Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




BƢỚC ĐẦU THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ






Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  




KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP




BƯỚC ĐẦU THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ





Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU
KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

iii
LỜI CẢM ƠN


Qua 4 năm học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã
đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững
chắc cho em trong cuộc sống sau này. Để có đƣợc những thành công bƣớc đầu nhƣ
ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Ba má là những ngƣời đã có công sinh thành, dƣỡng dục và luôn là chỗ dựa
tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học.
Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ƣu tú, rất tận tụy trong công tác, là ngƣời
đã vạch ra hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt
đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng đƣợc tiếp thu thêm
nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản.
Thầy Nguyễn Văn Út là ngƣời rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp
hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho
em làm cơ sở áp dụng trong đề tài.
Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực
hiện đề tài.
Hai anh Khƣu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ
Khánh Hƣng là những ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ,
cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những ngƣời đã giúp
đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống.

Sinh viên
Trƣơng Thị Hoàng Diệu




iv
TÓM TẮT
TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU. Lớp DH03SH, Khóa 2003-2007, Bộ môn Công
Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Tên đề tài: “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó”
Giáo viên hƣớng dẫn:
PGS.TS TRẦN THỊ DÂN
Kỹ sƣ NGUYỄN VĂN ÚT
Thời gian tiến hành đề tài: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007
Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa,
Khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ
sinh học sinh sản. Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào
gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó
cũng là một loài đáng đƣợc lƣu tâm.
Trong đề tài có 3 thí nghiệm đƣợc tiến hành:
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng
Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng
Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert- TALP và TYH
Kết quả:
Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM là 4,88%, 100 µM
là 1,65% và đối chứng (0 µM ) là 1,3%.
Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ các giai đoạn là 21,64% với nồng độ orcein là
0,75% và 28,19% với nồng độ 1%.

Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trƣờng Fert- TALP là 0,4%, trên môi trƣờng
TYH là 0%.






v
SUMMARY

TRUONG THI HOANG DIEU. Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology
Department of Nong Lam University.
Advisor:
Prof: TRAN THI DAN
Engineer: NGUYEN VAN UT
Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”.
Period: from the 1
st
Match, 2007 to the 15
th
August, 2007.
Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal
Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University.
In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive
biotechnology. Embryos are used for stem cell technology, animal breeding,
conservation of valuable mammalian species,… including dog.
The thesis consists of three experiments:
To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on
mature oocyte rate.

To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result.
To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro
fertilization result.
The results:
Mature oocyte rate was 1,3% in control; 4,88% in 50 µM β-mercaptoethanol;
1,65% in 100 µM β-mercaptoethanol.
Defined oocyte rate was 21,64% in 0,75% orcein; 28,19% in 1% orcein.
Fertilized oocyte rate was 0,4% in Fert-TALP medium and 0% in TYH medium.








vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii
Tóm tắt ..................................................................................................................... iv
Mục lục .................................................................................................................... vi
Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... x
Danh mục các hình và biểu đồ .................................................................................. xi
Danh mục các bảng .................................................................................................. xii
Chƣơng 1 : MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu ......................................................................................................... 2
1.3 Yêu cầu ........................................................................................................... 2

Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
2.1 Buồng trứng .................................................................................................... 3
2.1.1 Vị trí, hình thái ...................................................................................... 3
2.1.2 Cấu tạo................................................................................................... 3
2.1.3 Chức năng ............................................................................................. 3
2.2 Nang noãn ........................................................................................................ 4
2.2.1 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4
2.2.2 Sự phát triển của nang noãn .................................................................. 4
2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng ...................................................................... 6
2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn ............................................................. 7
2.2.4.1 Trƣởng thành nhân ...................................................................... 7
2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất ............................................................ 8
2.2.5 Sự rụng trứng ........................................................................................ 9
2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) .................... 9
2.3.1 Lịch sử IVM .......................................................................................... 9
2.3.2 Môi trƣờng IVM .................................................................................. 10



vii
2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM ......................................................... 10
2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM .......................................... 10
2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM ............................................. 12
2.3.3.1 Thời gian ................................................................................... 12
2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn ............................... 13
2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái ........................................... 13
2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng .................... 13
2.4 Phó tinh hoàn ................................................................................................. 13
2.5 Tinh trùng ...................................................................................................... 15
2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng ..................................................................... 15

2.5.2 Quá trình sinh tinh ............................................................................... 16
2.5.3 Cấu tạo................................................................................................. 16
2.5.4 Thành phần .......................................................................................... 17
2.5.5 Đặc tính sinh lý ................................................................................... 17
2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng ........................... 18
2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) ................................ 19
2.6.1 Lịch sử IVF ......................................................................................... 19
2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh ......................................................................... 20
2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi ........................................................ 21
2.6.4 Vật liệu cho IVF ................................................................................. 22
2.6.4.1 Giao tử ...................................................................................... 22
2.6.4.2 Môi trƣờng IVF ......................................................................... 22
2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro .............................................................. 23
2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh ................................................................... 24
2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF ........................................................... 25
Chƣơng 3: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 26
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 26
3.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26
3.3 Vật liệu........................................................................................................... 26



viii
3.3.1 Nguồn mẫu .......................................................................................... 26
3.3.2 Hóa chất............................................................................................... 27
3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng ........................................................... 27
3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng .................................................... 29
3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh ....................................................... 30
3.3.3 Dụng cụ - thiết bị ................................................................................. 31
3.3.3.1 Dụng cụ ..................................................................................... 31

3.3.3.2 Thiết bị ...................................................................................... 31
3.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 32
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để
nuôi chín trứng .......................................................... 32
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình
nhuộm trứng ............................................................... 32
3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng
Fert-TALP và TYH .................................................... 32
3.5 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 33
3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ .......................................................... 33
3.5.2 Xử lý buồng trứng ............................................................................... 35
3.5.3 Tìm và rửa trứng ................................................................................. 35
3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ............................................................ 35
3.5.5 Nuôi trứng ........................................................................................... 36
3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi ............................................ 36
3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi ..................................................... 36
3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi ...................................................... 37
3.5.7 Nhuộm trứng ....................................................................................... 38
3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ .............................................................. 39
3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng ................................................. 39
3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng ................................ 39
3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: ........... 39



ix
3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh ........................................................................ 40
3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP .................................... 41
3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH .............................................. 42
3.6 Xử lý số liệu.................................................................................................. 42

Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................... 43
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ
β-mercaptoethanol ............................................................. 43
4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng .. 44
4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng
TYH và Fert - TALP ....................................................... 47
4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF ................................................................. 48
4.4.1 Lấy mẫu ............................................................................................. 48
4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm ..................................................... 49
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 50
5.1 Kết luận ...................................................................................................... 50
5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50





x
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A Anaphase Kỳ sau
BAS Bovine adult serum Huyết thanh bò trƣởng thành
BSA Bovine serum albumine Albumine huyết thanh bò
cm centimet
COC Cumulus oocyte complex Phức hợp trứng - cumulus
Ctv Cộng tác viên
ECS Estrous cow serum Huyết thanh bò lên giống
EGF Epidermal growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô
Et al Cộng sự
FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bò

FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn
GSH Glutathione
GV Germinal vesicle Túi mầm
GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm
In vitro Trong ống nghiệm
In vivo Trong cơ thể sống
UI Unit international Đơn vị quốc tế
IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm
IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm
IVM In vitro maturation Trƣởng thành trong ống nghiệm
LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng
M Metaphase Kỳ giữa
mm milimet
NCSU North Carolina State University
T Telophase Kỳ cuối






xi
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ


HÌNH TRANG
Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng ....................... 6
Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân .............................................................. 8
Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành ............................................................................. 9
Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng ................................... 20

Hình 2.5. Các giai đoạn phát triển của phôi ............................................................. 21
Hình 3.1. Buồng trứng ............................................................................................. 26
Hình 3.2. Tinh hoàn ................................................................................................. 27
Hình 3.3. Phó tinh hoàn ............................................................................................ 27
Hình 3.4. Thao tác mổ lấy buồng trứng ................................................................... 35
Hình 3.5. Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ................................................................. 36
Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi..................................................................... 37
Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus................................................................. 38
Hình 4.1. Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein ........................... 46
Hình 4.2. Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn ................................ 46
Hình 4.3. Tiền nhân sau 24 giờ ................................................................................ 47
Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .......................... 43
Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ............... 45
















xii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn ..................... 15
Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó .................................................................... 34
Bảng 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .............................. 43
Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ................... 45
Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP ............................. 47
Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng ........................................................................... 38
Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh .................................................................................... 41


1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong lĩnh
vực sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại
nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Trong sinh sản vô tính nổi bậc
nhất là tạo con vật cloning, còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là
tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro culture - IVC), mục tiêu là cải tiến, hoàn thiện
quy trình tái sinh sản động vật trong điều kiện in vitro gần giống nhƣ điều kiện in
vivo để từ đó đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố sinh lý và sinh hóa làm cơ sở cho các
nghiên cứu khoa học và y học phục vụ cuộc sống.
Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) là một giai đoạn quan
trọng trong toàn bộ quy trình tạo phôi. Phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong
chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y
học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi hay một ý
nghĩa quan trọng là bảo tồn những loài động vật quý hiếm. Phôi còn là nguồn

nguyên liệu khai thác tế bào mầm rất hiệu quả phục vụ cho con nguời trong việc cấy
ghép nội tạng giảm nguy cơ đào thải của cơ thể.
Trên thế giới đã có rất nhiều thành tựu thụ tinh trong ống nghiệm trên nhiều
loài động vật (heo, bò, thỏ, dê, cừu, chó…), nhƣng trong đó chó là loài động vật có
đặc điểm sinh lý rất khác biệt, do đó tỷ lệ trứng chín và tỷ lệ hình thành phôi trong
ống nghiệm còn rất thấp, đây là vấn đề còn rất đƣợc quan tâm và nghiên cứu. Ở
Việt Nam, công nghệ sinh học sinh sản cũng mới đƣợc quan tâm trong thời gian gần
đây, viện Khoa học và Công nghệ, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã nghiên
cứu thành công trên chuột, heo, bò, nhƣng vẫn chƣa thực hiện trên chó.
Vì những lý do trên mà đề tài “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó”
đƣợc tiến hành.


2
1.2 Mục tiêu
Bƣớc đầu tìm quy trình thụ tinh trong ống nghiệm phù hợp trên chó
1.3 Yêu cầu
- Nuôi chín trứng chó trong ống nghiệm
- Hoạt hóa tinh trùng
- Thụ tinh trứng chó trong ống nghiệm

3
Chƣơng 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Buồng trứng
2.1.1 Vị trí, hình thái
Gia súc cái có 2 buồng trứng nằm hai bên cửa xoang chậu, phía sau lõm
hông phải và trái, dƣới góc hông xƣơng cánh chậu 3-5 cm, đƣợc treo ở cạnh trƣớc
dây chằng rộng của tử cung. Buồng trứng có hình hạt đậu, phần lõm là rốn buồng
trứng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005). Trên chó cái, buồng trứng có dạng hình
oval, nằm trong hai túi buồng trứng, ở phía sau thận, khoảng đốt sống lƣng thứ 3 - 4,
buồng trứng phải nằm cao hơn buồng trứng trái.
2.1.2 Cấu tạo
Buồng trứng có cấu tạo gồm 2 lớp: Bên ngoài là lớp màng liên kết sợi chắc
chắn nhƣ màng bao tinh hoàn. Bên trong đƣợc cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp,
gồm 2 miền: miền vỏ nằm ngoài sát bề mặt buồng trứng, là nơi sinh ra các loại nang
noãn và thể vàng ở các giai đoạn khác nhau (nang noãn, thể vàng, thể trắng - thể
vàng thoái biến), xảy ra sự chín và rụng trứng; miền tủy chứa nhiều mạch máu vào
nuôi dƣỡng nang noãn, mạch bạch huyết, thần kinh, mô liên kết cũng dày hơn gồm
sợi xốp và sợi cơ trơn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005).
2.1.3 Chức năng
Buồng trứng là một trong những bộ phận quan trọng của hệ thống sinh dục
thú cái, buồng trứng thực hiện hai chức năng quan trọng là ngoại tiết và nội tiết.
- Ngoại tiết: sinh ra noãn chín và rụng vào vòi Fallop chuẩn bị cho sự thụ tinh.
- Nội tiết: progesterone từ thể vàng và estrogen từ nang noãn là hai hormon
gây nên những đặc tính sinh dục thứ cấp ở con cái, ngoài ra buồng trứng còn tiết các
kích thích tố nhƣ oxytocin, relaxin, inhibin, activin (Trần Thị Dân và Dƣơng
Nguyên Khang, 2006). Tế bào hạt trong biểu mô của nang noãn thành thục tiết
nhiều estrogen.


4

2.2 Nang noãn
2.2.1 Đặc điểm hình thái (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997)
Noãn (trứng) là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích noãn lớn hơn
tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần tinh trùng. Noãn (trứng) có cấu tạo gồm 3 phần:
Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất hữu
cơ, muối khoáng và vật chất khác.
Nhân gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.
Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong.
Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế
bào này đƣợc phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các
tế bào này đƣợc gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men
hyaluronidase ở phần acrosom đƣợc tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng
phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh.
Màng giữa gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi
dƣỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dƣỡng
cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu
chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá
trình thụ tinh.
Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi
là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi
dƣỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng
trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao.
2.2.2 Sự phát triển của nang noãn
Trong suốt quá trình hình thành phôi, tế bào mầm nguyên thủy phát triển từ
trung bì ở túi niệu, định vị tại buồng trứng, sau đó tăng lên về số lƣợng và biệt hóa
thành nang noãn nguyên thủy. Nang noãn nguyên thủy ngừng phát triển đến giai
đoạn cơ thể thành thục về mặt sinh dục.
Khi đƣợc sinh ra, buồng trứng thú cái đã có sẵn các nang noãn nguyên thủy và
nang noãn bậc một cho hoạt động sinh sản suốt đời. Nang noãn bậc một có thể thoái

5
hóa hoặc phát triển thành nang noãn bậc hai nếu trở nên nhạy cảm với hormone
kích thích nang noãn (follicle stimulating hormone - FSH), nang noãn bậc hai đƣợc
bao bọc bởi một lớp trong suốt tƣơng đối dày (vùng trong suốt), nang noãn bậc hai
có hai hay nhiều lớp tế bào hạt nhƣng không có xoang nang. Nang noãn bậc ba là
nang noãn có xoang, chứa dịch nang và có thể trở nên trội hẳn để chuẩn bị xuất
noãn (nang Graaf). Nang noãn có xoang tƣơng tự nhƣ vết phỏng trên bề mặt buồng
trứng và có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng, kích thƣớc nang noãn có xoang
biến động khoảng nhỏ hơn 1 mm đến vài cm tùy theo giai đoạn phát triển hoặc thoái
biến và tùy loài, ví dụ ở bò 10-15 mm (Lussier et.al., 1987), bò 12-19 mm, heo 8-12
mm (Hafez, 1968), chó 4-6 mm (Cole và Cupps, 1959). Nang noãn có xoang cấu
tạo gồm 3 lớp: lớp bao ngoài, lớp bao trong và lớp tế bào hạt. Lớp bao ngoài là mô
liên kết lỏng lẻo, lớp bao trong sản xuất kích thích tố adrogen dƣới ảnh hƣởng của
kích tố thể vàng (luteinizing hormone-LH), lớp tế bào hạt tách rời lớp bao trong bởi
màng đáy rộng, tế bào hạt sản xuất nhiều chất sinh học và trên bề mặt tế bào có thụ
thể tiếp nhận LH, những chất quan trọng đƣợc sản xuất bởi tế bào hạt là estrogen,
inhibin và dịch nang (Trần Thị Dân và Dƣơng Nguyên Khang, 2006).


6






2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng
Sự tăng trƣởng, thành thục, rụng trứng và lutein hóa của nang Graff phụ thuộc
vào các yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lƣợng đủ và tỷ lệ phù hợp của FSH và

LH trong huyết thanh.
FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích
thích quá trình phân bào nguyên nhiễm của tế bào hạt (có sự hỗ trợ của estradiol),
quá trình hình thành dịch nang trứng. FSH còn làm tăng khả năng cảm ứng của tế
bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lƣợng các thể tiếp nhận LH, đây là sự chuẩn
bị cho quá trình lutein hoá của các tế bào hạt trong việc đáp ứng sóng gây rụng
trứng của LH. Theo Davol (2000), trên chó 2 ngày trƣớc khi rụng trứng, tuyến yên
tăng tiết LH làm cho nang noãn phồng lên nhanh chóng, nang noãn tiến dần lên bề
mặt buồng trứng và khi tỷ lệ LH/FSH phù hợp thì sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất noãn,
nếu vắng mặt LH thì không xảy ra sự xuất noãn.
Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng
(Nguồ n: Cummings, 2001)


7
Estrogen do các tế bào hạt trong nang tiết ra. Estrogen cần thiết cho sự duy trì
và phát triển của buồng trứng, cấu trúc sinh sản và đặc điểm sinh dục thứ cấp ở
động vật cái. Có ý nghĩa quan trọng trong việc thúc đẩy trứng phát triển, chín và
rụng, phát triển niêm mạc tử cung, tăng hàm lƣợng actin và myosin trong giai đoạn
mang thai, tăng sinh mô tuyến của niêm mạc và tế bào biểu mô lông rung của ống
dẫn trứng giúp trứng đã thụ tinh di chuyển dễ dàng vào tử cung.
Progesteron đƣợc phân tiết chủ yếu từ hoàng thể. Progesteron kích thích tăng
sinh niêm mạc tử cung, giúp tử cung có khả năng bài tiết, giảm co bóp cơ tử cung
tạo môi trƣờng yên ổn sẵn sàng đón chờ trứng đã thụ tinh vào làm tổ, kích thích
niêm mạc ống dẫn trứng bài tiết dịch chứa chất dinh dƣỡng nuôi phôi, progesteron
còn có tác dụng kích thích bài tiết prolactin làm tăng phát triển các ống sữa của
tuyến vú. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh bắt đầu tăng lên ở giai đọan
động dục, ở chó sau khi hàm lƣợng progesterone tăng đến 2 ng/ml thì sự xuất noãn
sẽ xuất hiện sau đó 2 ngày, do đó hàm lƣợng progesterone cũng là một chỉ tiêu hiệu
quả để xác định thời điểm phối giống trong thụ tinh nhân tạo (Davol, 2000).

2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn
Khi đạt đến kích thƣớc cực đại, nang noãn chuyển sang giai đoạn mới, đó là
giai đoạn trƣởng thành. Quá trình này xảy ra dƣới ảnh hƣởng của các cơ chế điều
chỉnh, trong đó quan trọng nhất là cơ chế thần kinh-hormone trong tƣơng tác noãn
bào với các tế bào xung quanh. Sự chuyển sang giai đoạn trƣởng thành đƣợc thực
hiện dƣới ảnh hƣởng của các kích thích tố của thùy trƣớc tuyến yên. Sự trƣởng
thành nang noãn bao gồm cả trƣởng thành nhân và trƣởng thành tế bào chất (Vũ
Văn Vụ và ctv, 2005).
2.2.4.1 Trƣởng thành nhân
Noãn trƣởng thành nhân là khi nhân đạt đến giai đoạn metaphase II (MII) với
hình dạng đƣợc quan sát bên ngoài là sự xuất hiện thể cực thứ nhất.
Ngay sau giảm phân, noãn ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle - GV) sẽ lần
lƣợt qua các giai đoạn: tan biến túi mầm (germinal vesicle break down - GVBD),
metaphase I (MI), sau giảm phân I (meiosis I) hình thành nên 2 tế bào: một gồm có


8
nhân và một chút tế bào chất tách khỏi màng noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất
nhƣng ở trong màng noãn hoàng, đó chính là thể cực thứ nhất; tế bào thứ hai là noãn
bào bậc hai, nhiễm sắc thể trong tế bào chất của tế bào này ngay lập tức bƣớc vào
metaphase II (II) và dừng lại tại đó (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Thời gian noãn trƣởng
thành khác nhau tùy loài nhƣ ở bò là 24 giờ (Sirard et al., 1989), heo là 38 giờ, chó
48-72 giờ (Rota, 2004). Đây là cơ sở cho việc thiết lập quy trình nuôi chín trứng in
vitro trên nhiều loài.

2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất
Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra nhiều
biến đổi. Noãn trở nên mọng nƣớc, các phiến noãn hoàng trong nƣớc và dần hòa tan
vào nhau, noãn trở nên trong hơn. Trong noãn xảy ra sự tăng áp suất nội bào, giảm
tính thấm, lớp tế bào chất ở bề mặt có khả năng co giãn và xuất hiện khả năng phân
chia (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Các bào quan trong tế bào chất đƣợc tổ chức lại
chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển phôi.
Sự trƣởng thành tế bào chất là yếu tố gián tiếp quyết định khả năng phát triển của
noãn để có thể xảy ra hiện tƣợng thụ tinh bình thƣờng, phân chia và phát triển tới
Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân
(Nguồn: Mario Mayes, 2002)


9
phôi nang (blastocyst). Nếu chỉ có sự trƣởng thành về nhân mà không có sự trƣởng
thành về tế bào chất thì sẽ không đảm bảo cho sự phát triển phôi sau này (Sirard et
al., 1989; Yang et al., 1998).

2.2.5 Sự rụng trứng
Lúc rụng trứng, thành nang vỡ ra và giải phóng trứng thứ cấp vào ống dẫn
trứng, trứng vẫn đƣợc một số tế bào hạt bao quanh.
Sự rụng trứng xảy ra vào cuối kỳ tăng trƣởng, ở đa số các loài trứng rụng khi
đã trƣởng thành đầy đủ về nhân và tế bào chất (MII), tuy nhiên ở ngựa, chó và cáo
trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Ở giai đoạn này,
nang trứng trội có khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích
dục tố bằng sự thay đổi hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tƣợng rách nang và
giải phóng noãn bào.
2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation-IVM)
2.3.1 Lịch sử IVM
Trên thế giới, kỹ thuật IVM đã xuất hiện từ rất sớm, với mục đích nghiên cứu
ảnh hƣởng của các yếu tố sinh lý, sinh hóa lên sự phát triển của trứng trong in vivo, từ
đó tái thiết lập quy trình IVM để làm cơ sở cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản sau này.
Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chƣa trƣởng thành khỏi sự ức
chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trƣởng thành khi nuôi cấy in vitro.
Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành
(Nguồn: Mario Mayes, 2002)


10
Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng
noãn chuột đƣợc trƣởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu đƣợc thụ tinh.
Năm 1983, Lenz và cộng sự cho rằng 39
o

C là nhiệt độ tối ƣu để noãn bò
trƣởng thành in vitro.
Năm 1988, Lu và cộng sự cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh
in vitro.
Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật
IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ.
Ngày nay kỹ thuật IVM đã đƣợc thực hiện thành công trên rất nhiều loài
động vật và đặc biệt là trên ngƣời, làm cơ sở cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
(in vitro fertilization - IVF), chuyển cấy phôi và chuyển gen. ngày nay kỹ thuật
IVM vẫn đang đƣợc rất chú trọng và phát triển.
2.3.2 Môi trƣờng IVM
2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM
Môi trƣờng đơn giản: là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối nhƣ
pyruvate, lactate, glucose. Các môi trƣờng thƣờng đƣợc cung cấp huyết thanh hay
albumine và một lƣợng thích hợp các kháng sinh (penicillin, streptomycin,
gentamycin).
Môi trƣờng phức tạp thƣờng chứa thêm một số yếu tố nhƣ amino acid,
vitamine, purine và những chất khác.
2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM
 Thành phần chính
- Nƣớc
Nƣớc là thành phần chính cho mọi loại môi trƣờng. Nƣớc sử dụng trong
IVM phải đƣợc qua hệ thống chƣng cất, siêu lọc, hấp vô trùng để loại bỏ các chất
khoáng, ion và nguồn gây nhiễm trong nƣớc.
- Nguồn năng lƣợng
Glucose, lactate, pyruvate là những nguồn năng lƣợng ngoại sinh quan trọng
nhất cho sự phát triển của trứng và phôi. Tuy nhiên tùy vào từng giai đoạn phát triển


11

mà nhu cầu năng lƣợng đối với từng cơ chất khác nhau. Thêm glucose vào môi
trƣờng chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 mM : 1 mM) làm tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột
(Downs et.al., 2000). Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt
MII (71,9%) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6%) (Masaya Geshi
et.al., 2000).
- Nguồn protein
Protein vừa là nguồn đạm có sẵn vừa là chất hấp thụ ion kim loại độc. Những
protein thƣờng đƣợc bổ sung:
 Huyết thanh
Một số loại huyết thanh thƣờng đƣợc sử dụng là: huyết thanh thai bò (fetal
cafl serum - FCS), huyết thanh bò lên giống (estrous cow serum - ECS), huyết thanh
bò trƣởng thành (bovine adult serum - BAS). Tỷ lệ noãn tiếp diễn giảm phân và
trƣởng thành khi thêm huyết thanh chó lên giống (16,3%) cao hơn so với huyết
thanh chó không lên giống (11,1%) (Otoi et.al., 1999).
 Albumine huyết thanh
Nếu không bổ sung huyết thanh vào môi trƣờng thì có thể thay bằng
albumine. Albumine huyết thanh bò (bovine serum albumine - BSA) là loại thƣờng
đƣợc sử dụng nhất, nó nhƣ là một biện pháp ngăn cản sự xâm nhập đa tinh trùng
trong thụ tinh in vitro. Bổ sung BSA hoặc FCS đều làm tăng khả năng tiếp diễn
giảm phân, nhƣng so sánh giữa hai kết quả này thì không có sự khác biệt nhau.
Noãn chó đƣợc nuôi trong môi trƣờng North Carolina State University 37 (NCSU
37) có bổ sung 0,4% BSA và 100 ng/ml yếu tố tăng trƣởng biểu mô (epidemal
growth factor - EGF) sẽ cho tỷ lệ noãn tiến đến giai đoạn MII cao nhất so với đối
chứng và các nồng độ khác (Kim et.al., 2006).
- Muối
Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trƣờng nuôi trứng và phôi nhằm
đảm bảo áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiêm cho sự điều hòa này
nhƣng chủ yếu là Na
+
và K

+
. Hàm lƣợng các ion trong môi trƣờng dựa vào thành
phần các chất khoáng trong huyết tƣơng máu.


12
- Hệ đệm
Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dƣới 5 % CO
2

.Cơ chế của hệ đêm
này cũng giống nhƣ hệ đệm trong sinh lý máu. Hệ đệm có vai trò quan trọng là ổn
định nồng độ CO
2
và pH của môi trƣờng.
- Kháng sinh
Các loại kháng sinh thƣờng dùng là penicillin, streptomycin, gentamycin.
Các loại kháng sinh đều có vai trò quan trọng nhất là giảm nguy cơ nhiễm khuẩn từ
các tác nhân bên trong và bên ngoài trong quá trình nuôi cấy.

Thành phần bổ sung

- Hormon
Hầu hết các môi trƣờng IVM đều đƣợc bổ sung hormon, đặc biệt là FSH và
LH. FSH giúp noãn giãn nở hạt tụ và vƣợt qua chƣớng ngại trong giảm phân nhƣng
không giúp phát triển hơn nữa. Ngoài ra còn bổ sung estradiol, progesteron vào môi
trƣờng. Tỷ lệ MII khi thêm estradiol (14,7%) cao hơn so với đối chứng(1,5-8,2%),
khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) (Kim et.al., 2005).
- Yếu tố tăng trƣởng
Trên chó, EGF đƣợc thu từ ống dẫn trứng. EGF đƣợc thêm vào môi trƣờng

nuôi cấy làm tăng tỷ lệ MII (16,7%) so với đối chứng (4%) (Bogliolo et.al., 2002).
Khi bổ sung EGF với nồng độ 20 ng/ml thì tỷ lệ trứng chín tăng (13,3%) so với đối
chứng (2,7%) (Kim et.al., 2004).
- Chất chống oxy hóa
Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy có thể bị oxy hóa và tao một số chất độc
gây ảnh hƣởng xấu tới noãn. Do đó chất chống oxy hóa thƣờng đƣợc cho vào môi
trƣờng là β- mercaptoethanol. Tỷ lệ trứng đạt đến MII tăng 20% so với đối chứng
khi bổ sung 50µM vào môi trƣờng nuôi cấy (Kim et.al., 2004).
2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM
2.3.3.1 Thời gian
Cho đến nay cũng chƣa có một công bố chính thức về thời gian tối ƣu nhất
cho nuôi chín trứng in vitro trên chó, có nhà khoa học cho rằng thời gian tốt nhẩt là


13
48h (Bogliolo et.al., 2002), nhƣng cũng có kết quả cho là không có sự khác biệt
giữa 48 giờ và 72 giờ (Kim et.al., 2006).
2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn
Theo Sorrensen và Wassaman (1976), nang noãn nguyên thủy chứa noãn
không có khả năng hỗ trợ quá trình giảm phân và phát triển của phôi. Tỷ lệ noãn có
khả năng giảm phân và hỗ trợ quá trình phát triển của phôi tăng dần theo đƣờng
kính của noãn. Để đạt hiệu quả IVM cao thì kích thƣớc noãn thƣờng đƣợc lấy là
100 µm (Kim et.al., 2006).
2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái
Hewitt và England (1998) so sánh noãn chó từ 2 nhóm tuổi : từ 1 - 6 tuổi và
trên 7 tuổi. Kết quả chứng minh rằng noãn từ các chó từ 1 - 6 tuổi đạt tỉ lệ trƣởng
thành nhiều hơn nhóm thứ hai.
Yamada et.al., (1992) đã báo cáo rằng có đến 32% trứng lấy từ chó siêu bài
noãn đạt đến MII sau 72 giờ nuôi cấy; trong khi đó, trứng lấy từ chó ở giai đoạn
không động dục thì không có dấu hiệu tiếp diễn giảm phân kể cả khi nuôi tới 144 giờ.

2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng
Nhiệt độ tốt nhất bảo quản mẫu buồng trứng là 37
o
C trong môi trƣờng nƣớc
muối sinh lý có đệm phosphate (phosphate buffered saline - PBS), thời gian tối đa
cho phép trữ mẫu từ lúc lấy buồng trứng ra ngoài cơ thể là 2 giờ (Kim et.al., 2006).
Ngoài ra còn có một số yếu tố khác nhƣ: điều kiện vô trùng, thao tác ngƣời
thực hiện, tủ nuôi cấy…
2.4 Phó tinh hoàn
 Vị trí: nằm ở một bên thân và đầu dƣới của tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung
và ctv, 2005)
 Cấu tạo
Về giải phẫu học, phó tinh hoàn gồm 3 phần (Hoàng Văn Tiến và ctv, 1995).
Đầu: có rất nhiều ống dẫn ra (13 đến 20) đính vào ống dẫn của phó tinh hoàn,
tạo nên một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của tinh hoàn.