

vậy nếu chúng ta có đƣợc chủng vi sinh vật thủy phân đạm và gây hƣơng thì ta có
thể linh động hơn trong quá trình sản xuất đồng thời có thể sử dụng các nguồn
nguyên liệu giàu đạm khác nhau và rút ngắn đƣợc chu kì sản xuất, nâng cao chất
lƣợng sản phẩm, nâng cao hiệu suất kinh tế.
Bên cạnh đó việc tìm các nguồn nguyên liệu mới nhằm làm đa dạng sản phẩm
nƣớc mắm cũng là một nhu cầu cấp thiết trên thị trƣờng. Làm sao để có một sản



2


phẩm nƣớc mắm mà những ngƣời an chay vẫn có thể dùng? Ta biết rằng từ lâu nấm
đã đƣợc coi là một đặc sản thơm ngon có giá trị dinh dƣỡng cao. Hàm lƣợng đạm
trong nấm cao hơn bất kì loại rau quả nào khác, hàm lƣợng muối khoáng trong nấm
cao hơn thịt cá và đặc biệt nấm có chứa nhiều loại vitamine nhƣ B12, B2… Ngoài
ra nấm còn có tác dụng chữa một số loại bệnh. Với những giá trị và tác dụng nhƣ
trên nấm đƣợc xem là loại thức ăn an toàn dành cho ngƣời. Những năm gần đây,
phong trào nuôi trồng nấm phát triển mạnh. Nhà nhà trồng nấm. Ngƣời ngƣời trồng
nấm. Gặp lúc thời tiết thuận lợi, nấm ra hàng loạt tiêu thụ và không tránh khỏi cảnh
“dội chợ”, hàng trăm ký nấm bị đổ đi vì không thể giữ lâu đƣợc. Chính vì vậy vẫn
dựa trên phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm cổ truyền và nguyên tắc sử dụng nguồn
hệ vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm, enzyme từ dứa và nguồn nguyên liệu nấm để
sản xuất ra sản phẩm nƣớc mắm chay. Từ những ý tƣởng trên, đƣợc sự cho phép
của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, dƣới sự hƣớng
dẫn của và giúp đỡ của Th.S Vƣơng Thị Việt Hoa chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng mắm
đặc trƣng và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm.
1.2.Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài.
1.2.1.Mục đích.

Tuyển chọn các vi khuẩn sinh protease và gây hƣơng từ các chủng vi khuẩn
đã đƣợc phân lập qua khảo sát khả năng phân giải đạm và gây hƣơng trong dịch
chiết nấm rơm.
Ứng dụng các chủng vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng để chế biến
nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nguyên liệu nấm rơm và nấm bào ngƣ làm đa
dạng sản phẩm nƣớc mắm, tạo sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, đáp ứng nhu
cầu an toàn thực phẩm.
1.2.2.Nội dung nghiên cứu.
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm.
Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trong
chƣợp mắm trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm.



3


Tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh protease qua khảo sát khả năng thủy
phân protein của các chủng vi sinh vật phân lập trong chƣợp mắm trên nguyên
liệu nƣớc chiếtt nấm rơm.
Khảo sát khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập trong
chƣợp mắm trên nguyên liệu nƣớc chiết nấm rơm.
Sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập và tuyển chọn đƣợc.
1.2.3. Giới hạn đề tài.
Đề tài chỉ bƣớc đầu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh thủy
phân tốt và gây hƣơng mắm đặc trƣng trên dịch chiết nấm rơm từ đó ứng dụng
vào sản xuất nƣớc mắm chay ở quy mô phòng thí nghiệm.
Do thiếu hóa chất để thực hiện một số phản ứng sinh hóa nên đề tài chỉ
dừng lại ở mức định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn.

4


Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Khái quát về nƣớc mắm.
2.1.1. Giới thiệu.
Nƣớc mắm đƣợc sản xuất bằng cách cho phân giải protein của cá dƣới tác
dụng của các enzyme có sẵn trong thịt và ruột cá. Cho cá vào hủ sành với lƣợng
muối đầy đủ, phơi trộn và để 6 – 12 tháng. Mắm cá đang muối đƣợc gọi là chƣợp.
Khi chƣợp chín đem lọc (hoặc đem nấu rồi lọc ta đƣợc nƣớc mắm). (Lê Xuân
Phƣơng, 2001).
Nƣớc mắm có truyền thống từ lâu đời và cho đến nay chƣa có tài liệu nào xác
định đƣợc thời điểm chính xác cũng nhƣ ai là ngƣời đầu tiên đƣa ra quy trình sản
xuất sản phẩm này, chỉ biết rằng nó đã gắn liền với đời sống hằng ngày, mang nét
đặc trƣng rất riêng, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam (Nguyễn Trọng
Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990).
Nghề nƣớc mắm đã có những chuyển biến rõ rệt từ màu sắc, mùi vị và thời
gian tạo ra sản phẩm rút ngắn từ 9 – 12 tháng còn lại khoảng 2 – 3 tháng.
Năm 1914, Rose đánh giá phẩm chất của nƣớc mắm theo các chỉ số hóa học:
Đạm toàn phần tính theo g/l.
Đạm hữu cơ = đạm toàn phần - đạm amoniac.
Đạm amin = đạm formol - đạm amoniac.
2.1.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm:
Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình

thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân, theo kinh
nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nƣớc chấm cho thấy lƣợng nƣớc cho vào thủy
phân tốt nhất là 30 – 40% so với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10%
muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 54
0
C – 58
0
C trong suốt thời gian lên men



5


là 64 – 72 giờ. ( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006)
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc chấm, thiếu
muối nƣớc chấm sẽ không hình thành đƣợc.
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc chấm phải là muối ăn
(NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ
rắn cao, màu trắng óng ánh không đóng cục, không có vị đắng chát.
Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein
nhanh hơn, tạo thành acid amin nhiều hơn.
Nồng độ muối cao có tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính của enzyme,
quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài.
Thƣờng lƣợng muối cho vào quá trình lên men khoảng 20 – 25% so với
lƣợng nƣớc. Nên thực hiện phƣơng pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác
định số lần cho muối vào và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh
hƣởng đến quá trình lên men.
Nồng độ muối ảnh hƣởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao
sẽ ức chế vi sinh vật phát triển. Còn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát

triển cùng với một số vi khuẩn gây thối phát triển và làm hƣ sản phẩm.
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng để phát huy tác dụng tích cực của các
loại enzyme. Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng
của các enzyme sẽ tăng, nhƣng nhiệt độ tăng cao quá sẽ ức chế enzyme và quá
trình thuỷ phân sẽ giảm. Vì enzyme mang bản chất là protein nên chúng không
chịu đƣợc nhiệt độ cao. Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme hoạt động từ
45
0
C – 54
0
C.
Ngoài ra nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Mỗi
loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định, do đó ta cần tạo một nhiệt
độ tối ƣu cho vi sinh vật phát triển và sinh trƣởng, từ đó vi sinh vật sẽ tiết ra
nhiều enzyme và quá trình thuỷ phân protein thành acid amin nhanh hơn.
Mỗi hệ enzyme có pH tối thiểu khác nhau vì vậy phải xem loại enzyme nào
nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nƣớc chấm.



6


Từ đó, ta tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho
thấy pH môi trƣờng tự nhiên có pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men. Đồng
thời, ở pH này còn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển.
Nƣớc bổi có vi khuẩn, men tiêu hóa đƣợc xem nhƣ dung môi hòa tan các chất
do sự phân giải cá hình thành để chống vi khuẩn bên ngoài xâm nhập khối thịt cá.
Trong nƣớc mắm có chứa rất nhiều loại vi khuẩn hiếu khí: gồm Escherichia
coli, Paracoli, Aerobacter, Bacillus subtilius….vi khuẩn gây bệnh: với tỉ lệ 1% nhƣ

Staphilococcus aureus, vi khuẩn yếm khí: Clostridium Tonkimeirs, Clostridium
welchii, Eubacterium; nấm mốc: Aspergillus Penicillium, Mucor; nấm men:
Trichoderma, Tropicalis…
Năm 1930, Boer và Guiller đã tách đƣợc từ nƣớc mắm một loại vi khuẩn kị
khí sinh bào nha là Clostridium. Loại này cấy trong môi trƣờng thạch pepton sẽ sản
sinh ra hƣơng vị của nƣớc mắm.
Thêm chƣợp chín cũng có tác dụng rút ngắn ¼ - ½ thời gian trong điều kiện
36
0
C – 44
0
C. Đồng thời phải cho muối từ nhạt đến mặn dần để lợi dụng khả năng
lên men ban đầu của vi sinh vật, không làm ức chế các men hoạt động.
Áp dụng phƣơng pháp cho muối nhiều lần sẽ phân giải nhanh hơn cho muối 1
lần.
Nguyên liệu đƣợc băm, nghiền, đập dập có tác dụng rút ngắn đƣợc thời gian
chế biến chƣợp hơn cá nguyên con.
Nghề nƣớc mắm hiện nay ở Việt Nam vẫn sản xuất theo phƣơng pháp cổ
truyền quá trình sản xuất thô sơ, thời gian kéo dài và hiệu quả kinh tế thấp. Đã có
nhiều công trình nghiên cứu để cơ giới hóa nghề nƣớc mắm nhƣng còn gặp nhiều
khó khăn và hạn chế vì sự ăn mòn của muối đối với kim loại.








7

2.1.3.Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm.

Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm.
Thành phần
hóa học (g/l)
Loại đặc biệt Loại I Loại II Loại III
Độ acid 4,75 3,5 2,95 2,13
NaCl 210 280 280 285
N
2
toàn phần 26 16 11,5 9,2
N
2
amon 7,6 3,1 3,2 2,1
N
2
formol 18,3 10,6 9,4 4,5
N
2
hữu cơ 19 8,3 10,5 6
N
2
amin 10,7 7,5 6,2 2,4
Tryptophan 1,05 0,64 0,45 0,31
Sắt 0,02 0,006 0,011 0,006
Magie 1,21 2,7 0,77 3,2
Canxi 0,21 0,39 0,35 0,41
(Lê Xuân Phƣơng, 2001 ).

2.2.Cơ chế quá trình hình thành nƣớc mắm.
Quá trình hình thành nƣớc mắm gồm 2 quá trình cơ bản:
2.2.1.Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin.
Quá trình thủy phân protit của cá thành acid amin, peptit nhờ enzyme protease
của cá hệ sinh vật có trong ruột cá hay vi sinh vật bên ngoài tác dụng vào qua các
dạng trung gian nhƣ peptin, polypeptit, peptit, và cuối cùng là acid amin.
Protein > polypeptid > acid amin
Nếu quá trình xảy ra mạnh sẽ dẫn đến các sản phẩm cuối cùng là acid amin và
1 số loại khí có mùi rất khó chịu nhƣ: H
2
, NH
3
,…Các sản phẩm này làm giảm chất
lƣợng nƣớc mắm, bay hơi tạo mùi khó chịu. Những vi sinh vật tiết ra enzyme
protease thúc đẩy quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Bên cạnh đó các vi sinh vật



8


gây thối có tác dụng ngƣợc lại làm nát thịt cá và gây thối sản phẩm, những vi sinh
vật này xuất hiện có khi ở giai đoạn đầu hay trong trong quá trình chế biến nếu
không khống chế kịp thời sau khi tạo thành nƣớc mắm cũng dễ bị thối do vi sinh vật
gây nên.
2.2.2.Quá trình tạo hƣơng thơm.
Đây là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải có thời gian nhất định để sản phẩm
tích lũy năng lƣợng đặc trƣng do sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo thành
hƣơng thơm.

Nƣớc mắm là một dung dịch mà trong đó không chỉ có acid amin, nƣớc, muối,
vitamine và các chất khoáng mà phải có loại hƣơng thơm đặc trƣng của nó. Do đó
nếu thiếu quá trình này thì nƣớc mắm không còn là nƣớc mắm mà chỉ là dung dịch
acid amin thuần túy.
Cho đến nay vẫn chƣa có sự giải thích rõ ràng nào về sự tạo hƣơng nƣớc mắm,
nhiều ngƣời cho rằng các sản phẩm thủy phân trong quá trình kết hợp với nhau mà
sinh hƣơng, một số khác thì cho ràng là do hoạt động của vi khuẩn lactid hoặc vi
khuẩn thuộc giống Clostridium nhƣ công trình nghiên cứu cùa Boer và Guiller
(1930), Creach và Koskopull (1940)…
2.3.Quy trình sản xuất nƣớc mắm.
2.3.1.Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày.
Đây là phƣơng pháp làm nƣớc mắm thủ công, quá trình này thƣờng kéo dài
12 – 14 tháng để làm chuyển hóa protein của cá thành acid amin rùi đem lọc và nấu
nƣớc mắm. Ở mỗi vùng mỗi địa phƣơng có phƣơng pháp làm khác nhau nhƣng ta
có thể tóm tắt quy trình tổng quát nhƣ sau :









9


Cá + Muối
Phƣơng pháp gài nén khu bốn Phƣơng pháp bổ sung
nƣớc

Phƣơng pháp của vùng Phú Quốc Phƣơng pháp khuấy trộn

Lên men

Chiết rút lần 1

Bã chƣợp chín Nƣớc mắm nguyên chất

Chiết rút lần 2 Nƣớc mắm chiết rút lần 2 Pha đấu Thành
phẩm nƣớc
mắm các
loại
Bã

Làm phân bón hoặc làm thực phẩm gia súc
Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày.
(Nguyễn Đức Lƣợng, 2006).

Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất:
*Cho muối trong quá trình lên men
Cho muối thành nhiều lần khác nhau: Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là:
Làm cho enzyme protease không bị ức chế bởi nồng độ muối cao, ngay từ đầu
ở nồng độ muối thấp quá trình thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn.
Kiềm hãm hoạt động của các vi sinh vật gây thối. Nếu với nồng độ muối cao
thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy làm chậm tốc độ thủy phân cá.



10

*Sự cho nước thêm vào chượp:
Điều này có tác dụng làm loãng nồng độ muối, làm loãng chƣợp tạo điều kiện
cho các enzyme hoạt động tốt, dễ khuấy trộn, thịt cá chóng nát, nhiệt độ phân phối
đều trong chƣợp.
Tuy nhiên, việc cho nƣớc thêm vào chƣợp dễ tạo điều kiện xâm nhập hoạt
động của các vi sinh vật gây thối. Do đó cần theo dõi quá trình sản xuất để phát hiện
các hiện tƣợng bất thƣờng, tạo mùi thối, vị xấu... để bổ sung muối kịp thời ngăn
chặn sự hƣ hỏng của chƣợp cá.
*Tác dụng phơi nắng:
Tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động làm tăng tốc độ thủy phân.
Chƣợp càng phơi nắng nhiều nƣớc mắm càng ngon, càng rút ngắn đƣợc thời
gian chƣợp chín làm tăng hiệu suất thủy phân.
*Tác dụng của khuấy trộn, đánh nhuyễn:
Tác dụng cơ học làm cho thịt cá chóng rã, tăng diện tích tiếp xúc với enzyme,
nhiệt độ, nồng độ muối, khối cá đƣợc đồng đều, đồng nhất, tạo điều kiện thủy phân
tốt hơn.
*Tác dụng bổ sung bã mắm cá và chượp chín vào chượp mới ướp muối: Cơ sở áp
dụng của phƣơng pháp này là:
Làm tăng lƣợng enzyme và lƣợng vi sinh vật cần thiết giúp quá trình phân giải
nhanh hơn.
Giảm đƣợc lƣợng muối cho những lần men sau, giảm bớt mùi tanh.
2.3.2.Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày.
Có nhiều biện pháp để rút ngắn thời gian len men bằng cách tăng cƣờng lƣợng
enzyme từ vi sinh vật, từ thực vật, điều chỉnh chế độ nhiệt độ, pH, lƣợng nƣớc thích
hợp từ đó làm thay đổi đáng kển thời gian, hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm.

11


Cá tƣơi

Làm sạch

Phân loại và trộn muối

Ƣớp muối

Lên men

Lọc

Bã Dùng chăn nuôi, làm phân bón

Nƣớc mắm nguyên chất

Pha chế

Thành phẩm
Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày
( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006)

Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất:

*Tăng lượng enzyme từ bên ngoài bổ sung enzyme vào cần hỗ trợ cho enzyme
protease của vi sinh vật ruột cá
Nguồn enzyme bên ngoài có thể lấy từ thực vật nhƣ bromelin của dứa, từ động
vật nhƣ pepsin từ niêm mạc dạ dày, enzyme protease khác từ tụy tạng, ruột non…
protease từ chƣợp cá đã chín của các mẻ nƣớc mắm trƣớc. Hiện nay ở nƣớc ta
ngƣời ta áp dụng biện pháp sử dụng các chế phẩm enzyme protease vi sinh vật. Các