SEMINAR xác ĐỊNH các gốc tự DO TRONG KHÓI THUỐC lá BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPCC QTOF MS kết hợp PHƯƠNG PHÁP bẫy gốc tự DO sắc ký HIỆN đại

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG

XÁC ĐỊNH CÁC GỐC TỰ DO
TRONG KHÓI THUỐC LÁ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPCC-QTOF-MS
KẾT HỢP PHƯƠNG PHÁP BẪY GỐC TỰ DO

1


NỘI DUNG
1. Giới thiệu chung
2. Thí nghiệm
2.1. Thuốc thử và mẫu
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.2. Thuốc lá
2.2. Trang thiết bị
2.3. Chuẩn bị mẫu
2.4. Ổn định gốc tự do
2.5. Điều kiện UPCC-QTOF-MS
2.6. Phân tích thống kê
2.7. Phân tích bẫy EPR-spin
2.8. Tính tốn lý thuyết

3. Kết quả và bàn luận
3.1. Cơ sở của nghiên cứu
3.2. Phân tích mẫu khói thuốc lá bằng bẫy EPR- spin
3.3. Phân tích mẫu thuốc lá bằng UPCC
3.4. Xác định các gốc tự do đánh dấu bằng OPLS-DA
3.5. Xác định các gốc tiềm năng bằng QTOF-MS
3.6. Mơ hình của các gốc tiềm năng bằng phần mềm

vi tính hóa
4. Kết luận


1. GIỚI THIỆU CHUNG

Nicotiana tabacum Solanaceae

3


1. GIỚI THIỆU CHUNG

>

+

+

6 triệu người/năm

Khói thuốc:
- Hơn 4 000 đến 7 500 chất
- Một số chất độc tính cao, có thể gây ung thư, dị tật bẩm sinh hoặc
bệnh tim mạch.

4


1.

GIỚI THIỆU CHUNG

Phân tích chính xác các gốc tự do trong khói thuốc lá sẽ là một cơng cụ để kiểm soát chất lượng và giảm tác hại của thuốc lá


1.

GIỚI THIỆU CHUNG

6


1. GIỚI THIỆU CHUNG

Tiến bộ của cơng nghệ phân tích:

-

Sử dụng phương pháp UPCC - QTOF - MS
Sử dụng phân tích thống kê đa biến trực giao kết hợp bình phương tối thiểu (OPLS-DA)
Sử dụng phần mềm vi tính hóa

Ưu điểm:

-

Tính chọn lọc, độ nhạy cao
Thời gian phân tích nhanh, độ phân giải cao
Tiết kiệm dung môi hữu cơ, bảo vệ môi trường do sử dụng CO2 siêu tới hạn

Xác định được cấu trúc cụ thể

7


2. THÍ NGHIỆM

2.1. TÁC NHÂN VÀ MẪU THỬ
Dung mơi – Hóa chất
Phenyl tert-butyl nitrone (PBN), Xyclohexan, Hexan, Benzen
4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidinooxy (TEMPOL)
Thuốc lá

Mua thuốc lá

Bảo quản

Tạo điều kiện tối ưu*

T°phòng: 3 tháng

Nhiệt: 22 ° C, ẩm tương đối 60%

≤ -16 °C: dài hạn

trong 2-10 ngày sau mở gói

*Theo ISO3402:1999

2. THÍ NGHIỆM

2.2. Trang thiết bị

Bộ phận phát hiện (A)

Cột sắc kí và điều áp (B)

Acquity UPCC

Bộ phận hội tụ (C)

(Waters, USA)

Bơm mẫu tự động (D)

Bơm dung môi nhị phân (E)


2. THÍ NGHIỆM
2.2. Trang thiết bị
Bộ phận phát hiện (A)
- Máy quang phổ khối Waters
Synapt G2 Q-TOF*
(Milford, MA, USA)
- Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF)
- Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole)

*Q-TOF: Quadrupole Time of flight

2. THÍ NGHIỆM
2.3. CHUẨN BỊ MẪU

ISO 3308:2000
(Mỗi 60s, máy đốt và tạo 35mL khói thuốc/2s với thơng khí đầu lọc khơng đổi).

-

Khói được lọc qua đầu lọc của nhà sản xuất trước khi qua dung dịch bắt giữ
PBN/hexan

Máy đốt thuốc lá RM20H
(Borgwaldt, Đức)

*Q-TOF: Quadrupole Time of flight


2. THÍ NGHIỆM

2.4. ỔN ĐỊNH GỐC TỰ DO

Dung dịch bắt giữ mẫu là 20 ml 0,02 mol/L PBN trong hexan


2. THÍ NGHIỆM
2.5. ĐIỀU KIỆN UPCC-QTOF-MS

UPCC
- Pha tĩnh: cột ACQUITY BEH (3.0x100 mm, 1.7 mm)

- Pha động gồm:
(A) CO2 siêu tới hạn
(B) Acetonitril/Isopropyl alcohol (50/50)
- Chương trình rửa giải theo gradient
- Dữ liệu được thu thập theo chế độ Ion hóa tia điện ESI (electrospray ionization) ion dương
- Phạm vi thu thập dữ liệu m/z là 50 - 600
- Nhiệt độ nguồn là 120 °C, nhiệt độ loại dung môi là 500 °C.


2. THÍ NGHIỆM
2.6. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

Dữ liệu thơ từ UPCC-QTOF-MS được phân tích bằng phương pháp OPLS-DA bằng phần mềm
MarkerLynx 4.1 (Waters, Milford, MA)
Dữ liệu thơ sau đó được xử lý để phát hiện peak, hiệu chỉnh thời gian lưu; mỗi peak được
biểu thị bằng giá trị m/z, thời gian lưu và diện tích peak trên các mẫu

14


2. THÍ NGHIỆM
2.7. Phân tích bẫy EPR-spin

- Phổ cộng hưởng thuận từ điện tử - electron paramagnetic resonance (EPR)* là một phương pháp để nghiên cứu
các chất thông qua các electron chưa ghép cặp của các gốc tự do
- Khi T1/2 của các gốc tự do quá ngắn để phát hiện với EPR, các bẫy spin (Spin Traps) được sử dụng để phản ứng với
các gốc tự do -> sản phẩm cộng ổn định hơn nên sẽ dễ phát hiện bằng phổ cộng hưởng thuận từ điện tử EPR (so với
phương pháp DPPH)

* />

15


2. THÍ NGHIỆM
2.7. PHÂN TÍCH BẪY EPR-SPIN

Máy quang phổ kế Bruker EMX 10 EPR

Tần số điều biến và microwave: 100 kHz và 9.516 GHz
Trường trung tâm (central field): 3510.051 G;
Phạm vi quét (sweep width): 100 G
Tần số (frequency) 9.8369 GHz
Hằng số thời gian (time constant) 40.96 ms
Thời gian chuyển đổi (conversion time): 163.84 ms
16


2. THÍ NGHIỆM
2.8. TÍNH TỐN LÝ THUYẾT

- Sử dụng tổ hợp hàm số (Hybrid functionals) phiên bản B3LYP và phần mềm Gaussian 09 tối ưu hóa cấu trúc
=> Xác định cấu trúc không gian

17


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Cơ sở của nghiên cứu (Concept of design)

ĐỐI TƯỢNG

YÊU CẦU

GIẢI PHÁP

ỔN ĐỊNH
HOẠT TÍNH

UPCC –
KHẢ NĂNG

QTOF – MS

TÁCH LỚN

và
PBN

TĂNG HIỆU QUẢ BẮT
GIỮ

18


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Cơ sở của nghiên cứu (Concept of design)

Khói thuốc

Hexan

Khói (smoke)

(cigarette smoke)

UPCC - QTOF - MS
Cấu trúc
của các gốc

Khói thuốc
(cigarette smoke)

PBN /hexan

Khói -PBN
(PBN-smoke)

PCA, OPLS-DA

tự do

Vi tính hóa

19


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Phân tích mẫu thuốc lá bằng bẫy EPR- spin

Kết quả phổ EPR thu được ghi nhận được rất ít

thơng tin

UPCC

20


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3. PHÂN TÍCH MẪU KHĨI THUỐC LÁ BẰNG UPCC

(B)

(A)

21


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. Xác định các gốc tiềm năng đánh dấu bằng OPLS-DA

OPLS-DA giúp phân loại các gốc tiềm năng do PBN bắt giữ
22


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.4. Xác định các gốc tiềm năng đánh dấu bằng OPLS-DA

Các TFP là các gốc carbon trung tâm

23

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.5. Xác định các gốc tiềm năng bằng QTOF-MS

TEMPOL: C9H20NO2
M= 172

TEMPOL

(a radial

UPCC –QTOF- MS

standard sample)

24


3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.5. Xác định các gốc tiềm năng bằng QTOF-MS

Kiểu ion hóa
[M + 2H]

+

25