Nghiên cứ thu nhận enzyme protease có trong phụ phẩm của ngành chế biến thủy sản

- 59 -

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
------0------

TRẦN QUỐC HIỀN

ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN
ENZYME PROTEASE CÓ TRONG PHỤ PHẨM
CỦA NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÃ SỐ NGÀNH: 2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 09 năm 2005


- 60 -

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cám ơn:
- Thầy Tiến só Lê Văn Việt Mẫn
- Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách
Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh
- Các đồng nghiệp tại Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

- Các thành viên trong gia đình và các bạn lớp cao học thực phẩm
K14
Đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt thời gian của khóa học.

Trần Quốc Hiền


- 61 -

TÓM TẮT
Chế biến những phụ phẩm của ngành thủy sản thành những sản phẩm giá trị
gia tăng sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất và giảm lượng phế
liệu thủy sản gây ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly
và tinh sạch enzyme protease từ dạ dày và ruột cá Basa (Pangasius bocourti).
Dịch trích ly protease acid thu được từ dạ dày có tổng hoạt tính cao nhất là
98,7796UI/gCKNT trong điều kiện: tỷ lệ nội tạng/dung môi: 1/3(w/w); pH 4,0;
nhiệt độ 45oC; thời gian trích ly 10 phút.
Dịch trích ly protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là
15,7795UI/g CKNT trong điều kiện trích ly: tỷ lệ nội tạng/dung môi: 1/1(w/w);
pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian trích ly 10 phút.
Dung môi isopropanol là tác nhân thích hợp nhất để kết tủa portease từ nội
tạng cá Basa.
Với tỷ lệ thể tích dịch trích ly enzyme và thể tích isopropanol: 15/85, mức tinh
sạch chế phẩm protease acid là 1,44 lần và hiệu suất thu hồi enzym là 89,53%.
Trong khi đó, chế phẩm protease kiềm đạt mức tinh sạch 1,65 lần và hiệu suất
thu hồi enzyme là 90,42%.
Chế phẩm protease acid thu được có Topt= 55oC và pHopt 2,0.
Chế phẩm protease kiềm thu được có Topt= 55oC và pHopt 10,0.
Sử dụng chế phẩm protease để thủy phân protein cá nục (Protein:21,83%, độ

ẩm 74,30%) với hàm lượng chế phẩm protease bổ sung là 10UI/g protein cá nục.
Sau 15 giờ phản ứng, hàm lượng N-amin trong mẫu được thủy phẩn bởi chế phẩm
protease kiềm và acid đạt được 193,26mg/gNtổng và 140,95mg N-amin/g N-tổng
tương ứng.


- 62 -

ABSTRACT
EXTRACTION AND PURIFICATION OF PROTEASE FROM STOMACH
AND INTESTINE OF BASA CATFISH (Pangasius bocourti)
Tranformation of fish by-products to food and products with bioactivity brings
about economic effects and reduces waste ratio in fishsery industry. This study,
focussed on the extraction and purification of protease from stomach and
intestine of Basa catfish (Pangasius bocourti).
Optimal conditions for protease extraction from Basa catfish stomach were as
follows: stomach and puffer ratio-1/3(w/w); pH 4,0; temperature- 45oC;
extraction time-10 minutes.
Optimal conditions for protease extraction from Basa catfish intestine were as
follows: intestine and puffer ratio-1/1(w/w); pH 9,5; temperature- 35oC;
extraction time-10 minutes.
Isopropanol was a suitable precipitating agent for protease purification. The
optimal ratio of enzyme extract and isopropanol was 15/85(v/v). The acid
protease recovery yield was 89,53% and the purity degree was 1,44; the alkaline
protease recovery yield was 90,42% and the purity degree was 1,65.
The pHopt and Topt of the acid protease were 2,0 and 55oC.
The pHopt and Topt of the alkaline protease were 2,0 and 55oC.
Proteolysis of Laying scad (Decapterus macrosoma) was carried out by the two
produced proteases above. The exoenzyme dose was 10 UI/g fish protein. After
15 hours, the free amino nitrogen content in the two samples catalyzed by the

acid and alkaline proteases was 140,95 and 193,26mg amino-nitrogen/g totalnitrogen respectively.


- 63 -

MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
CKNT:

Chất khô nội tạng

CP:

Chế phẩm

HTR:

Hoạt tính riêng

HS:

Hiệu suất

KT:

Kết tủa

M:

Mẫu thí nghiệm

N-amin:

Nitơ amin

N-tổng

Nitơ tổng

OD0:

Độ hấp thu của mẫu trước phản ứng

OD1:

Độ hấp thu của mẫu sau phản ứng

OD0:

Trung bình độ hấp thu của mẫu trước phản ứng

OD1:

Trung bình độ hấp thu của mẫu sau phản ứng

pHopt:

pH tối thích

THT:

Tổng hoạt tính

TN:

Thí nghiệm

Topt:

Nhiệt độ tối thích

Vm:

Thể tích mẫu

Vdm:

Thể tích dung môi

V/V:

Tỷ lệ tính theo thể tích

W/W:

Tỷ lệ tính theo khối lượng


- 64 -

DANH MỤC BẢNG

Bảng1.1: Nguồn protease động vật, thực vật và vi sinh vật ........................................ 7
Bảng1.2: Sự phân bố hệ enzyme protease trong hệ tiêu hóa của loài cá...................10
Bảng1.3: Hoạt tính enzyme protease có trong hệ tiêu hóa Brazilian catfish .............12
thay đổi theo mức protein (%) có trong khẩu phần
Bảng 1.4: Hoạt tính enzyme protease có trong hệ tiêu hóa South American
catfish...............................................................................................................13
thay đổi theo mức protein (%) có trong khẩu phần
Bảng 3.1: Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly enzyme protease..........34
từ dạ dày cá Basa
Bảng 3.2: Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly enzyme protease..........36
từ ruột cá Basa
Bảng 3.3: Các mẫu dịch chiết từ dạ dày cá Basa với nồng độ protease khác nhau....48
Bảng 3.4: Các mẫu dịch chiết từ ruột cá Basa với nồng độ protease khác nhau ........49


- 65 -

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế khái quát thủy phân protein bởi hệ enzyme protease ........................... 7
Hình 1.2: Hệ tiêu hoá cá Basa .........................................................................................12
Hình 2.1: Cá Basa (Pangasius bocourti) ..........................................................................18
Hình 3.1: nh hưởng của tỷ lệ nội tạng/dungmôi (w/w) đến tổng hoạt tính protease .....27
dịch trích.
Hình 3.2: nh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích protease acid từ dạ dày .......28
Hình 3.3: nh hưởng của pH dung môi đến quá trình trích protease kiềm từ ruột .........29
Hình 3.4: nh hưởng nhiệt độ đến tổng hoạt độ protease dịch trích từ nội tạng cá .........31
Hình 3.5: nh hưởng thời gian trích đến quá trình trích protease từ nội tạng cá .............32
Hình 3.6: Tổng hoạt tính protease dịch trích thu được từ dạ dày cá Basa trong ..............35

thí nghiệm tối ưu hóa qui hoạch thực nghiệm
Hình 3.7: Tổng hoạt tính protease dịch trích thu được từ ruột cá Basa trong ..................37
thí nghiệm tối ưu hóa qui hoạch thực nghiệm
Hình 3.8: Hiệu suất thu và hồi mức tinh sạch protease acid trong dịch trích từ ..............39
dạ dày cá Basa (tác nhân kết tủa (NH4)2SO4)
Hình 3.9: Hiệu suất thu và hồi mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ruột .........39
cá Basa (tác nhân kết tủa (NH4)2SO4)
Hình 3.10: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease acid trong dịch trích ................41
từ dạ dày cá Basa (tác nhân kết tủa: ethanol)
Hình3.11: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ...............42
từ ruột cá Basa (tác nhân kết tủa: ethanol)
Hình 3.12: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease acid trong dịch trích ...............43
từ dạ dày cá Basa (tác nhân kết tủa: aceton)
Hình 3.13: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ..............44
từ ruột cá Basa (tác nhân kết tủa: aceton)
Hình 3.14: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ..............44
từ ruột cá Basa (tác nhân kết tủa: isopropanol)


- 66 -

Hình 3.15: Hiệu suất thu hồi và mức tinh sạch protease kiềm trong dịch trích ..............45
từ ruột cá Basa (tác nhân kết tủa: isopropanol)
Hình3.16: Tổng hoạt tính protease khác nhau ở các mẫu dịch diết ...............................46
từ dạ dày cá Basa
Hình3.17: Tổng hoạt tính protease khác nhau ở các mẫu dịch diết ...............................46
từ dạ dày cá Basa
Hình 3.18: nh hưởng nồng độ protease acid ban đầu trong dịch trích từ dạ dày ..........49
Cá Basa đến hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch
của chế phẩm (Vmẫu/Visopropanol là 15/85)

Hình 3.19: nh hưởng nồng độ protease acid ban đầu trong dịch trích từ ruột................50
cá Basa đến hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm
(Vmẫu/Visopropanol là 15/85)
Hình 3.20: nh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm protease acid có nguồn gốc
....................................................................................................................................51
từ dạ dày cá Basa
Hình 3.21: nh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm protease kiềm có nguồn gốc ............52
từ ruột cá Basa
Hình 3.22: nh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm protease ở các giá trị ..53
nhiệt độ khác nhau
Hình 3.24: Sự biến đổi hàm lượng N-amin trong dịch thủy phân protein cá nục .............55
theo thời gian


- 67 -

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: nh hưởng của tỷ lệ nội tạng /dung môi (w/w) đến hoạt tính ...................62
của protease acid chiết từ dạ dày cá Basa
Phụ lục 2: nh hưởng của tỷ lệ nội tạng /dung môi (w/w) đến hoạt tính ...................62
của protease kiềm chiết từ ruột cá Basa
Phụ lục 3: nh hưởng pH đến hoạt tính của protease acid chiết từ dạ dày cá Basa...63
Phụ lục 4: nh hưởng của pH đến hoạt tính của protease kiềm chiết .......................63
từ ruột cá Basa
Phụ lục 5: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính của protease acid chiết ........................64
từ dạ dày cá Basa
Phụ lục 6: nh hưởng của pH đến hoạt tính của protease kiềm chiết ........................64
từ ruột cá Basa
Phụ lục 7: nh hưởng thời gian đến hoạt tính của protease acid chiết .................................65
từ dạ dày cá Basa

Phụ lục 8: nh hưởng của thời gian đến hoạt tính của protease kiềm chiết .........................65
từ ruột cá Basa
Phụ lục 9: Tối ưu hóa điều kiện chiết protease acid (pH, ToC) từ dạ dày cá.............66
bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm.
Phụ lục 10: Tối ưu hóa điều kiện chiết protease kiềm (pH, ToC) từ ruột cá ..............67
bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm
Phụ lục11: Tinh sạch protease acid từ dịch chiết nội tạng cá Basa ............................68
bằng tác nhân(NH4)2SO4
Phụ lục12: Tinh sạch protease kiềm từ dịch chiết nội tạng cá Basa...........................68
bằng tác nhân(NH4)2SO4
Phụ lục13: Tinh sạch protease acid từ dịch dạ dày tạng cá Basa ...............................69
bằng tác nhân Ethanol
Phụ lục 14: Tinh sạch protease kiềm từ dịch chiết ruột cá Basa ................................70


- 68 -

bằng tác nhân ethanol
Phụ lục15: Tinh sạch protease acid từ dịch chiết dạ dày cá Basa ..............................71
bằng tác nhân Acetone
Phụ lục 16: Tinh sạch protease kiềm từ dịch chiết ruột cá Basa ................................72
bằng tác nhân Acetone
Phụ lục17: Tinh sạch protease acid từ dịch chiết dạ dày cá Basa ..............................73
bằng tác nhân Isopropanol
Phụ lục 18: Tinh sạch protease kiềm từ dịch chiết ruột cá Basa ................................74
bằng tác nhân Isopropanol
Phụ lục 19: nh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính chế phẩm protease acid....75
Phụ lục 20: nh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính chế phẩm protease kiềm ..75
Phụ lục 21: nh hưởng của nhiệt độ môi trường đến hoạt tính chế phẩm ..................76
protease acid

Phụ lục 22: nh hưởng của nhiệt độ môi trường đến hoạt tính chế phẩm.............................76
protease kiềm
Phụ lục 23: Thủy phân protein cá nục bằng chế phẩm Protease acid thu nhận
được ..................................................................................................................77
Phụ lục 24: Thủy phân protein cá nục bằng chế phẩm Protease kiềm thu nhận
được ..................................................................................................................78
Phụ lục 25: Các thông số trong phương trình hoài qui..................................................78


- 69 -

PHẦN 1

TỔNG QUAN


- 70 -

1.1. Giới thiệu về phụ phẩm của ngành chế biến thủy sản [20][24][33][36]
Ngành chế biến thủy sản trong nước hiện nay phát triển rất mạnh. Sản lượng
xuất khẩu trong những năm gần đây tăng lên rõ rệt, đóng góp một phần không
nhỏ trong việc chuyển dịch cơ cấu kinh tế, tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm
nghèo cho người nông dân. Cùng với một số lónh vực khác, ngành thủy sản thực
sự trở thành một ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước.
Tuy nhiên, ngành chế biến thủy sản trong nước và thế giới hàng năm đều thải
ra một lượng lớn các phụ phế phẩm cần được xử lý hoặc chế biến tiếp. Ước tính
có khoảng 30-40% lượng thủy sản đánh bắt được trở thành phụ phế phẩm. Để
giải quyết một lượng lớn phụ phế phẩm như hiện nay, tại Việt Nam và trên thế
giới đang có xu hướng là phải cố gắng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành
các sản phẩm có giá trị gia tăng. Có nhiều cách để chế biến phụ phẩm thủy sản.

Một số phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng cao dùng để chế biến thành bột cá, dầu
cá… Ngoài ra các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide có hoạt tính sinh học,
màng sinh học được chế biến từ một số loại phụ phẩm thủy sản có thể mang lại
những hiệu quả kinh tế rất lớn cho con người.
Phụ phế phẩm thủy sản hiện nay được sử dụng để chế biến thành các sản
phẩm sau:
Bôït cá: Hiện nay, phần lớn phụ phế phẩm thủy sản trong nước và thế giới
được chế chế biến thành bột cá. Tổng sản lượng bột cá trên thế giới (bao gồm cả
phần bột được sản xuất từ phụ phẩm) trong thời kỳ 1999-2001 trung bình là 6,53
triệu tấn/năm. Trong năm 2002, tổng sản lượng bột protein tiêu thụ trên thế giới
là 210,7 triệu tấn, riêng sản lượng bột cá chiếm 3,4%. Ngành công nghiệp chế
biến bột cá và dầu cá rất phát triển ở các nước Peru, Chile, Nauy, Đan Mạch. Các
nhà máy chế biến bột cá thường được xây dựng kết hợp với các nhà máy chế biến
thủy sản lớn (Peter Edwards, 2004).


- 71 -

Nước mắm: Là sản phẩm truyền thống lâu đời của khu vực Đông Nam Á. Sản
phẩm được tạo nên từ quá trình thủy phân protein cá tạp hoặc phụ phế phẩm từ cá
của các nhà máy chế biến thủy sản bởi hệ enzyme có trong bản thân của cá và hệ
enzyme do vi sinh vật xâm nhập vào. Sản lượng nước mắm trung bình được sản
xuất hàng năm lên tới 250.000 tấn (Rustad, T., 2003; Gildberg, 2002).
Sản phẩm thức ăn gia súc: Từ nguyên liệu là cá tạp hoặc phụ phẩm ngành chế
biến thủy sản được thủy phân bởi acid formic kết hợp với enzyme nội tạng cá.
Sản phẩm này được sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho gia súc (Rustad, T., 2003).
Surimi: Tại các quốc gia như Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Myanmar và
Thái lan, nền công nghiệp surimi phát triển từ những năm cuối thập niên 80.
Surimi được sản xuất từ những loài cá nhỏ như cá mối, cà chỉ vàng, cá tráp…
Surimi được xuất khẩu chủ yếu sang Nhật Bản, Hàn Quốc và Singapore. Hiện

nay, tại Việt Nam, nguyên liệu sản xuất surimi đang bị khan hiếm dần do lượng
cá tạp được tập trung làm thức ăn cho thủy sản nuôi (Goh, K. H and Yeap, S. E;
2005).
Collagen/gelatin: Da và xương cá có trong phế liệu thủy sản là nguồn nguyên
liệu sản xuất collagen và gelatine (Rustad, T., 2003; Sikorski & Borderias,
1994). Collagen tinh khieát được sử dụng nhiều trong dược phẩm và mỹ phẩm.
Gelatine là nguyên liệu được sử dụng trộng rãi như là chất bổ sung trong công
nghiệp thực phẩm. Gelatine giúp gia tăng cấu trúc, khả năng giữ nước và độ bền
của sản phẩm thực phẩm.
Peptide có hoạt tính sinh học: Protamine là peptide chứa hơn 80% arginine.
Protamine thì được tìm thấy trong tuyến sinh dục của hơn 50 loài cá. Protamine
giúp ngăn ngừa khả năng phát triển bào tử Bacillus và là chất ức chế khả năng
phát triển vi khuẩn trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm (Rustad, T.,
2003).


- 72 -

Chế phẩm Enzyme: enzyme protease có trong nội tạng cá sống trong môi
trường nước lạnh được các nhà khoa học quan tâm nhiều trong thập niên qua.
Enzyme này có thể thủy phân protein ở nhiệt độ thấp và được so sánh tương
đương với nhóm protease của động vật có vú và thực vật (Rustad, T., 2003;
Gudbjarnason, 1999). Enzyme này được sử dụng làm chất trợ tiêu hóa cho cá con
và trong ngành mỹ phẩm. Taiï Việt Nam, protease được trích từ nội tạng cá thu
cũng được thử nghiệm ứng dụng trong sản xuất nước mắm (Đỗ Văn Ninh, 2003).
Dầu cá: Sản lượng dầu cá tuy có biến động nhưng trung bình hàng năm là 1,24
triệu tấn/năm, chiếm 1,4% tổng sản lượng các loại dầu mỡ tiêu thụ trên thế giới.
Tại Việt Nam, sản xuất dầu cá chủ yếu từ phụ phế phẩm cá Tra, cá Basa. Dầu cá
Tra, cá Basa thu nhận được có hàm lượng docosahexaenoic acid (DHA, C22:6 n3) khá thấp (0,23%), chủ yếu sử dụng trong sản xuất thức ăn thủy sản. Những
acid béo không no có trong dầu cá biển như eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5

n-3) và DHA làm cho dầu cá có giá trị hơn hẳn những nguồn lipit khác. Những
năm gần đây, ngành công nghiệp dược phẩm đã sản xuất ra những viên vi nang
lipit từ dầu cá (Rustad, T., 2003; Peter Edwards, 2004).
Tuy nhiên, việc bổ sung và ứng dụng các chế phẩm acid béo không no vào
trong sản phẩm thực phẩm vẫn còn những hạn chế vì chúng dễ bị oxy hóa, làm
giảm mùi, vị của sản phẩm.
1.2. Giới thiệu về hệ enzyme protease
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu enzyme protease [2][3][4][11]
Protease là các enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong các
chuỗi peptide hoặc protein và tạo ra sản phẩm là các acid amin tự do và các
peptide có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.
Trong các protease, enzyme protease của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn
cả.


- 73 -

-

Thế kỷ XVIII: Nhà tự nhiên học người Pháp là Reomur phát hiện ra trong
dạ dày của chim ăn thịt có hợp chất có khả năng tiêu hóa thịt.

-

Năm 1857: Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên
thu được ở dạng chế phẩm.

-

Năm 1862: Danilevxki đã tách được trypsin và amilase từ tụy tạng.

Các protease thực vật thì được phát hiện muộn hơn:
-

Năm 1871, Group Besanez công bố thu nhận được enzyme protease từ hạt
của một loài đậu.

-

Năm 1879, Wurtz phát hiện ra rằng các phần khác nhau của cây đu đủ
(Carica papaya) có chứa một loại protease gọi là papain.

-

Năm 1929, Willstatter. Bamann đã phát hiện bromeline từ dứa.

Ngày nay, người ta đã xác định được trọng lượng phân tử, cấu trúc trung tâm
hoạt động, tính chất lý hóa và tính đặc hiệu của nhiều loại protease. Người ta đã
nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của papain, trypsin, … Tuy nhiên,
còn có nhiều vấn đề chưa rõ ràng về tính đặc hiệu của các protease, vì vậy việc
phân loại và xác định tên hệ thống của chúng vẫn còn có những khó khăn nhất
định.
1.2.2. Phân loại enzyme protease [2][3][4][11][23]
Theo IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology),
caùc protease được chia thành hai nhóm:
-

Endoprotease: Thủy phân liên kết peptide nằm trong phân tử protein, nó
còn có tên là peptidase “nội”. Dưới tác dụng của Endoprotease, protein bị
phân cách thành những đoạn polypeptide, peptide có trọng lượng phân tử

nhỏ hơn.

-

Exoprotease: Thủy phân từ hai đầu mạch, tách các gốc acid amin thành
các acid amin tự do. Enzyme này còn có tên peptidase “ngoại”.


- 74 -

Dựa vào thành phần acid amin ở tâm hoạt động của phân tử enzyme, người ta
phân hệ enzyme protease thành 4 nhóm:
-

Aspartic protease: Cấu trúc trung tâm hoạt động của các enzyme này gồm

hai nhóm carboxyl của hai gốc aspartat tham gia xúc tác phản ứng.
Nhóm này bao gồm các enzyme điển hình như: pepsin, renin, cathepsin D. pH
hoạt động của các enzyme này trong khoảng 2-5, tùy thuộc vào loại cơ chất và
loại enzyme.
-

Metalo protease: Trung tâm hoạt động của các enzyme này có chứa các

ion kim loại trực tiếp tham gia xúc tác phản ứng. Nhóm này bao gồm các enzyme
như: carboxylpeptidase A và B, aminopeptidase, dipeptidase, prolinase,
prolidase.
-

Cystein protease: Trong trung tâm hoạt động của các enzyme này có

nhóm -SH của gốc cystein trực tiếp tham gia xúc tác phản ứng thủy phân. Các
enzyme thuộc nhóm này bao gồm: bromelin, papain, ficin. Khoảng pH hoạt động
của chúng rất rộng từ 4,5-10, khoảng pH tối ưu là 6-7,5.
-

Serin protease: Trung tâm hoạt động của các enzyme này có một gốc

serine và một gốc histindine. Nhóm này bao gồm một số enzyme điển hình có
nguồn gốc động vật như: trypsin, chymotrypsin, elastase, plasmin và thromin. pH
hoạt động của các enzyme này trong khoảng 7-10, hay còn gọi là các protease
kiềm.
1.2.3. Cơ chế tổng quát của việc thủy phân liên kết peptide [2][3][4][11][23]
Enzyme protease xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide. Các
enzyme thuộc nhóm này có tính đặc hiệu cao đối với vị trí của liên kết peptide,
bản chất của acid amin tham gia trong liên kết peptide cũng như các acid amin ở
lân cận liên kết peptide. Khả năng xúc tác của enzyme bao gồm nhiều cơ chế bổ
sung phối hợp với nhau trong việc gia tăng tốc độ phản ứng của một enzyme.


- 75 -

exoprotease
R1
+

exoprotease
R2

R3

H3N CH CO NH CH CO NH CH CO…NH

R4

R5

CH CO NH CH COO-

endoprotease

Hình 1.1: Cơ chế khái quát thủy phân protein bởi hệ enzyme protease
1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme protease [2][4][11]
Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên sự
phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan khác nhau.
Một số loài, cơ quan và mô của động vật có chứa một hay một số protease nhất
định, có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng. thực
vật, người ta có thể tách enzyme protease từ dứa, đu đủ và sung. động vật, có
thể tách enzyme protease từ tụy tạng, dạ dày, mô cơ và máu. vi sinh vật có thể
tách từ canh trường vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc.
Bảng1.1: Nguồn protease từ động vật, thực vật và vi sinh vật [11]
Nguồn

Enzyme

Ghi chú

Động vật
Tụy tạng

Trypsin

Các enzyme này được tiết ra

Chymotrypsin

ngoài tế bào cùng với dịch

Cacboxylpeptidase A

tụy

Cacboxylpeptidase B
Dạ dày (màng nhầy dạ

Pepsin A

Các enzyme được tiết ra

dày)

Pepsin B, C, D

ngoài tế bào cùng với dịch vị

Gastrisin
Renin


- 76 -

Mô cơ (gan, lá lách,

Cathepsin A, B, C, D

thận, phổi, tim, dạ con)

Leucinaminopeptidase

Thực vật
Mủ đu đủ

Papain

Mủ sung

Ficin

Chồi và vỏ quả dứa

Bromelin

Vi khuẩn
Bac. subtilis

Protease trung tính
Protease kiềm

Bac. licheniformis

Protease kiềm

Bac. megaterium

Protease trung tính

Ps. aeruginosa

Protease trung tính

Nấm mốc
Asp. oryzase

Protease trung tính,
Protease kiềm,
Protease acid

Asp. niger

Protease acid

Asp. candidus

Protease acid

Pen. chrysogenum

Protease acid

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme [2][4][10][11][12][23][41]

1.2.5.1.

nh hưởng của nhiệt độ môi trường

Theo qui luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng
enzyme cũng tăng khi nhiệt độ tăng. Nhưng vì enzyme có bản chất là protein nên
khi tăng nhiệt độ vượt quá một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị
giảm do sự biến tính bất thuận nghịch của protein.
1.2.5.2.

nh hưởng của pH môi trường


- 77 -

pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzyme. Mỗi enzyme chỉ xúc tác
với cường lực cao nhất tại một giá trị pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích
của enzyme. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu
hoặc trung tính. Chỉ có một số enzyme có pH hoạt động tối thích nằm trong vùng
acid mạnh hoặc kiềm mạnh. Cùng một loại enzyme nhưng được thu nhận từ các
nguồn khác nhau thì pH tối thích của chúng sẽ khác nhau.
1.2.5.3.

nh hưởng của cơ chất phản ứng

Phần lớn enzyme có động học xúc tác giống nhau: khi tăng nồng độ cơ chất sẽ
tăng tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Phương trình động học MichaelisMenten Vo = Vmax [S]/ Km + [S] phản ánh mối quan hệ giữa tốc độ của phản ứng
và nồng độ cơ chất.
1.2.5.4. nh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm
Các chất khi cho vào trong môi trường phản ứng sẽ làm tăng hoạt động hay ức

chế khả năng hoạt động của enzyme được gọi là chất hoạt hóa hoặc chất kìm
hãm. Phụ thuộc vào bản chất hóa học của phân tử protein mà mỗi enzyme sẽ có
những chất hoạt hóa hay kìm hãm đặc trưng riêng.
1.3. Hoạt động enzyme protease có trong động vật thủy sản

1.3.1. Giới thiệu chung [21][26][27][37]
Theo Santos. M. R (2003), hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá rất đa dạng,
bao gồm: protease, amilase, lipase… Tiêu hóa protein ở dạ dày động vật xảy ra
trong dịch lumen tiêu hóa. Protease xúc tác phản ứng thủy phân protein tạo nên
polypeptide, polypeptide tiếp tục bị thủy phân tạo nên các acid amin tự do.
Trypsin, chymotrypsin và elastase là những enzyme có trong bộ phận tiêu hóa
của hầu hết các loài động vật không xương sống và có xương sống (Solomon và
cộng sự, 1996). Trypsin là enzyme đặc trưng cho quá trình thủy phân của peptide
và các este của amino acid lysine vaø arginine (Ferscht, 1985).


- 78 -

Bảng1.2: Sự phân bố hệ enzyme protease trong hệ tiêu hóa của loài cá [21]
Enzyme

Pepsin

Vị trí tổng

Vị trí phản

pH tối

Sản phẩm

hợp

ứng

ưu

thủy phân

Dạ dày

Lumen dạ

Vùng

dày

acid

Peptide

Tác giả

Class

và

cộng

sự

(1987, 1989); Smith
(1989);

Dougtas

và

cộng sự (1999)
Trypsin

Enxocrine tụy Lumen của
ruột và môn

Vùng

Peptide

kiềm

Class

và

cộng

sự

(1985); Sabapathy và

vị

Teo (1993); Kuz’mina
và Gclman (1997)

Chymotryp-

Enxocrine tụy Lumen của

sin

ruột và môn

Vùng

Peptide

kiềm

Class

và

cộng

sự

(1985); Sabapathy và

vị

Teo (1993); Kuz’mina
và Gclman (1997)

Aminopep-

Dạ dày,

tidase

Enxocrine tụy dày, lông

Lumen dạ

Vùng

Peptide

acid hoặc ngắn

Lener (1981); Smith
và (1989); Kuz’mina và

và

mao của ruột

vùng

amino acid Gclman (1997)

enterocytes

và tụy

kiềm

tự do

Leucin

Dạ dày,

Màng liên

Vùng

Peptide

Aminopep-

Enxocrine tụy kết

kiềm

ngắn

và (1989); Kuz’mina và

tidase

và

leucin

tự Gclman (1997)

enterocytes

do

Lener (1981); Smith


- 79 -

1.3.2. Enzyme protease có trong hệ tiêu hóa của cá Catfish [26][27][37]
Enzyme protease thuộc hệ tiêu hóa của
loài cá da trơn được nhiều nhà nghiên cứu
quan tâm.
Yosinaka và cộng sự (1984) đã tách ra
được trypsin từ tuyến tụy của catfish
Silurus asotus. Enzyme này có trọng lượng
phân tử là 26.000 dalton, hoạt động ở pH

Hình 1.2: Hệ tiêu hóa cá Basa

tối ưu là 8,3. Nó có thành phần các amino acid tương tự như trypsin ở bò.
Kuz’mina (1991) ghi nhận được sự hiện diện của Protease kiềm trong dịch
ruột và dịch dạ dày Brazilian catfish. Hoạt tính protease có trong dịch ruột thấp

hơn rất nhiều so với protease có trong dịch dạ dày.
Lundstedt. L. M (2002) đã phát hiện Trypsin và chymotrypin trong toàn bộ
đoạn ruột và dạ dày Brazilian catfish (P. coruscans). Sự hiện diện trypsin và
chymotrypsin trong dạ dày của cá là một kết quả nghiên cứu đã gây ngạc nhiên
lớn cho giới khoa học.
Santos. M. R (2003) nhận thấy rằng hoạt tính của protesae kiềm ở những phân
đoạn ruột khác nhau (đoạn trước, giữa và sau) của cá South American catfish
(Rhamdia quelen) thì khác nhau. Hoạt tính protease kiềm được tìm thấy trong
suốt chiều dài của ruột cá nhưng thường giảm khi về cuối đoạn ruột.
Thông thường, sự phân bố và hoạt tính của enzyme trong hệ tiêu hóa biến đổi
theo tập tính ăn và thành phần thức ăn (Tengjaroenkul và cộng sự, 2001).
Lundstedt. L. M (2002) đã khảo sát sự thay đổi hoạt tính protease có trong hệ
tiêu hóa khi thay đổi hàm lượng protein trong khẩu phần thức ăn cá Brazilian
catfish (P. coruscans) (bảng 1.3). Tổng hoạt tính protease cao nhất đã được tìm
thấy ở dạ dày (79,2UI/mg protein). Các enzyme này hoạt động ôû vuøng pH acid.


- 80 -

Bảng1.3: Hoạt tính enzyme protease trong hệ tiêu hóa Brazilian catfish thay
đổi theo tỷ lệ hàm lượng protein (%) có trong khẩu phần thức ăn cho cá [27]
Protein (%)

20

30

40

50

Protease tổng (UI/mg Protein)
Dạ dày

52,2 ± 17,5

79,2 ± 15,5

52,6 ± 9,1

60,7 ± 17,2

Ruột trước

0,60 ± 0,017

1,03 ± 0,022

0,43 ± 0,022

0,46 ± 17,2

Ruột giữa

-

-

-

-

Ruột sau

17,5 ± 14,96

3,9 ± 3,87

7,9 ± 5,83

12,6 ± 9,24

Trypsin (UI/mg Protein)
Dạ dày

3,6 ± 1,43

3,6 ± 1,40

2,7 ± 1,12

4,2 ± 1,47

Ruột trước

0,24 ± 0,11

0,24 ± 0,04

0,33 ± 0,18

0,41 ± 0,13

Ruột giữa

0,75 ± 0,23

0,56 ± 0,22

0,61 ± 0,25

0,22 ± 0,08

Ruoät sau

0,60 ± 0,50

0,53 ± 0,45

0,41 ± 0,24

0,19 ± 0,09

Chymotrypsin (UI/mg Protein)
Dạ dày

1,2 ± 0,43

1,4 ± 0,38

1,5 ± 0,39

1,5 ± 0,45

Ruột trước

0,48 ± 0,31

0,40 ± 0,09

0,58 ± 0,27

0,62 ± 0,11

Ruột giữa

0,83 ± 0,17

1,34 ± 0,33

1,51 ± 0,18

0,97 ± 0,16

Ruột sau

1,18 ± 0,41

0,97 ± 0,18

1,21 ± 0,23

0,96 ± 0,18

Lundstedt. L. M (2003) ghi nhận rằng: hoạt tính enzyme protease kiềm,
protease acid, trypsin và chymotrypsin trong nội tạng cá South American catfish
(Rhamdia quelen) thì luôn thay đổi theo tỷ lệ hàm lượng protein có trong khẩu
phần thức ăn cho cá (bảng 1.4). Hoạt tính protease kiềm trong đoạn ruột trước và
đoạn ruột giữa được ghi nhận là 1,40 UI/mg protein. Đây là giá trị hoạt tính
protease cao nhất được ghi nhận khi khẩu phần thức ăn cho cá chứa tỷ lệ hàm
lượng protein laø 27%.


- 81 -

Bảng 1.4:Hoạt tính enzyme protease của South American catfish thay đổi theo
mức protein (%) có trong khẩu phầnthức ăn cho cá [26]
Protein (%)

20

27

34

41

1,29

1,43

1,62

Protease acid (UI/mg Protein)
Dạ dày

0,96

Protease kiềm (UI/mg Protein)
Ruột trước

1,17

1,40

1,36

1,26

Ruột giữa

0,70

1,11

1,09

0,97

Ruột sau

0,61

0,94

0,98

0,87

Trypsin (UI/mg protein)
Dạ dày

0,18

0,02

-

-

Ruột trước

0,31

0,50

0,51

0,32

Ruột giữa

-

-

0,16

0,05

Ruột sau

0,10

0,20

0,10

0,08

Chymotrypsin (UI/mg protein)
Dạ dày

3,00

2,91

2,57

2,53

Ruột trước

2,73

3,06

3,11

3,00

Ruột giữa

1,49

2,46

2,71

2,68

Ruột sau

1,58

2,33

2,30

2,32

1.4. Trích ly & tinh sạch enzyme protease từ hệ tiêu hóa động vật thủy sản
[7][8][13][14][17[18]][22][25][28][27][30][38].v.v…

Trích ly và tinh sạch enzyme là quá trình thu nhận enzyme và loại bỏ các tạp
chất không cần thiết nhưng không làm vô hoạt enzyme. Khi chọn các phương
pháp trích ly và tinh sạch enzyme, ta cần phải lưu ý tới sự ảnh hưởng của bản
chất dung môi trích ly, pH, nhiệt độ, lực ion… đến hoạt tính cuûa enzyme.


- 82 -

1.4.1. Trích ly enzyme
Quá trình trích ly nhằm mục đích chiết enzyme từ nguyên liệu vào dung môi.
Quá trình này là một giai đoạn quan trọng trong công nghệ sản xuất chế phẩm
enzyme. Chúng ta có thể sử dụng phương pháp vật lý (nghiền, xử lý bằng sóng
siêu âm), phương pháp hóa học (sử dụng hóa chất), phương pháp sinh học (tự
phân tế bào, sử dụng chế phẩm enzyme) hay sử dụng kết hợp các phương pháp
để xử lý nguyên liệu trước khi trích ly. Dung môi trích ly enzyme là dung dịch
đệm có pH thích hợp, dung dịch muối loãng hoặc nước. Có nhiều yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng khuếch tán enzyme từ nguyên liệu vào dung môi như: tỷ lệ
nguyên liệu và dung môi, pH, nhiệt độ, thời gian… Sau quá trình trích ly, ta tiến
hành lọc hoặc ly tâm để loại bỏ các chất không tan và thu được dịch enzyme thô.
1.4.2. Tinh sạch enzyme
Từ dung dịch chứa enzyme thô lẫn các tạp chất hòa tan, ta có thể sử dụng
nhiều phương pháp khác nhau để tinh sạch enzyme.
- Tách tạp chất ra khỏi mẫu: Các tạp chất hòa tan và nước có thể loại khỏi
dịch enzyme bằng phương pháp khác nhau như: siêu lọc, thẩm tích, cô đặc
chân không, sấy thăng hoa, sấy chân không…
- Tách enzyme ra khỏi mẫu: Có thể dùng phương pháp tách phân đoạn nhờ

kết tủa protein bằng các dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, sắc ký lọc gel,
sắc ký trao đổi ion… để thu những phần dịch trích ly có hoạt tính enzyme cao
nhất.
1.4.3. Phương pháp kết tủa enzyme bằng muối và dung môi hữu cơ
Kết tủa bằng muối, dung môi hữu cơ là phương pháp nhằm tách enzyme ra
khỏi mẫu ban đầu chứa hỗn hợp enzyme và các tạp chất khác. Tác nhân kết tủa
protein với tỷ lệ thích hợp được đưa vào dịch enzyme. Sau khi kết tủa, chế phẩm


- 83 -

enzyme được tách bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc để loại bỏ phần lỏng và
được sấy khô (sử dụng phương pháp sấy đối lưu ở nhiệt độ không lớn hơn 50oC
hoặc sấy chân không).
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành kết tủa protein bằng muối amonium
sulfat và các dung môi hữu cơ như: ethanol, aceton và isopropanol.
1.4.3.1. Tác nhân muối (NH4)2SO4
Các muối trung tính có ảnh hưởng rất sâu sắc đến độ hòa tan của protein. Sự
hòa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có yếu tố nồng độ muối
trong dung dịch. Với nồng độ muối thấp, sự hiện diện của muối giúp ổn định các
nhóm chức năng khác nhau của phân tử protein và có thể làm tăng tính hòa tan
của một số protein trong dung dịch. Nhìn chung, các muối MgCl2, (NH4)2SO4 làm
tăng độ hòa tan của protein cao hơn so với muối NaCl, NH4Cl, KCl. Tuy nhiên
khi nồng độ muối tăng lên thì có thể loại bỏ lớp nước hydrate hóa ra khỏi phân tử
protein, làm giảm tính hòa tan của protein. Đến khi không còn đủ lượng nước cần
thiết để tương tác với các phân tử protein thì protein bắt đầu kết tủa.
Protein được kết tủa bằng muối vẫn giữ nguyên các tính chất ban đầu của
chúng, có thể hòa tan trở lại và không bị biến tính bất thuận nghịch. (NH4)2SO4
được dùng để kết tủa protein, bởi vì độ hòa tan của nó trong nước rất lớn và do đó
có thể đạt được giá trị lực ion cao.

1.4.3.2. Tác nhân dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó
có giá trị hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi
có hằng số điện môi lớn (nước, dimethylsulphoside) có thể ổn định các tương tác
giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của
protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ
(ethanol, aceton và isopropanol) ngăn cản sự phân tán các phân tử protein trong