Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh ứng dụng cho cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.74 MB, 108 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VŨ QUANG KHUÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN ĐÀO TẠO QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VẬT LIỆU
-----o0o-----
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH: KHOA HỌC VẬT LIỆU
KHOA HỌC VẬT LIỆU
ITIMS 2007 - 2009
HÀ NỘI
2009
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA
KÊNH ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
TRÊN CƠ SỞ ĐỘ DẪN
VŨ QUANG KHUÊ
Hà Nội - 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN ĐÀO TẠO QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VẬT LIỆU
-----o0o-----
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA
KÊNH ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH
TRÊN CƠ SỞ ĐỘ DẪN
VŨ QUANG KHUÊ
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU
KHOÁ ITIMS 2007 - 2009
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Mai Anh Tuấn
Hà Nội - 2009
ii
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian 2 năm học tập và làm việc tại Viện ITIMS - trường Đại Học
Bách Khoa Hà Nội đã giúp tơi ngày càng hồn thiện kiến thức chuyên môn,
phương pháp nghiên cứu khoa học, đồng thời trưởng thành hơn về phong cách,
kinh nghiệm sống.
Người đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đó là thầy giáo, Tiến sỹ Mai Anh Tuấn; Thầy đã tạo mọi điều kiện cũng như
luôn luôn động viên và giải quyết mọi khó khăn để tơi có thể hồn thành tốt luận
văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể nhóm Biosensor, Viện ITIMS; đặt biệt là
nghiên cứu sinh Trần Quang Huy, tiến sỹ Phương Đình Tâm, các anh chị và các
bạn trong nhóm Biosensor - những người đã ln khuyến khích động viên và
giúp tơi về chun mơn trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các thầy cô và cán bộ Viện
ITIMS những người đã đem lại cho tôi những kiến thức khoa học và tạo mọi
điều kiện để tơi thực hiện tốt nhiệm vụ của mình trong 2 năm học.
Tôi xin cảm ơn tới tập thể lớp ITIMS khóa 2007 - 2009, những người thường
xuyên động viên, đóng góp những ý kiến và trao đổi kiến thức thực nghiệm trong
thời gian chúng tôi học tập tại đây.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình và những người
thân, Ban giám hiệu, cán bộ, giáo viên cơ quan nơi tôi công tác đã tạo điều kiện
cho tôi cả về vật chất và tinh thần trong những thời gian tôi theo học tại Trường
Đại Học Bách Khoa Hà Nội.
Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2009
Vũ Quang Khuê
iii
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa ......................................................................................................................................... i
Lời cảm ơn...............................................................................................................................................ii
Mục lục ......................................................................................................................................................iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ..................................................................................v
Danh mục các bảng biểu .................................................................................................................vii
Danh mục các hình vẽ, đồ thị .......................................................................................................viii
Mở đầu ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC ............................ 3
1.1. Cảm biến sinh học .................................................................................... 3
1.1.1. Cấu tạo, nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học ......................... 3
1.1.2. Phân loại cảm biến sinh học ............................................................... 4
1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học ............................................................. 13
1.2.1. Trong y tế dự phòng ........................................................................... 13
1.2.2. Phát hiện chuyển đổi gen trong thực phẩm ........................................ 14
1.2.3. Quan trắc môi trường ......................................................................... 14
1.3. Các thiết bị đo cho cảm biến sinh học .................................................... 15
1.4. Nguyên lý hệ đo và xử lý tín hiệu của cảm biến miễn dịch đa kênh ....... 22
1.4.1. Cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn ............................................... 22
1.4.2. Nguyên lý của hệ đo cho cảm biến miễn dịch đa kênh...................... 24
Chương 2. NGHIÊN CỨU, CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO ĐA KÊNH ......... 28
2.1. Vi cảm biến độ dẫn đa kênh ..................................................................... 28
2.2. Đóng gói và chức năng hóa cảm biến ...................................................... 33
2.2.1. Đóng gói cảm biến đa kênh................................................................ 33
iv
2.2.2. Chức năng hóa cảm biến đa kênh ...................................................... 35
2.3. Thiết kế chế tạo hệ đo đa kênh cho cảm biến miễn dịch ........................ 37
2.3.1. Thiết kế và chế tạo hệ đo đa kênh ...................................................... 37
2.3.1. Khối nguồn ......................................................................................... 39
2.3.2. Khối phát tín hiệu ............................................................................... 39
2.3.3. Khối tách sóng biên độ....................................................................... 41
2.3.4. Khối xử lý tín hiệu và giao tiếp máy tính .......................................... 42
2.3.5. Khối bàn phím .................................................................................... 45
2.3.6. Khối hiển thị kết quả .......................................................................... 46
2.3.2. Phát triển phần mềm hiển thị số liệu và kết quả đo ........................... 47
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 49
3.1. Đóng gói cảm biến .................................................................................. 50
3.1.1. Thông số của đế và cảm biến sau khi chế tạo .................................... 50
3.1.2. Hàn và đóng gói cảm biến.................................................................. 51
3.2. Các đặc tuyến của thiết bị đo và phần mềm hiển thị số liệu .................... 54
3.2.1. Các đặc tuyến của thiết bị .................................................................. 54
3.2.2. Giao diện người dùng của phần mềm ................................................ 60
3.2.3 Đóng gói thiết bị.................................................................................. 63
3.3. Xác định Vi rút H5N1 gây bệnh ............................................................. 64
3.4. Thảo luận .................................................................................................. 70
3.5. Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài .................................................... 72
Kết luận chung ................................................................................................ 73
Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 75
Phụ lục 1
Phụ lục 2
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TT
Kí hiệu
1
2
3
4
APTS
PBS
PCR
ELISA
5
6
7
DNA,
RNA
ISFET
8
MOSFET
9
EDC
10 MIA
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
AcChE
BSA
Ig
ECL
USB
LCD
UDC
UAC
IgM
Psoc
ADC
HID
Viết tắt cho
Aminopropyltriethoxysilane
Phosphate Buffered Saline
Polymerase Chain Reaction
Enzyme-Linked-Immuno Sorbent
Assay
Deoxyribo Nucleic Axit
Ribonucleic Acid
Ion Sensitive Field Effect
Transistor
Metal Oxide Semiconductor Field
Effect Transistor
Ethy-3-(3-dimethyl aminopropyl)Carbodiimide
N - methyl - imidazole
Acetyl-Cholinesterase
Bovine Serum Albumin
Immunoglobulin
Electrochemiluminescence
Universal Serial Bus
Liquid Crystal Display
Direct Current
Alternating Current
Immunoglobulin M
Programmable System on Chip
Analog-to-Digital Converter
Human Interface Devices
Nghĩa tiếng việt
Chất APTS
Dung dịch đệm PBS
Phản ứng chuỗi polyme
Miễn dịch đánh dấu enzyme
Axit nucleic
Axit ribonucleic
Bóng bán dẫn hiệu ứng
trường nhạy ion
Bóng bán dẫn cấu trúc ơxít
kim loại
Chất EDC
Chất MIA
Chất AcChE
Chất BSA
Globulin miễn dịch
Phản ứng ECL
Giao tiếp USB
Hiển thị tinh thể lỏng
Điện áp một chiều
Điện áp xoay chiều
Kháng thể loại Muy
Hệ thống khả trình trên chip
Chuyển đổi số tương tự
Chuẩn giao tiếp HID
vi
23
24
25
26
LED
VB
S/N
ROM
Light Emitting Diode
Visual Basic
Signal / Noise
Programmable Read-Only Memory
Điốt phát quang
Ngôn ngữ Visual Basic
Tín hiệu / Nhiễu
Bộ nhớ chỉ đọc
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
TT
Tên
Tiêu đề bảng
Trang
1
Bảng 1
Tính chất của các kháng thể
10
2
Bảng 2.1
Các thông số của cảm biến đa kênh
29
3
Bảng 2.2
Các thông số khi hàn cảm biến
35
4
Bảng 3.1
Các thông số của cảm biến và đế cảm biến
51
5
Bảng 3.2a
Bảng thông số quá trình đo xác định kháng
66
nguyên vi rút H5N1 lần 1
6
Bảng 3.2b
Bảng thơng số q trình đo xác định kháng
nguyên vi rút H5N1 lần 2
67
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
TT
Tiêu đề hình vẽ
Tên
Trang
1
Hình 1.1
Cấu tạo của cảm biến sinh học
3
2
Hình 1.2
Cấu tạo của cảm biến (A) và hệ đo (B) ISFET
6
3
Hình 1.3
Cấu tạo của cảm biến vi điện cực
7
4
Hình 1.4
Cảm biến và thiết bị đo nồng độ thuốc trừ sâu
15
5
Hình 1.5.
Xác định nồng độ thuốc trừ sâu ở dạng vi dịng
16
6
Hình 1.6
Mơ hình thiết bị đo xác định nồng độ chất Lactate
18
7
Hình 1.7
Cảm biến đa kênh với 16 điện cực làm việc
19
8
Hình 1.8
So sánh độ ổn định làm việc của điện cực chế tạo
20
bằng vàng và cacbon
9
Hình 1.9
Mơ hình thiết bị xác định cúm gia cầm dựa trên cảm
21
biến quang
Cấu trúc cảm biến vi điên cực
10
Hình 1.10
22
11
Hình 1.11
Sơ đồ thiết lập hệ đo cho cảm biến đa kênh
24
12
Hình 1.12
Sơ đồ điện tương đương cho cảm biến miễn dịch
25
13
Hình 2.1
Mặt nạ chế tạo cảm biến đa kênh
28
14
Hình 2.2 a
Kích thước của cảm biến đa kênh
29
15
Hình 2.2 b
Thơng số chi tiết 01/01của cảm biến
30
16
Hình 2.3
Quy trình chế tạo cảm biến đa kênh
30
17
Hình 2.4
Cảm biến sau khi cắt ra từ phiến Silicon
32
18
Hình 2.5 a
Đế cảm biến đa kênh thiết kế cho mặt trên
33
19
Hình 2.5 b
Đế cảm biến đa kênh thiết kế cho mặt dưới
33
20
Hình 2.6
Quy trình gia nhiệt cho đế hàn
34
21
Hình 2.7
Quy trình cố định kháng thể vi rút H5N1 lên bề mặt
35
ix
cảm biến
22
Hình 2.8
Sơ đồ khối của thiết bị đo đa kênh
38
23
Hình 2.9
Sơ đồ nguyên lý của khối nguồn
39
24
Hình 2.10
a. Sơ đồ khối phát tín hiệu điều chỉnh tần số, b. Điều
40
chỉnh biên độ.
25
Hình 2.11
Sơ đồ mạch chỉnh lưu nhạy pha và dạng tín hiệu
42
26
Hình 2.12
Các mơđun của PSoC được sử dụng trong thiết bị đa
43
kênh
27
Hình 2.13
Thiết lập phần cứng và phân bố chức năng chân cho
43
CY8C24894
28
Hình 2.14
Ghép nối USB với chíp Psoc CY8C24894
44
29
Hình 2.15
Các chế độ thiết lập cho USB trong phần mềm
45
Designer 4.4
30
Hình 2.16
Hình ảnh bàn phím và thiết lập chế độ hoạt động
46
31
Hình 2.17
a. Mơđun LCD và b. Thiết lập thống số hoạt động
47
32
Hình 2.18
Cửa sổ thiết lập trong Visual Basic của phần mềm
48
hiển thị
33
Hình 3.1
Cảm biến sau khi được chế tạo, cắt thành từng chip
50
34
Hình 3.2
Đế cảm biến sau khi được chế tạo, gia cơng
51
35
Hình 3.3
Hình ảnh cảm biến sau khi được hàn và đóng gói
52
36
Hình 3.4
Cảm biến giao tiếp với bản mạch chính thơng qua
53
socket
37
Hình 3.4
Sơ đồ chân cảm biến miễn dịch đa kênh
53
38
Hình 3.5
Tín hiệu đưa vào cảm biến miễn dịch 100 mV, 50
54
kHz
x
39
Hình 3.6
Khối phát tín hiệu cho cảm biến đa kênh
55
40
Hình 3.7
Khối nguồn ni cho bảng mạch chính
55
41
Hình 3.8
Khối tách sóng biên độ
56
42
Hình 3.9
Tín hiệu VHaft sau khi ra từ khối tách sóng biên độ
56
43
Hình 3.10
Hình ảnh khối xử lý, giao tiếp USB, RS-232
58
44
Hình 3.11
Bản mạch chính của thiết bị đo đa kênh
59
45
Hình 3.12
Giao diện người sử dụng phần mềm BS 2.0
61
46
Hình 3.13
Giao diện thống kê số lần đo
62
47
Hình 3.14
Hình ảnh thiết bị phát hiện vi rút đa kênh ghép nối
64
máy tính
48
Hình 3.15
Kết quả đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 10µl
65
49
Hình 3.16
Kết quả đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 20µl
66
50
Hình 3.17
Đồ thị đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 10µl trên
68
phần mềm BS 2.0
51
Hình 3.18
Đồ thị đo xác định vi rút H5N1 với thể tích 20µl trên
phần mềm BS 2.0
68
-1-
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, sự phát triển của công nghệ vi điện tử và công nghệ
sinh học đã góp phần to lớn vào vấn đề phát hiện sớm, nhanh và chữa khỏi một số
bệnh lây nhiễm trong đời sống, sinh hoạt của con người, làm rõ hơn cơ chế sinh lý
phức tạp trong cơ thể sống. Việc ứng dụng cảm biến sinh học và thiết bị đi kèm
giúp chúng ta chẩn đoán xác định, điều trị bệnh một cách dễ dàng và nhanh chóng
hơn, nghiên cứu và bào chế thuốc, kiểm tra chất lượng thức ăn hoặc xác định việc
chuyển đổi gen trong động, thực vật, đặc biệt thời gian gần đây dịch bệnh do vi rút
gây nên đối với sức khoẻ con người ngày càng gia tăng. Điều nguy hiểm là ở chỗ,
chúng có khả năng biến chủng nhanh chóng. Khống chế và ngăn chặn kịp thời các
tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết khơng chỉ đối ngành y tế
mà cịn với tất cả các ngành nghề khác nhằm giảm thiểu nguy cơ liên quan tới sức
khỏe và những thiệt hại về mặt kinh tế xã hội. Chính vì vậy, phát hiện nhanh, nhạy
và sàng lọc mầm bệnh truyền nhiễm là mấu chốt để ngăn chặn q trình lây nhiễm,
có biện pháp cách ly hay điều trị kịp thời, khống chế và ngăn chặn dịch bệnh bùng
phát.
Có nhiều phương pháp đang được áp dụng tương đối rộng rãi trong phịng thí
nghiệm để xác định các tác nhân gây bệnh như: phân lập; nuôi cấy; huyết thanh
học; ELISA; PCR,... Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống này thường mất
hàng giờ tới hàng tuần để biết được kết quả. Đề tài “Nghiên cứu chế tạo thiết bị
đo đa kênh ứng dụng cho cảm biến miễn dịch trên cơ sở độ dẫn” được tác giả
lựa chọn mục đích xác định nhanh vi rút H5N1 gây bệnh, có khả năng bổ trợ cho
những phương pháp nghiên cứu xác định vi rút trước đây. Điều đặt biệt là thiết bị
có thể xác định vi rút ở mọi nơi khi cần di chuyển hoặc ở tại các vùng sâu, vùng xa
nơi thiếu cả điều kiện máy móc và nhân viên y tế cao cấp. Thiết bị đo đa kênh bao
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-2-
gồm một bộ biến năng / chuyển đổi (transducer) đã được cố định các phần tử sinh
học là kháng thể của vi rút H5N1, hệ mạch đo, phần mềm thu thập và xử lý số liệu.
Hệ thống có thể hoạt động và chỉ thị kết quả độc lập hoặc ghép nối, điều khiển
thơng qua máy tính cá nhân. Luận văn này mơ tả chi tiết q trình phát triển mạch
đo và xây dựng phần mềm. Luận văn gồm 3 chương:
Chương 1. Tổng quan về cảm biến sinh học
Trong chương này tác giả mô tả tổng quan về cấu tạo, nguyên lý hoạt động và phân
loại cảm biến sinh học. Khái quát các phần tử cả nhận sinh học và kháng thể được
cố định lên bề mặt cảm biến. Tóm tắt tổng thể các thiết bị đo ứng dụng cho cảm
biến sinh học được nghiên cứu ứng dụng ở trong nước và trên thế giới trong những
năm gần đây. Bênh cạnh đó, tác giả mơ tả nội dung về ngun lý và xử lý tín hiệu
của hệ đo cho cảm biến miễn dịch đa kênh.
Chương 2. Nghiên cứu chế tạo thiết bị đo đa kênh
Chương 2 tập trung vào việc mô tả các quá trình thực nghiệm như: Nghiên cứu và
cùng tham gia chế tạo, cố định chức năng hóa cho cảm biến miễn dịch đa kênh.
Thiết kế, xây dựng quy trình đóng gói cho cảm biến đa kênh. Tạo bộ socket cho
phép cảm biến giao tiếp với bản mạch chính xử lý tín hiệu của thiết bị. Nghiên cứu
chế tạo thiết bị đo đa kênh và nâng cấp phần mềm thu thập, xử lý tín hiệu kết quả
đo.
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Trong chương này, bên cạnh những lập luận khoa học của kết quả thu thập được.
Tác giả cũng đưa thêm vào những nhận xét, bàn luận làm cơ sở cho việc phát triển
các luận văn sau.
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-3-
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC
1.1. Cảm biến sinh học
1.1.1. Cấu tạo, nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học
Cấu tạo của cảm biến sinh học:
Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng cung cấp
những thơng tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng, gồm 02 thành phần
chính: Phần tử nhận biết sinh học và bộ chuyển đổi tín hiệu [15]. Phần tử nhận biết
thực chất là các lượng chất sinh học hoặc các thực thể sinh học, hoạt động như một
yếu tố nhận biết, được liên kết với bộ chuyển đổi một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
Phần tử sinh học được sử dụng chủ yếu là enzim, ADN, ARN, kháng thể [21].
Bộ chuyển đổi thực hiện nhiệm vụ chuyển đổi các tín hiệu khơng điện do các phản
ứng hố học sinh ra thành tín hiệu điện, quang, cơ, nhiệt [21].
Hình 1.1. Cấu tạo của cảm biến sinh học
Nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học:
Sự tương tác giữa phần tử cảm nhận sinh học và đối tượng phân tích sẽ làm thay
đổi các tính chất sinh, hóa. Sự thay đổi này được nhận biết bằng bộ chuyển đổi của
cảm biến và chuyển thành tín hiệu điện [3]. Mỗi phần tử nhận biết sinh học khác
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-4-
nhau chỉ cho phép nhận biết được một loại đối tượng phân tích theo ngun tắc
khóa - chìa. Nếu khơng có đối tượng phân tích phù hợp với thành phần cảm nhận
sinh học thì khơng có sự thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến hoặc chỉ đơn
thuần là đóng góp các ồn trong q trình đo. Chính vì vậy mà cảm biến sinh học có
độ chọn lọc rất cao [17].
1.1.2. Phân loại cảm biến sinh học
Dựa trên những thành phần cảm nhận sinh học và phần tử chuyển đổi người ta phân
loại ra loại các cảm biến sinh học khác nhau:
Phân loại theo phần tử chuyển đổi:
Dựa trên bộ phận chuyển đổi có thể chia cảm biến sinh học thành: Cảm biến quang
trên cơ sở phép đo huỳnh quang [6], cảm biến cơ dựa trên cơ sở thay đổi khối
lượng ở bề mặt cảm biến sẽ làm thay đổi tần số trong vi cân của tinh thể thạch anh
[16], chuyển đổi điện hóa [21], hiệu ứng trường nhạy ion, bộ chuyển đổi nhiệt và
bộ chuyển đổi từ [2].
Cảm biến ADN quang học dựa trên cộng hưởng Plasma bề mặt:
Loại cảm biến này khơng địi hỏi phải đánh dấu chuỗi ADN, kết quả của phép đo
được hiển thị ngay trong quá trình đo [17]. Hệ thống này dựa trên sự thay đổi góc
cộng hưởng của ánh sáng phản xạ ở bề mặt cảm biến, khi có sự lai hóa của chuỗi
ADN dị và ADN đích trong dung dịch. Sự thay đổi phần tử cảm nhận sinh học do
lai hóa ADN sẽ tương ứng với sự thay đổi khối lượng phân tử trên bề mặt cảm
biến. Loại cảm biến này được sử dụng trong việc xác định đột biến gen [4], nghiên
cứu tương tác kháng thể - kháng ngun trong lúa mì [7], phân tích trong q trình
bào chế thuốc [9].
Cảm biến có bộ chuyển đổi cơ học trên cơ sở vi cân tinh thể thạch anh:
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-5-
Cảm biến vi cân tinh thể thạch anh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau,
trong đó việc sử dụng vật liệu này làm bộ chuyển đổi tín hiệu trong cảm biến sinh
học nhằm ứng dụng trong lĩnh vực y, sinh học để xác định các loại vi rút, vi khuẩn
gây bệnh. Ưu điểm của loại cảm biến này là có độ nhạy rất cao, khả năng đo sự
thay đổi khối lượng ở mức nanogam, quá trình xác định khơng cần đánh dấu, kết
quả có thể định tính hoặc định lượng. Nhược điểm của loại cảm biến này là hoạt
động ở tần số cao, đóng góp ồn của mơi trường làm ảnh hưởng tới q trình xử lý
tín hiệu [5].
Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hoá:
Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hố có cấu trúc đơn giản, q trình
nhận biết khơng phức tạp do những phản ứng điện hoá sẽ cho tín hiệu điện trực
tiếp, độ nhạy tương đối cao, thời gian đáp ứng nhanh, kích thước nhỏ, thích hợp
cho việc xác định nhanh các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm bệnh [11], hoặc
ứng dụng để kiểm tra môi trường... Để nhận biết sự phản ứng của phần tử sinh học
với chất cần phân tích, bề mặt cảm biến phải được cố định kháng thể, enzim, chuỗi
ADN dị, sau đó đưa vào dung dịch mẫu cần phân tích tương ứng như kháng
ngun, cơ chất, ADN đích. Khi có phản ứng kháng nguyên - kháng thể, lai hóa
ADN, phản ứng ức chế enzim, xẩy ra sẽ làm thay đổi độ dẫn giữa các điện cực, gây
lên thay đổi điện áp ở đầu ra [21].
Cảm biến sinh học dựa trên bóng bán dẫn nhạy ion hiệu ứng trường ISFET (Ion
Sensitive Field Effect Transistor):
Bóng bán dẫn nhạy ion hiệu ứng trường là một loại điện cực được sử dụng để thay
thế các điện cực thuỷ tinh đo pH hoặc nồng độ ion trong kim loại. Loại linh kiện
này được cải tiến từ MOSFET (Metal Oxide Semiconductor Field Effect
Transistor) với sự thay thế của lớp oxít cực cổng bằng một lớp màng nhạy hố học
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-6-
và một điện cực chuẩn. Nếu phủ một lớp màng cảm nhận sinh học lên cực cổng của
ISFET, nó trở thành cảm biến sinh học. Các loại cảm biến này được phủ bởi màng
enzim lên cực cổng nhạy ion của ISFET, sự đáp ứng tín hiệu ra được xác định bằng
sự thay đổi điện áp trong kênh dẫn. Loại cảm biến này có kích thước nhỏ, độ nhạy
cao [2].
Phép đo dịng
Hiển thị
Keithley4200
1.
2.
3.
Hộp tấm chắn
Cảm biến ISFET
Hệ đo cảm biến
Hình 1.2. Cấu tạo của cảm biến (A) và hệ đo (B) ISFET
Cảm biến sinh học trên cơ sở vi điện cực độ dẫn:
Cảm biến vi điện cực độ dẫn đã được sử dụng phổ biến với những ưu điểm vượt
trội như: giá thành thấp, cấu trúc đơn giản, độ ổn định cao, tin cậy khi làm việc,
phân tích nhanh và dễ dàng trên cơ sở phép đo độ dẫn, quy trình chế tạo đơn giản.
Đây là loại cảm biến dựa trên sự thay đổi độ dẫn điện ở lân cận bề mặt cảm biến
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-7-
khi có sự thay đổi về tính chất vật lý, hóa học hoặc sinh học trong dung dịch phân
tích. Khi đó, sẽ làm thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến. Cảm biến vi điện
cực có nhiều cấu hình, kích thước khác nhau. Chúng có thể được chế tạo bằng cách
sử dụng dây kim loại hoặc các bon làm điện cực trong một ống thuỷ tinh. Hiện nay
vi điện cực được ứng dụng dùng làm cảm biến sinh học là những vi điện cực có
dạng hình trịn và đặc biệt là các vi điện cực Planar có cấu trúc dạng răng lược đan
xen hoặc cấu trúc mảng [21]. Quy trình chế tạo loại cảm biến này được tác giả trình
bày chi tiết trong chương 2 của luận văn.
5mm
5mm
Hình 1.3. Cấu tạo của cảm biến vi điện cực
Cũng như các loại cảm biến sinh học khác, để xác định kháng nguyên, trên bề mặt
cảm biến miễn dịch dựa trên vi điện cực độ dẫn cần được cố định kháng thể. Quá
trình xảy ra phản ứng kháng nguyên - kháng thể (phản ứng miễn dịch) sẽ gây lên sự
thay đổi độ dẫn trên bề mặt cảm biến và làm thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm
biến. Những loại cảm biến này thường được ứng dụng để xác định loại khuẩn
Salmonella - một loại khuẩn gây nhiễm độc trong sữa với thời gian nhanh gấp
nhiều lần so với các phương pháp xác định khác [8], xác định vi rút viên gam C
[16], xác định vi rút gây bệnh H5N1 [21].
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-8-
Phân loại theo thành phần cảm nhận sinh học:
Thực tế có khá nhiều phần tử sinh học được sử dụng làm thành phần cảm nhận sinh
học. Tuy nhiên các chất thường được sử dụng trong các cơng trình và sản phẩm là:
ADN, ARN, kháng thể, enzim.
Phần tử cảm nhận là chuỗi ADN:
Cấu trúc, tính chất của các ADN được trình bày chi tiết trong [21]. Có nhiều
phương pháp để cố định ADN lên bề mặt cảm biến nhưng phương pháp cố định
ADN dò lên bề mặt cảm biến sử dụng APTS và ống nanocacbon là được sử dụng
phổ biến và có nhiều ưu điểm [21]. Quy trình cố định ban đầu cảm biến được xử lý
sạch bề mặt để tẩy bỏ chất bẩn và ion kim loại gây lên khi chế tạo và đóng gói cảm
biến, tiếp đó hydrát hố bề mặt cảm biến bằng CH3OH/HCl tỷ lệ 1:1, Phủ APTS
và cố định ADN dò lên bề mặt cảm biến dung dịch APTS/C2H5OH tỷ lệ 3:7 cùng
với đó là quá trình hoạt hóa chuỗi ADN bằng EDC và MIA, phủ ADN hoạt hóa lên
bề mặt cảm biến và đem ủ ở 37 0C trong 18 giờ [19]. Khi trong mẫu cần xác định
có ADN đích sẽ có sự lai hóa ADN dị và ADN đích làm cho mật độ điện tích trên
bề mặt cảm biến tăng lên khi đó độ dẫn của điện cực làm việc sẽ tăng hơn so với
điện cực chuẩn. Đây là cơ sở để nhận biết quá trình làm việc của cảm biến ADN.
Phần tử cảm nhận là enzim:
Đối với cảm biến cố định bằng màng enzim thường được ứng dụng trong quan trắc
môi trường và công nghệ thực phẩm. Trước khi cố định, bề mặt cảm biến được làm
sạch bằng dung dịch K2Cr2O7 trong H2SO4 98% sau đó cho enzim lên bề mặt vi
điện cực của cảm biến. Chức năng hóa bề mặt cảm biến để xác định nồng độ thuốc
trừ sâu trong nước, điện cực cố định enzim được phủ 1mg AcChE (AcetylCholinesterase) và 1mg BSA (Bovine Serum Albumin) trộn với dung dịch đệm
KH2PO4 20 mM, pH = 7,5 và 10% Glycerol. Điện cực chuẩn được phủ hỗn hợp
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-9-
2mg BSA với 10 µl chất đệm KH2PO4 20 mM, pH = 7,5 với 10% Glycerol. Khi có
nồng độ thuốc trừ sâu - carbonsulfan C20H32N2O3S trong nước làm cho Acetylcholinesrase phân tách thành acetic và choline khi đó proton sinh ra là nguyên nhân
làm thay đổi độ dẫn, lúc này độ dẫn trên màng enzim của điện cực làm việc giảm
so với điện cực chuẩn và tạo sự chênh lệnh tín hiệu điện trên đầu ra của cảm biến
[23].
Phần tử cảm nhận là kháng thể:
Kháng thể bản chất là một loại glycoprotein do kháng ngun kích thích tạo ra và
có thể kết hợp một cách đặc hiệu với kháng nguyên ấy. Kháng thể còn được gọi là
globulin miễn dịch (immunoglobulin), viết tắt là Ig vì khi chạy điện di miễn dịch thì
kháng thể nằm ở vùng globulin [20].
Cấu trúc của kháng thể là một phần tử đối xứng, cấu tạo bởi 2 chuỗi nặng và 2
chuỗi nhẹ giống nhau đôi một.
Chuỗi nhẹ L (light): Mỗi chuỗi nhẹ là một chuỗi polypeptid cấu tạo khoảng 214
axit amin, được đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành 2
vùng. Vùng định hằng C (constant) nằm ở sau, có loại và trình tự axit amin khơng
thay đổi, vùng thay đổi V (variable) nằm ở phía trước có loại và trình tự axit amin
thay đổi tùy theo từng loại kháng thể. Có hai chuỗi nhẹ chuỗi kappa và chuỗi
lamda.
Chuỗi nặng H (heavy): Có cấu tạo tương tự như chuỗi nhẹ, chuỗi polypeptid gồm
440 axit amin, đánh số thứ tự từ đầu NH2 đến đầu COOH và được chia thành 3
hoặc 4 vùng tùy theo từng chuỗi nặng. Vùng C gồm CH1, CH2, CH3, CH4, vùng V
và vùng siêu biến. Có 5 loại chuỗi nặng khác nhau: Chuỗi gamma, chuỗi alpha,
chuỗi muy, chuỗi delta, chuỗi epsilon [18].
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-10-
Sự liên kết giữa các chuỗi, hai chuỗi nặng nối với nhau bằng cầu nối lưu huỳnh (SS), số cầu nối lưu huỳnh thay đổi tùy từng chuỗi. Chuỗi nhẹ nối với chuỗi nặng
bằng cầu nối lưu huỳnh [20,12].
Tính chất và đặc điểm của kháng thể, tính chất của các lớp kháng thể được nêu
trong bảng 1.1 [20].
Bảng 1.1 Tính chất của các kháng thể
Tính chất
Dạng phân tử
IgG
Đơn phân
Chuỗi nặng
Chuỗi nhẹ
Gamma
Kampa
hoặc
Lamda
IgG1, IgG2,
IgG3, IgG4,
Gm
Dưới lớp
Alloptyp chuỗi
nặng
Trọng lượng
phân tử
Hằng số lắng
% gluxit
Nồng độ huyết
tương (g/l)
Thời gian bán
hủy (ngày)
Cố định bổ thể
Gắn trên tế
bào mast
Vai trò
Chuỗi khác
IgA
Đơn phân
Nhị phân
Alpha
Kampa hoặc
Lamda
IgM
Ngũ phân
IgD
Đơn phân
IgE
Đơn phân
Muy
Kampa hoặc
Lamda
Delta
Kampa hoặc
Lamda
Apilon
Kampa hoặc
Lamda
IgA2, IgA1
-
-
-
Am
Mm
-
-
150000
160000
900000
175000
190000
6,6 S
3
12,5
14 S
7
2,1
19 S
10
1,25
7S
9
0,04
8S
13
0,003
23
5,8
5,1
2,8
2,5
+ IgG1,
IgG3, IgG4
+ IgG1,
IgG3, IgG4
Kháng thể
chống
nhiễm vi
khuẩn và vi
rút
-
-
+
-
-
-
-
+
Kháng thể
trên bề mặt
lympho B
trong nhận
diện kháng
nguyên
Kháng thể
chống ký
sinh trùng,
gây dị ứng
-
Kháng thể bảo
vệ bề mặt niêm
mạc chống
nhiễm khuẩn
Kháng thể chủ
yếu trong đáp
ứng tiên phát
chống nhiễm
vi khuẩn và vi
rút
Chuỗi J, mảnh tiết
Chuỗi J
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-11-
Tính kháng thể là khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Đặc
hiệu có nghĩa là kháng thể do kháng ngun nào kích thích tạo ra thì chỉ kết hợp
với kháng ngun ấy mà thơi. Tính kháng thể là đặc điểm quan trọng nhất của
kháng thể.
Tính kháng nguyên của phần tử kháng thể là khả năng kích thích cơ thể khác tạo ra
kháng thể kháng lại chính nó. Lý do là các phần tử kháng thể bản chất là một loại
protit có trọng lượng phân tử đủ lớn, đủ tiêu chuẩn là một kháng nguyên đối với cơ
thể khác.
Kháng ngun (antigen) là những chất có khả năng:
Kích thích được cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch, khả năng này được gọi là tính
sinh miễn dịch của kháng nguyên.
Kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng, khả năng này được gọi là tính đặc hiệu
của kháng ngun.
Kháng ngun thuộc loại protein và polysaccarid có tính sinh miễn dịch cao khi
dùng dạng hòa tan và cả khi chúng nằm trong một dạng cấu trúc phức hợp như vỏ
vi khuẩn. Kháng nguyên càng phức tạp về cấu tạo và kích thước thì chúng càng có
thể kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh [20].
Phản ứng kháng nguyên - kháng thể. sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu
nhờ vào các liên kết lý hóa [12]:
Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Vander - Wals
Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau như nhóm amin và nhóm carboxyl
Lực liên kết giữa các cầu nối hydro với nhau và lực kỵ nước
Phản ứng kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hồn tồn,
nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên - kháng thể.
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-12-
Cố định kháng thể lên cảm biến vi điện cực: cũng như các phương pháp cố định
phần tử sinh học khác, việc cố định kháng thể ban đầu cũng được làm sạch bề mặt
vi cảm biến quá trình này nhằm loại bỏ những chất bám dính trên bề mặt vi cảm
biến và phần không gian silica giữa các vi điện cực để giải phóng nhóm chức - OH,
thuận tiện cho q trình cố định các phần tử sinh học. Có một số kiểu nhóm chức
như Si- OH tạo ra trên bề mặt silica, như silanol germinal và silanol Isolated. Nếu
bề mặt vi cảm biến không được làm sạch đúng cách để loại bỏ chất bẩn, dầu, chất
tẩy rửa, thì nhóm chức - OH sẽ khơng hình thành và lớp silan trên bề mặt vi cảm
biến sẽ không đồng nhất, dẫn đến hiệu quả của q trình cố định khơng cao. Việc
cố định kháng thể sử dụng phương pháp cộng hóa trị dùng APTS được mô tả tại
đây [12].
Sau khi thực hiện làm sạch bề mặt cho cảm biến như đã trình bày ở trên. Để chức
năng hóa bề mặt của cảm biến miễn dịch sử dụng APTS ta thực hiện nhỏ
glutaraldehyde 10% lên bề mặt vi cảm biến và ủ trong 30 phút. Tiếp đó rửa hai lần
bằng nước khử ion và để khô, nhỏ 1mg / mL dung dịch kháng thể của vi rút H5N1
lên bề mặt cảm biến và ủ trong 1 giờ. Tiếp tục rửa bằng dung dịch PBS và nước
khử ion để loại bỏ những thành phần sinh học không gắn kết trên bề mặt. Sau đó
đêm ủ bề mặt cảm biến với 0,1 M glycine - PBS (0,1 M glycine trong 50 mM pBS,
pH = 7,0) trong 30 phút. Quá trình này nhằm gắn kết chặt chẽ kháng thể trên bề
mặt cảm biến. Tất cả các quá trình này đều được thực hiện tại nhiệt độ phịng và áp
suất khí quyển [2]. Chi tiết của quy trình cố định tạo chức năng cho cảm biến được
tác giả trình bày chi tiết trong chương 2 của luận văn.
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-13-
1.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học có rất nhiều ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm, y học dự
phịng, mơi trường, qn sự quốc phịng. Trong nội dung này tác giả trình bày một
số ứng dụng chính.
1.2.1. Trong y tế dự phịng
Trước đây, việc xác định vi rút gây bệnh thường được xác định sử dụng kỹ thuật
lâm sàng như phương pháp phản ứng chuỗi polyme (phương pháp - PCR). Đây là
phương pháp phát hiện vi rút có trong bệnh phẩm lâm sàng hoặc ni cấy vi rút
được định hướng vào những gen tương đối ổn định ở tất cả các loại vi rút hoặc các
gen ngưng kết hồng cầu. Ưu điểm của những phương pháp này cho độ nhạy rất cao,
phát hiện vi rút ngay cả với lượng mẫu nhỏ, rất đặc hiệu. Nhược điểm của các
phương pháp này là thời gian xác định dài có thể lên tới 8 giờ, tiêu tốn nhân lực và
địi hỏi người sử dụng phải có những kiến thức nhất định về chun mơn. Có nhiều
loại cảm biến sinh học dựa trên các phương pháp phân tích truyền thống ứng dụng
cho việc xác định vi rút gây bệnh [22]. Trong đó, nguyên lý của cảm biến sinh học
trên cơ sở vi điện cực được ứng dụng để xác định vi rút gây bệnh được chế tạo dựa
trên công nghệ vi điện tử tạo ra các thanh kim loại có kích thước và khoảng cách cỡ
micromet. Sau đó cố định lên bề mặt điện cực làm việc của cảm biến là kháng thể
hoặc ADN dò của vi rút cần xác định. Khi cho cảm biến đã được chức năng hóa
vào trong mẫu cần xác định loại vi rút, nếu trong mẫu có kháng ngun hoặc ADN
đích của loại vi rút cần xác định sẽ gây ra phản ứng lai hóa ADN dị với ADN đích
hoặc phản ứng kháng ngun - kháng thể làm mật độ điện tích giữa các thanh kim
loại và độ dẫn giữa chúng tăng lên, trong khi đó điện cực chuẩn khơng thay đổi độ
dẫn so với ban đầu tạo ra sai lệnh tín hiệu điện giữa điện cực làm việc và điện cực
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
-14-
chuẩn ở đầu ra. Nếu khơng có ADN đích hoặc kháng ngun của loại vi rút cần xác
định thì tín hiệu điện ra trên hai điện cực không thay đổi [21].
1.2.2. Phát hiện chuyển đổi gen trong thực phẩm
Việc xác định chuyển đổi gen trong cây trồng như đậu tương, ngơ, bơng, cải. Trong
đó việc xác định khả năng kháng sâu bệnh luôn được quan tâm. Xác định nhanh
như quá trình chuyển đổi gen của cây trồng cho thấy hiệu quả kinh tế cao trong
việc đưa cây trồng vào nuôi cấy, làm tăng số lượng sản lượng lương thực, tăng giá
trị dinh dưỡng và không gây ảnh hưởng tới môi trường do sử dụng thuốc bảo vệ
thực vật [21]. Cảm biến vi điện cực sau khi được cố định ADN lên các thanh kim
loại theo một quy trình và bảo quản nhất định được đưa vào ống chứa mẫu dung
dịch có ADN cần xác định, khi có sự lai hóa của ADN dị và ADN đích thì mật độ
điện tích giữa các thanh kim loại tăng làm tăng độ dẫn trên các điện cực. Khi đó tín
hiệu điện khỏi cảm biến thay đổi nếu khơng có sự lai hóa ADN dị và ADN đích thì
tín hiệu điện ra trên các thanh điện cực có giá trị khơng đổi [21].
1.2.3. Quan trắc môi trường
Việc sử dụng cảm biến để xác định các thông số ảnh hưởng tới môi trường sống là
điều cấp thiết hiện nay. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu để sử dụng các loại
cảm biến xác định các chất độc hại gây ảnh hưởng tới môi trường sống như việc sử
dụng cảm biến khí để xác định nồng độ khí thải của các nhà máy, kiểm tra khí thải
của các loại phương tiện giao thông…Trong việc sử dụng cảm biến sinh học để
kiểm tra nồng độ thuốc trừ sâu trong nước [23], hay nồng độ pH trên cơ sở hiệu
ứng trường của bóng bán dẫn ISFET. Đối với cảm biến độ dẫn, sau khi cảm biến
được chế tạo, đóng gói và xử lý bề mặt sau đó đem cố định Acetyl-Cholinesterase
lên điện cực làm việc của cảm biến và phủ BSA (Bovine Serum Albumin) lên điện
cực so sánh nhằm không cho chất ức chế ảnh hưởng tới điện cực so sánh. Khi có
Vũ Quang Khuê, ITIMS 2007-2009
