Định lượng nhanh vibrio parahaemolyticus bằng mẫu dò biotin labeled ap conjugate khảo sát mật độ nhiễm v parahaemolyticus trong nhuyễn thể tại vùng nuôi cần giờ tp hcm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ VĂN HIỂU

ĐỊNH LƯỢNG NHANH VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS BẰNG MẪU DÒ BIOTINLABELED AP CONJUGATE. KHẢO SÁT MẬT ĐỘ
NHIỄM V.PARAHAEMOLYTICUS TRONG NHUYỄN
THỂ TẠI VÙNG NUÔI CẦN GIỜ - TP. HCM

CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2009


Phần 1
MỞ ĐẦU


Phần 2
TỔNG QUAN


Phần 3
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU


Phần 4

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN


Phần 5
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
----oOo---

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Ngày tháng 08 năm 2009


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc.
-------------oOo--TP. HCM, ngày tháng 08 năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SỸ

Họ và tên học viên: LÊ VĂN HIỂU

Giới tính: Nam

Ngày tháng năm sinh: 10/10/1983

Nơi sinh: Hà Tĩnh

Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học
Khóa: 2007
1. TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG NHANH VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
BẰNG MẪU DÒ BIOTIN-LABELED AP CONJUGATE. KHẢO SÁT MẬT
ĐỘ NHIỄM V.PARAHAEMOLYTICUS TRONG NHUYỄN THỂ TẠI VÙNG
NUÔI CẦN GIỜ - TP. HCM
2. NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
Nghiên cứu xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh
V.parahaemolyticus trong thủy sản và thức ăn chế biến dựa trên q trình lai phân
tử, sử dụng mẫu dị biotin-tlh-labele alkaline phosphatase conjugate, đặc hiệu với
đoạn gene thermolabile hemolysin chỉ có ở các dịng V.parahaemolyticus mà khơng
có ở các vi sinh vật khác.
Xác nhận hiệu lực phương pháp mới xây dựng.
Xác định một số thông số của phương pháp mới.
So sánh hiệu quả phân tích của phương pháp mới xây dựng với phương pháp
định lượng truyền thống.
Ứng dụng phương pháp mới vào phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng ni
Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, từ kết quả đưa ra khuyến cáo cần thiết.


3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/02/2009
4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 03/08/2009

5. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Thầy, PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong q trình
học tập và thực hiện luận văn.
Tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy
sản vùng 4 đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho Tôi cả về vật chất và thời gian để hoàn
thành luận văn này.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ Môn Công nghệ Sinh học,
Đại học Bách Khoa cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã truyền đạt cho em
những kiến thức nền tảng trong quá trình học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Anh, ThS. Nguyễn Tiến Dũng đã nhiệt tình giúp
đỡ và động viên em hồn thành tốt luận văn. Cảm ơn tất cả các Anh, Chị, bạn đồng
nghiệp bộ phận Vi sinh đã luôn sát cánh và chia sẻ cùng Tơi những khó khăn trong
cơng việc và tận tình giúp đỡ Tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Lời tri ân cuối cùng, con xin gửi đến Ba Má, anh hai và em út, những người
luôn ủng hộ, động viên và tạo cho con động lực, niềm tin để học tập, lao động và

vươn lên trong cuộc sống.

Trân trọng
LÊ VĂN HIỂU


TĨM TẮT
Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây bệnh cho người và các đối tượng
thủy sản. Một số dòng mang gene Thermostable Direct Hemolysin (TDH) và
Thermostable Related Hemolysin (TRH) gây nên bệnh tiêu chảy và viêm dạ dày rất
nguy hiểm ở người. Một nghiên cứu của Taniguchi và các cộng sự vào năm 1986 đã
chỉ

ra

Thermolabile

Hemolysin

(TLH)

là

đoạn

gene

đặc

hiệu

cho

V.parahaemolyticus mà khơng có ở bất cứ loài nào khác. Các phương pháp định
lượng V.parahaemolyticus trong thực phẩm hiện nay chủ yếu dựa trên phương pháp
nuôi cấy vi sinh truyền thống và các phép thử sinh hóa, địi hỏi nhiều thời gian và
cơng thực hiện, nhưng đơi khi kết quả lại không ổn định và thời gian phân tích dài 5
– 6 ngày. Mục tiêu của luận văn này là xây dựng phương pháp định lượng nhanh
V.parahaemolyticus dựa trên phương pháp lai phân tử, sử dụng mẫu dò biotin-tlhlabeled AP conjugate, để phát hiện đoạn gene TLH của V.parahaemolyticus.
Phương pháp lai DNA với mẫu dị có gắn biotin (biotin-labele) để phát hiện gene
đặc hiệu của vi khuẩn là một kỹ thuật mới của Công nghệ sinh học cho phép xác
định chính xác đối tượng quan tâm mà không cần phải tốn nhiều thời gian và công
sức.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng lai: thời
gian, độ đặc hiệu, hiệu suất chuyển khuẩn lạc lên màng lai…, từ đó làm cơ sở cho
việc đề xuất dự thảo phương pháp định lượng nhanh V.parahaemolyticus bằng
phương pháp lai phân tử. Đồng thời, chúng tôi thực hiện xác định hiệu lực và đánh
giá hiệu quả phân tích của phương pháp mới so với phương pháp truyền thống.
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp chúng tơi xây dựng có độ nhạy
đạt trên 95%, độ đặc hiệu 100%, tỷ lệ dương tính giả 0%, và tỷ lệ âm tính giả dưới
5%. Hiệu quả phân tích tương đương với phương pháp truyền thống (trên đối tượng
chủng gây nhiễm vào mẫu) ở độ tin cậy 95%.


Chúng tơi áp dụng quy trình mới vào phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng nuôi
Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, kết quả trong 11 mẫu phân tích có 03 mẫu nghêu
nhiễm V.parahaemolyticus vượt giới hạn cho phép, chiếm tỷ lệ 27,3%.


ABSTRACT

Vibrio parahaemolyticus is the pathogenic organism of human and aquatic
animals. Some strains of V. parahaemolyticus carry Thermostable Direct Hemolysin
(TDH) and Thermostable Related Hemolysin (TRH) genes causing human serious
diarrhea and gastritis. Taniguchi et al. (1986) indicates that Thermolabile
Hemolysin (TLH) is a specified gene of V. parahaemolyticus, which does not exist
in any other species. Current methods of quantifying V. parahaemolyticus in
foodstuff are mostly based on traditional cultivation and biochemical tests, which
are time and labor consuming. It takes from five to six days for the whole analyzing
procedure. However, the testing results are sometimes variable. This thesis aims to
construct a rapid quantitative method of V. parahaemolyticus based on principle of
molecular hybridization. Biotin-tlh-labeled probe AP conjugate is used to detect V.
parahaemolyticus TLH gene. The hybridization between DNA and a biotin-labele
probe, allowing detecting bacterial specified gene, is an advanced technique of
applied biotechnology. This method takes less time and labor to accurately capture
the targets.
Several factors, affecting the hybridization reaction, are investigated such as
time, specificity, efficiency of transferring colonies on hybridization membrane.
The result of investigation provides a sound basis to propose the rapid method of
quantifying V. parahaemolyticus based on in-situ hybridization. Simultaneously, the
new method is validated and compared with a tradition testing method.
Results show that of the new method, the sensitivity, specificity, false
positive rate and false negative rate are above 95%, 100%, 0% and below 5%,
respectively. Compared with the traditional method, the new method has no
statistically significant difference in analyzing effectiveness at the confidence of
95%.


The new method is applied to analyze bivalve mollusks of Can Gio - Ho Chi
Minh aquaculture ponds. Of eleven samples tested, three are excessively
contaminated with V. parahaemolytis, well over accepted limit, proportion 27,3%.

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................1
Phần 2: TỔNG QUAN ........................................................................................6
2.1. Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus ..........................................................6
2.1.1. Định nghĩa và phân loại V.parahaemolyticus ...............................................6
2.1.2. Đặc điểm sinh học V.parahaemolyticus .......................................................7
2.1.3. Các bệnh do V.parahaemolyticus gây ra ......................................................7
2.1.4. Cách điều trị ................................................................................................9
2.1.5. Đặc điểm cấu trúc phân tử và miễn dịch học của V.parahaemolyticus........10
2.1.6. Trình tự đoạn gene thermolabile hemolysin và mẫu dò ..............................11
biotin-tlh-labele của V.parahaemolyticus.
2.2. Phương pháp lai phân tử ...............................................................................12
2.2.1. Các hệ thống đánh dấu mẫu dò ..................................................................13
2.2.1.1. Hệ thống đánh dấu khơng dùng phóng xạ ...............................................13
2.2.1.2. Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ ..........................................................13
2.2.2. Giới thiệu về hệ thống biotin – streptavidin ...............................................14
2.2.3. Giới thiệu về biotin ....................................................................................17
2.2.4. Giới thiệu về NBT .....................................................................................18
2.2.5. Giới thiệu về BCIP-T.................................................................................18
2.2.6. Giới thiệu về alkaline phosphatase .............................................................19
2.3. Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực phương pháp ................19
2.3.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .................................................19


2.3.2. Độ chính xác..............................................................................................20
2.3.3. Độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả ..................20
2.4. Các phương pháp định lượng V.parahaemolyticus trong thực phẩm .............21
2.4.1. Phương pháp MPN ....................................................................................21

2.4.2. Phương pháp đếm đĩa ................................................................................22
2.4.3. Phương pháp màng lọc ..............................................................................22
2.4.4. Phương pháp lai phân tử ............................................................................23
2.5. Giới thiệu về chương trình nhuyễn thể ..........................................................24
Phần 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................26
3.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................26
3.1.1. Chủng chuẩn V.parahaemolyticus và mẫu thủy sản....................................26
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính...........................................................................26
3.1.3. Mơi trường và hóa chất ..............................................................................26
3.2. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................28
3.2.1. Phương pháp nhuộm gram .........................................................................28
3.2.2. Phương pháp xác định V.cholerae và V.parahaemolyticus .........................29
trong thực phẩm.
3.2.3. Phương pháp định lượng V.parahaemolyticus............................................32
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
3.2.4. Phương pháp gây nhiễm chủng vào mẫu thực phẩm...................................37
3.2.5. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..............39
3.2.6. Xác định các thuộc tính của phương pháp..................................................41
3.2.7. So sánh hiệu quả phân tích V.parahaemolyticus giữa .................................43


phương pháp mới xây dựng và phương pháp đếm đĩa.
3.2.8. Ứng dụng phân tích mẫu nhuyễn thể..........................................................44
Phần 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN .....................................................................45
4.1. Kết quả phân lập và kiểm tra chủng V.parahaemolyticus ..............................45
4.2. Xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh V.parahaemolyticus........46
bằng mẫu dò biotin-labele.
4.2.1. Cơ sở xây dựng phương pháp ....................................................................46
4.2.2. Đề xuất dự thảo phương pháp ....................................................................48
4.3. Thăm dị phương pháp ..................................................................................53

4.4. Xác định tính đặc hiệu của phương pháp.......................................................54
4.5. Khảo sát hiệu suất chuyển khuẩn lạc lên màng lai.........................................57
và mật độ phát hiện tối ưu trên màng.
4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ......................................59
của phương pháp mới xây dựng.
4.7. Khảo sát các thuộc tính của phương pháp định lượng nhanh .........................62
V.parahaemolyticus bằng mẫu dò Biotin-labele AP conjugate.
4.8. So sánh hiệu quả định lượng V.parahaemolyticus .........................................64
giữa phương pháp mới xây dựng và phương pháp sinh hóa truyền thống.
4.9. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng ni CầnGiờ ...........67
Tp. Hồ Chí Minh.
Phần 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ......................................................................69
5.1. Kết luận........................................................................................................69
5.2. Đề nghị.........................................................................................................69


TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................70
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Hình dạng V.parahaemolyticus chụp dưới kính hiển vi điện tử .............6
Hình 2.2: Biotin gắn vào mẫu dị tại vị trí của Adenine ở đầu 5’ .........................12
Hình 2.3: Cơ chế hoạt động và phát hiện mẫu dị................................................16
Hình 2.4: Đồng phân lập thể dạng D(+) của biotin..............................................17
Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của NBT...................................................................18
Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của BCIP-T ..............................................................18
Hình 2.7: Cấu trúc enzyme alkaline phosphatase ................................................19
Hình 4.1: Khuẩn lạc V.parahaemolyticus trên thạch TCBS và kết quả lai ...........46
Hình 4.2: Màng lai bị đen khi ủ với thuốc nhuộm qua đêm.................................54

Hình 4.3: Kết quả lai giữa 2 chủng V.parahaemolyticus và E.coli.......................56
Hình 4.4: Kết quả lai giữa 7 chủng V.parahaemolyticus và 5 chủng vsv .............57
không phải là vsv mục tiêu.
Hình 4.5: Khả năng phát hiện khuẩn lạc khi trên màng có mật độ vsv lớn ..........59
Hình 4.6: Dãy thử nghiệm sinh hóa của V.parahaemolyticus ..............................66


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các nghiệm sinh hóa sơ bộ xác định V.cholerae .................................30
và V.parahaemolyticus.
Bảng 3.2: Các nghiệm sinh hóa xác định V.cholerae...........................................31
và V.parahaemolyticus.
Bảng 3.3: Các nghiệm sinh hóa sơ bộ xác định V.parahaemolyticus ...................33
Bảng 3.4: Các nghiệm sinh hóa xác định V.parahaemolyticus.............................34
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng lai ...............53
Bảng 4.2: Kết quả phản ứng lai với 2 chủng V.parahaemolyticus và E.coli.........55
Bảng 4.3: Kết quả lai 7 chủng V.parahaemolyticus và 5 chủng không phải.........55
là V.parahaemolyticus.
Bảng 4.4: Hiệu suất chuyển khuẩn lạc từ đĩa thạch lên màng lai .........................58
Bảng 4.5: Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp cho 10g mẫu tôm tươi ................60
Bảng 4.6: Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp cho 10g mẫu khô........................60
Bảng 4.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp...............61
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát các thuộc tính của phương pháp trên nền mẫu ..........63
tôm tươi và cá khô.
Bảng 4.9: Các thuộc tính của phương pháp trên hai nền mẫu tơm tươi ................64
và cá khơ.
Bảng 4.10: Kết quả phân tích 5 mẫu đại diện theo hai phương pháp ...................65
Bảng 4.11: Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể ....................................................67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AP

: Alkaline Phosphatase.

APW

: Alkaline Peptone Water.

ADH

: Arginine dihydrolase.

BYT

: Bộ y tế.

BNN&PTNT

: Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.

bp

: base pair – cặp base.

CFU

: Colony-forming unit – số đơn vị hình thành khuẩn lạc.

DNA

: Deoxyribonucleotide Acid – bộ mã di truyền.

FDA

: Food and Drung Administration – Cơ quan quản lý thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ.

ISO

: International standart organization.

LDC

: Lysine decarboxylase.

MPN

: Most Probable Number – Số có xác xuất lớn nhất.

ml

: mili lit.

NXB

: Nhà xuất bản.

NCBI

: National Center for Biotechnology Information.

ng

: nano gam.

ODC

: Ornithine decarboxylase.

PCR

: Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại.

Probe

: Mẫu dò.


RNA

: Ribonucleotide Acid.

RFLP

: Restriction Fragments Length Polymorphism – Tính đa hình
chiều dài các đoạn cắt giới hạn.

TDH

: Thermostable Direct Hemolysin.

TRH

: Thermostable Related Hemolysin.

TLH

: Thermolabile Hemolysin.

Tm

: Melting Temperature – Nhiệt độ nóng chảy.

UV

: Untra Violet – tia cực tím.

V. parahaemolyticus : Vibrio parahaemolyticus.
vsv

: Vi sinh vật.

µl

: micro lit.


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Hệ thống phát hiện mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin......................16

Sơ đồ 3.1: Quy trình định lượng V.parahaemolyticus..........................................36
bằng phương pháp đếm đĩa
Sơ đồ 3.2: Quy trình gây nhiễm chủng vào mẫu..................................................38
Sơ đồ 3.3: Quy trình xác định giới hạn định lượng của phương pháp ..................40
Sơ đồ 4.1: Quy trình định lượng V.parahaemolyticus bằng mẫu dò.....................49
biotin-labele AP conjugate.


1
GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

MỞ ĐẦU

Sử dụng thực phẩm không an tồn có thể gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh
truyền qua thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người sử dụng, tác động xấu
đến kinh tế - xã hội và quan hệ quốc tế.
Ngộ độc thực phẩm và các bệnh có liên quan từ thực phẩm do nhiều nguyên
nhân khác nhau, một trong số các nguyên nhân đó là do vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) gây ra.
Ngộ độc do nhiễm V.parahaemolyticus thường xảy ra suốt cả năm, đặc biệt
vào các tháng mùa hè, và có thể lây lan thành dịch lớn nếu khơng được kiểm sốt
chữa trị kịp thời. Vi khuẩn này được tìm thấy trong hải sản và các sản phẩm chế
biến từ hải sản, trong nước vùng ni, trong các lồi hải sản sống như cá, giáp xác
đặc biệt trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ: hàu, nghêu, sò… Các triệu chứng thường
gặp khi bệnh nhân bị nhiễm V.parahaemolyticus: nôn mửa, sốt cao, tiêu chảy, và co
thắt bụng. V.parahaemolyticus gây ra các bệnh viêm dạ dày, viêm ruột cấp, nhiễm
trùng máu và bệnh gan. [13,14]
Năm 2002, một nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Khánh Hòa, các nhà
nghiên cứu ghi nhận trong thời gian từ tháng 01/1995 đến tháng 09/2001, có 528
bệnh nhân bị tiêu chảy, trong số này có 471 người lớn và 57 trẻ em. Phân tích vi

sinh học cho thấy trong số 528 bệnh nhân bị tiêu chảy, có 53% dương tính với
V.parahaemolyticus.[6]
Ngồi ra, V.parahaemolyticus cịn gây bệnh cho các lồi thủy hải sản, đặc
biệt gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tơm có thể gây chết từ 80 – 100% ấu trùng.
Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam năm 2007 đạt 917,3 nghìn tấn; kim ngạch
đạt 3,758 tỷ USD, tăng 15,3% về lượng và 10,5% về kim ngạch so với năm 2006.
Dự kiến năm 2008 sản lượng và kim ngạch xuất khẩu sẽ cao hơn năm 2007. Bên
cạnh việc phát triển số lượng xuất khẩu, mở rộng thị trường, thường kèm theo
những yêu cầu trong công tác đảm bảo chất lượng các mặt hàng xuất khẩu mà các

HVTH: LÊ VĂN HIỂU

LUẬN VĂN THẠC SỸ


2
GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

MỞ ĐẦU

thị trường nhập khẩu đặt ra. Trong số các chỉ tiêu vi sinh cần kiểm sốt có chỉ tiêu
định lượng V.parahaemolyticus. [2]
Hiện nay, đang có một dự án “kiểm sốt chất lượng vùng ni nhuyễn thể
hai mảnh vỏ”, nhằm tạo ra một vùng nuôi và nguồn ngun liệu sạch khơng có các
độc tố hóa học, sinh học và nhiễm vi sinh vật.
Việc định lượng V.parahaemolyticus bằng phương pháp ni cấy vi sinh
truyền thống địi hỏi nhiều thời gian thực hiện các thử nghiệm sinh hóa sơ bộ và
khẳng định, ảnh hưởng đến việc tìm ra nguyên nhân gây bệnh, cũng như chậm trễ
trong công tác kiểm dịch cấp chứng thư đảm bảo chất lượng các mặt hàng thủy sản
xuất nhập khẩu, cũng như tăng thêm chi phí cho doanh nghiệp do tăng thời gian lưu

kho chờ thông quan.
Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phát
hiện các gene gây bệnh: TRH, TDH, phương pháp này cho kết quả khá nhanh và
chính xác. Tuy nhiên, việc đầu tư cho thiết bị và hóa chất địi hỏi chi phí cao, thao
tác thực hiện phức tạp và qua nhiều công đoạn. [5,18]
Hiện nay, quy trình định lượng V.parahaemolyticus trực tiếp dựa trên
phương pháp sử dụng mẫu dò DNA đã được áp dụng tại nhiều phịng thí nghiệm
trên thế giới và các bộ kit đã được thương mại hóa. [18]
Định lượng mật độ V.parahaemolyticus sử dụng mẫu dò Biotin-tlh-labeled
Alkaline phosphatase (AP) conjugate là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, khơng
địi hỏi nhiều về thiết bị và công thực hiện, lại cho kết quả nhanh, chỉ sau 48 giờ
phân tích. [5,18]
Trên cơ sở này, cùng với mục tiêu xây dựng phương pháp định lượng
V.parahaemolyticus cho kết quả nhanh, chính xác, phù hợp với thực trạng các
phịng Thí nghiệm tại Việt Nam, nhằm phục vụ cơng tác kiểm dịch xuất nhập khẩu
và chương trình kiểm sốt chất lượng vùng nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại địa bàn
huyện Cần Giờ, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường Đại học
HVTH: LÊ VĂN HIỂU

LUẬN VĂN THẠC SỸ