Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân tử Detection of Escherichia coli which cause diarrheal disease in human by molecular technology

Mẫu 04/ĐTCS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÁO CÁO TỔNG KẾT
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ
Tên đề tài:

Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây
bệnh tiêu chảy ở ngƣời bằng kỹ thuật phân
tử

Mã số đề tài:

TN.18.14

Chủ nhiệm đề tài:

TS. Phạm Thanh Hiền


Mẫu 04/ĐTCS
PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
- Tiếng Việt: Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở người bằng kỹ
thuật phân tử
- Tiếng Anh: Detection of Escherichia coli which cause diarrheal disease in human by
molecular technology.
2. Mã số: TN.18.04

3. Danh sách các cán bộ thực hiện đề tài:
TT

Học vị, họ và tên

Đơn vị công tác

1

TS. Phạm Thanh Hiền

2

TS. Trần Thị Thanh Huyền

Bộ môn Vi sinh vật học,
Khoa Sinh học, Trường
ĐHKHTN

Vai trò thực hiện đề tài
(Chủ nhiệm/Tham gia)
Chủ nhiệm
Tham gia

4. Đơn vị chủ trì thực hiện: Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN
5. Thời gian thực hiện:
5.1. Theo hợp đồng: Từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019
5.2. Gia hạn (nếu có): Gia hạn đến tháng 12 năm 2019
5.3. Thực hiện thực tế: Từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 12 năm 2019
6. Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt của đề tài: 25 triệu đồng.

7. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có)
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; nguyên
nhân; ý kiến của Trường ĐHKHTN)
Khơng có
PHẦN II. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang, nội dung gồm các phần:
1. Đặt vấn đề
Tiêu chảy là bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, ở người lớn bệnh thường ít nguy hiểm
đến tính mạng nhưng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, khả năng lao động và sinh hoạt của
người bệnh. Tiêu chảy rất nguy hiểm đối với trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là ở trẻ từ 0 đến 2
tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình ở trẻ em dưới
5 tuổi là trên 3 lần/ trẻ em/ năm. Tuy nhiên, ở một số nước đang phát triển con số này có thể
cao tới 12 lần/trẻ em/năm. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy
trong một năm đối với một trẻ là 2,2 lần [2,19]. Đây là bệnh đứng thứ hai về tỷ lệ tử vong ở
trẻ dưới 5 tuổi chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp, trong đó hơn 80% số ca tử vong ở trẻ từ 0
- 2 tuổi. Nguyên nhân chính gây tử vong khi bị tiêu chảy là do mất nước và điện giải, tiếp
theo là suy dinh dưỡng. Suy dinh dưỡng và tiêu chảy tạo thành một vòng xoắn bệnh lý: tiêu
chảy dẫn đến suy dinh dưỡng và khi trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy cơ bị tiêu chảy cao
hơn [2]. Tác nhân chính gây bệnh là vi khuẩn E. coli, trong đó có nhiều nhóm gây bệnh khác
nhau như STEC (shiga toxin producing E. coli), ETEC (enterotoxigenic E. coli), EPEC
(enteropathogenic E. coli), EIEC (enteroinvasive E. coli), EHEC (enterohemorrhagic E.
1


Mẫu 04/ĐTCS
coli), EaggEC (enteroaggregative E. coli) và DAEC (diffusely adherent E. coli). Vi khuẩn
thường mang các gen độc lực khác nhau giúp chúng có thể bám vào niêm mạc ruột, giải
phóng yếu tố tan máu và độc tố ruột. Trong số các gen độc lực đó gen eae (E. coli attaching
and effacing) được xem là gen phổ biến có mặt hầu hết trong các nhóm EPEC, EHEC. Có
rất nhiều phương pháp khác nhau để xác nhận sự có mặt của gen eae như PCR, real time

PCR hoặc microarray… tuy nhiên kết quả của các phương pháp này thường bị phụ thuộc
vào kỹ thuật, thao tác tiến hành và sử dụng các thiết bị đắt tiền.
Năm 2000, Notomi và cộng sự đã phát triển một kỹ thuật mới khuếch đại DNA trên
cơ sở nguyên lý khuếch đại của PCR nhưng có độ đặc hiệu và độ nhạy cao gấp nhiều lần so
với PCR, quá trình khuếch đại DNA diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt nên không cần phải sử
dụng các máy móc hiện đại. Hiện nay, LAMP được xem là một phương pháp phổ biến sử
dụng trong chẩn đoán nhanh các tác nhân virut, vi khuẩn và nấm. Với mong muốn tìm ra
một phương pháp chẩn đốn nhanh nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác, có thể tiến hành bằng
các thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tại các tuyến y tế cơ sở nhằm góp phần nâng
cao hiệu quả trong phịng chống, kiểm sốt và điều trị vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở
người chúng tôi đã lựa chọn kỹ thuật LAMP để phát hiện gen độc tố eae gây tiêu chảy. Gen
eae mã hóa cho protein intimin có trọng lượng phân tử là 94- 97 kDa là yếu tố độc lực cần
thiết của EPEC cần thiết cho việc tạo tổn thương mô học niêm mạc ruột. Gen eae hiện diện ở
tất cả các chủng EPEC, EHEC nhưng khơng có ở những dịng vi khuẩn E. coli thuộc hệ vi
khuẩn đường ruột thông thường [18]. Đây được xem là một trong những chỉ thị phân tử để phát
hiện ra các vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người.
2. Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
Mục tiêu: Phát triển được kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt gen eae đặc hiệu vi khuẩn E.coli
Phạm vi nghiên cứu
Nội dung 1: - Phân lập vi khuẩn E.coli gây bệnh từ mẫu phân trẻ bị tiêu chảy
- Thu thập các chủng nghi ngờ là nhiễm E.coli từ phòng xét nghiệm của bệnh viện
Thái Nguyên
Nội dung 2: - Phát hiện gen độc tố của vi khuẩn E.coli bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật nhân
gen đẳng nhiệt LAMP
- Sử dụng phần mềm thiết kế mồi dựa trên trình tự gen eae đã được công bố trên Genbank
- Tách chiết ADN: sử dụng các phương pháp thường quy hoặc kit thương mại
- Sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen eae bằng các đoạn mồi đặc hiệu
- Sử dụng kỹ thuật LAMP nhân gen eae bằng 4 mồi đặc hiệu.
- Xác định độ đặc hiệu của phương pháp LAMP
So sánh giới hạn phát hiện ADN của 2 phương pháp PCR và LAMP

3. Tổng quan tài liệu
Escherichia coli (E. coli) là một loại vi khuẩn sống trong đường ruột của người và
động vật. Có rất nhiều typ khác nhau nhưng hầu hết trong số chúng không gây bệnh và là
thành phần của khu hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa. Dựa vào tính chất gây bệnh E.coli
được chia thành EPEC (Enterophathogenic E.coli) - E.coli gây bệnh đường ruột [1].


EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli) - E.coli gây chảy máu đường ruột (gồm hai
2


Mẫu 04/ĐTCS
phân nhóm là EHEC1 và EHEC2)


STEC – (Shiga toxin producing E.coli) – E.coli sinh độc tố shiga

 AEEC – (attaching and effacing E.coli) - E. coli gây kết dính đường ruột
Trong những nhóm gây bệnh kể trên cần kể đến nhóm AEEC là nhóm có khả năng
sinh ra intimin gây ra hiện tượng kết dính niêm mạc ruột [2,10] được mã hóa bởi gen eae
lần đầu tiên được phát hiện ở nhóm EPEC và EHEC [9]. Có ít nhất 27 dạng intimin khác
nhau đã được xác định dựa vào trình tự đầu 3’ của gen eae tạo nên sự đa dạng của nhóm vi
khuẩn đường ruột gây tiêu chảy này. Có nhiều cơng bố sử dụng các kỹ thuật khác nhau để
phát hiện gen eae ví dụ như PCR [13, 2, 4], multiplex PCR [13] hoặc Real time PCR [6]
hay Microarray [7] tuy nhiên những phương pháp này không xác định được tất cả các
chủng mang gen tổng hợp intimin và cần sử dụng các thiết bị đắt tiền cũng như các kỹ thuật
viên được đào tạo. Như vậy, những phương pháp này chỉ có thể áp dụng trong phịng thí
nghiệm chứ khơng thể ứng dụng ngồi thực tế. Do đó, việc phát triển một kỹ thuật mới, có
thể xác định được tất cả các dạng intimin khác nhau chỉ trong một bước duy nhất và dùng
một thiết bị đơn giản là rất có triển vọng ứng dụng trong chẩn đốn bệnh tiêu chảy do E.

coli.
Một cơng cụ chẩn đoán phân tử mới được gọi là khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành
các loop (LAMP) đã chứng minh được rằng: ADN có thể được khuếch đại ở điều kiện đẳng
nhiệt mà khơng cần phải có chu trình nhiệt biến đổi như PCR. Khơng giống như PCR, ADN
đích sử dụng trong phương pháp này khơng cần phải biến tính để tách chuỗi, lượng sản
phẩm phản ứng sau khi được khuếch đại với một thời gian rất ngắn lại rất lớn và các phản
ứng dương tính có thể phát hiện được bằng mắt thường thay vì phải điện di như phương
pháp PCR [11]. Ưu điểm của phương pháp này là rất đơn giản, chỉ cần một bể ổn nhiệt hoặc
một thiết bị gia nhiệt có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định là có thể tiến hành phản ứng.
Phương pháp LAMP sử dụng một ADN polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc hiệu
dựa trên 6 trình tự khác biệt trên gen đích. Mồi trong có trình tự tương tự và bổ sung với
trình tự mạch LAMP khởi đầu. Cặp mồi ngồi có khả năng tách chuỗi phân tử ADN cùng
với sự hỗ trợ của Bst hoặc Bsm polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao tạo ra phân tử ADN
mạch đơn. Sợi đơn này sau đó sẽ tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc tạo điều kiện khởi đầu cho
phản ứng khuếch đại bởi LAMP. Đây là phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để
chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng tổng hợp một lượng lớn ADN
mà không cần máy biến nhiệt được thực hiện bởi một ADN polymerase đặc biệt và ít nhất
hai cặp mồi đặc hiệu. Bước đầu tiên của quá trình khuếch đại, bốn mồi được sử dụng để tổng
hợp khn cho phản ứng LAMP từ gen đích, sau đó hai mồi được sử dụng cho mỗi chu kỳ.
Tồn bộ q trình khuếch đại đoạn ADN đích cần thời gian khoảng 40 đến 60 phút. Sản
phẩm cuối cùng nhận được là các đoạn ADN kép dạng gấp khúc có kích thước gấp nhiều lần
kích thước của đoạn gen cơ sở. Tồn bộ dung dịch sau phản ứng có thể quan sát được bằng
mắt thường dưới sự thay đổi của các chỉ thị mà không cần điện di trên gel agarose. ADN
polymerase thường được sử dụng trong các phản ứng LAMP là Bst ADN polymerase hoặc
Bsm ADN polymerase có hoạt tính tự tách chuỗi cao. Do sử dụng 2-3 cặp mồi bắt cặp bổ
sung với 6-8 đoạn trình tự trên gen đích nên phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy rất
3


Mẫu 04/ĐTCS

cao, có thể thu được kết quả tốt ngay ở nồng độ ADN thấp [11]. Oriel và cs năm 2010 đã
cơng bố sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được gen rim và p150 của vi khuẩn
Theileria parva ở giới hạn 1 fg [12], còn Chen năm 2009 đã cơng bố có thể phát hiện được
gen rimM của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium bovis ở giới hạn là 1
pg [3]. Như vậy có thể thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát hiện thấp hơn nhiều so với
phương pháp PCR hoặc Real-time PCR nên có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác hơn so
với các phương pháp sinh học phân tử khác. Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại
phức tạp hơn mồi cho phản ứng PCR thông thường. Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai
cặp mồi, một cặp có chiều dài khoảng 40 nucleotit và được thiết kế đặc biệt, cặp còn lại có
chiều dài khoảng 20 nucleotit [11].
Thêm vào đó, tồn bộ q trình từ lúc khuếch đại gen đích và phát hiện sản phẩm
phản ứng đều diễn ra trong 1 ống thí nghiệm ở điều kiện đẳng nhiệt. Ưu điểm của phương
pháp này là có thể hạn chế sự nhiễm ADN ra khu vực xung quanh, điều mà phương pháp
PCR không đảm bảo được do phải tiến hành điện di sản phẩm PCR và soi dưới máy UV.
Như vậy, nếu sử dụng phương pháp LAMP thì khơng cần đến các thiết bị phịng thí nghiệm
hiện đại và rất dễ dàng thao tác ở ngồi phịng thí nghiệm.
Kỹ thuật LAMP có những ưu điểm mà kỹ thuật PCR khơng có được như:


Khơng địi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền như PCR bởi vì tất cả phản ứng diễn ra tại một
nhiệt độ cố định, dao động từ 60- 65oC, tùy thuộc vào hàm lương GC trong mồi.



Kết quả có thể được đọc ngay bằng mắt thường sau khi phản ứng kết thúc mà không
cần điện di trên gel agarose.



Thời gian thực hiện phản ứng rất ngắn, trong vòng 60 phút với giới hạn phát hiện cao

hơn kỹ thuật PCR.



Sự khuếch đại đặc hiệu cao vì có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng riêng biệt trên
ADN khuôn.



Trong phương pháp LAMP lượng ADN tổng hợp được lớn hơn gấp nhiều lần so với
PCR.



Phương pháp LAMP có thể thực hiện khuếch đại RNA bằng cách bổ sung thêm enzym
phiên mã ngược vào trong hỗn hợp phản ứng.
Chính từ những ưu điểm đó, chúng tôi phát triển kĩ thuật này để phát hiện vi khuẩn
E.coli mang gen eae gây bệnh tiêu chảy ở người nhằm chẩn đốn nhanh chính xác tác nhân
gây bệnh trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần mất nhiều thời gian như những
phương pháp thông thường khác.
4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu
Cách tiếp cận
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện vi sinh vật gây bệnh, bao gồm
cả những phương pháp truyền thống và các phương pháp phân tử hiện đại. Tuy nhiên, trong
chẩn đoán tiêu chảy do vi khuẩn E. coli các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc,
thử các tính chất sinh vật, hóa học giúp phát hiện vi khuẩn E.coli nhưng không thể phân biệt
giữa các vi khuẩn E. coli hội sinh cư trú bình thường ở đường ruột với các vi khuẩn E. coli
mang gen độc lực gây bệnh.
4

Mẫu 04/ĐTCS
Gen eae được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn E.coli thuộc nhóm EPEC chủng O127 bởi
Jerse và cộng sự năm 1990 [9] và sau đó ở vi khuẩn nhóm EHEC chủng EDL933 bởi Yu và
Kaper năm 1992. Khơng giống như trình tự đầu 5’, trình tự ở đầu 3’ có tính khơng đồng nhất
[5]. Có ít nhất 17 dạng intimin khác nhau và các dưới đơn vị [1, 2, 8] được xác định bằng
phương pháp PCR và RFLP. Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng các phương pháp PCR thông
thường sẽ không phát hiện được hết các subtype của gen eae. Phương pháp LAMP được
phát triển lần đầu tiên bởi Notomi và cộng sự năm 2000, Zablon 2012 ngồi tính đặc hiệu và
nhạy (có thể phát hiện được ADN đích ở nồng độ pg) thì cịn có khả năng phát hiện tất cả
các biến thể của eae trong cùng một phản ứng [11,14]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết
kế mồi khuếch đại gen eae tại vùng 5’ của gen để có thể phát hiện được gen eae của hơn 20
dạng gen eae mã hóa intimin khác nhau cho kết quả nhanh và chính xác nhất so với phương
pháp PCR hoặc real time PCR.
Nguyên liệu
- 25 mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương
Thái Nguyên dùng cho nghiên cứu phân lập vi khuẩn E. coli.
- Các chủng vi khuẩn YTN1, YTN2, là các vi khuẩn E. coli không gây bệnh, được
cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
- Hóa chất gồm: SYBR Green I, Betain, Calcein, pepton, cao thịt, agar, phenol,
chloroform, iso-amylalcohol, glycerol, ethanol, MgSO4, MnCl2, NaCl, HCl, NaCH3COO,
axit acetic, lactose, sodium chloride, sodium citrate, sodium deoxycholate, Neutral red,
nước cất, nước khử ion, bộ Kit API - 20E ....
- Mồi nhân gen (5’-3’): Mồi nhân gen eae bằng kỹ thuật PCR kí hiệu SK1/SK2 (Mồi
xuôi CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC;
Mồi ngược CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG) của vi khuẩn E. coli
Mồi nhân gen eae bằng kỹ thuật LAMP: F3 (CGACGATTTGGTCGTTGAA);
B3 (TGTCATCGGTCATGTTGC);
FIB (CAAAATGATCTGCTGACCAGGCTTTTTAAGCATTTATACAGTTCTGAAAGC)
BIP (ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTTTTCATTTTAGTCAGTTTATTCGTGTGA)

Phƣơng pháp nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn
Các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy được thu thập ngay khi người bệnh bị tiêu
chảy cấp, bệnh phẩm được lấy trước khi người bệnh dùng thuốc kháng sinh. Dùng que tre vô
trùng lấy khoảng 1-2 ml phân cho vào hộp đựng mẫu vô trùng. Hộp đựng mẫu phải dán
nhãn, ghi đầy đủ thông tin người bệnh, người lấy mẫu và thời gian thu mẫu. Sau đó, các mẫu
phân được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh để tiến hành các bước nghiên cứu
tiếp theo. Các vi khuẩn được phân lập từ mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy trên môi trường
chọn lọc DCL, ủ ấm ở 37oC, sau 18 - 24 giờ, quan sát hình thái khuẩn lạc. Trên mơi trường
DCL các khuẩn lạc dạng S, có màu hồng, kích thước 1,5 - 2 cm nghi ngờ là vi khuẩn E. coli
tiếp tục cấy ria sang đĩa môi trường thạch máu để kiểm tra các tính chất tiếp theo. Những
khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E. coli được làm tiêu bản nhuộm Gram. Nếu thấy là trực
khuẩn Gram (-) được dự đốn là vi khuẩn E. coli thì tiến hành thực hiện các kiểm tra tính
5


Mẫu 04/ĐTCS
chất sinh vật hóa học. Định danh vi khuẩn bằng cách sử dụng bộ Kit API 20E, do hãng
Biomerieux sản xuất. Bộ kit API 20E có thể kiểm tra nhanh 20 chỉ tiêu hóa sinh chỉ sau 18 24 giờ. Dựa vào sự biển đổi màu sắc của cơ chất, so sánh với phần mềm APIweb để định
danh vi khuẩn.
Tách chiết DNA từ vi khuẩn
Vi khuẩn sau khi được nuôi trong môi trường LB ở 28oC trong 18 giờ, thu sinh khối.
Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft và ly tâm 5000 vòng/phút trong 7 phút thu
tế bào. Tế bào được hòa tan trong 0,5 ml đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8), ly
tâm thu tế bào [8]. Bổ sung 0,5 ml TE, 3 µl RNAse, 2 µl lysozyme, trộn đều và để nhiệt độ
phịng trong 30 phút. Thêm 30 µl SDS 10%, 3 µl proteinase K trộn đều ủ 37oC trong 60
phút. Bổ sung 180 µl 5M NaCl, ủ 65oC trong 10 phút, ly tâm thu dịch nổi ở trên. Chiết DNA
hai lần bằng hỗn hợp Phenol: Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1), ly tâm thu pha trên.
DNA genome được tủa trong 70% cồn ở –20oC trong 30 phút. Ly tâm thu tủa và làm khơ,
sau đó bổ sung 40 µl TE để hịa tan DNA genome. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA genome

sau tách chiết trên gel 0,8% agarose.
Kỹ thuật PCR
Để có thể khuếch đại đoạn gen eae bằng kỹ thuật PCR, chúng tơi đã thiết kế cặp mồi
dựa trên trình tự đoạn gen eae trên genome của vi khuẩn E.coli..
Thành phần phản ứng PCR (25 µl): 10x Taq polymerase buffer (Fermentas), 1,5 mM
MgCl2, 2,5 mM dNTP, 100 µM mồi xi, 100 µM mồi ngược, 0,5 IU Taq polymerase,
DNA, dH2O cho đến 25 µl. Chu trình nhiệt: (1) Biến tính DNA ở nhiệt độ 940C trong 4
phút. (2) Khuếch đại gen eae trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước. Bước 1: Biến tính
sợi khn DNA ở 940C trong 30 giây. Bước 2: Mồi bắt cặp bổ sung với đoạn gen tương
đồng trên sợi khuôn ở 450C trong 40 giây. Bước 3: Tổng hợp kéo dài chuỗi ở 720C trong 1
phút 50 giây.(3) Phản ứng kết thúc ở 720C trong 5 phút 30 giây để tạo sợi DNA hoàn chỉnh
và ủ mẫu ở 220C.
Kỹ thuật LAMP
LAMP là phản ứng tự tổng hợp DNA vịng khi có mặt của Bst DNA polymerase ở điều
kiện đẳng nhiệt. Phương pháp này sử dụng 2 cặp mồi khác nhau vì thế sản phẩm khuếch đại rất
đặc hiệu. Phản ứng có tốc độ nhanh, diễn ra trong khoảng thời gian ngắn chỉ từ 30- 60 phút.
Thành phần đệm LAMP 1X gồm (200 mM Tris HCl pH 8,8, 100 mM KCl, 100 mM
(NH4)2SO4, 1% Triton 100X, 25 mM MnCl2). Thành phần phản ứng (25µl): 5M Betatin, 1X
buffer LAMP, 25 mM dNTPs, 25 mM MgSO4, 2 µM B3 và F3, 20 µM BIP và FIP, 8 U/µl Bst
polymearas, DNA và dH2O đến thể tích cuối cùng. Chu trình nhiệt như sau: 64oC trong 60
phút, 80ºC trong 10 phút và kết thúc ở 22oC. Sản phẩm LAMP được quan sát bằng điện di trên
gel agarose 2% hoặc bằng mắt thường khi có bổ sung chỉ thị kim loại Calcein trước phản ứng.
Hỗn hợp Calcein và Mn2+ được thêm vào trước phản ứng. Do sự có mặt của ion Mn2+,
Calcein liên kết với Mn2+ khơng phát quang, dung dịch có màu da cam. Khi phản ứng
khuếch đại DNA xảy ra với sự có mặt của DNA đích, sản phẩm phụ là ion P2O74- được tạo
thành sẽ kết hợp với ion Mg2+ tạo thành muối Mg2P2O7, sau đó ion Mn2+ đẩy Mg2+ khỏi
muối để tạo thành muối Mn2P2O7 và giải phóng ion Mg2+. Mg2+ tự do trong dung dịch sẽ kết
6

Mẫu 04/ĐTCS
hợp với Calcein tạo ra phức hợp Calcein-Mg phát quang [16].

7


Mẫu 04/ĐTCS
Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP
Để xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP với các cặp mồi nhận biết gen eae của
vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy. Chúng tôi sử dụng các vi khuẩn YTN1, YTN2 là những vi
khuẩn E. coli không gây bệnh được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược
Thái Nguyên, genom được tách chiết theo phương pháp giống như các mẫu bệnh phẩm đã
trình bày ở trên để sử dụng làm đối chứng âm trong phản ứng LAMP.
Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP
Nồng độ DNA ban đầu được xác định bằng máy nanodrop, sau đó tiến hành pha
lỗng theo cơ số 10 đến khi đạt các nồng độ pha loãng DNA mong muốn. Xác định ngưỡng
nồng độ DNA mà phản ứng vẫn diễn ra.DNA tổng số được tách trực tiếp từ khuẩn lạc theo
bước tiến hành như sau:
Điện di DNA trên gel agarose
Hóa chất điện di: agarose 0,8 -2 % (phụ thuộc vào kích thước phân tử ADN); dung dịch
đệm 50x TAE (24,2% Tris-base, 5,7% axit acetic, 50 mM EDTA pH 8); dung dịch đệm tra mẫu
đặc 5 lần (30% glycerol, 0,25% Bromophenol Blue, 0,25% Xylen Cyanol FF); dung dịch nhuộm
0,5 g/ml EtBr.
Quy trình điện di:
- Chuẩn bị gel agarose: hịa 0,8 hoặc 2 gram agarose vào 100 ml dung dịch đệm 1x
TAE tương ứng với gel 0,8% và gel 2%, cho vào lị vi sóng quay dung dịch agarose cho đến
khi tan hết, để nguội đến khoảng 40-50oC, đổ dung dịch agarose vào khay gel điện di đã cài
sẵn lược để tạo các giếng nhỏ chứa mẫu. Độ dày của gel tuỳ thuộc mục đích sử dụng. Để
thời gian 30 phút cho gel đơng và ổn định hồn tồn. Gỡ lược và đặt khay gel vào bể điện di,
đổ đệm 1x TAE tới khi ngập bề mặt gel từ 1 đến 2 cm.

- Dung dịch sản phẩm phản ứng được trộn đều với đệm lót mẫu 5x (tỷ lệ 1:5 về thể
tích) và được tra vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu
điện thế 90 V, trong khoảng thời gian 30 phút. Thang DNA chuẩn được chạy cùng các mẫu
để xác định kích thước các băng của các mẫu cần xác định.
- Sau khi điện di xong, bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong dung dịch chứa
EtBr nồng độ 0,5 g/ml trong 20 phút, sau đó gel được rửa bằng nước, các băng DNA được
quan sát dưới đèn tử ngoại (bước sóng 260-280 nm) trên máy soi DNA và chụp ảnh.
5. Nội dung và kết quả nghiên cứu
5.1. Phân lập và định danh chủng vi khuẩn E. coli
Từ 25 mẫu bệnh phẩm phân thu được từ bệnh nhân tiêu chảy tại Khoa Vi sinh - Bệnh
viện Trung ương Thái Nguyên vào tháng 6 năm 2018. Chúng tôi phân lập trên môi trường
chọn lọc DCL, ủ ở 37oC, sau 18- 24 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc. Các khuẩn lạc nghi
ngờ là vi khuẩn E. coli sẽ được cấy trên môi trường thạch máu, nuôi ở nhiệt độ 35oC, sau 18
-24 giờ khuẩn lạc phát triển với đường kính khoảng 1,5 mm, dạng S (trịn, bờ đều, lồi bóng),
màu trắng đục, tan máu nhẹ hoặc không gây tan máu. Trên môi trường chọn lọc DCL, sau
18 - 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng S, màu hồng, kích thước khoảng 1,5 - 2
mm. Kết quả được trình bày trong hình 1.
8


Mẫu 04/ĐTCS

Hình 1. Hình dạng khuẩn lạc trên mơi trường DCL
Kết quả đã sàng lọc được 25 mẫu vi khuẩn trực tiếp từ mẫu phân của bệnh nhân tiêu
chảy, trong điều kiện vô trùng, chiếm 100% tổng số mẫu. Các mẫu vi khuẩn đều có chung
một dạng hình thái, màu sắc và kích thước hồn tồn đồng nhất, khơng thấy có khuẩn lạc
nào khác biệt và đều bắt màu vi khuẩn Gram âm.
O A L O C H U T I V G G M I S R S M A A
N D D D I 2 R D N P E L A N O H A E M R
P H C C T S E A D

L U N O R A C L Y A
G
E1

E2

E4

E10

E11

E25
Hình 2. Kết quả phẩn ứng sinh hóa chủng E1, E2, E10, E11, E25.

9


Mẫu 04/ĐTCS
Toàn bộ 25 mẫu vi khuẩn này tiếp tục được định danh bằng bộ Kit API - 20E do
hãng BioMerieux sản xuất. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa môi trường thạch
máu, ở 37oC trong khoảng thời gian 18 - 24 giờ. Chọn một khuẩn lạc đơn, điển hình để tiến
hành thử nghiệm các tính chất sinh vật hóa học theo quy trình kèm theo của bộ kit.
Kết quả trên hình 2 cho thấy: giếng đầu tiên là thử nghiệm ONPG, giúp nhận biết sự
có mặt của enzyme β - galatosidase, đây là enzym có liên quan tới q trình dị hố lactose,
nếu dương tính cho kết quả màu vàng, âm tính cho kết quả màu trắng. Ba phản ứng tiếp theo
lần lượt là arginin, lysin và ornithin là thử nghiệm tách carboxyl của amino acid. Phản ứng
decarboxyl dương tính các giếng này sẽ chuyển sang màu đỏ, âm tính có màu vàng. Chín
giếng cuối là các phản ứng xác định sự lên men của carbohydrat (glucose, mannitol, inositol,
sorbitol, rhamnose, sucrose, melibiose, amygdalin và arabinose). Sự lên men nếu diễn ra,

các giếng sẽ chuyển sang màu vàng, âm tính cho kết quả màu xanh đậm. Sự có mặt của sản
phẩm H2S và gelatin hydrolysis (GEL) được thể hiện bằng mầu đen bao phủ khắp ống. Phản
ứng dương tính của tryptophan deaminase (TDA) thể hiện bằng màu nâu sẫm khi thêm
thuốc thử là FeCl3. Như vậy các vi khuẩn đều có chung một số tính chất như: ONPG (+),
Glu (+), Sor (+), H2S(-), Urea (-), IND (+), đây là những tính chất sinh hóa cơ bản của vi
khuẩn E. coli. Giữa các chủng vi khuẩn có thể có một vài tính chất sinh hóa khác nhau, như
chủng E11 cho phản ứng SAC dương tính, trong khi 4 chủng cịn lại bao gồm E2, E4, E10,
E25 đều có kết quả âm tính với SAC. Tuy nhiên, khi kiểm tra bằng phần mềm APIweb thì
tất cả các chủng trên đều cho kết quả là vi khuẩn E. coli với độ tương đồng từ 86,6 đến
99,9%. Kết quả các phản ứng sinh hóa của 25 chủng vi khuẩn nghiên cứu được trình bày
trong bảng 1.
Bảng 1. Kết quả kiểm tra tính chất sinh vật hóa học các chủng E. coli.
O
N

A
D

L
D

O
D

C
I

H
2

U
R

T
D

I
N

P

H

C

C

T

S

E

A

D

V
P

G
E

G
L

M
A

I
N

S
O

R
H

S
A

M
E

A
M

A
R

L

U

N

O

R

A

C

L

Y

A

G
E1

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E2

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E3

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

E4

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

E5

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E6

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E7

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E8

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E9

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E10

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

E11

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

E12

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

E13

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

E14

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

10


Mẫu 04/ĐTCS
O
N

A
D

L
D

O
D

C
I

H
2

U
R

T
D

I
N

P
G

H

C

C

T

S

E

A

D

E15

+

-

+

+

-

-

-

-

+

E16

+

-

+

+

-

-

-

-

E17

+

-

+

+

-

-

-

E18

+

-

+

+

-

-

E19

+

-

+

+

-

E20

+

-

+

+

E21

+

-

+

E22

+

-

E23

+

E24
E25

V
P

G
E

G
L

M

A

I
N

S
O

R
H

S
A

M
E

A
M

A
R

L

U

N

O

R

A

C

L

Y

A

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

+

(+): phản ứng dương tính, (-): phản ứng âm tính.
5.2. Tách DNA genome của vi khuẩn
DNA của 25 mẫu vi khuẩn nghiên cứu được tách chiết theo phương pháp đã mô tả ở
phần phương pháp. Kết quả tách chiết DNA genom được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8% được biểu diễn trên hình 3 cho thấy băng DNA genom thu được sáng, rõ,
không bị đứt gãy và hoàn toàn sạch. Chất lượng DNA đủ tiêu chuẩn để làm khn nhân các
gen mong muốn bằng PCR và LAMP.

Hình 3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA. M: Thang DNA chuẩn 1kb; E1, E2,
E4
5.3. Phát hiện gen eae của các chủng vi khuẩn E. coli bằng kỹ thuật PCR
M- 1
24 25

2 3 4 5

6 7 8 9

M - 10 11 12 13 14 15 16 17 18

M - 19 20 21 22 23

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen eae 25 chủng vi khuẩn E. coli.
11


Mẫu 04/ĐTCS

M: thang DNA chuẩn, (-) mẫu đối chứng âm, 1-25 tương ứng với 25 mẫu vi khuẩn kí hiệu
E1-E25
Sử dụng DNA của 25 chủng vi khuẩn làm khuôn và cặp mồi SK1/SK2, tiến hành
chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt được mơ tả ở trên. Sản phẩm sau phản ứng được
kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm sau điện di (hình 4) cho kết quả
13 chủng E1, E2, E3, E6, E8, E10, E11, E13, E16, E18, E20, E23 và E24 dương tính với gen
eae, thể hiện các băng DNA sáng, kích thước khoảng 876 bp phù hợp với những tính tốn lý
thuyết. Những chủng cịn lại có kết quả âm tính với gen eae, không thấy xuất hiện băng
DNA trên sản phẩm điện di. Như vậy bằng phản ứng PCR, với DNA của 25 chủng vi khuẩn
E. coli nghiên cứu và cặp mồi SK1/SK2 đã phát hiện được 13 vi khuẩn E. coli dương tính
với gen eae, chiếm tỷ lệ 52%. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Svenungsson và
cộng sự (2000) khi nghiên cứu tiêu chảy do vi khuẩn E. coli ở người trưởng thành cũng cho kết
quả tỉ lệ phát hiện gen eae là 56% [14]. Gomes và cộng sự (1996), khi phát hiện các chủng
EPEC được tìm thấy ở 30% mẫu phân trẻ em bị tiêu chảy [4]. Sehand (2010) với tỉ lệ phát
hiện gen aea 63,1% trong mẫu phân tiêu chảy [13]. Kết quả tỉ lệ vi khuẩn E. coli mang gen
eae của chúng tôi cao hơn so với một số tác giả đã công bố trước đó. Năm 2003, Nguyễn Vũ
Trung và cộng sự đã dùng kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen
eae ở trẻ em tiêu chảy ở Hà Nội chỉ là 3% [11]. Cũng dùng phương pháp Multiplex PCR, Bii
và cộng sự (2005) cũng phát hiện gen eae trong vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy với tỷ lệ là
7% [1]. Hồng Bích ngọc (2017) phát hiện gen eae trên E. coli gây tiêu chảy tại Hà Nội là
4,2 % [5]. Konaté và cộng sự (2017) là 7,4% [6]. Như vậy, có thể thấy sự khác nhau về tỷ lệ
mang gen eae của vi khuẩn E. coli giữa các nghiên cứu của các tác giả tại Việt Nam và trên
thế giới. Sự khác nhau này có thể đến từ nhiều nguyên nhân như: đối tượng nghiên cứu của
mỗi nhóm nghiên cứu thuộc các vùng dịch tễ khác nhau hay sự khác nhau ở các nhóm tuổi
nghiên cứu. Ngồi ra trong nghiên cứu của chúng tơi, với số lượng chỉ 25 mẫu nên không đủ
để đại diện cho tỷ lệ mang gen này của vi khuẩn E. coli trong phân của bệnh nhân tiêu chảy
tại Việt Nam.
5.4. Phát hiện gen eae của các chủng E. coli bằng kỹ thuật LAMP
Phản ứng LAMP được thực hiện với các cặp mồi được thiết kế trên trình tự gen eae.
Lựa chọn ngẫu nhiên 5 mẫu dương tính với phản ứng PCR, 1 mẫu âm tính với phản ứng

PCR và 2 mẫu YTN1, YTN2 là các chủng vi khuẩn E. coli không gây bệnh được cung cấp
bởi Bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên làm đối chứng, với các
thành phần phản ứng và chu kì nhiệt như mô tả ở trên. Sản phẩm phản ứng được phân tích
trên gel agarose 2% cho kết quả như Hình 5.

876 bp
bp
228 bp
bp

12


Mẫu 04/ĐTCS
Hình 5. Kết quả khuếch đại gen eae bằng PCR (A) và LAMP (B)
M: thang DNA chuẩn, (-): đối chứng âm. E1, E2, E10, E11, E20 và E4: chủng vi
khuẩn kiểm tra, YTN1, YTN2: chủng đối chứng không gây bệnh.
Trên hình 5A các chủng E1, E2, E10, E11 và E20 cho kết quả dương tính với
phương pháp PCR (876 bp) và LAMP (228 bp) trên hình 5B. Trên băng điện di sản phẩm
phản ứng LAMP xuất hiện các băng dạng bậc thang bắt đầu từ băng cơ sở có kích thước là
228 bp do sản phẩm DNA được khuếch đại với nhiều kích thước khác nhau. Ở giếng 2 là
mẫu đối chứng âm không bổ sung DNA phản ứng không diễn ra, 3 giếng cuối là chủng E4,
YTN1 và YTN2 đều cho kết quả âm tính. Hình ảnh trên băng điện di hồn tồn giống với
mơ tả của Notomi (2000) [12]. Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả khuếch đại gen
eae bằng phản ứng PCR (Hình 1). Như vậy chứng tỏ các cặp mồi được thiết kế để nhận biết
gen eae trong phản ứng LAMP là hoàn toàn đặc hiệu.
5.4.1. Giới hạn phát hiện gen eae của phản ứng LAMP
Kĩ thuật LAMP sử dụng enzym Bst Polymerase và một bộ 4 mồi được thiết kế đặc
biệt để nhận ra từ 2-6 trình tự cách xa nhau trên gen đích eae, do vậy có tốc độ phản ứng và
độ nhạy rất cao. Để xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP trong việc khuếch đại

gen eae của vi khuẩn E. coli, DNA genom được pha loãng theo cơ số 10 với các nồng độ
100, 10-1, 10-2, 10-3.... Nồng độ DNA genom ban đầu được xác định thông qua đo bằng máy
nanodrop là 15 ng/l. Các thí nghiệm được tiến hành với DNA khn ban đầu là 15 ng/l
sau đó giảm dần nồng độ theo cấp số 10 từ 15 ng/µl đến 15 fg/µl. Tiến hành song song với
phương pháp PCR để so sánh độ nhạy của 2 phương pháp trong cùng một nồng độ DNA.
Kết quả được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2. Giới hạn phát hiện của PCR và LAMP
Phƣơng
pháp 15ng

Hàm lƣợng ADN
1,5ng

0,15ng

15pg

1,5pg

0,15pg

15fg

PCR

+

+

+

-

-

-

-

LAMP

+

+

+

+

+

-

-

(+): dương tính, (-): âm tính.

Hình 6. Giới hạn phát hiện A: phản ứng PCR, B: phản ứng LAMP.
M(A): thang DNA chuẩn 1kb, M(B): thang DNA chuẩn 100bp, (-): đối chứng âm.
1- 15 ng/µl, 2- 1,5 ng/µl, 3 - 0,15 ng/µl, 4 - 15 pg/µl, 5 - 1,5 pg/µl, 6- 0,15 pg/µl, 7 - 15

fg/µl
13


Mẫu 04/ĐTCS
Kết quả bảng 2 cho thấy: cùng với nồng độ DNA khuôn như nhau và tiến hành so
sánh độ nhạy phản ứng LAMP và PCR cùng khuếch đại gen eae, giới hạn phát hiện của
phương pháp LAMP cao hơn rất nhiều so với phương pháp PCR. Phương pháp PCR sử
dụng cặp mồi SK1/SK2 có thể phát hiện được DNA ở mức độ pha loãng 10-3 tương ứng với
nồng độ DNA là 0,15 ng/µl (đường chạy số 3) nhưng vạch điện di tương đối mờ. Trong khi
đó, nếu sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được ở độ pha lỗng rất cao (10-5)
tương ứng với 1,5 pg/µl (đường chạy số 5), cao gấp hơn 100 lần so với phương pháp PCR.
(Hình 6).
Như vậy bằng phương pháp LAMP với các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho gen
eae, chúng tôi đã phát hiện thành công gen eae ở nồng độ rất thấp là 1,5 pg/µl. Kết quả này
tương đồng với một số nghiên cứu đã công bố của các tác giả khác khi sử dụng phương pháp
LAMP để phát hiện các gen đích. Kuboki (2003) khi nghiên cứu đơn bào trypanosome gây
bệnh ngủ ở người và gia súc sử dụng phương pháp LAMP phát hiện thành công T. brucei
PFR A ở giới hạn nồng độ 1 pg tổng DNA, trong khi giới hạn phát hiện bằng PCR là 100 pg
[8]. Cũng dùng phương pháp LAMP để phát hiện nấm Fusarium Nessie cơng bố phát hiện
được gen đích gaoA - gen mã hóa galactose oxidase ở nồng độ 2 pg [10]. Verma (2017) phát
hiện Leishmania tropica ở nồng độ 1pg [17]. Năm 2010, tác giả Trần Thị Thanh Huyền đã
dùng phương pháp LAMP để phát hiện thành công vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh Gan thận
mủ trên cá Tra việt Nam, ở nồng độ 9,4 fg [15]. Engku (2017) phát hiện Vibrio cholerae ở
nồng độ 10fg [3], thấp hơn gần 100 lần so với nghiên cứu của chúng tôi.
Từ nghiên cứu của chúng tôi và các công bố của các tác giả khác nhau cùng sử dụng
kỹ thuật LAMP để phát hiện gen đích cho thấy, đây là phương pháp có độ nhạy cao với giới
hạn phát hiện ở mức rất thấp, phương pháp này cho độ nhạy cao gấp từ 10 – 100 lần so với
các phương pháp PCR thơng thường khi cùng phát hiện một gen đích. Do vậy, phương pháp
LAMP có thể được sử dụng để phát hiện giai đoạn sớm của bệnh, góp phần trong cơng tác

phịng chống và điều trị bệnh tích cực cho bệnh nhân.
5.4.2. Phát hiện gen eae của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein:
Trong quá trình tiến hành phản ứng LAMP, mỗi ống phản ứng được bổ sung 1 µl
Calcein, sau đó chạy phản ứng LAMP theo chu trình đã trình bày ở chương 2. Kết quả phản
ứng được quan sát dưới ánh sáng thường (Hình 7) hoặc soi dưới đèn UV (Hình 8)

Hình 7. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị màu Calcein.
(-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15ng đến 15fg.

14


Mẫu 04/ĐTCS

(-)

(+)

Hình 8. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị Calcein dưới ánh sáng UV.
(-): phản ứng âm tính - trái, (+): phản ứng dương tính- phải
Khi thêm calcein vào các ống phản ứng, dưới ánh sáng thường những mẫu dương
tính dung dịch sau phản ứng sẽ phát quang và chuyển sang màu xanh lá cây, những mẫu âm
tính dung dịch sau phản ứng không phát quang và vẫn có màu vàng cam. Dưới ánh sáng
UV, những mẫu dương tính dung dịch sau phản ứng có màu xanh lá cây rất sáng, mẫu âm
tính khơng phát sáng và có màu đen. Kết quả thay đổi màu sắc thấy rõ ở các nồng độ nồng
độ DNA pha loãng giảm dần tử 15ng đến 1,5 pg. Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết
quả phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di trên gel agarose 2% (Hình 6)
5.4.3. Phát hiện gen eae của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị SYBR Green I
SYBR Green I có khả năng bắt cặp với các DNA sợi đôi, việc tồn tại DNA được
khuếch đại sẽ làm cho SYBR Green I chuyển từ màu vàng cam sang màu xanh. Do nồng độ

DNA sau khi được khuếch đại bằng phương pháp LAMP cao hơn nhiều lần so với các
phương pháp khuếch đại thông thường khác như PCR nên dấu hiệu chuyển màu rất rõ ràng.
Do đó, sản phẩm của phản ứng LAMP có thể được nhận biết bằng mắt thường nhờ chỉ thị
SYBR Green I, mỗi ống phản ứng được bổ sung thêm 2 µl SYBR Green I sau khi phản ứng
LAMP kết thúc. Kết quả sự thay đổi màu sắc của sản phẩm phản ứng được biểu diễn trên
hình 9.

Hình 9. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị màu SYBR I.
(-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15ng đến 15fg.
Các ống có nồng độ từ 15ng đến 1,5pg có kết quả dương tính, phát quang màu xanh,
các ống cịn lại khơng phát quang màu xanh cho kết quả âm tính. Như vậy, giới hạn phát
hiện phản ứng LAMP bằng SYBR Green I hoàn toàn giống với kết quả điện di trên gel
agarose 2% hay sử dụng chỉ thị Calcein. Tuy nhiên, do SYBR Green I được bổ sung sau khi
phản ứng kết thúc nên với hàm lượng DNA lớn được khuếch đại sau phản ứng nên việc lây
nhiễm là điều có thể xảy ra với bất cứ phịng thí nghiệm nào. Do đó, để tránh việc lây nhiễm
và thuận lợi trong việc ứng dụng ngồi thực tế, có giá trị về mặt kinh tế thì Calcein đáp ứng
được các tiêu trí trên hơn là SYBR Green I.
6. Đánh giá về kết quả nghiên cứu đạt đƣợc
15


Mẫu 04/ĐTCS
Bằng kỹ thuật vi sinh phân lập được 25 mẫu vi khuẩn là E.coli tuy nhiên trong số
25 mẫu đó chỉ có khi xác định sự có mặt của gen độc tố eae chỉ có 13/25 chủng dương tính
chiếm tỷ lệ 52%.
Khi sử dụng đồng thời 2 kỹ thuật là PCR và LAMP sử dụng các cặp mồi đặc hiệu
được thiết kế trên đoạn gen eae có thể phát hiện được vi khuẩn của vi khuẩn E. coli. Tuy
nhiên kỹ thuật LAMP thể hiện sự ưu việt hơn cả. Phương pháp PCR có thể phát hiện được
DNA đích ở nồng độ 0,15 ng/µl. Trong khi đó bằng phương pháp LAMP với các cặp mồi
được thiết kế đặc hiệu cho gen eae, chúng tôi đã phát hiện thành công gen eae ở nồng độ rất

thấp là 1,5 pg/µl cho thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát hiện cao hơn 100 lần so với
phương pháp PCR do đó có thể ứng dụng phương pháp này để xác định tác nhân gây bệnh
là vi khuẩn E. coli một cách nhanh chóng và hiệu quả. Thêm vào đó, kỹ thuật LAMP có
tính ứng dụng cao hơn do không cần các thiết bị phịng thí nghiệm phức tạp. Phản ứng diễn
ra ở một nhiệt độ cố định và thời gian nhanh chỉ sau 30 phút có thể xác định được phản ứng
là dương tính hay âm tính.
Để phát hiện sản phẩm của phản ứng một cách đơn giản nhất và hạn chế sự lây
nhiễm DNA chúng tơi có sử dụng 2 loại chỉ thị màu là Calcein và có thể được phát hiện
bằng mắt thường dưới sự có mặt của một loại chỉ thị kim loại là Calcein và SYBR Green I
cho thấy, Calcein thể hiện sự ưu việt hơn vì tạo ra một hệ phản ứng kín, chỉ thị này được bổ
sung từ đầu phản ứng giúp hạn chế tối đa việc mở ống phản ứng. trong khi đó SYBR Green
I được bổ sung và sau phản ứng do đó sẽ dễ làm ơ nhiễm DNA trong vùng thí nghiệm. Cả 2
loại chỉ thị màu này đều giúp cho việc xác định phản ứng dương tính được dễ dàng bằng mắt
thường mà không cần phải điện di trên agarose hay sử dụng bất kể thiết bị phụ trợ nào khác.
7. Kết luận
- Đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn E. coli từ mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy
- Đã phát hiện được 13/25 mẫu là vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy do có mang gen eae
bằng kỹ thuật PCR
- Đã thiết kế thành công và ứng dụng thành công phản ứng LAMP khuếch đại gen eae
của vi khuẩn E.coli trong một hệ thống kín, phản ứng diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt
60-65oC thời gian tối thiểu 30 phút. Kỹ thuật LAMP có độ nhạy cao hơn 100 lần so
với kỹ thuật PCR. Kết quả của phản ứng có thể xác định nhanh bằng mắt thường khi
có sự bổ sung chỉ thị Calcein hoặc SYBR Green I
8. Tài liệu tham khảo
1. Bii C.C, Taguchi H, Ouko T.T, Muita W, Wamae N, Kamiya S (2005), “Detection of
virulencerelated genes by Multiplex PCR in multidrug-resistant diarrhoeagenic
Escherichia coli isolates from Kenya and Japan”, Epidemiol Infect, 133(4), pp.627-633
2. Bộ Y tế (2009), Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy ở trẻ em, Ban hành kèm theo quyết
định số 4121/QĐ-BYT ngày 28/10/2009, Hà Nội
3. Engku N. S., Nurul N. A. B, Foo PC, Mohd Ali MR, Mohamed M, Yean CY (2018),

“An ambient temperature stable and ready-to-use loop-mediated isothermal
amplification assay for detection of toxigenic Vibrio cholerae in outbreak settings”, Acta
Trop;182:223-2313.
16


Mẫu 04/ĐTCS
4. Gomes T A T, Rassi V, Macdonald K L, Ramos S R T S, Trabulsi L R, Vieira M A M,

5.

6.

7.
8.

Guth B E C, Candeias J A N, Ivey C, Toledo M R F, Blake P A. (1991)
“Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in Sao Paulo,
Brazil”. J Infect Dis., 164:331–337
Hồng Thị Bích Ngọc (2017), Xác định sự phân bố và một số đặc điểm sinh học phân tử
của nhóm Escherichia coli gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi tại địa bàn Hà Nội, Luận
án tiến sỹ Y học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội.
Konaté A, Dembélé R, Kagambèga A, Soulama I, Kaboré WAD, Sampo E, Cissé
H, Sanou A, Serme S, Zongo S, Zongo C, Fody AM, Guessennd NK 5 , Traoré
AS, Gassama-Sow
A, Barro
N, (2017),
“Molecular
Characterization
of

Diarrheagenic Escherichia Coli in Children Less Than 5 Years of Age with Diarrhea in
Ouagadougou, Burkina Faso” Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2017 Sep; 7(3): 220–228.
Jams PN, Jams BK (1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Cnilical Microbioly
Review; 11(1), pp.142-210.
Kuboki N., Inoue, N., Sakurai, T., Di Cello, F., Grab, D.J., Suzuki, and H. S., C.,

Igarashi, I. (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for detection of African
trypanosomes”, J. Clin.Microbiology, 41, pp. 5517-5524.
9. Krystal DB, Hemant MC, Roxanna S, Kevin RU (2003), Detection of Edwardsiella
infections in Opsanus tau by Polymerase Chain Reaction. Biol Bull 205: 235-236
10. Niessen L. and Zudi F.V. (2010), “Detection of Fusarium graminearum DNA using a
loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay”, International Journal of Food
Microbiology, 140, pp. 183–191.
11. Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej Weintraub (2003), “Phát triển
và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân”. Tạp
chí Nghiên cứu Y học. tr. 7-14.
12. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T
(2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Axit nucleic Res . 28 (12):
e63
13. Sehand KA, Layla IFS (2010), “Identification of Different Categories of Diarrheagenic
Escherichia coli in Stool Samples by Using Multiplex PCR Technique”, Asian Journal
of Medical Sciences; 2(5), pp. 237-243.
14. Svenungsson B., Lagergren A., Ekwall E., Evengard B., Hedlund K.O., Karnell A.,
Lofdahl S., Svensson L., Weintraub A (2000), “Enteropathogens in adult patients with
diarrhea and healthy control subjects: a 1-year pro-spective study in a Swedish clinic for
infectious diseases”, Clin. Infect. Dis, 30, pp.770-778.
15. Trần Thị Thanh Huyền (2010), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop - mediated
isothermal amplification) để xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận
mủ trên cá tra, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Hà Nội.
16. Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T. (2008), “Loop-mediated isothermal

amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products”, Nat
Protoc, 3 (5), pp. 877-882
17


Mẫu 04/ĐTCS
17. Verma S, Singh R, Sharma V, Bumb RA, Negi NS, Ramesh V, Salotra P.(2017),
“Development of a rapid loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis and
assessment of cure of Leishmania infection”, BMC Infect Dis. 2017 Mar 23;17(1):223
18. Xue-han Z, Qing Y, Ya-dong L, Bin L, Renata I, Kong-wang H (2013), “Development
of a LAMP assay for rapid detection of different intimin variants of attaching and
effacing microbial pathogens”, J Med Microbiol., 62(11), pp1665-72
19. />9. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện vi sinh vật gây bệnh, bao
gồm cả những phương pháp truyền thống và các phương pháp phân tử hiện đại. Tuy nhiên,
trong chẩn đoán tiêu chảy do vi khuẩn E. coli các phương pháp phân lập trên môi trường
chọn lọc, thử các tính chất sinh vật, hóa học giúp phát hiện vi khuẩn E.coli nhưng không thể
phân biệt giữa các vi khuẩn E. coli hội sinh cư trú bình thường ở đường ruột với các vi khuẩn
E. coli mang gen độc lực gây bệnh. Bài báo này đề cập đến phương pháp LAMP (LoopMediated Isothermal Amplification) khuếch đại DNA với độ đặc hiệu và độ nhạy cao được
ứng dụng để phát hiện nhanh vi khuẩn E.coli ở giới hạn phát hiện là 15 fg, cao gấp hơn 100
lần so với phương pháp PCR. Các mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn gen eae là một trong
những gen độc lực của vi khuẩn E. coli có kích thước khoảng 288 bp trong DNA genome vi
khuẩn và với sự có mặt của một loại chỉ thị kim loại. Calcein (C30H26N2O13) là một chỉ thị
kim loại dùng để phát hiện sự có mặt của Magie. Trong trường họp này, Calcein ban đầu bị
bất hoạt bởi sự kết hợp với Mangan nên dung dịch có màu vàng cam. Khi phản ứng LAMP
khuếch đại gen eae diễn ra, một lượng lớn DNA được tổng hợp sẽ giải phóng sản phẩm phụ
là Magie pyrophotphat. Khi đó, Magie sẽ đẩy Mangan ra khỏi nhân Calcein tạo ra phức hợp
Calcein-Magie phát ra ánh sáng huỳnh quang màu xanh. Do đó, phản ứng dương tính thì
dung dịch sẽ chuyển từ màu cam sang màu huỳnh quang có thể quan sát bằng mắt thường
sau khi phản ứng diễn ra là 60oC và sau ít nhất 30 phút phản ứng hoặc dưới ánh sáng UV.

Tín hiệu chỉ thị rất nhạy này cho phép phân biệt trực quan các kết quả mà không cần sử dụng
các thiết bị đắt tiền. Phương pháp phát hiện này mở ra tiềm năng ứng dụng trong trong
nghiên cứu cơ bản về y học và dược phẩm, vệ sinh môi trường, xét nghiệm điểm chăm sóc và
nhiều hơn nữa.
Nowaday, many techniques are use for detecting pathogenic agents, including
traditional and model molecular techniques. However, pathogenic E. coli are not
distinguishable from other common strains or from each other by the appearance on culture
plates or by the results of the usual biochemical tests. In this study, a new method called
LAMP ((Loop- Mediated Isothermal Amplification) was applied to amplify DNA with high
specificity and sensitivity at 15 fg, 100 times higher than PCR method. Primes were
designed to detect the eae gene, one of the toxic genes of E. coli with the length of 288 bp.
Calcein (C30H26N2O13) is a fluorescent metal indicator for Magesium detection. In this case
Calcein is initially quenched by manganese and it emits a yellowish-green fluorescence. In
eae LAMP reaction, a large amount of DNA is synthesized, yielding a large pyrophosphate
18


Mẫu 04/ĐTCS
ion by-product. LAMP-generated pyrophosphate preferentially precipitates manganese,
resulting in a calcein–magnesium complex visible as bright green fluorescence. So a positive
reaction was observed by a colour change from orange to green through the naked eyes after
completion at 63°C for at least 30 min or under UV light detection. As the signal recognition
is highly sensitive, this system enables visual discrimination of results without costly
specialized equipment. This detection method should be helpful in basic research on
medicine and pharmacy, environmental hygiene, point-of-care testing and more

19


Mẫu 04/ĐTCS

PHẦN III. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
1. Các công trình khoa học đã cơng bố:

TT

1

Ghi địa chỉ và
Tình trạng
cảm ơn sự tài
(Đã
in/chấp trợ
của
nhận in,…)
ĐHQGHN /
ĐHKHTN

Sản phẩm

Đánh giá
chung
(Đạt,
không
đạt)

Bài báo trên các tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia
Trần Thị Thanh Huyền, Đinh Đức Thọ, Đã chấp nhận
Phạm Thanh Hiền, Trần Văn Tuấn, đăng tại Tạp

Có

Đạt

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP Chí khoa học
(Loop
mediated
isothermal và Cơng nghệ
amplification) phát hiện nhanh vi khuẩn Việt Nam
Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở
người
2. Sản phẩm đào tạo:
TT Họ và tên

Thời gian và kinh Cơng trình cơng bố liên
phí tham gia đề tài quan (Sản phẩm KHCN, Đã bảo vệ
(số tháng/số tiền)
luận án, luận văn)

Thạc sỹ / Học viên cao học
1

Đinh Đức Thọ

6

01 bài báo khoa học

01/2019

3. Các sản phẩm khác (phương pháp, quy trình cơng nghệ, phần mềm máy tính, bản vẽ

thiết kế, sơ đồ, bản đồ, cơ sở dữ liệu, báo cáo phân tích, model, maket, vật liệu, thiết bị, máy
móc,…): Không
4. Tổng hợp các sản phẩm đăng ký và đã hoàn thành của đề tài:

Số lƣợng

Số lƣợng Tự đánh giá về
đã hoàn số lƣợng, chất
thành
lƣợng

STT

Sản phẩm

1

Bài báo / báo cáo khoa học

01

01

Tốt

2

Đào tạo / hỗ trợ đào tạo

01

01

Tốt

3

Phương pháp, quy trình cơng nghệ, phần 0
mềm máy tính, bản vẽ thiết kế, sơ đồ, bản
đồ, cơ sở dữ liệu, báo cáo phân tích,...

4

Sản phẩm cơng nghệ (model, maket, vật 0
liệu, thiết bị, máy móc)

5

Kết quả khác hoặc minh chứng áp dụng

đăng ký

0

20


Mẫu 04/ĐTCS
PHẦN IV. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ
Kinh

phí Kinh
phí
đƣợc duyệt
thực hiện
Ghi chú
(triệu đồng)
(triệu đồng)

STT

Nội dung chi

1

Xây dựng đề cương chi tiết

2

Thu thập và viết tổng quan tài liệu

3

Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập 13,06
số liệu, nghiên cứu...

13,06

4

Thuê trang thiết bị, mua vật tư, hóa chất

9,94

5

Hội thảo khoa học, viết báo cáo tổng 2,0
kết, nghiệm thu

2,0

6

Chi khác

1,25

1,25

Tổng số:

25

25

9,94

PHẦN V. KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu thử nghiệm phương pháp LAMP phát hiện gen độc tố eae của vi khuẩn E. coli ở
số lượng mẫu lớn hơn và trên các gen độc tố khác của vi khuẩn E. coli.
PHẦN VI. PHỤ LỤC

- Minh chứng sản phẩm khoa học.
- Minh chứng sản phẩm đào tạo.
- Bản photocopy của hợp đồng nghiên cứu khoa học, thuyết minh đề tài.
Hà Nội, ngày 6 tháng 12 năm 2018
ĐƠN VỊ CHỦ TRÌ THỰC HIỆN

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS. Phạm Thế Hải

TS. Phạm Thanh Hiền

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

21