Định loại các loài cá bơn phổ biến tại khánh hòa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa loài

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐỊNH LOẠI CÁC LỒI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HỊA
DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ ƯỚC TÍNH
THỜI GIAN PHÂN HĨA LỒI

Giảng viên hướng dẫn:
Sinh viên thực hiện:
Mã số sinh viên:

TS. Đặng Thúy Bình
Phạm Thiên Phú
56131191

Khánh Hịa − 2018


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐỊNH LOẠI CÁC LỒI CÁ BƠN PHỔ BIẾN TẠI KHÁNH HỊA
DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, DI TRUYỀN VÀ ƯỚC TÍNH
THỜI GIAN PHÂN HĨA LỒI

GVHD: TS. Đặng Thúy Bình
SVTH: Phạm Thiên Phú
MSSV: 56131191

Khánh Hòa, tháng 7 năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả của đề tài: “Định loại các loài cá bơn phổ biến tại
Khánh Hịa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa
lồi” là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ
cơng trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này.
Nha Trang, ngày 19 tháng 7 năm 2018
Sinh viên

Phạm Thiên Phú

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang, em xin
chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ giáo,
đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã
truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong các năm học vừa qua.
Với tình cảm chân thành và lịng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến TS.
Đặng Thúy Bình (Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường) đã định hướng và tận tình
hướng dẫn cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến NCS. Vũ Đặng Hạ Quyên, ThS. Trương
Thị Oanh và ThS. Trần Quang Sáng (Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường) và ThS.

Đồn Vũ Thịnh (Khoa Công Nghệ Thông Tin) đã động viên và dìu dắt em trong suốt
quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài và viết luận văn tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị
trên phịng thí nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm, giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt
thời gian thực hiện để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Mặc dù, em đã rất cố gắng để hoàn thiện đồ án nhưng do thời gian và kiến thức
còn hạn chế, nên trong q trình thực hiện đồ án khơng thể nào tránh khỏi những thiếu
sót. Em rất mong nhận được những đóng góp ý kiến q báu của thầy, cơ giáo để đồ án
được hoàn thiện hơn.Em xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 19 tháng 7 năm 2018
Sinh viên

Phạm Thiên Phú

ii


TĨM TẮT
Thành phần các lồi cá bơn ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng. Đây là lồi cá
có giá trị thương phẩm và được sử dụng làm thực phẩm phổ biến của người dân ven
biển. Bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ở Việt Nam được ghi nhận có tới 97 lồi, thuộc 33
giống, 7 họ. Vùng biển Khánh Hịa là nơi có mật độ cá bơn tập trung cao. Tuy nhiên
trong những năm vừa qua, nghề khai thác thủy sản ven bờ tỉnh Khánh Hòa phát triển
quá mức cùng với lượng chất thải độc hại gia tăng đã làm suy giảm nghiêm trọng nguồn
lợi này. Mặt khác, chưa có các nghiên cứu di truyền đi sâu vào khảo sát mối quan hệ
phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các lồi thuộc bộ cá bơn
(Pleuronectiformes) tại khu vực này. Chính vì vậy, nghiên cứu hiện tại tiến hành định
loại một số loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hịa dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền
(sử dụng gen CO1 mtDNA). Nghiên cứu đã ghi nhận được 16 loài thuộc 10 giống, 4 họ.
Cây phát sinh loài cho thấy sự đồng dạng của các loài cá nghiên cứu ở mức giống, tuy

nhiên, ở mức độ họ, họ cá bơn vỉ (Bothidae) được sắp xếp với các loài thuộc họ cá bơn
sọc (Soleidae) và họ cá bơn cát (Paralichthyidae). Thời gian phân hóa của bộ cá bơn khi
so sánh với dẫn liệu hóa thạch ước tính cách đây khoảng 72,58 triệu năm về trước (Ma),
thuộc kỷ Cretaceous, thế Upper Cretaceous, tầng Campanian. Thời gian phân hóa của
các lồi cá bơn có thể liên quan đến sự hình thành các đặc điểm phân loại (vây ngực,
xương trước nắp mang, sự hình thành mắt).
Các dữ liệu trong nghiên cứu có thể được sử dụng cho những nghiên cứu về đa
dạng sinh học, các nghiên cứu chuyên sâu về q trình tiến hóa và trong cơng tác bảo
tồn các lồi cá tầng đáy nói chung cũng như cá bơn nói riêng.

iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii
TÓM TẮT .................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ................................................................................................................... ivs
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... viii
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................4
1.1. Tổng quan về vùng nghiên cứu.......................................................................... 4
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu (bộ cá bơn – Pleuronectiformes) ............. 5
1.2.1. Giới thiệu về bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ................................................5
1.2.2. Tình hình nghiên cứu hình thái bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ngồi nước
và trong nước...........................................................................................................7
1.2.3. Tình hình nghiên cứu di truyền bộ cá bơn .....................................................8
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu............................................................. 11

1.3.1. Tổng quan về hệ gen ty thể ........................................................................ 11s
1.3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài ....13
1.3.3. Giới thiệu về ước tính thời gian phân hóa lồi (divergence time) và phương
pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock) ..............................................14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................16
2.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................... 16
2.2. Thu thập và định loại các loài cá bơn phổ biến tại Khánh Hịa dựa trên đặc điểm
hình thái .................................................................................................................... 17
2.2.1. Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu ............................................17
2.2.2. Định loại các loài cá bơn phổ biến dựa vào đặc điểm hình thái.................17
2.3. Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn phổ biến
tại vùng biển Khánh Hòa .......................................................................................... 18
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ...............................................................................18
2.3.2. Kiểm tra DNA tổng số ..................................................................................18
2.3.3. Khuếch đại đoạn gen CO1 mtDNA bằng phản ứng PCR ............................19
iv


2.3.4. Giải trình tự gen CO1 mtDNA .....................................................................20
2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa lồi (divergence
time) của cá bơn ....................................................................................................... 20
2.4.1. Xây dựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá bơn phổ biến tại Khánh
Hịa sử dụng trình tự gen CO1 mtDNA .................................................................20
2.4.2. Ước tính thời gian phân hóa (divergence time) của các loài cá bơn ..........22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................24
3.1. Thu thập và định loại các lồi cá bơn phổ biến tại Khánh Hịa dựa trên đặc điểm
hình thái .................................................................................................................... 24
3.2. Đặc điểm hình thái các loài thuộc bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thu tại Khánh
Hịa............................................................................................................................ 25
3.3. Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn phổ biến

tại vùng biển Khánh Hòa .......................................................................................... 32
3.3.1. Tách chiết DNA tổng số ...............................................................................32
3.3.2. Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen CO1 mtDNA một số loài cá bơn..........32
3.3.3. So sánh sự tương đồng trình tự với Genbank ..............................................33
3.3.4. So sánh sự khác biệt về trình tự gen CO1 mtDNA giữa 16 lồi cá bơn phổ
biến ở Khánh Hòa..................................................................................................36
3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cá bơn........................................................ 38
3.5. Ước tính thời gian phân hóa của các lồi cá bơn .............................................. 42
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................49
4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 49
4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................50
PHỤ LỤC .....................................................................................................................59

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ hành chính khu vực tỉnh Khánh Hịa ..................................................4
Hình 1.2. Q trình biến đổi mắt của cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) ...........6
Hình 1.3. DNA ty thể loài cá Bơn Mắt Lệch (Crossorhombus azureus) bao gồm 37 gen
mã hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA và 13 vùng mã hóa protein (Shi và cs, 2013).
.......................................................................................................................................12
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu ....................................................................16
Hình 2.2. Một số đặc điểm hình thái dùng trong định loại cá bơn ................................17
Hình 2.3. Các chỉ số đếm trong phân loại cá bơn (Carpenter và Niem, 2001) .............18
Hình 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi FishF1 - FishR1 ..........20
Hình 3.1. Tỷ lệ (%) các giống, lồi trong thành phần bộ cá bơn thu tại Khánh Hòa ....25
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CO1 mtDNA mẫu cá bơn .............32
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại từ phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình tiến

hóa GTR+G+I) dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của các lồi cá bơn phổ biến tại
Khánh Hịa. ....................................................................................................................38
Hình 3.4. Cây ước tính thời gian phân hóa các lồi cá bơn dựa trên trình tự gen CO1
mtDNA ..........................................................................................................................43
Hình 3.5. Đặc điểm khơng có vây ngực của họ cá bơn lưỡi bị (Cynoglossidae) .........44
Hình 3.6. Sự xuất hiện của vây ngực trên các giống thuộc họ cá bơn sọc (Soleidae) ..45
Hình 3.7. Đặc điểm khơng có xương trước nắp mang của họ cá bơn sọc (Soleidae) và
họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) ................................................................................46
Hình 3.8. Đặc điểm mắt của các lồi thuộc họ cá bơn mơi vỉ (Bothidae).....................46
Hình 3.9. Đặc điểm giống cá bơn khoang (Zebrias) và cá bơn lưỡi trâu (Brachirus) ..47
Hình 3.10. Đặc điểm giống cá bơn vảy trịn (Liachirus) và cá bơn hoa (Pardachirus)48

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................19
Bảng 2.2. Trình tự gen CO1 mtDNA các lồi cá bơn sử dụng trong xây dựng cây phát
sinh chủng loại ...............................................................................................................21
Bảng 3.1. Danh sách các loài cá bơn thu tại Khánh Hịa, Việt Nam.............................24
Bảng 3.2. Chỉ tiêu hình thái các lồi cá bơn phổ biến ở Khánh Hòa ............................31
Bảng 3.3. Kết quả độ tương đồng của các trình tự CO1 mtDNA từ 16 lồi cá bơn thu tại
Khánh Hịa với dữ liệu từ Genbank...............................................................................33
Bảng 3.4 Sự khác biệt về trình tự CO1 mtDNA của 16 loài cá bơn phổ biến ở Khánh
Hòa.................................................................................................................................37

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

μL

Microliter

μM

Micromol

bp

Base pairs

BT

Bootstrap

cs

Cộng sự

CO1

Cytochrome c oxidase subunit 1

Cyt b

Cytochrome b

DNA

Deoxyribonucleic acid

GB
mt DNA

Ký hiệu cho các loài từ Genbank
Mitochondrial deoxyribonucleic acid

ND1

NADH dehydrogenase, subunit 1

PCR

Polymerase Chain Reaction

Rag 1

Recombinase Activating Gene 1

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

Ma

Million years ago − triệu năm về trước

RH

Rhodopsin

RAG1

Recombination Activating Gene 1

RAG2

Recombination Activating Gene 2

E1
E2B
E3
MLL

Early Growth Response Protein genes 1
Early Growth Response Protein genes 2B
Early Growth Response Protein genes 3
Mixed-lineage Leukemia
viii


MỞ ĐẦU
Nguồn lợi cá tầng đáy tại vùng biển Việt Nam đa dạng và phong phú với tiềm năng
lớn, chiếm vai trị quan trọng trong các lồi hải sản nước ta (Bùi Đình Chung và cs,
2001). Cá bơn (Pleuronectiformes) là nhóm cá trải qua q trình biến đổi trong vịng đời

của chúng với cơ thể bất đối xứng đặc trưng nhằm thích nghi với lối sống ở tầng đáy
(Robin và cs, 2015). Tính tới năm 2016, trên thế giới đã phát hiện được 772 loài cá bơn
thuộc 129 giống và 14 họ khác nhau. Theo thống kê của Voronina và cs (2016), bộ cá
bơn tại biển Việt Nam đa dạng về thành phần loài và phân bố tại nhiều khu vực khác
nhau với 97 loài, 33 giống thuộc 7 họ.
Cá bơn là lồi có giá trị thương phẩm và được sử dụng làm thực phẩm phổ biến
của người dân ven biển (Lê Quang Dũng, 2013). Các loài cá bơn nhỏ khơng đánh bắt và
bn bán tại vùng biển phía bắc Australia lại có giá trị kinh tế ở thị trường của hầu hết
các nước Đơng Nam Á, trong đó có Việt Nam (Robin và cs, 2015). Tuy nhiên trong
những năm vừa qua, nghề khai thác thủy sản ven bờ phát triển quá mức đã làm suy giảm
nghiêm trọng nguồn lợi cá tầng đáy (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2016). Các chất thải
độc hại từ các nhà máy, xí nghiệp chưa qua xử lí thải trực tiếp ra biển, các sự cố tràn
dầu,…đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nước biển, gây ô nhiễm đáy biển do
lắng đọng các kim loại nặng, hóa chất độc hại. Điều kiện mơi trường nước thay đổi sẽ
ảnh hưởng đến sự phân bố của các thủy sinh vật và nhóm động vật đáy (Dương Trí Dũng
và cs, 2007).
Đã có những nghiên cứu về di truyền ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại,
xây dựng cây phát sinh loài ở Việt Nam như nghiên cứu của Huỳnh Thị Hậu (2016) sử
dụng trình tự gen CO1 mtDNA trên đối tượng cá nước ngọt thuộc khu vực Duyên hải
Nam Trung Bộ và Tây Nguyên, nghiên cứu của Đinh Thị Phượng (2015) sử dụng trình
tự gen 16S rRNA trên đối tượng cá tầng đáy tại Phú n và Khánh Hịa. Ngồi ra, cũng
đã có những nghiên cứu về di truyền trên đối tượng cá bơn ứng dụng các chỉ thị phân tử
(16S rRNA, CO1 mtDNA, cyt b, RAG2, ND1, RAG1, RH, E1, E2B, E3, MLL) trên thế
giới (Exadactylos và Thorpe, 2001; Pardo và cs, 2005; Kartavtsev và cs, 2008; Sharina
và Kartavtsev, 2010; Roje, 2010; Campbell và cs, 2013; Campbell và cs, 2014; Betancur
và Ortí, 2014). Tuy nhiên, mới chỉ có nghiên cứu của Campbell và cs (2013) về ước tính
thời gian phân hóa lồi trên cá bơn sử dụng các chỉ thị phân tử.
1

Nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học các loài cá bơn (Pleuronectiformes) ở Việt
Nam đã được tiến hành với phương pháp phân loại truyền thống là dựa trên đặc điểm
hình thái (Nguyễn Hữu Phụng, 1999; Đinh Thị Phương Anh và Phan Thị Hoa, 2010;
Trần Đắc Định và cs, 2013; Voronina và cs, 2016). Tại Khánh Hòa, các nghiên cứu đa
dạng sinh học các lồi cá tầng đáy nói chung và cá bơn nói riêng đã được thực hiện bởi
Trần Văn Phước (2011), Trần Thị Hồng Hoa (2014), Đinh Thị Phượng (2016). Tuy
nhiên, đặc điểm hình thái dưới tác động của mơi trường và biến dị cá thể có thể gây
nhầm lẫn trong công tác phân loại. Mặt khác, các nghiên cứu trên chỉ mang tính thống
kê về số lượng, thành phần các loài mà chưa đi sâu vào nghiên cứu khảo sát mối quan
hệ phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các lồi thuộc bộ cá bơn
(Pleuronectiformes).
Do đó, nhận thấy việc định danh, phân loại, thu thập bổ sung dữ liệu di truyền và
tiến hóa về đối tượng cá bơn là cần thiết, đề tài “Định loại các loài cá bơn phổ biến tại
Khánh Hịa dựa trên đặc điểm hình thái, di truyền và ước tính thời gian phân hóa
lồi” được thực hiện nhằm cung cấp dẫn liệu về hình thái, di truyền và bước đầu khảo
sát về thời gian phân hóa của một số lồi cá bơn ở địa bàn tỉnh Khánh Hịa. Đây là những
dẫn liệu đầu vào làm cơ sở cho các nghiên cứu đa dạng sinh học, công tác bảo tồn, đánh
giá nguồn lợi hải sản cũng như cho các nghiên cứu chun sâu hơn về q trình tiến hóa
của bộ cá bơn (Pleuronectiformes).
 Mục tiêu của đề tài
Mô tả đặc điểm hình thái, khảo sát sự đa dạng thành phần loài, mối quan hệ phát
sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa của các lồi cá bơn phổ biến ở tỉnh Khánh
Hịa dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA.
 Nội dung nghiên cứu
− Thu thập và định loại các lồi cá bơn phổ biến tại Khánh Hịa dựa trên đặc điểm
hình thái.
− Khuếch đại và giải trình tự đoạn gen CO1 của DNA ty thể một số lồi cá bơn
phổ biến tại vùng biển Khánh Hịa.
− Xây dựng cây phát sinh chủng loại và ước tính thời gian phân hóa lồi
(divergence time) của cá bơn.

2


 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu cung cấp dữ liệu về đặc điểm hình thái, di truyền và bước đầu ước tính
thời gian phân hóa lồi dựa trên trình tự gen CO1 mtDNA của một số lồi cá bơn phổ
biến ở tỉnh Khánh Hịa. Các dữ liệu có thể được sử dụng cho những nghiên cứu về đa
dạng sinh học, các nghiên cứu chuyên sâu về q trình tiến hóa và trong cơng tác bảo
tồn các lồi cá tầng đáy nói chung cũng như cá bơn nói riêng.

3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu
Khánh Hòa là một tỉnh thuộc khu vực duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, có hình
dạng thon hai đầu và phình ra ở giữa, phía Bắc giáp tỉnh Phú n, phía Nam giáp tỉnh
Ninh Thuận, phía Tây giáp tỉnh Đắc Lắc, phía Đơng giáp Biển Đơng, với tổng diện tích
5197 km² (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006) (Hình 1.1). Diện tích vùng biển của Khánh
Hịa rộng gấp nhiều lần đất liền với đường bờ biển kéo dài 385 km từ xã Đại Lãnh tới
cuối vịnh Cam Ranh (Nguyễn Thế Biên và cs, 2006).

Hình 1.1. Bản đồ hành chính khu vực tỉnh Khánh Hịa
(Nguồn: khanhvinh.khanhhoa.gov.vn, có chỉnh sửa)
Thềm lục địa Khánh Hòa rất hẹp, các đường đẳng sâu 50 m, 100 m và 200 m chạy
gần song song và sát gần bờ (Trịnh Thị Minh Trang và cs, 2015), sườn lục địa khá dốc.
Trầm tích tầng mặt chủ yếu là các hạt mịn bao gồm bùn và bùn cát, các vùng diện tích
nhỏ hẹp với thành phần sét cát là chủ yếu (Trần Anh Tuấn và Nguyễn Thế Tiệp, 2015).
Trên địa bàn Khánh Hịa có 7 bán đảo lớn, khoảng 200 hịn đảo lớn nhỏ ven bờ và các

đảo san hơ trong quần đảo Trường Sa tạo thành nhiều đầm, vịnh kín gió tạo điều kiện
4


cho các đàn cá di cư đến sinh sản (Nguyễn Tuấn, 2007). Các điều kiện về địa hình này
góp phần tạo nên sự đặc trưng về địa mạo, trầm tích, dưới tác động của các yếu tố thủy
động lực làm cho Khánh Hòa trở nên đa dạng và phong phú về nguồn lợi cá đáy nói
riêng và nguồn lợi thủy sản nói chung.
Khánh Hịa nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa. Nhiệt độ trung bình năm
của khu vực là 26,5oC; cao nhất vào tháng 6 đến tháng 8. Độ ẩm trung bình khoảng
80,5%. Khí hậu chia thành hai mùa rõ rệt: mùa mưa ngắn, từ khoảng tháng 9 – 12, lượng
mưa chiếm khoảng 80% tổng lượng mưa cả năm; mùa khô từ tháng 1 đến tháng 8
(Nguyễn Hữu Hồ và cs, 2003).
Tốc độ dòng chảy vùng biển Khánh Hòa khá lớn trong cả mùa hè và mùa đơng, có
thể đạt đến 100 cm/s. Mùa đơng, dịng chảy theo hướng bắc – nam. Vào mùa hè, khu
vực này chịu ảnh hưởng của gió mùa Tây Nam nên hướng dịng chảy chủ yếu theo
hướng bắc – đơng bắc (Nguyễn Mạnh Hùng, 2014). Chính các dịng hải lưu này tạo ra
các dịng hải lưu hội tụ (hiện tượng chìm xuống của một hoặc hai khối nước) mang theo
các sinh vật phù du và các sinh vật khác sống ở độ sâu khác nhau.

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu (bộ cá bơn – Pleuronectiformes)
1.2.1. Giới thiệu về bộ cá bơn (Pleuronectiformes)
Bộ cá bơn (Pleuronectiformes) thuộc lớp cá vây tia, gồm 772 loài thuộc 129 giống
và 14 họ (Nelson và cs, 2016). Bộ này gồm 2 phân bộ: (1) phân bộ cá ngộ (Psettodoidei)
chỉ chứa duy nhất 1 họ cá bơn ngộ (Psettodidae) gồm 3 loài. (2) Phân bộ cá bơn vĩ
(Pleuronectoidei) chiếm số lượng loài lớn, gồm 13 họ còn lại trong bộ cá bơn (Robin và
cs, 2015). Các họ có thành phần lồi đa dạng nhất của bộ cá bơn đều thuộc phân bộ cá
bơn vĩ: họ cá bơn sọc (Soleidae), họ cá bơn lưỡi bò (Cynoglossidae) và họ cá bơn vỉ
(Bothidae) (Robin và cs, 2015; Nelson và cs, 2016). Dựa trên kết quả phân tích hóa
thạch xương ốc tai cho thấy những loài đầu tiên thuộc bộ cá bơn có thể xuất hiện trong

khoảng từ cuối kỷ Paleocene tới đầu kỷ Eocene, khoảng 53 – 57 triệu năm về trước
(Campbell và cs, 2013).
Các loài thuộc bộ cá bơn khi trưởng thành có hai mặt bên khơng đối xứng với hai
mắt cùng nằm về một bên phải hoặc trái của đầu, có thể nhơ cao lên để quan sát, trong
khi ấu trùng cá bơn có cơ thể đối xứng với hai mắt nằm về hai bên của đầu. Quá trình
phát triển từ ấu trùng thành cá trưởng thành làm biến đổi cấu trúc xương sọ, sắp xếp lại
5


các dây thần kinh, kết quả làm di chuyển một mắt từ mặt bên này sang mặt còn lại của
đầu, màu sắc thân trở nên khác biệt giữa hai mặt (Robin và cs, 2015; Nelson và cs,
2016). Cá bơn có thân dẹp bên, vây lưng và vây hậu môn của các loài thuộc bộ cá bơn
kéo dài. Các loài trong bộ này thường có 6 – 7 nhánh xương nắp mang (branchiostegal
ray), rất ít trường hợp có 8 nhánh (Nelson và cs, 2016).

Hình 1.2. Quá trình biến đổi mắt của cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus)
(Nguồn: Okada và cs (2003) có hiệu chỉnh)

A - Giai đoạn ấu trùng, chưa bắt đầu di chuyển mắt; B → E - Quá trình di
chuyển của mắt từ bên trái sang bên phải của đầu; F - Cá trưởng thành.
Các loài thuộc bộ cá bơn phân bố trên nhiều loại địa hình đáy: bùn, cát, thềm đáy
nhiều đá, sỏi. Bộ cá bơn được tìm thấy ở nhiều môi trường sống: nước mặn, nước lợ và
nước ngọt, với vùng phân bố trải dài từ phía nam Bắc Băng Dương tới Nam Cực, ở các
độ sâu khác nhau từ vùng nước nông, trong các bãi rạn, vùng ven cửa sông tới vùng
thềm lục địa. Các vùng biển có khí hậu nhiệt đới là nơi đa dạng về thành phần loài cá
bơn nhất (Robin và cs, 2015).
Từ quan sát tại các hệ sinh thái trên khắp thế giới cho thấy rằng cá bơn chủ yếu
săn hai loại thức ăn chính: họ giun nhiều tơ và những động vật giáp xác nhỏ vùng đáy,
những con cá bơn có miệng rộng hơn thì ăn gần như tồn bộ các loài cá và mực. Một số
loài khác là thức ăn cho cá bơn nhưng ít phổ biến như các lồi hai mảnh vỏ, động vật da

gai, lớp giun ít tơ, ấu trùng của cơn trùng,… Chúng là lồi săn mồi đóng vai trị quan
trọng trong hệ sinh thái vùng đáy. Nhìn chung, các yếu tố quyết định tới chế độ ăn của
cá bơn là đặc điểm hình thái, tập tính sinh học và những con mồi có sẵn trong mơi trường
xung quanh chúng (Robin và cs, 2015) .

6


1.2.2. Tình hình nghiên cứu hình thái bộ cá bơn (Pleuronectiformes) ngoài nước
và trong nước
 Ngoài nước
Dagang và cs (1992) đã nhận diện được 14 loài cá bơn thuộc 12 giống tại vùng
nước ven biển Hoàng Hải, Trung Quốc dựa trên đặc điểm hình thái. Nghiên cứu đã tóm
tắt các đặc điểm sinh học của bộ cá bơn tại vùng biển này gồm: thành phần loài, tuổi, sự
trưởng thành của tuyến sinh dục, thức ăn, sự phát triển, sự phân bố và di cư dựa trên
phân tích về kích thước cơ thể, tuyến sinh dục, dạ dày và xương ốc tai của các mẫu cá.
Manickchand (1994) nghiên cứu thành phần loài và mức độ đa dạng của cá bơn tại
vùng thềm lục địa Nam Mỹ, kéo dài từ Suriname tới Colombia. Phân tích đặc điểm hình
thái đã nhận diện được 41 loài cá bơn thuộc 18 giống và 4 họ. Kết quả nghiên cứu cho
thấy mật độ cá bơn tại vùng nghiên cứu thấp hơn rõ rệt so với các vùng có khí hậu ấm
áp hơn.
Nghiên cứu về mối liên hệ giữa sự phân bố của các loài thuộc bộ cá bơn với địa
hình đáy của Amezcua và Nash (2001) tại vùng biển phía bắc của Ireland đã định danh
được 15 loài cá bơn. Qua khảo sát các nhân tố về điều kiện môi trường, chỉ số dự trữ
năng lượng (HIS) cùng với các yếu tố về mùa vụ và địa hình đáy, nghiên cứu xác định
được mối liên hệ giữa sự đa dạng của cá bơn thuộc vùng biển bắc Irish với các yếu tố
về mùa vụ và đặc điểm địa hình đáy.
Kumar và Deepthi (2009) thu thập mẫu cá bơn bằng tàu lưới rà tại vùng duyên hải
Kerala của Ấn Độ và phân loại dựa trên hình thái. Kết quả đã xác định được 34 loài,
thuộc 17 giống và 4 họ. Đáng chú ý, loài Laeops natalensis (Norman, 1931) lần đầu tiên

được tìm thấy tại vùng duyên hải của Ấn Độ. Ngoài ra, loài Aseraggodes umbratilis
(Alcock, 1894) cũng được tìm thấy kể từ sau các báo cáo về loài này của Alcock vào
năm 1894 và 1899.
 Trong nước
Ở Việt Nam, mới chỉ có những nghiên cứu về lồi cá bơn dựa trên đặc điểm hình
thái. Năm 1999, Nguyễn Hữu Phụng đã thống kê có 82 lồi, nằm trong 33 giống, 6 họ
thuộc bộ cá bơn được tìm thấy tại vùng biển trong nước. Nghiên cứu sự đa dạng trong
thành phần loài của Voronina và cs (2016) tại vùng biển Việt Nam tìm được 47 lồi,
thuộc 28 giống cá bơn, thuộc 6 họ. Kết quả của nghiên cứu này đã bổ sung thêm 15 loài
7


cá bơn mới vào danh sách 82 loài đã biết trước đây, bao gồm: Arnoglossus macrolophus,
Chascanopsetta lugubris, Engyprosopon maldivensis, Kamoharaia megastoma (thuộc
họ Bothidae), Samariscus filipectoralis, Samariscus luzonensis (thuộc họ Samaridae),
Aseraggodes dubius, Zebrias crossolepis, Zebrias lucapensis (thuộc họ Soleidae),
Cynoglossus kopsi, Cynoglossus quadrilineatus, Paraplagusia japonica, Symphurus
microrhynchus (thuộc họ Cynoglossidae). Đặc biệt, hai loài Pseudorhombus oculocirris
và Soleichthys tubiferus lần đầu tiên được báo cáo tìm thấy tại vùng biển Đơng. Mặc dù
có sự khác biệt về khí hậu và thủy văn nhưng thành phần loài cá bơn giữa vùng biển
miền bắc và miền nam Việt Nam thể hiện sự tương đồng.
Ở Nam Bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng, Đinh Thị Phương Anh và Phan Thị Hoa (2010)
xác định được 164 loài cá thuộc 111 giống, 65 họ thuộc cá tầng đáy bằng hình thái.
Trong đó bộ cá bơn (Pleuronectiformes) có 4 lồi thuộc 3 họ khác nhau, chiếm 1,83%
tổng số loài đã phát hiện được. Đa dạng thành phần loài ở khu vực nghiên cứu thấp hơn
một số khu hệ khác ở khu vực miền Trung, cụ thể số lượng loài tại đây bằng 62,36%
vùng ven biển Khánh Hòa.
Trần Văn Phước (2011) đã xác định thành phần loài thủy sản khai thác bằng nị
sáo tại thơn Tân Đảo, đầm Nha Phu, tỉnh Khánh Hịa, sử dụng phương pháp so sánh về
hình thái. Kết quả phát hiện được 63 lồi thủy sản, trong đó có 2 lồi thuộc bộ cá bơn,

nằm trong họ cá bơn sọc (Soleidae) chỉ chiếm 3,17% cấu trúc thành phần loài tại vùng
nghiên cứu. Kết quả cho thấy sản lượng khai thác thủy sản thấp, chủ yếu là các loài giáp
xác chiếm hơn 50% tổng lượng thủy sản đánh bắt được.
Trần Thị Hồng Hoa và cs (2014) nghiên cứu về tính đa dạng lồi và nguồn lợi cá
khai thác tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa. Kết quả đã xác định được 351 loài cá
thuộc 19 bộ, 100 họ và 215 giống, chủ yếu là nhóm cá đáy ven bờ và nhóm cá rạn san
hơ (283 lồi, chiếm 80,63%). Trong đó, đã xác định được 22 lồi thuộc bộ cá bơn, thuộc
15 giống, nằm trong 6 họ. Nghiên cứu này góp phần cung cấp dữ liệu về thành phần
nguồn lợi cá khai thác, đồng thời làm rõ đặc điểm các nghề, mùa vụ khai thác.

1.2.3

Tình hình nghiên cứu di truyền bộ cá bơn
Nghiên cứu của Campbell và cs (2014) lần đầu sử dụng trình tự hệ gen ty thể để

phân tích mối quan hệ di truyền giữa các lồi thuộc bộ cá bơn. Nhóm nghiên cứu đã
dóng hàng, phân tích sử dụng trình tự hệ gen ty thể của 39 loài thuộc bộ cá bơn và 66
8


loài cá khác. Kết quả của nghiên cứu cho thấy các lồi cá bơn khơng thể hiện tính đồng
dạng ở mức độ bộ (Order). Ngoài ra, các loài thuộc phân bộ cá bơn ngộ (Psettodoidei)
không thể hiện sự gần gũi về mặt di truyền với các loài khác thuộc bộ cá bơn.
Để kiểm tra giả thuyết về tính đồng dạng của bộ cá bơn (Pleuronectiformes),
Campbell và cs (2013) phân tích trên 6 vùng gen nhân RAG1, RH, E1, E2B, E3, và
MLL từ 25 lồi cá bơn, 15 lồi thuộc nhóm Carangimorpha và 48 loài thuộc bộ cá vược
(Perciformes), sử dụng 2 lồi thuộc bộ Beryciformes làm nhóm ngoại. Kết quả phân tích
cho thấy bộ cá bơn khơng đồng dạng do các loài thuộc giống Psettodes thuộc một nhánh
khác trên cây tiến hóa. Ước tính thời gian phân hóa lồi dựa trên thuật tốn Bayesian
kết hợp với dữ liệu hóa thạch suy ra được phân bộ cá bơn vỉ (Pleuronectoidei) đã có từ

73 triệu năm trước, trong khi thời gian phân hóa của các lồi thuộc giống Psettodes
(được cho là tổ tiên của phân bộ cá bơn vỉ) là từ 77 triệu năm về trước.
Trong một nghiên cứu khác, Pardo và cs (2005) đã xây dựng mối quan hệ phát
sinh loài của 30 loài cá bơn thuộc 7 họ thu được phần lớn từ vùng bờ biển Galician (Tây
Ban Nha) và Brazil dựa trên một phần trình tự của đoạn gen 16S thuộc DNA ty thể. Kết
quả cho thấy các loài thuộc các họ: Soleidae, Scophthalmidae, Achiridae, Pleuronectidae
và Bothidae đều nằm trên một nhánh đồng dạng (monophyly), riêng các loài thuộc họ
Paralichthyidae nằm trên hai nhánh khác nhau, một trong số hai nhánh này có liên hệ
với họ Pleuronectidae. Kết quả của nghiên cứu góp phần củng cố thêm cho giả thuyết
rằng các loài thuộc bộ cá bơn hiện nay đều có nguồn gốc từ một tổ tiên chung.
Roje (2010) đưa ra giả thuyết về mối liên hệ giữa các loài cá bơn thuộc họ
Pleuronectidae dựa trên phân tích di truyền của 30 loài cá thuộc 22 giống, sử dụng 2 lồi
thuộc họ Paralichthyidae làm nhóm ngoại trong xây dựng cây phát sinh lồi, kết hợp với
phân tích đặc điểm hình thái ấu trùng thuộc họ cá này. Đối với phân tích mối liên hệ di
truyền giữa các lồi thuộc họ Pleuronectidae, sử dụng thuật toán Bayesian và Maximum
Like-lihood để phân tích trình tự gen RAG2 của nhân, gen ND1 và 16S của ty thể. Phân
tích về đặc điểm hình thái của ấu trùng cá thuộc họ Pleuronectidae nhằm kiểm tra lại giả
thuyết về mối liên hệ di truyền giữa các loài cá bơn sau khi xây dựng cây phát sinh loài.
Điều này khẳng định lại sự quan trọng của việc phân tích hình thái ấu trùng cá, nó đóng
vai trị như bằng chứng để kiểm tra về mối liên hệ di truyền giữa các loài khi kết quả

9


phân tích thơng qua đặc điểm hình thái của cá trưởng thành và thơng qua trình tự DNA
khơng thống nhất với nhau.
Nghiên cứu của Sharina và Kartavtsev (2010) đã định danh 13 loài thuộc bộ cá
bơn (Pleuronectiformes) thuộc 4 họ, thu được từ vịnh Kievka và Vostok (Liên bang
Nga), đồng thời cũng xây dựng và phân tích mối quan hệ phát sinh lồi giữa chúng bằng
cách sử dụng trình tự đoạn gen CO1 mtDNA với 2 loài thuộc bộ cá vược (Perciformes)

đóng vai trị làm nhóm ngoại. Kết quả phân tích cây phát sinh lồi góp phần ủng hộ cho
giả thuyết về tính đồng dạng của các họ cá bơn trong nghiên cứu: họ Pleuronectidae,
Soleidae, Cynoglossidae và Paralichthyidae. Các loài cá đại diện cho các họ và lồi có
sự khác biệt rõ rệt về mặt di truyền.
Exadactylos và Thorpe (2001) định danh, phân loại 7 loài cá bơn nằm trong 3 họ:
Pleuronectidae, Soleidae, Scophthalmidae từ vùng biển đông bắc Đại Tây Dương tới
biển Địa Trung Hải. Nghiên cứu sử dụng 11 loại enzyme được mã hóa bởi 14 loci từ 17
quần thể để phân tích mối quan hệ di truyền giữa 7 lồi cá này. Nhìn chung, tất cả các
lồi đều có sự khác biệt về mặt di truyền và chỉ tương đồng ở một vài allen. Kết quả
phân tích sự khác biệt về di truyền cho thấy hai loài Pleuronectes platessa và
Pleuronectes flesu đều thuộc giống Pleuronectes, loài Limanda limanda thuộc một
giống khác (Limanda).
Kartavtsev và cs (2008) đã định danh được 6 loài cá bơn thuộc 3 giống của họ
Pleuronectidae thu được tại vùng cực đông của nước Nga dựa vào trình tự của vùng gen
CO1 mtDNA, đồng thời xây dựng mối quan hệ phát sinh loài giữa chúng. Kết quả nghiên
cứu cho thấy các loài thuộc họ Pleuronectidae trong nghiên cứu cùng nằm trên một
nhánh đồng dạng. Phân tích dữ liệu từ các trình tự nghiên cứu ủng hộ cho quan điểm về
sự phân hóa lồi của bộ cá bơn chủ yếu phụ thuộc vào đặc điểm địa lý thơng qua tích
lũy nhiều đột biến di truyền nhỏ trong thời gian tiến hóa.
Potapova và cs (2014) định danh và so sánh trình tự đoạn gen CO1 trong ty thể
của hai loài Liopsetta glacialis và Liopsetta pinnifasciata thu tại vịnh Taui thuộc vùng
biển Okhotsk (Liên bang Nga). Sự khác biệt về trình tự của 10 cá thể Liopsetta glacialis
(π = 0,00370) ít hơn so với sự khác biệt giữa 28 cá thể Liopsetta pinnifasciata (π =
0,00446). Tỷ lệ khác biệt di truyền giữa các cá thể thuộc hai loài cá thân bẹt này phản
ánh về tình trạng lồi của chúng.
10


Nghiên cứu của Märss và cs (2017) sử dụng các đặc điểm của răng và xương mang
để phân loại hình thái ba loài thuộc bộ cá thân bẹt: Pleuronectes platessa, Platichthys

flesus trachurus, Scophthalmus maximus từ vùng biển Baltic. Các đặc điểm về hình thái
được so sánh, sự khác nhau giữa chúng là nguồn dữ liệu cho nghiên cứu hình thái và di
truyền của bộ cá thân bẹt. Đồng thời, kết quả của nghiên cứu giúp tăng thêm sự hiểu biết
về tập tính săn mồi của chúng.

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.3.1

Tổng quan về hệ gen ty thể
Hệ gen (genome) chứa tồn bộ thơng tin di truyền và các chương trình cần thiết

cho cơ thể hoạt động. Ở các sinh vật nhân chuẩn (Eukarytote) 99% genome nằm trong
tế bào (hệ gen nhân – nuclear DNA (nDNA)) và phần còn lại nằm trong một số cơ quan
như ty thể và lạp thể (hệ gen ty thể mitochondrial DNA (mtDNA) và hệ gen lạp thể chloroplast (ctDNA)) (Chial và Craig, 2008).
Ty thể là bào quan hình cầu, có màng kép gồm màng trong và màng ngồi ty thể.
Chúng có nhiệm vụ chuyển đổi năng lượng từ các vật chất hữu cơ thành dạng mà các tế
bào có thể sử dụng được (Genetics Home Reference, 2018). DNA ty thể (mtDNA) là
một hệ gen độc lập có kích thước nhỏ (14 – 42 kb), cấu trúc mạch vòng và nằm trong ty
thể, bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 13 mRNA, 2 rRNA và 22 tRNA
(Wolstenholme, 1992).
Trong tế bào chứa vài trăm ty thể, mỗi ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của
nó, vì vậy trong một tế bào có thể chứa được hàng nghìn bản sao của bộ gen ty thể
(Taylor và Turnbull, 2005; Galtier và cs, 2009; Budimir và cs, 2014). Điều này khiến
cho việc tách chiết DNA ty thể trở nên rất dễ dàng ngay cả với một lượng mẫu nhỏ.
DNA ty thể có đặc điểm di truyền theo dịng mẹ, vùng mã hóa lớn, khơng có hiện tượng
tái tổ hợp (Dimauro và Davidzon, 2005). Trong khi đó, DNA nhân di truyền từ cả bố và
mẹ thì bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dị tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của
đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Ngồi ra, vùng khơng mã hóa ở DNA nhân
chiếm tới 93%; trong khi ở DNA ty thể, vùng khơng mã hóa chỉ chiếm 3% (Taylor và
Turnbull, 2005). Các vùng không mã hóa này sẽ làm cho q trình giải trình tự thêm

phức tạp vì đơi khi cần phải tạo dịng để thu được đoạn gen mong muốn (Tautz và cs,
2003; Schander và Willassen, 2005). Việc khuyếch đại các đoạn gen của DNA ty thể
11


chỉ cần một số lượng giới hạn các đoạn mồi (Hebert và cs, 2004). Việc sử dụng DNA ty
thể để xác định lồi với tỉ lệ thành cơng trên 95% (Waugh, 2007). Mặt khác, các gen ty
thể trong cùng chủng, cùng lồi có tính bảo tồn sinh học ở một số gen như gen 16S
rRNA, Cytochrome Oxidase subunits 1 (CO1) mtDNA (Mas-Coma và cs, 2009). Nhìn
chung, DNA ty thể là cơng cụ hữu hiệu trong xác định các lồi, đánh giá mối quan hệ
của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các lồi đang
bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng (Grande và cs, 2008)

Hình 1.3. DNA ty thể lồi cá Bơn Mắt Lệch (Crossorhombus azureus) bao gồm 37 gen mã
hóa đặc trưng cho 22tRNA, 2rRNA và 13 vùng mã hóa protein (Shi và cs, 2013). Mũi tên đỏ
chỉ vùng gen CO1 (Cytochrome Oxidase subunits I) được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại.

Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể cũng có một số giới hạn. Kích thước của DNA
ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền. Tỷ lệ đột biến ở DNA ty thể
cao hơn DNA nhân (Brown và cs, 1979), trong khi DNA ty thể lại nhỏ, nên đột biến có
thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh lồi hay lịch sử tiến
hóa. Hơn nữa, việc không tuân theo quy luật di truyền của Mendel không phù hợp với
nhiều nghiên cứu di truyền (Wong, 2011). Mặt khác, nghiên cứu di truyền dựa trên một
chỉ thị phân tử hoặc trình tự protein riêng lẻ chỉ cho thấy sự tiến hóa của gen mục tiêu
đó và tần số tiến hóa của các gen có thể khác nhau (Anand và Roy, 2014). Các marker
12


DNA ty thể được sử dụng kết hợp với marker DNA nhân trong một số trường hợp cho
thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và Willassen, 2005).

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài

1.3.2

Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử đóng vai trị quan trọng trong nghiên
cứu mối quan hệ phát sinh loài. Một số chỉ thị phân tử thường được sử dụng trong nghiên
cứu có thể kể đến như: 16S rRNA, 12S rRNA, CO1,…Các phương pháp nghiên cứu
mối quan hệ phát sinh loài dựa trên đặc điểm hình thái vẫn được sử dụng rộng rãi cho
dù vẫn còn một số hạn chế. Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị phân tử vẫn cần phải kết
hợp với các đặc điểm hình thái để làm rõ mối quan hệ phát sinh loài (Anand và Roy,
2014).
Đoạn gen 16S rRNA thường được sử dụng trong phân loại vi khuẩn. Đây là đoạn
gen có tính bảo tồn sinh học, nhưng tần số tiến hóa của nó khác nhau tùy vào lồi sinh
vật. Nhờ tính chất này nên có thể phân biệt các nhóm vi khuẩn dựa trên đoạn gen 16S
rRNA (Anand và Roy, 2014).
Đoạn gen 12S rRNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu mối quan hệ phát
sinh loài. Đoạn gen này có tính bảo tồn sinh học tương đối, tốc độ tiến hóa chậm hơn so
với tốc độ tiến hóa trung bình của các gen ty thể (Palumbi, 1996; Jin và cs, 2013). Ngồi
ra, gen này cũng thích hợp cho việc phân biệt các lồi, nghiên cứu q trình tiến hóa, di
truyền quần thể của các lồi cá biển (Jin và cs, 2013).
Enzyme cytochrome c oxidase là một protein có mặt trong chuỗi truyền điện tử,
nó được tìm thấy ở màng tế bào vi khuẩn hoặc ty thể. Đoạn gen CO1 nằm trên ty thể
chịu trách nhiệm mã hóa cho một trong bảy tiểu phần polypeptid của enzyme này
(Anand và Roy, 2014). Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở vị trí số 3 trong các chuỗi bộ ba
của đoạn gen này cao hơn so với các đoạn gen 12S rRNA và 16S rRNA dẫn tới tỷ lệ đột
biến cao hơn khoảng 3 lần (Knowlton và Weigt, 1998). Trong thực tế, sự thay đổi này
là đủ nhanh để cho phép xảy ra mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài và trong
cùng một loài. Trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài, việc sử dụng đoạn gen CO1
làm chỉ thị mang lại các lợi thế quan trọng so với những đoạn gen mtDNA khác: đoạn
gen này được sử dụng phổ biến với nhiều loài động vật (Sharina và Kartavtsev, 2010),

cung cấp sự hiểu biết về phân loại cao hơn do sự thay đổi trong chuỗi amino acid chậm
hơn các gen ty thể khác dù tỷ lệ thay thế các nucleotide cao hơn (Habeeb và Sanjayan,
13


2011; Mandal và cs, 2014), chỉ cần sử dụng một đoạn gen ngắn (khoảng 500 – 700 bp)
là có thể phân loại các lồi (Kartavtsev và cs, 2008). Vì vậy, đoạn gen CO1 của ty thể
được sử dụng trong các nghiên cứu về sự tiến hóa và biến đổi di truyền của sinh vật.

1.3.3. Giới thiệu về ước tính thời gian phân hóa lồi (divergence time) và phương
pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock)
Ước tính thời gian phân hóa là xác định khoảng thời gian mà các lồi phân hóa
thơng qua dữ liệu sinh học (thường là DNA hoặc Protein), với tham chiếu là thơng tin
về hóa thạch. Trong việc ước tính thời gian phân hóa lồi dựa trên so sánh sự khác biệt
giữa các trình tự phân tử, dẫn liệu hóa thạch đóng vai trị là thơng tin tối ưu để hiệu chỉnh
kết quả tính tốn. Các trình tự phân tử chỉ cho thấy sự khác biệt/ phân tách về mặt di
truyền, trong khi đó thơng tin hóa thạch (hoặc các sự thay đổi về mặt địa lý được ghi
nhận trong khoảng thời gian tiến hóa) mới có thể suy đốn và ước tính được thời gian
phân hóa (Barba-Montoya và cs, 2017). Ước tính chính xác về thời gian phân hóa là rất
quan trọng để hiểu được về lịch sử sinh học của sinh vật theo các niên đại địa lý (Heath,
2016) và giải thích mối quan hệ phát sinh loài (Yoo và cs, 2005). Hiện nay, với một số
lượng lớn các chuỗi trình tự sinh học, dẫn liệu phân bố địa lý (geographic distributions)
và hóa thạch có khả năng cung cấp nhiều thơng tin hữu ích để khảo sát lịch sử tiến hóa
của sự sống trên trái đất.
Uớc tính thời gian phân hóa lồi sử dụng lý thuyết đồng hồ phân tử để thiết lập
khung thời gian tiến hóa dựa trên khoảng cách di truyền giữa các loài sinh vật (O’Reilly
và cs, 2015). Đồng hồ phân tử ban đầu là một giả thuyết dự đoán giữa các lồi có tồn tại
một tần số tiến hóa phân tử khơng đổi. Lý thuyết này đóng vai trị như một cơng cụ hữu
ích nhằm phân tích di truyền, ứng dụng trong ước tính tần số và thời gian tiến hóa từ dữ
liệu DNA hoặc protein (Mark, 2012). Tuy nhiên, lý thuyết cổ điển về đồng hồ phân tử

vẫn còn hạn chế do tần số tiến hóa có thể khác nhau giữa các sinh vật. Vì vậy, các nhà
nghiên cứu đã cải tiến lý thuyết về đồng hồ phân tử, những lý thuyết mới này (“relaxed”
molecular clocks) cho phép tần số tiến hóa có thể thay đổi theo một quy luật giữa các
lồi có mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền (Ho, 2008).
 Phương pháp phân tích đồng hồ phân tử (molecular clock)
BEAST (Bayesian evolutionary analysis by sampling trees) là phần mềm tích hợp
các nguồn dữ liệu khác nhau này để giải quyết các giả thuyết tiến hóa (Drummond và
14


Rambaut, 2007). BEAUti là một phần mềm tạo dữ liệu đầu vào cho BEAST (file XML
- eXtensible Markup Language) (Bouckaert và cs, 2014). Các mơ hình đồng hồ phân tử
được sử dụng trong ước tính thời gian phân hóa sử dụng phần mềm BEAST gồm:
− Strict Clock: Mơ hình này giả định rằng các nhánh của cây phát sinh loài đều
tiến hóa theo cùng một tỷ lệ nhất định. Mơ hình này chỉ có một tham số đại diện cho tỷ
lệ giữa độ dài của nhánh cây và thời gian tiến hóa.
− Relaxed Clock: Mơ hình này giả định rằng các nhánh có thể thay đổi theo một
quy luật nhất định. Trong phân tích cây phát sinh lồi sử dụng BEAST2, mơ hình đồng
hồ phân tử này bao gồm hai lựa chọn:
+ Relaxed Clock Log Normal: Mơ hình này giả định rằng tần số tiến hóa của
từng nhánh trên cây tiến hóa được lấy một cách độc lập từ một phân phối log
normal riêng (Drummond và cs, 2006)
+ Relaxed Exponentinal Clock: Mơ hình này giả định rằng tần số tiến hóa của
từng nhánh trên cây tiến hóa được lấy theo một phân phối cấp số nhân (Drummond
và cs, 2006).
− Random Local Clock: Mơ hình này cho phép có sự thay đổi nhất định trong tần
số tiến hóa nhiều hơn mơ hình Strict Clock (tần số tiến hóa khơng đổi) nhưng ít hơn các
mơ hình Relaxed Clock (tần số tiến hóa khác nhau giữa các nhánh) (Drummond và
Suchard, 2010).

15