CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN (DI TRUYỀN học) (chữ biến dạng do slide dùng font VNI times, tải về xem bình thường)

CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ADN


ADN là gì?
• ADN là phân tử
chứa TẤT CẢ vật
liệu di truyền của
cơ thể và do đó
chịu trách nhiệm
cho DI TRUYỀN
• Một sợi ADN chứa
nhiều GEN, tất cả
các gen này mã
hóa cho các
PROTEIN
• Mỗi protein có
chức năng khác
nhau trong tế baøo

2


ADN có ở đâu?

3


I. CHIẾT TÁCH ADN

4

øm sao chiết ADN từ tế bào?

PHÁ màng tế
bào

5


KẾT TỦA ADN khỏi
dung dịch bằng Ethanol

6


CHIẾT TÁCH ADN
Bước 1: Phá màng tế bào và màng
nhân (tế bào nhân thật), giải
phóng ADN ra môi trường
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không
mong muốn

trong mẫu (protein,

mảnh vỡ tế bào…)
Bước 3: Kết tủa acid nucleic
7

TINH CHẾ ACID NUCLEIC
- Siêu ly tâm trên gradient liên tục CsCl độ
phân giải 1% đơn vị tỉ trọng
- Siêu ly tâm trên đệm CsCl (gradient không
liên tục): để tinh chế một lượng lớn acid
nucleic
- Siêu ly tâm trên gradient saccharose: để
phân tách hỗn hợp các acid nucleic có
kích thước chênh lệch nhau nhiều kb

8


TINH CHẾ ACID NUCLEIC

- Sắc ký ái lực: pha tónh là USepharose / oligodT- cellulose
- Sắc ký lọc gel: tách các nucleotid
tự do sau khi tạo mẫu dò đánh
dấu
- Sắc ký trao đổi ion trên vi cột:
thu hồi lượng ADN rất nhỏ
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao:
tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ
phân giải 1 nt)
plasmid
phân tách các đoạn ADN

9

II. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
ĐỊNH TÍNH

VÀ ĐỊNH LƯNG SƠ BOÄ

ACID NUCLEIC

10


2.1. Quang phổ kế
OD260nm – Optical Density 260nm
OD260nm = 1  50 g/ml dung dịch ADN sợi
đôi
40 g/ml
dd~ARN hay ADN sợi
Ví dụ: giá trị OD
=
0,9
260nm
đơn
- Dd có nồng độ ADN sợi đôi = 0,9x50
= 45 g/ml

- Dd có nồng độ ARN hay ADN sợi đơn =
36 g/ml
D260nm/OD280nm ~ 1,8-2  Dung dịch ADN tinh khiết
11

2.2. Điện di

ên tắc: dựa vào sự di chuyển khác nhau trong
trường của các acid nucleic

ược làm bằng agarose hay polyacrylamid

độ điện di của ADN qua gel tùy thuộc
Kích thước phân tử ADN
Cấu dạng của ADN (sợi đơn, sợi đôi,
vòng, siêu xoắn)

Điều kiện điện di: nồng độ gel, điện
thế sử duïng

12


Ñieän
di

13


III. KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ
ỨNG DỤNG

14

t ADN bằng enzym giới hạn (RE, restriction enzyme
Khái niệm
. ADN có thể được cắt tại các trình tự
chuyên biệt bởi các RE
. Nhiều RE tinh khiết có bán sẵn
. Mỗi enzym nhận diện trình tự đặc hiệu,
4-8 cặp base

15


Ví dụ

aeIII cắt tạo đầu bằng
5'. . . GGCC. . . 3'
3’. . .CCGG . . . 5'

EcoRI cắt tạo ñaàu so le
5'. . . GAATTC. . . 3'
3’. . . CTTAAG . . . 5'
16


3.2. Nối các đoạn acid nucleic: LIGASE
ADN ligase xúc tác hình thành liên kết nối
hai đoạn ADN
ARN ligase xúc tác hình thành liên kết nối
hai đoạn ARN
Ly trích từ E. coli (E. coli DNA ligase)
từ phage T4 E. coli (T4 DNA ligase vaø T4

RNA ligase)
17


3.3. Kỹ thuật lai nucleotid

Dùng phát hiện các trình tự ADN hoặc ARN
chuyên
Tại
Tm: haibiệt
mạch phân tử ADN tách rời
nhau
hạ Nhiệt độ phản ứng xuống đột
ngột
 không bắt cặp trở lại  ADN
mạch đơn
Nhiệt độ được làm giảm từ từ và
cấu
hình không gian
điều
kiện
thích
hợp
vô trật tự
2 mạch sẽ bắt cặp trở lại
= lai phân tử, có tính đặc hiệu tuyệt
Các
yếu tố ảnh hưởng đến sự
đối
lai phân tử

Nồng độ ADN và thời gian
phản ứng
18
Nhiệt độ


Mẫu dò = bản sao của một trình tự acid
nucleic và
được đánh dấu để
dễ nhận biết
chuyên biệt - chỉ lai với trình tự bắt
cặp bổ sung
Tác do
nhân
đánh
dấu
nhạy
được
đánh
dấu để phát hiện
32
các đồng
P
và định
lượng vị phóng xạ:
35
S
3

H

hóa chất: hệ thống avidin (hay
streptavidin) – biotin
hệ thống peroxydase – cơ chất
19


LAI TRÊN PHA RẮN
1 trình tự bổ sung

Trình tự kia
(trình tự đích cần

(các mạch đơn)

tìm) được cố định

trong môi trường

trên một giá

lỏng (ddđệm)

thể rắn

 Southern blot
 Northern blot

20

ern blot
phân tích các trình tự ADN chuyên biệt

phát hiện 1 bản copy trình tự ADN trong bộ gen

Ứng dụng
- định vị trình tự đặc biệt trên ADN gen,
ADN plasmid, phage,..
- lập bản đồ giới hạn của gen
- phát hiện các đa dạng trình tự: đột
biến mất đoạn, đột biến điểm, tái tổ
hợp
21


Phương pháp Southern
blot

Thang
chuẩnADN
ADN đã
cắt

Giấy
thấm
Màng
nilon

Dung

dịch
đệm
Bấc

Vị trí đa
hình

DNA probe

Màng nilon
Gia
ù

Bản đồ
vị trí
cắt giới
hạn

Bản
phóng
xạ tự
ghi

1. Chuẩn bị ADN và cắt bằng RE
2. Điện di ADN trên gel agrarose
3. Biến tính ADN bằng kiềm và chuyển ADN
từ gel gắn vào bề mặt màng (nitrocellulose,
nylon, nylon tích điện âm)

22

Kết quả Southern
blot

23


rthern blot tương tự Southern blot nhưng dùng

ân tích các trình tự ARN

24


LAI TẠI CHỖ
Trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm
ngay

trong tế bào hay trong mô

không cần qua giai đoạn tách chiết ra khỏi
mô, tế bào

Ứng dụng:

định vị gen trên nhiễm sắc thể,

phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp
nghiên cứu mARN chuyên biệt trong tế

bào &ø mô
25