Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm vi hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường nguyễn thị sơn, trần lệ minh

NG U Y ỄN TH Ị SƠ N - TRAN l ệ m i n h

TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THÍ NGHIỆM

VI - HỐ SINH ỨNG DỤNG
CƠNG NGHỆ MƠI TRƯỜNG

ÌĨA ỈĨ
3000025634

XUẤT BẢN BÁCH

NỘI


PG S. TS NGUYỄN T H Ị SƠN - THS. TRẦN LỆ M IN H

TÀI LIỆU THÍ NGHIỆM
VI - HĨA SINH ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

NHÀ XUẤT BẢN BÁCH KHOA - HÀ NỘI


Mã số: 285-2008/CXB/03-57/BKHN


LỜI MỞ ĐẦU
“Tài liệu thi nghiệm Vì - Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi
trường” được biên soạn phù hợp với nội dung mơn học tương ứng trong
chương trình khung được Bộ Giáo dục và Đào tạo thông qua cho ngành Kỹ

thuật môi trường. Tài liệu được sử dụng trong hướng dẫn thực hành cho sinh
viên đại học và học viên cao học ngành kỹ thuật môi trường.
1. Tài liệu được biên soạn gồm 4 phần cơ bàn
2. Thí nghiệm Hóa sinh ứng dụng trong cơng nghệ mơi trường
3. Thí nghiệm Vi sinh ứng dụng trong cơng nghệ mơi trường
4. Thí nghiệm chuyên đề Xử lý sinh học nước thải
Phụ lục giới thiệu một số dụng cụ, thiết bị cần thiết phục vụ cho các thí
nghiệm trên (hiện có tại Viện Khoa học và công nghệ môi trường - Trường Đại
học Bách khoa Hà Nội).
Nội dung tài liệu được viết nhằm củng cố phần lý thuyết của hai môn học:
- Hóa sinh ứng dụng trong cơng nghệ mơi trường
- Ví sinh ứng dụng trong cơng nghệ mơi trường đồng thời cung cấp cho
sinh viên một số kỹ năng thực hành trong nghiên cứu về vi sinh vật cũng như
phương pháp phân tích một số chỉ tiêu sinh học quan trọng trong xử lý và đánh
giá chất lượng môi trường.
Phần thí nghiệm chuyên đề giúp sinh viên bước đầu làm quen với các
phương pháp xử lý sinh học. Trên cơ sở vận hành, phân tích và tính tốn các thơng
số kỹ thuât thu được, sinh viên có thể đánh giá cũng như xử lý các sự cô phát sinh
trong quá trình vận hành hệ thống xử lý sinh học nước thải.
Chúng tơi hy vọng cuốn sách này cũng có thể dùng làm tài liệu tham
khảo bổ ích cho cơng tác đào tạo và nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh
học môi trường cũng như cho các cán bộ kỹ thuật các ngành liên quan.
Do được biên soạn lần đầu, cuốn tài liệu khơng tránh khỏi cịn những
thiếu sót. Chúng tơi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của bạn đọc và đồng
nghiệp để bổ sung và chinh sửa khi tài liệu được tái bản.

Các tác giả

3

PHẦN I
HĨA SINH ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ
MƠI TRƯỜNG
1.1. NI CÁY VI SINH VẬT THU CHÉ PHẨM ENZYM VÀ XÁC ĐỊNH
HOẠT LỰC ENZYM TỪ VI SINH VẬT
Tế bào vi sinh vật tuy nhỏ bé nhưng trao đổi chất không ngừng. Sự sống
của vi sinh vật được đặc trưng bởi hàng loạt các phản ứng chuyển hố vật chất,
trong đó có những phản ứng thực tể không xảy ra trong ống nghiệm ỏ' điều kiện
bình thường nhưng trong tế bào vi sinh vật các phản ứng này xảy ra với tốc độ
nhanh gấp hàng triệu lần nhờ những chất xúc tác đặc biệt: chất xúc tác sinh học
hay còn gọi là Enzym.
1.1.1. Đặc trưng và một số Enzym được ứng dụng trong công nghệ
môi trường

I/Những đặc trưng của Enzym từ vi sinh vật
Hệ Enzym cùa vi sinh vật rất đa dạng, phong phú. Từ vi sinh vật có thể
thu nhiều Enzym khác nhau, trong đó có những Enzym chi cỏ ở vi sinh vật như
zenlulaza, razemaza.
- Enzym từ vi sinh vật có hoạt lực cao hon các Enzym tưong tự ỏ' động vật
và thực vật.
- Vi sinh vật nhạy cảm với môi trường nên khi thay đổi điều kiện sống hoặc
tác động bằng các yếu tố khác nhau, có thể thay đổi hệ Enzym và hoạt lực Enzym
cùa chúng. Nhờ vậy có thể tạo được các Enzym theo yêu cầu với hoạt lực cao.
- So với các sinh vật khác, vi sinh vật phát triển nhanh hơn, tuy kích
thước nhỏ nhưng hiệu suất sinh tổng hợp Enzym và tỷ lệ Enzym trong tế bào
tương đối lớn nên hiệu suất thu hòi Enzym cao, quy trình sản xuất đơn giản.
- Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu Enzym rất rẻ tiền, dễ
kiếm, thường là các loại phụ phàm, phế liệu. Do đó, giá thành Enzym từ vi sinh
vật thấp hơn nhiều so với Enzym nguồn gốc động, thực vật.

4


2 /Một số Enzym được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ môi trường
a/ Enzym Amylaza
- Enzym Amylaza là Enzym có ứng dụng rộng rãi nhất. Amylaza là tên
chung chỉ một nhóm gồm các Enzym có khả năng xúc tác thuỷ phân tinh bột
thành dextrin, đường maltoza và glucoza như a - amylaza, ß - amylaza,
glucoamylaza, dextrinaza...
- Amylaza có trong một số nấm mốc:
+ Aspergillus: Asp. oryzae, Asp. usami, Asp. niger, Asp. awamori

+ Rhizopus: Rh. delemar. Rh. japonium
+ Mucor: M. rouxii
Nấm men có khả năng tổng hợp Amylaza:
+ Endomycopsis: E. fỵbuliger, E. species

+ Endomyces: Endomyces spc.
Vi khuẩn có khả năng tổng hợp Amylaza:
+ Bacillus: Bacillus subtilis. Bac. macerans
+ Vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt lực amylaza mạnh: Bac. diastilicus, Bac.

circulans
Enzym Amylaza cịn có trong thực vật (hạt nảy mầm, thóc mầm, hạt malt
khoai lang), trong động vật (nước bọt).

b/ Enzym proteaza
Proteaza có nhiều ở động, thực vật và vi sinh vật. Proteaza ở vi sinh vật
tồn tại dưới dạng nội bào và ngoại bào, phân hủy các liên kết peptit.

Proteaza có ở vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc:
•

-Vi khuẩn tổng họp Proteaza:
+ Bacillus: Bac. subtilis, Bac. thermophilus
+ Clostridium: d o s t, perfringen, Clost. histolyticum
-Nấm mốc:
+ Aspergillus: Asp. oryzae, Asp. fumigatus, Asp. flavus
+ Penicillum: Pen. janthinellum
Proteaza có trong thực vật (promelin ở quả dứa, papain ở quà đu đủ

xanh...), trong động vật (tụy tạng, dạ dày...).

5


c / Enzym Pectinaza
Pectin là thành phần chính của lóp gian bào có chức năng kết dính các tế
bào tạo thành mô thực vật.
Pectin thực chất là axit Polygalacturonic đirợc tạo thành nhờ liên kết a - 1,4
- glycozit của axit D - Galacturonic, trong đó gốc cacboxyl ở vị trí C6 có thể được
metyl hóa. Khi số lượng các gốc cacboxyl được metyl hóa vượt quá 75%, pectin
trở nên bền, không tan được gọi là Protopectin.
Enzym thủy phân pectin thực chất gồm 2 nhóm: Enzym thủy phân liên
kết este (Esteraza) chuyển Pectin không tan thành pectin tan và Enzym thủy
phân liên kết a 1 ,4 - glycozit (Depolymeraza) thủy phân pectin tan thành axit
D - Galacturonic.
Enzym Pectinaza có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ môi trường, đặc biệt
trong xử lý chất thải rắn (sinh hoạt và công nghiệp) có nguồn gốc thực vật như vỏ
quả, cuống rau, chất thải nông nghiệp (thân, lá, vỏ hạt...), chúng phân hủy pectin,

giải phóng Xenllulo, giúp q trình chuyển hóa Xenllulo và q trình vơ cơ hóa
xác thực vật xảy ra nhanh hơn.
Pectinaza chỉ có ở vi sinh vật, nhất là Protopectinaza. Hoạt lực Enzym
Pectinaza có thể được xác định bằng phương pháp đồng (Cu) pectat.
Vi sinh vật có khả năng tổng họp Pectinaza gồm nhiều lồi nấm sợi và vi
khuẩn. Mơt số loài ký sinh ở thực vật, chúng phân giải pectin, phá hủy mô thực vật
và gây hư hỏng sản phẩm, chúng có nhiều trong đất (1 o 5 tế bào/g đất). Các vi sinh
vật cỏ thể xâm nhập vào khối rác thải thực vật trong quá trình thu gom, vận chuyển
lầm thay đổi tính chất cơ lý của rác, gây khó khăn cho phân loại và xử lý rác.
Một số chủng điển hình có hoạt lực Pectinaza:
- Một số loại nấm đa bào như Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum ký sinh
trên hầu hết thảo mộc, Erwinia carotovora gây hư hỏng rau xà lách, carot, cần
tây... Enzym Pectinaza có thể được sản xuất nhờ Asp. niger, Penicillum,

Fusarium soỉani...
- Một số vi khuẩn có hoạt lực Pectinaza mạnh như Bacillus macerans,

Bacillus polymyxa\ một số chủng Pseudomorm (Pseud. fluorescens), nhiều vi
khuẩn dạ cỏ, một số vi khuẩn ưa nhiệt thuộc nhóm Clostridum (Clost. pectinovorun,
Clost. felsineun).
6


d/ Enzym Zenlulaza
Hệ Enzym zenlulaza gồm 3 Enzym chủ yếu:
Exo. ß 1,4 - glucanaza
Endoglucanaza
Zenlobiaza
thuỷ phân zenluloza thành đường glucoza.
Zenlulaza có trong xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn:

Nấm mốc: Trichodenna reesei. Tri. lignoran, Fusarium lini, Fus. solani
Xạ khuẩn: Streptomyces flagrogrisens
Vi khuẩn: Clost. thermicillum, Cellulomonas sp, Bacillus thermospoza spc.
Các Enzym nói trên có vai trị rất
chất thải rắn giàu các chất hữu CO'.

1ĨT1

trong cơng nghệ xử lý nước thải và

Nhờ có hệ Enzym rất phong phú của vi sinh vật, các chất hữu Cơ dưới dạng
protein, gluxit, pectin và cả zenlulo được chuyển hố, góp phần ổn định chu trinh
tuần hồn vật chất trong tự nhiên, đồng thịi góp phần làm sạch mơi trường.
Các Enzym nói trên có vai trị rất lớn trong xử lý yểm - hiếu khí các chất
thải rắn, nước thải giàu chất hữu cơ.
1.1.2. Phương pháp nuôi cấy thu chế phẩm Enzym
Các vi sinh vật được sử dụng để thu Enzym gồm nhiều loại nấm mốc, nấm
men, vi khuẩn và xạ khuẩn bằng phương pháp nuôi bề mặt hoặc ni chìm.
Như trên đã trình bày, nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp Enzym,
thậm chí có những vi sinh vật có khả năng tổng hợp các Enzym khác nhau
trong các mơi trường có cơ chất khác nhau.
Để thu được Enzym từ vi sinh vật cần tiến hành nuôi cấy chúng. Hầu hết
các vi sinh vật sinh tổng hợp Enzym trong điều kiện có oxy. Vì vậy, về ngun
tắc có hai phương pháp ni cấy vi sinh vật thu Enzym là:
- Nuôi cấy bề mặt
- Nuôi cấy chim

1/Phương pháp nuôi bề mặt
Phương pháp này sử dụng chủ yếu với các loài nấm mốc, xạ khuẩn và
nấm men có khuẩn ty thật hoặc khuẩn ty giả. Enzym tạo thành dưới dạng

Enzym nội bào.

7


a) Ngun tắc: Tạo mơi trường có bề mặt riêng lớn (có độ xốp cao) và đủ
dinh dưỡng cho hệ sợi của nấm phát triển và sinh tổng hợp Enzym.
b) Nguyên liệu và yêu cầu đổi với môi trường sinh tổng hợp Enzym
Một trong những yếu tố ảnh hưởng quyết định đến sự sinh trưởng, phát
triển cũng như khả năng sinh tổng hợp Enzym của vi sinh vật chính ià thành
phần môi trường. Môi trường dinh dưỡng phải đảm bào có đủ các thành phần
cần thiết có chứa c, N, H, o, các nguyên tố khoáng đa lượng như p, s, Ca, Mg,
K... và trong một số trường hợp còn có cả một số nguyên tố vi lượng hoặc các
chất kích thích sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym như axit amin, các bazo
pyrin (Adenin, Guanin), bazo Pyrimidin (Timin, Xytozin...).
Trong thực tế, mơi trường ni cấy bề mặt có thể là môi trường tự nhiên
hoặc môi trường bán tổng hợp.
Nguyên liệu cơ bản để pha chế môi trường nuôi bề mặt là cám gạo, cám lúa
mi... vì chúng khơng chỉ chứa các chất hữu cơ khác nhau là nguồn cung cấp c,
N,... mà cịn chứa nhiều ngun tố khống đa, vi lượng và các yếu tố sinh trưởng
cần thiết cho sự phát triển và sinh tổng họp Enzym như các axit amin, Vitamin...
Trong nuôi cấy vi sinh vật tổng họp, mỗi Enzym cần một tác nhân điều hòa
sinh tổng họp khác nhau, đặc biệt là các chất câm ứng, ví dụ để thu Amylaza cần
tinh bột, dextrin; thu Proteaza là peptit, protein; Pectinaza là Hydratpectic,
protopectin và Xenllulaza là Xenllulo, CMC (Cacboxyl Metyl Cenllulo)...
Trong thực tế sản xuất, để giảm giá thành sản phẩm, nguyên liệu thường
được sử dụng là bột ngô, gelatin, bột carot, củ cải và bột giấy hay CMC...
Trong những trường hợp cần thiết có thể bổ sung nguồn nitơ dưới dạng
hữu cơ (bột khô lạc, khô đậu tương, sữa bột...) hay vô cơ như Amonsunphat
(NH 4)2S 04 , NH 4NO 3...).

Các nguyên tố khoáng, nhất là p và s là những thành phần trong cấu trúc
của nhiều hợp chất rất quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật như các
Nucleotit, Protein, Lipit phức tạp và các Vitamin... có thể bổ sung thêm dưới
dạng các muối photphat (KH 2PO4, K2HPO4,...), muối sunphat (MgSƠ 4,
(NH 4)2S04...).
Một nguyên liệu không thể thiếu được trong nuôi cấy bề mặt là vật liệu
làm tăng độ xốp, tăng bề mặt tiếp xúc cho mơi trường. Nhờ vậy, oxy của khơng
khí khuyểch tán tốt vào môi trường giúp cho hệ sợi của nấm, xạ khuẩn phát
triển tốt, đồng nhất trong môi trường, nâng cao hiệu quà sinh tổng họp Enzym.

8


c) Các bước tiến hành làm môi trường
Phối trộn nguyên liệu:
Thành phần môi trường nuôi bề mặt gồm:
+ Cám gạo: 35 - 40%
+ Trấu: 40 - 50%
+ N guyên liệu cảm ứng: 10%

(bột ngô: 10 %, gelatin: 10 %, khô lạc: 5 %, CMC: 5 %, bột carot: 5%)
- Môi trường dinh dưỡng cần có độ ẩm khoảng 65%. Để tạo độ ẩm, có
thể sử dụng nước cất (trong phịng thí nghiệm), nước máy (trong sản xuất đại
trà) bơ sung vào môi trường và trộn đều.
- Môi trường cần được khử trùng trong nồi áp lực ở áp suất 1 atm trong
thời gian 30 phút.
Trường hợp cần bổ sung các chất kích thích sinh trưởng dạng hữu cơ như
axit amin, vitamin..., các nguyên liệu này được khử trùng riêng ở áp suất 0,5
atm trong 15 phút, sau đó bổ sung vào môi trường.
- Sau khử trùng, môi trường được để nguội đến nhiệt độ thưịng.

d) Cấy và ni vi sinh vật
- Canh trường giống phải là canh trường thuần khiết có thể ở dạng rắn
hoặc lỏng.
- Với nấm mốc và xạ khuẩn, canh trường thường dùng là bào tử được pha
lỗng trong nước vơ trùng với tỷ lệ 1% - 1%0
- Sau khi cấy, canh trường nuôi được trộn đều. Nếu ni quy mơ lớn, mơi
trưịng được phân phối vào các khay hoặc dàn ni với lóp dày khơng q 5 cm.
- Thời gian nuôi cấy thường từ 36 - 48 giờ tùy thuộc thời gian tạo Enzym
cùa mỗi loài vi sinh vật.
- Nhiệt độ nuôi cấy trong khoảng từ 28 - 30°c, độ ẩm: 58 - 60%. Trong
1 0 - 1 4 giờ đầu, bào tử trương nỏ' và nảy mầm, nhiệt độ mơi trường ni ít
biến động. Từ 15 - 30 giờ tiếp theo, hệ sợi nấm phát triển mạnh. Q trình hơ
hấp giải phóng năng lượng và nước làm cho nhiệt độ và độ ẩm môi trường
tăng. Nếu lớp môi trường dày cần được đảo trộn và làm thống khí để cung cấp
oxy và giải nhiệt. Q trình này cũng làm cho độ ẩm mơi trường giảm, canh
trường tơi, xốp.
Chế phẩm Enzym thơ thu được có hệ sợi phát triển mạnh, đồng đều,
tránh để bào tử phát triển. Nếu nấm mốc quá già, hoạt lực Enzym giảm rõ rệt.

9


Chế phẩm thơ có thể được sấy khơ ở nhiệt độ 43 để bảo quản và sử dụng.
e)

45°c đến độ ẩm 8 - 12%

Tinh chế Enzym

Để thu chế phẩm Enzym dạng tinh khiết hơn, chế phẩm Enzym tươi

(hoặc khô) được nghiền nhỏ để phá võ' cấu trúc sợi nấm giải phóng Enzym.
Enzym được chiết trong mơi trường nước với pH xác định bằng dung dịch đệm
tương ứng với mỗi loại. Enzym tinh chế có thể ở dạng lỏng hoặc dạng bột sau
khi được làm khơ.
Phương pháp ni bề mặt có ưu điểm lớn là hoạt lực Enzym cao, công
nghệ đơn giản, có thể tự động hóa, dễ triển khai ở quy mô lớn; yêu cầu năng
lượng thấp, thiết bị đơn giản, nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm nên làm giảm giá
thành sản phẩm. Sản phẩm dễ bảo quản và vận chuyển, phù hợp trong xử lý
các chất thải rắn giàu chất hữu cơ. Tuy nhiên, chế phẩm Enzym từ nuôi cấy bề
mặt có độ tinh khiết thấp hơn ni cấy chìm.

Ni cấy nấm mốc thu chế phẩm Enzym Amylaza và Proteaza bằng phương
pháp nuôi cấy bề mặt
a) Chuẩn bị mồi trường
+ Cân:

- 8g cám gạo
- 1Og trấu
- 2g bột ngô (cho môi trường thu chế phẩm Enzym Amylaza)
- 2g gelatin (cho môi trường thu chế phẩm Enzym Proteaza)

+ Trộn đều, chuyển hỗn hợp vào bình tam giác 250 ml, bổ sung nước cất
đến độ ẩm 60 —65%. Nút bông.
+ Thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 11 l°c trong 30 phút.
+ Để nguội đến nhiệt độ phòng.

b) Cấy vsv
Cấy Iml dịch chứa bào tử của nấm mốc:
- Thu Enzym Amylaza: Asp.usami
- Thu Enzym Proteaza: Asp.oryzae

c) Nuôi cấy

vsv thu Enzym: ỏ' nhiệt độ 28 - 30°c trong thời gian 36 giờ.

2/ Phương pháp ni chìm
Phương pháp ni chìm thường được sử dụng với các tác nhân như nấm
men, vi khuẩn tổng hợp Enzym ngoại bào. Cũng có thể sử dụng nấm mốc, xạ
khuẩn để thu hệ sợi chứa Enzym nội bào.

10


a) Nguyên tắc: Vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp Enzym
trong mơi trường lỏng được cấp khí và trong điều kiện vô trùng.
b) Môi trường nuôi cấy
Khác với ni cấy bề mặt, mơi trường ni cấy chìm thường là môi
trường bán tổng hợp. Nguyên liệu cho nuôi cấy chìm thường ở dạng hịa tan
hoặc huyền phù.
Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là nước chiết ngô, nước chiết nấm
men. Nguồn nitơ vô cơ và các nguyên tố khống được sử dụng như ở phương
pháp ni bề mặt. Các tác nhân cảm ứng thường được sử dụng ở dạng tinh
khiết hơn như tinh bột hồ hóa, tinh bột tan, pepton, casein, C M C ,...
pH của môi trường được điều chỉnh cho phù hợp với mỗi loại Enzym và
mỗi loài vi sinh vật.
c) Các bước tiến hành
Các cấu tử của mơi trường được hịa vào nước và được đưa vào thiết bị
khử trùng 2 vỏ hoặc dạng ống xoắn ruột gà. Môi trường được khử trùng trực
tiếp bằng hơi quá nhiệt ở nhiệt độ 118 - 125°c trong thời gian 30 phút.
Sau khử trùng, môi trường được chuyển sang thiết bị nuôi cấy. Trong

nhiều trường họp, để tránh nhiễm trùng, ngưòi ta thường kết hợp khử trùng
trực tiếp trong thiết bị nuôi cấy.
d) Cấy và nuôi vi sinh vật thu Enzym
Môi trường được làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (28 - 30°C) thì cấy vi
sinh vật. Với nấm mốc và xạ khuẩn có thể cấy bằng bào tử, nhiệt độ nuôi 28 30°c, thời gian nuôi 36 - 48 giờ.
Khơng khí được cấp liên tục trong q trình ni cấy. Để tránh tạo bọt
thái q có thể bổ sung vào môi trường một chút dầu phá bọt hoặc axit oleic đã
khử trùng.
Thiết bị khuấy làm việc liên tục để tạo độ đồng nhất, giúp cho Enzym
khuyếch tán tốt vào mơi trường.
Trong ni cấy chìm, Enzym tạo thành trong suốt quá trinh phát triển cùa vi
sinh vật dạng ngoại bào được khuyếch tán vào môi trường. Lượng Enzym trong té
bào chỉ chiếm 10 - 15%. Vì vậy, chỉ cần ly tâm hoặc lọc tách sinh khối là thu được
dung dịch chứa Enzym.
Cá biệt có một số nấm mốc sinh tổng hợp Enzym nội bào (Glucooxydaza
ở nấm mốc Asp. niger), Enzym tồn tại trong cấu trúc của sợi nấm. Trong
trường hợp này, chỉ cần tách lấy sinh khối (sợi nâm), sau đó nghiên phá võ' tê
bào đe chiết Enzym như đối với canh trường bề mặt.


Phương pháp ni chìm có thể áp dụng trong phịng thí nghiệm với bình
tam giác và máy lắc hoặc với thiểt bị ni hiểu khí quy mơ nhỏ, pilot như thiết
bị Bio - stat. Ở quy mơ cơng nghiệp, có các thiết bị lên men hiếu khí với các
dung tích khác nhau.
Phương pháp ni chìm hiện đại hơn (dễ tự động hóa ở quy mơ lớn) và cho
chế phẩm Enzym tinh khiết hơn. Phương pháp này phải được tiến hành trong điều
kiện vô trùng nghiêm ngặt nên thu được chế phẩm tinh khiết, hoạt lực cao hơn.
Tuy nhiên, đó cũng là khó khăn khơng nhỏ trong q trình ni. Vì lý do nào đó
như thiết bị khơng thật kín, thiết bị khơng hồn tồn vơ trùng... có thể dẫn đến
nhiễm tạp khuẩn tồn bộ mơi trường, q trình bị ngừng hhồn tồn.

Ni cấy nấm men thu che phẩm glucoamylaza bằng phương pháp ni cấy chìm
a) Chuẩn bị mơi trường
- Lấy 50 ml mơi trường lỏng vào bình tam giác 250 ml để nuôi cấy
Endomycopsis. Nút bong.
- Thanh trùng ỏ' 11 l° c trong 30 phút.
- Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng.
b) Cấy nấm men
Cấy 5 ml canh trường nấm men Endomycopsis.
c) Nuôi trên máy lắc ờ nhiệt độ 28 - 30°c trong thời gian 48 giờ.
1.1.3. Xác định hoạt lực Enzym

I/Định tính hoạt lực Enzym
a) Nguyên tắc: Định tính hoạt lực Enzym dựa trên kết quả đánh giá nhanh
hiệu lực xúc tác chuyển hóa cơ chất của Enzym thơng qua diện tích vịng thủy
phân hoặc phản ứng hóa học (tạo màu) của sản phẩm với chất chỉ thị.
b) Phương pháp tiến hành
Để định tính hoạt lực Enzym, vi sinh vật thường được ni cấy trên mơi
trường thạch vói cơ chất tương ứng. Sau một thịi gian ni nhất định (24 - 36
giờ), thử phản ứng với chất chỉ thị thích hợp.
Enzym Amylaza: với mơi trường chứa tinh bột. chỉ thị là dung dịch Iot
hoặc dung dịch Lugol (chứa lot).
Enzym Xenllulaza: với môi trường chứa CMC, chỉ thị là dung dịch Iot.
Enzym Proteaza: với môi trường chứa Gelatin hoặc sữa bột. Hoạt lực
Protein là vịng dịch hóa Gelatin hoặc làm mất màu đặc trưng của sữa bột.

12


Hoạt lực của Enzym Amylaza và Xenllulaza thể hiện qua độ lớn của đường

kính vùng mất màu với Iot xung quanh khuẩn lạc. Cũng có thể định tính hoạt lực
Amylaza của chế phẩm thô bằng cách thực hiện phản ứng giữa dịch chiết Enzym
với dung dịch tinh bột tạo 1% rồi thử phản ứng với dung dịch Iot. Phản ứng cho
màu xanh đen là hoạt lực rất yếu, màu nâu đỏ thể hiện có hoạt lực ct - amylaza.
Phản ứng mất màu vói lot là có hoạt lực Maltaza và Glucoamylaza, mất màu
nhanh với Iot thể hiện hoạt lực Amylaza cao (gồm a - amylaza và Glucoamylaza).
Phưong pháp định tính có ưu điểm lón là có thể phát hiện nhanh sự hiện diện của
Enzym nhưng chưa cho phép đánh giá chính xác hoạt lực của Enzym.

Chn bị mơi trường cho định tính Enzym
+ Enzym Amylaza: Mơi trường Shapec tinh bột
+ Enzym Proteaza: Môi trường gelatin
+ Enzym Zenlulaza: Môi trường Hutchison

Gieo cấy và ni VSVsinh tịng hợp Enzym

vsv có khả năng sinh tống hợp Amylaza, Proteaza, Zenlulaza.
+ Nuôi ởnhiệt độ28 - 30°c trong 48h.
+ Cấy

Nhận xét và đảnh giá kết quà
- Đánh giá chất lượng canh trường thu được bằng cảm quan: dịch hóa
tinh bột, gelatin.
- Đo đường kính của khuẩn lạc.
- Đo vòng thủy phân và đánh giá khả năng sinh tổng hợp Enzym của các vi
sinh vật:
+ Độ lớn của đường kính vịng thủy phân tinh bột
+ Độ lớn của đường kính vịng thủy phân gelatin
+ Độ lớn của đường kính vịng thủy phân CMC

2 /Định lượng hoạt lực Enzym Glucoamylaza
Amylaza là tên chỉ nhóm enzym có khả năng phân cắt các liên kết
glycozit trong mạch tinh bột. Chúng gồm:
+ a-amylaza (Enzym dịch hóa) phân cắt các liên kết a-1,4 - glycosit
trong mạch tinh bột tạo sản phẩm là các Dextrin.
+ ß-amylaza (hay maltoza) phân cắt liên kết a -1,4 - glycosit trong mạch
amyloza tạo maltoza. ß -amylaza thủy phân amylopectin tạo maltoza và dextrin
giới hạn.

13


+ Glucoamylaza (y- amylaza) phân cắt liên kết a -1,4 - glycosit trong
mạch amyloza thành glucoza và thủy phân amylopectin thành glucoza và
dextrin giới hạn.
+ (X -1,6 - glycosidaza phân cắt liên kết a -1,6 glycosit trong dextrin giới
hạn hoặc trong mạch Amylopectin
+ a -1 ,6 - glycosidaza cùng với các Enzym khác thủy phân tinh bột hoàn
toàn thành glucoza.
Amy laza nói chung và Glucoamylaza nói riêng là những Enzym được
ứng dụng rộng rãi trong thực tế, đặc biệt trong công nghệ thực phẩm, trong sản
xuất rượu, bia, nước giải khát, trong sản xuất dextrin, đường glucoza... Trong
công nghệ môi trường, các vi sinh vật có hoạt lực Amylaza được sử dụng trong
xử lý chất thải rắn, nước thải chứa tinh bột.
a) Định nghĩa và nguyên tắc xác định
- Định nghĩa hoạt độ Glucoamylaza: 1 đơn vị hoạt độ Glucoamylaza là
lượng enzym cần thiết xúc tác thủy phân tinh bột tạo thành 1 mg Glucoza trong
thời gian 1 giờ ỏ' điều kiện tiêu chuẩn (môi trường đệm axetat với pH = 4,7 và
nhiệt độ 30°C).
- Độ hoạt động (hoạt lực) của Enzym là đại lượng biểu thị khả năng xúc

tác chuyển hóa cơ chất của mồi Enzym.
- Nguyên tắc định lượng: Dựa trên khả năng thủy phân tinh bột tạo thành
đường glucoza của Enzym Glucoamylaza. Lượng glucoza tạo thành được định
lượng bằng phương pháp Luff - School cải tiến.
b) Các bước tiến hành

* Thu Enzym từ canh trường Vi sinh vật

Thu Enzym từ canh trường nuôi cấy bề mặt nam mốc Asp. awamori hoặc
Asp. usami:
- Nghiền nhỏ chế phẩm Enzym.
- Cân 5 g chế phẩm đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình định mức 50 ml.
- Thêm 5 ml dung dịch đệm axetat, định mức bằng nước cất đến vạch.
- Giữ hỗn hợp

ở 30°c trong 30 phút.

- Lọc lấy dịch chiết bằng giấy lọc băng vàng thu chế phẩm Enzym tinh khiết.

Thu Enzym từ canh trtrờng ni cấy chìm nấm men Endomycopsis:
Lấy 10 ml canh trường nuôi nấm men Endomycopsis ly tâm ở vận tốc
5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút để loại sinh khối nấm men.

14


Phần dịch thu được có chứa Glucoamylaza ngoại bào của Endomycopsis.

* Xác định hoạt tực Enzym
Thủy phân tinh bột bằng chế phẩm Enzym thu được:

- Cho vào bình tam giác 100ml:
+ 1 ml dịch chiết Enzym.
+ 2 ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7.
+ 10 ml dung dịch tinh bột 1%.
- Đặt bình vào thiết bị ổn nhiệt. Thực hiện quá trình xúc tác thủy phân
tinh bột ở nhiệt độ 30°c trong thời gian 1 giờ.
- Định tính hoạt lực Amylaza: thử phản ứng với lốt sau 3 phút, 5 phút, 15 phút
- Lấy mẫu sau 1 giờ và định lượng đường khử.
- Song song tiến hành thí nghiệm kiểm chứng trong cùng điều kiện (đun
sôi dịch chiết để vô hoạt Enzym).
- Định lượng Glucoza tạo thành bằng phương pháp Luff- School cải tiến.

* Tinh hoạt lực Enzym
Từ lượng Thiosunfat tiêu tốn trong phân tích, tính được lượng Glucoza
tạo thành và hoạt độ Enzym Glucoamylaza theo biểu thức:

Held

{a h ) -/ 3 J ,ứv HđG/g
m.t

trong đó:

a: thế tích NciìSiOỉ 0, ỈN chuẩn kiểm chímg, ml
b: thể tích NCI2S2O3 0, IN chuán mau thủy phân, mỉ
3,3: đương lượng đường khử tính theo Na2S2Ỡ3 (1 ml
Aa.ẠỢ} 0,1N~3,3 mgglucoza)
f: hệ sổ pha lỗng
m: lượng Enzym xúc tác phản img (tính tương ímg với
mẫu khi chuẩn đường khử), gam

t: thời gian phản ímg, giờ

3 /Xác định hoạt lực Proteaza theo Anson
Enzym Proteaza là nhóm Enzym xúc tác cho q trình phân cắt liên kết
peptit trong các mạch peptit hoặc protein (polypeptit) nhò' phản ứng thuỷ phân
theo cơ chế:

15


-CH-C-N-CHI

II

I

I

R|

o

H

R2

____f e O - C H - C O O H
Proteaza

+

H 2N - C H -

Ị

I

Ri

R2

Proteaza thường được dùng trong sản xuất nước chấm, trong quá trình
chế biến các sản phẩm từ sữa, trong thuộc da, y học, ... Trong công nghệ môi
trường, các vi sinh vật sinh tổng hợp Proteaza và các chế phẩm Proteaza được
sử dụng trong xử lý hoặc hỗ trợ xử lý phân giải các chất thải rắn, nước thải
giàu protein như chất thải từ thuộc da, chế biến thủy sản, phế liệu hoặc phụ
phẩm nông nghiệp giàu protein (khô lạc, khô đậu tương, khô bông ...).

Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Proteaza
- Các vi khuẩn:
+ Bacillus subtilis, Bac. thermophilus\ Bac. mesentericus...
+ Clotridium perfriugens, Clost. histolitium.
+ Pseudomonas aeruginoza.
- Các Nấm mốc:
+ Aspergillus oryzae, Asp. fumicatus, Asp. flavus.
+ Penicillium ganthinellum, Perl. Chrysogenum.
Proteaza từ vi sinh vật tồn tại dưới dạng: Proteaza axit tính, trung tính và
kiềm tính.

a/ Định nghĩa và nguyên tắc xác định HđP

Hoạt độ Proteaza (HđP) là đại lượng đặc trưng cho khả nâng xúc tác phân
giải protein tới peptit và axit amin của các Enzym.
HđP được biểu thị bằng số đơn vị proteaza có trong 1 g (hoặc lml) chế phẩm.
Hoạt độ riêng cùa chế phẩm được biểu thị bằng số đơn vị proteaza trên

1mg protein của chế phẩm.
Định nghĩa: 1 đơn vị hoạt độ proteaza là lượng Enzym xúc tác thủy phân
protein thành các sản phẩm hoà tan trong TCA cho phản ứng tạo màu với thuốc
thử Folin (tương đương với I pmol Tyrozin) trong 1 phút ở điều kiện tiêu
chuẩn (pH = 5,5 và nhiệt độ 30°C).
Nguyên tắc xác định hoạt độ Proteaza theo Anson: Enzym Proteaza có
khả năng thuỷ phân Protein (Gelatin, Casein, H em oglobin...) tạo thành axit
amin. Lượng axit amin tạo thành trong phản ứng thủy phân được xác định bằng
phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin.

16


Dựa vào thang chuẩn của Tyrozin để tính lượng axit amin thu được nhờ
phản ứng thủy phân.

b/Các bước tiến hành
1/ Hoá chất, dụng cụ
+ Dung dịch Na2CC>3 0,5M
+ Dung dịch đệm vạn năng pH = 5,5
+ Dung dịch Gelatin 2%
+ Thuốc thử Folin
+ Dung dịch Tyrozin chuẩn 10'3 (1 pmol/ml)
+ TCA (Triclo - axetat) 0,3M
2/ Thu Enzym Proteaza từ chế phẩm Enzym thô

+ Cân 2g chế phẩm thu được đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình định
mức 50 ml.
+ Thêm 5 ml dung dịch đệm vạn năng 0,1M, pH = 5,5 và định mức đến vạch.
+ Lắc đều, giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30°c trong 30 phút.
+ Lọc thu dịch chiết Enzym.
3/ Thực hiện phản ứng xúc tác thủy phân Protein
+ Cho vào bình tam giác 100 ml: 2 ml dịch chiết Enzym 2 ml dung dịch
gelatin 2%
+ Cho con từ vào bình phản ứng và đặt vào thiết bị điều nhiệt cỏ khuấy từ.
+ Thực hiện phản ứng xúc tác thủy phân ở nhiệt độ 30°c trong thời gian

10 phút.
+ Để đình chỉ phản ứng, thêm 4 ml TCA 0,3M để kết tủa protein dư và
các sản phẩm thủy phân phân tử lượng lớn.
+ Tiếp tục giữ hỗn hợp

ở 30°c trong 20 phút.

+ Lọc thu dịch thủy phân.
Song song tiến hành thí nghiệm kiểm chứng trong cùng điều kiện
+ Cho vào bình tam giác 100 mi:
2 ml dịch chiết Enzym
4 ml TCA 0,3M, khuấy đều trong 10 phút
Thêm 2 ml Gelatin 2%, khuấy đều và để 20 phút

17


4/ Dvmg đường chuẩn Tyrozin
Từ dung dịch Tyrozin chuẩn (1 jj.mol/ml), chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có

hàm lượng Tyrozin từ 0 - 0,3 pmol theo bảng sau:
ố n g nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

Nồng độ Tyrozin (|im ol)

0

0.02

0.04

0.08

0.12

0.16

0,2

0.3

ImlHhO

0.1

0.2

0,4

0.6

0.8

1

1,5

4

4,9

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.5

Thể tích Tyrozin
lịimol/ml (ml)
Thể tích HCI 0,2N (ml)

+ Chuẩn bị một dãy ống nghiệm gồm 8 ống:
+ Lấy 1ml của mỗi nồng độ chuẩn và lần lưọt cho vào từng ống nghiệm.
+ Thêm vào mỗi ống nghiệm: 5 ml dung dịch Na 2C 0 3 0,5M,
1 ml thuốc thử Folin, lắc đều.
+ Giữ hỗn hợp trong 20 phút ở nhiệt độ 30°c.
+ Đo cường độ màu của hỗn hợp bằng máy so màu quang điện ở bước
sóng X = 670 nm với cuvet dày 1 cm.
+ Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoành là hàm lượng
Tyrozin và trục tung là mật độ quang.
5/ Định lượng axit amin có trong mẫu thủy phân và tính hoạt độ Proteaza
+ Lấy 1 ml sản phẩm thủy phân (dịch lọc) cho vào ống nghiệm.
+ Thêm vào mỗi ống nghiệm: 5 mỉ dung dịch Na 2CƠ 3 0,5M,
1 ml thuốc thử Folin, lắc đều.
+ Giữ hỗn hợp trong

20 phút ở nhiệt độ 30°c.

+ Đo độ chiết quang bằng máy so màu quang điện ở bước sóng X = 670nm.
Hoạt độ Proteaza (HđP) của chế phẩm được tính bằng biểu thức:

HdP = ỉ ^ - , đ v /g
t.m
trong đó:

HdP: hoạt độ Proteaza của chế phẩm Enzym, đơn vị/g
D: số pmol Tyrozin tương ứng với hiệu sổ hiệu số giá trị mật độ
quang đo được của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng
t: thời gian phản íeng, phút
m: lượng chế phẩm dùng cho phản ứng xúc tác, g
f: độ pha loãng của dịch chiết Enzym trong hỗn hợp phản ứng xúc tác
( f - 4).
18


1.2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO LUFF - SCHOOL CÀI TIÉN

1) Nguyên tắc
Phản ứng oxy hóa khử giữa Sunfat đồng II (C 11SO4) và đường khử
(Glucoza, Fructoza) tạo thành oxyt đồng I (Cu20 ) kết tủa màu đỏ. Sunfat đồng
dư được định lượng gián tiếp bằng KI trong môi trường axit mạnh.

2) Hóa chất
-Dung dịch Fehling I
- Dung dịch Fehling II
- Dung dịch:

tinh bột tan 1%

KI: 30%
H2S 0 4: 25%

- Dung dịch Na2S2Ơ 3 0, IN

3) Các hước tiến hành
- Lấy vào bình tam giác 50ml:
+ 1 ml dung dịch Fehling I

+ 1 ml dung dịch Fehling II
+ 2 ml nước cất.
+ 1 ml dung dịch mẫu cần phân tích.
- Đậy bình tam giác bằng phễu thuỷ tính. Đặt bình lên bếp đun sơi nhẹ
trong 2 phút (tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên). Sau khi đun sơi, nhấc bình
ra khỏi bếp, để nguội đến nhiệt độ phịng. Dung dịch hỗn hợp vẫn còn màu
xanh đặc trưng của Sunphat đồng và xuất hiện kết tủa màu đỏ của oxyt đồng I
(Cu20 ) (nếu mẫu có đưịng khử).
- Thêm vào hồn họp 1 ml dung dịch H2S 0 4 25%, 1 ml dung dịch KI 30%;
lắc đều và giữ trong 2 phút, hỗn họp sẽ có màu vàng nâu.
- Chuẩn iôt dư bằng dung dịch Thiosunfat chuẩn (Na 2S2C>3 0,1N) với chỉ
thị hồ tinh bột 1%, sao cho hỗn họp dung dịch chuyển từ màu đen sang màu
trắng sữa.
- Làm mẫu đổi chứng: tương tự mẫu phân tích nhưng thay vào lml mẫu
cần phân tích là lml nước cất.

Chủ ỷ:
- Nếu sau khi đun, hỗn họp dung dịch có màu đỏ, như vậy là sunphat
đồng đã được sử dụng hết do lượng đường khử quá lớn. Muốn định lượng
chính xác, mẫu cần được pha lỗng đến nồng độ thích họp (< 50 mg/1).

19


- Nếu sau khi đun, không thấy kết tủa oxyt đồng I (CU2O) màu đỏ thì cần
tăng lượng mẫu, giảm lượng nước cất.

4) Tính kết quả
ỵ = ( a - b ) . f 3,3 100Q^mg/1
trong đó:

X: đường khử, mg/ỉ
a: thế tích NaXiOỉ 0,IN chuẩn mẫu trắng, mỉ
b: thế tích NdìSĩ 0, IX chuẩn mầu phản tích, ml
V: thể tích mẫu phân tích, ml
F: hệ so pha lỗng (nếu có)
3,3: đương lượng đường khử tính theo Na2S2Ũ3
1.3. ĐỊNH LƯỢNG N1TƠ AMIN BẢNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY
Nitơ am in là thành phần không thể thiếu được trong cấu trúc của axit
amin, peptit và protein.
Nitơ am in có trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, thực vật và
vi sinh vật.
Nitơ am in trong liên kết peptit là thành phần chậm chuyển hóa và thường
chiếm khoảng 16% protein thơ.
Nitơ amin có trong nước thải giàu chất hữu cơ có nguồn gốc từ quá trình
chê biến thịt, cá, trứng, sữa, sản xuất các loại mắm, nước chấm, đồ hộp thịt cá,
thuộc da, nước thải lị mổ, nước thải chăn ni gia súc. Trong phân giải yếm
khí, nitơ amin được khử để tạo thành NH 3 từ đó hình thành NH 4+ trong mơi
trường lỏng. Trong phân giải hiếu khí, xử lý nitơ amin địi hỏi lượng oxy cho
q trình oxy hóa rất lớn.
Quá trình phân giải nitơ amin là quá trình rất quan trọng trong xử lý nước

thải, chất thải rắn giàu axit am in và protein.

ỉ/Nguyên tắc định lượng nitơ amìn bằng phương pháp Lowry
a/ Nguyên tắc
Hàm lượng nitơ amin tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu
phân tích.
Nitơ amin được định lượng giản tiếp qua phản ứng tạo màu giữa protein
và thuốc thử Folin.

20


Cường độ màu của hỗn họp phản ứng được đo bằng mật độ quang ở
bước sóng X. = 750 nm.
Hàm lượng nitơ min được tính dựa vào đường chuẩn của protein tinh
khiết với thuốc thử Folin.
b/ Hoá chất
- Dung dịch protein chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch A: dung dịch Na 2C 0 3 2% pha trong NaOH 0,1N.
- Dung dịch B: dung dịch C uS0 4 0,5% pha trong Natrixitrat 1% hoặc
kali-natritactrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp dung dịch A và B theo tỷ lệ thể tích 50 : 1 (chỉ
pha trước khi dùng).
- Thuốc thử Folin.

2/ Cách tiến hành
a/ Dụng đường chuẩn
- Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn (8 mẫu) với nồng độ tăng dần từ 0

0,3 mg theo

bảng sau:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

8

Lượng Protein (mg)

0

0.03

0.05

0.1

0,15

0.2

0,25

0.3

Thế tích dung dịch Protein

0

0.3

0.5

1

1,5

2

2,5

3

4

3.7

3,5

3

2.5

2

1,5

1

chuẩn 0 .Img/ml (ml)
H20 (ml)

- Thêm vào mỗi ống nghiệm:
+ 2 ml dung dịch

c, lắc đều, thực hiện phản ứng trong 10 phút,

+ Sau 10 phút, thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.
- Đo độ chiết quang bằng máy so màu ở bước sóng X = 750 nm.
- Dựng đồ thị chuẩn từ kết quả đo được:
+ Trục tung biểu thị mật độ quang (ABS),
+ Trục hồnh biểu thị lượng Protein (mg).
Đồ thị có dạng

21

c = kX + B

b/ Xác định lượng protein có trong mẫu cần phân tích
- Pha lỗng mẫu phân tích sao cho hàm lưọng protein trong khoảng 0,01 4- 0,075
mg/ml
- Lấy vào ống nghiệm 4 ml dung dịch mẫu cần phân tích
- Thêm vào ống nghiệm:
+ 2 ml dung dịch

c, lắc đều, thực hiện phản ứng trong 10 phút.

+ Sau 10 phút, thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.
- Màu vàng của hỗn hợp sẽ chuyển sang màu xanh da trời và đạt cường
độ màu cực đại sau 30 phút.
- Đo độ chiết quang của hỗn hợp trên máy so màu ở bước sóng Ằ = 750 nm.
- Lượng Protein của mẫu phân tích được tra theo đường chuẩn.

* Chú ỷ: Phản ứng xảy ra ỡ nhiệt độ phòng.

c/ Tính hàm lượng nitơ amin
- Dựng đường chuẩn và xác định k, B.
- Tính lượng nitơ amin trong mẫu đã phân tích.

N„t/min. =
trong đó:

p
6,25 .a

. / , mg/ml

P: lượng protein, mg
f: hệ số pha lỗng
a: thể tích mẫu dùng trong phán tích (a = 4 ml)
6,25: hệ số quy chuẩn nitơ amin theo Protein

1.4. ĐỊNH LƯỢNG TỎNG NITƠ BÀNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
Nitơ tồn tại trong các hợp chất hữu cơ dưới dạng Ni tơ am in (- NH 2) và
imin (- NH - ) được gọi là nitơ hữu cơ. Nitơ hữu cơ gồm nitơ trong axit amin,
amin, amit, imit, các peptit và protein.
Phương pháp Kjeldahl được sử dụng để xác định N ở trạng thái oxi hoá - 3,
bao gồm cả nitơ hữu cơ và nitơ amon.

22


1.4.1. Nguyên tắc định lượng và các yêu cầu

1/ Nguyên tắc: Trong mơi trường axit đặc (H2SO4) và có mặt hỗn hợp
xúc tác (K2SO 4, C 11SO4, Se), nitơ hữu cơ và nitơ amoniac được chuyển hố
thành nitơamon (NH4+).
Giải phóng amoniac từ amonsunphat trong môi trường kiềm mạnh và hấp
thụ bằng dung dịch axit boric.
Lượng amon được định phân bằng axit chuẩn hoặc bằng phương pháp
trắc quang.

2/ Lấy mẫu và bảo quản
Mầu cần được phân tích càng sớm càng tốt. Thời gian lưu mẫu tốt nhất
không quá một ngày và tránh để mẫu hấp thụ amoniac từ mơi trường. Có thể sử
dung bình polyetylen hoặc bình thủy tinh để đựng mẫu.

Trong trưịng họp khơng thể phân tích ngay, cần axit hoá mẫu bằng H2SO4
đặc tới pH = 2 và bảo quản ở 4°c.

3/ Những điều cần lưu ý
Nitrat (NO 3'): nồng độ > 10 mg/1 có thể gây sai số âm do sự oxi hố
amoni trong q trình phá mẫu tạo thành N20 và gây tổn thất nitơ amon. Nitrat
cũng có thể bị khử thành amoni khi mẫu cỏ chứa nhiều chất hữu cơ ở trạng thái
oxi hoá thấp và gây sai số dương.
Các muối vơ cơ cũng có thể ảnh hưởng tới kết quà do có thể ảnh hưởng
tới nhiệt độ của quá trình phá mẫu. Quá trình amon hóa xảy ra hồn tồn và
hiệu quả ở nhiệt độ 380°c.
Khi mẫu có hàm lượng muối và chất rắn cao, nhiệt độ của dung dịch hỗn
họp có thể lên đến 400°c, gây tổn thất nitơ. Để hạn chế ảnh hường này cần bổ
sung H2SO4 đặc với tỉ lệ thơng thưịng khoảng 1 ml/g muối.
1.4.2. Các bước tiến hành

I/Hoâ chất
Sử dụng hố chất tinh khiết phân tích và nước cất khơng chứa amoni để
chuẩn bị thuốc thử
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc (98%, d = 1,84 g/cm3)
- Xúc tác: K2SO4 : C u S04 : Se với tỷ lệ khối lượng 100 : 10 : 1

23


Dung dịch NaOH 40%: hoà tan 400 g NaOH phân tích bằng nước cất
khơng amon, định mức tới 1 lít.
- Chỉ thị Taxiro: trộn 100-ml dung dịch metyl đỏ (0,2 gam metyl đỏ trong 100
ml cồn 95°) với 50 ml dung dịch metyl xanh (0,1 g metyl xanh trong 50 mi cồn 95°).
- Dung dịch axit boric/chỉ thị: hoà tan 20 g axit boric H3BO 3 trong nước.

Thêm 10 ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp rồi pha loãng thành 1 lít.
- Dung dịch HC1 tiêu chuẩn: 0,1 mol/1. Chuẩn bị từ dung dịch HC1
đặc (d = 1,18 g /cm 3) hoặc pha từ ống chuẩn.
- Dung dịch HC1 tiêu chuẩn 0,02 mol/1. Pha loãng từ dung dịch chuẩn 0,1
mol/1 và định chuẩn bàng phương pháp thông thường.
Chuẩn bị nước cất khơng amoni: có thể sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:
- Cho nước đã cất (2 lần) chảy qua cột nhựa cationit axit mạnh và chứa
nước thu được trong bình thuỷ tinh có nút nhám. Thêm vào bình 10 g cationit
cùng loại cho mỗi lít nước.
- Phương pháp chưng cất: thêm 0,10 ± 0,01 mi H2SO4 đặc vào 1 lít nước
cất và cất lại trong máy hồn tồn bằng thuỷ tinh. Bỏ 50 ml nước hứng đầu tiên
và chứa nước vào bình thuỷ tinh có nút nhám. Thêm khoảng 10 g cationit axit
mạnh cho mồi lít nước thu được.

2/ Các bước tiến hành
Thể tích mẫu được lấy theo hàm lượng nitơ:
Nồng độ nitơ Kjeldahl (mg/l)

Thể tích mẫu cần lấy (ml)

Cho đến 10

250

1 0 -2 0

100

2 0 -5 0

50

5 0 - 100

25

Vơ cơ hóa mẫu phân tích:
+ Lấy thể tích mẫu thích hợp cho vào bình Kjeldahl, thêm 10 ml axit
H2SO 4 đặc, 5 g hồn hợp xúc tác.
+ Thêm vài hạt đá bọt và đun nhẹ cho nước bay hơi hết, khi đó thấy khói
trắng bắt đầu xuất hiện.
+ Khi hết khói trắng dung dịch trở nên trong suốt. Tiếp tục đun thêm 60
phút nữa.
+ Sau khi vô cơ hố, để nguội mẫu đến nhiệt độ phịng.

24