SEMINAR định lượng các flavonol glycosid trong cây trà (camellia sinensis) bằng chế độ MRM của phương pháp UPLC QQQ MSMS _ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆN ĐẠI

Định lượng các flavonol glycosid trong cây trà (Camellia sinensis) bằng
chế độ MRM của phương pháp UPLC-QQQ-MS/MS*

1

Quantification of flavonol glycosides in Camellia sinensis by MRM mode of UPLC-QQQ-MS/MS.
Journal of Chromatography B


NỘI DUNG

Tổng quan

Nguyên liệu

Phương

Kết quả &

& Hóa chất

pháp

bàn luận

Kết luận

2

1. Tổng quan
1.1. Camellia sinensis

Catechin
Flavonol
Theaflavin
Thearubigins

3

/>

1. Tổng quan

1.2. Các flavonol glycosid trong Camellia sinensis






Quercetin,
Rutin,
Myricetin
…

4

/>T. Guardia, A.E. Rotelli, A.O. Juarez, L.E. Pelzer, Il Farmaco 56 (2001) 683–687.

C.H. Jung, J.Y. Lee, C.H. Cho, C.J. Kim, Arch. Pharmacal Res. 30 (2007)1599–1607.


1. Tổng quan

1.3. Các kỹ thuật phân tích

 Sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng
 Phổ khối
 1H và 13C-NMR
 HPLC, UPLC
 PDA, QQQ-MS/MS-MRM

5


2. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1. Nguyên liệu thực vật

 Chồi, lá thứ hai, lá thứ tư, lá trưởng thành, thân non, thân già và rễ của cây trà.
 Các giống cây của Duokangxiang, Baiye, Nong Khangzao, và Shuchazao

6


2. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2.2. Hóa chất

Nhà cung cấp

Hóa chất

Metanol, Acetonitril

Tedia Co, Ltd

Acid acetic (HPLC)
Chất chuẩn

Quercetin 3-O-glucosid

Sigma-Aldrich

Quercetin 3-O-galactosid
Kaempferol 3-O-glucosid
Kaempferol 3-O-galactosid
Myricetin 3-O-galactosid
Quercetin 3-O-rutinosid

7


2. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2.3. Thiết bị

Nhà cung cấp

HPLC-PDA

SHI-MAZDU

HPLC-ESI-ToF/MS-PDA

Agilent Technologies

UPLC-ESI-QQQ-MS/MS

Agilent Technologies

Cột HPLC

Phenomenex

Cột UPLC

Phenomenex
8


0.2 g mẫu/ nitơ lỏng

Nghiền

3. Phương pháp

Chiết 2 lần
Mẫu/ 2 ml (MetOH/HCl 99:1)

3.1. Chuẩn bị mẫu

Chiết, ly tâm

Phần bã

Phần dịch + nước (đồng lượng)

CHCl3, đồng lượng
Chiết, ly tâm

Phần nổi

EtOAc, đồng lượng
Chiết 2 lần
Cơ áp suất giảm
Lớp EtOAc

Cắn

1.
2.

Hịa tan/ MetOH
Pha lỗng 5 lần với nước

9
Mẫu phân tích


3. Phương pháp

3.2. Kỹ thuật
HPLC-ToF/MS










Nhiệt độ buồng cột: 250C,
Thể tích tiêm: 5 µl
Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
Pha động: Acid acetic 1% và acetonitril, gradient.
Thời gian phân tích: 55 phút
Đầu dị PDA (190nm đến 600nm).
Q trình ion hóa ESI ở chế độ ion hóa âm, điện áp ở mức 175V, m/z 100-800.
Tốc độ dịng khí khơ 12 l/phút, nhiệt độ 350 0C, áp suất 45 psi và điện áp mao quản
3500V.

10


3. Phương pháp
3.2. Kỹ thuật
HPLC-ToF/MS

11

3. Phương pháp
3.2. Kỹ thuật
UPLC-QQQ-MS/MS (chế độ MRM-QQQ)










Nhiệt độ buồng cột: 40oC,
Thể tích tiêm: 3 µl,
Tốc độ dịng: 0,4 ml/phút.
Pha động: Acid acetic 1% và acetonitril, gradient.
Thời gian phân tích: 20 phút
Đầu dị UV ở bước sóng 350nm.
Q trình ion hóa ESI ở chế độ ion hóa âm, m/z 100-800.
Tốc độ dịng khí khơ là 6 l/phút, nhiệt độ 350 0C, áp suất 45 psi và điện áp mao quản
3500V.

12


3. Phương pháp
3.2. Kỹ thuật

UPLC-QQQ-MS/MS (chế độ ghi phổ MRM-QQQ)

13

/>

3. Phương pháp
3.3. Tối ưu hóa điều kiện MS

 Điện áp phân mảnh
 Năng lượng va chạm

14


3. Phương pháp

3.4. Thẩm định phương pháp







Độ chính xác
Độ chính xác trung gian
Độ phục hồi
LOD và LOQ
Tính tuyến tính

15


4. Kết quả và bàn luận
4.1. Xác định flavonol glycosid bằng kỹ thuật HPLC-ToF/MS

16


4. Kết quả và bàn luận
4.2. Phương pháp định lượng
flavonol glycosid bằng chế độ
MRM của kỹ thuật UPLC-QQQMS/MS

17


4. Kết quả và bàn luận
4.2. Phương pháp định lượng flavonol glycosid bằng chế độ MRM của kỹ thuật UPLC-QQQMS/MS
Thẩm định phương pháp

18


4. Kết quả và bàn luận
4.2. Phương pháp định lượng flavonol glycosid bằng chế độ MRM của kỹ thuật UPLC-QQQMS/MS
Thẩm định phương pháp

19

4. Kết quả và bàn luận
4.3. Định lượng 6 flavonol glycosid trong 4 giống Camellia sinensis

20


5. Kết luận

 Chế độ MRM của UPLC-QQQ-MS / MS có độ tái lặp, độ nhạy và độ ổn định tốt. Tiết
kiệm thời gian phân tích so với phương pháp HPLC-ToF/MS.

 Kết quả:
- Flavonol glycosid có nhiều ở lá non và ít hơn trong chồi, lá trưởng thành và thân
- Myricetin 3-O-galactosid là thành phần chính trong 6 flavonol glycosid được định lượng.

21


CÁM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI

22