Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính Protease HIV 1 từ dịch chiết của lá cây thạch châu Pyrenaria Jonqueriana ổi Psidium guajava và Ma hoàng Ephedra Distachya

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1
TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU
(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)
VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Hồng Anh

NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1
TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU
(PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA)
VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA)
Chuyên ngành:
Mã số:

Sinh học thực nghiệm
60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hƣớng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn
thạc sĩ khoa học

TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc bày tỏ lịng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với
GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa và TS. Nguyễn Thị Hồng Loan đã tận tình hƣớng dẫn,
đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và
thực hiện luận văn này. Tôi đã học hỏi đƣợc rất nhiều ở thầy, cô từ kiến thức,
phƣơng pháp nghiên cứu khoa học cũng nhƣ cách xử lý công việc.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo của Khoa
Sinh học cũng nhƣ các thầy, cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa

Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức
nền tảng bổ ích.
Lời cảm ơn tiếp theo tơi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh
viên Phịng Protein tái tổ hợp, Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và
Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt
nhất để tơi học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, ông bà và những ngƣời thân trong
gia đình đã ln dành tình cảm và động viên, khích lệ tơi trong suốt q trình học tập.
Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tơi hồn
thành luận văn.
Luận văn đƣợc thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí của đề tài độc
lập cấp Nhà nƣớc mã số ĐT-PTNTĐ.2012-G/02.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên

Nguyễn Hồng Anh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 ............... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về HIV ......................................................................... 3
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1 ............................................ 4
1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1..................................................... 8
1.2. CÁC CHẤT ỨC CH PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG
ĐIỀU TRỊ AIDS ................................................................................... 11
1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hố học .............................. 12
1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên ............................. 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23

2.1. NGUYÊN LIỆU.................................................................................... 23
2.1.1. Mẫu dƣợc liệu ....................................................................................... 23
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ............................................................. 23
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ ..................................................... 23
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 24
2.3.1. Phân tách các hợp chất từ dịch chiết thực vật ....................................... 24
2.3.2. Xác định cấu trúc của chất đƣợc phân tách ........................................... 24
2.3.3. Xác định hoạt tính ức chế pepsin bằng phƣơng pháp khuếch tán
trên đĩa thạch có chứa cơ chất hemoglobin ........................................... 25
2.3.4. Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến .... 26
2.3.5. Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide đặc hiệu .. 26
Chƣơng 3. K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 28
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CH PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH
CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM
GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.) ............ 28
3.1.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây
Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ........................................ 28


3.1.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Ổi
(Psidium guajava L.) ............................................................................. 30
3.1.3. Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ thân
cây Ma hoàng (Ephedra distachya L.) .................................................. 32
3.2. TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CH PROTEASE
HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHI T LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM
GUAJAVA L.) ....................................................................................... 33
3.2.1. Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease
HIV-1 từ cao Hx của lá Ổi ..................................................................... 34
3.2.2. Kết quả tinh sạch và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1
của hợp chất LO-I.................................................................................. 37

3.2.3. Xác định cấu trúc hợp chất LO-I ........................................................... 39
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC ............ 40
3.3.1. Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic ................... 40
3.3.2. Cơ chế ức chế protease HIV-1 của acid ursolic .................................... 41
3.3.3. Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic ............................................. 43
K T LUẬN ............................................................................................................... 46
KI N NGHỊ .............................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 48
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(Acquired Immunodeffiency Syndrome)

ART

Liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus ( Antiretroviral Treatment)

CBB

Coomassie brilliant blue

DABCYL

4 - [4 '- (dimetylamino) phenyl] azo acid -benzoic

DEPT

Detortionless enhancement by polarization transfer

DMSO

Dimethyl sulphoxide

EDANS

5 - [(2'aminoethyl) -amino] acid naphtalenesulfonic

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ
(Food and Drug Administration)

HIV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời
(Human Immunodeficiency Virus)

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao
(High-Performance Liquid Chromatography)

IC

Nồng độ ức chế (Inhibitory Concentration)

kDa

kilo Dalton

MS

Phƣơng pháp khối phổ (Mass spectrometry)

NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

13

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13

1

Phổ cộng hƣởng từ proton

C-NMR

H-NMR

PI

Chất ức chế protease (Protease Inhibitor)

SDS -PAGE

Điện di gel polyacrylamide có SDS (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

TMS

Tetramethyl silan

UNAIDS

Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hợp quốc (United Nations
Programme on HIV/AIDS)

UPLC

Sắc kí lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol ..... 9
Bảng 1.2. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các triterpen .................................. 18
Bảng 2.1. Mức độ ức chế pepsin của các hợp chất thực vật theo đƣờng kính
vịng phân giải ........................................................................................................... 25
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sử dụng cơ chất
peptide đặc hiệu L6525 ............................................................................................. 27
Bảng 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Thạch châu .................. 30
Bảng 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi .................................. 31
Bảng 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ thân Ma hoàng ................. 33
Bảng 3.4. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn từ cao Hx lá cây Ổi ............. 35
Bảng 3.5. Khả năng ức chế pepsin của hợp chất LO-I từ lá cây Ổi ......................... 38
Bảng 3.6. Sự thay đổi Km và Vmax của protease HIV-1 khi có và khơng có acid ursolic ... 42

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc dạng dimer (A) và cấu trúc chi tiết (B) của protease HIV-1.............. 5
Hình 1.2. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol ...................... 7
Hình 1.3. Nguyên tắc hoạt động cơ chất huỳnh quang của protease HIV-1 .................. 11
Hình 3.1. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Thạch châu ......................... 29
Hình 3.2. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá cây Ổi ................................. 31
Hình 3.3. Khả năng ức chế pepsin của các dịch chiết từ cây Ma hồng......................... 32
Hình 3.4. Sắc ký đồ SKLM định tính các phân đoạn của dịch chiết lá cây Ổi .............. 34
Hình 3.5. Khả năng ức chế pepsin của các phân đoạn tinh sạch từ cao Hx của lá Ổi ... 35
Hình 3.6. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của dịch chiết phân đoạn PĐ2 ................... 36
Hình 3.7. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn PĐ2..................................................... 37
Hình 3.8. Khả năng ức chế pepsin các phân đoạn tinh sạch từ dịch chiết lá cây Ổi ...... 37
Hình 3.9. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1 khi có và khơng có LO-I ..... 39
Hình 3.10. Cơng thức cấu tạo hợp chất acid ursolic (LO-I) ............................................ 40
Hình 3.11. Hoạt tính ức chế của acid ursolic với protease HIV-1 (A) và pepsin (B) .... 41
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng phân giải cơ chất của protease HIV-1
vào nồng độ cơ chất trong điều kiện có và khơng có chất ức chế theo phƣơng trình
Lineweaver Burk ................................................................................................................ 42
Hình 3.13. Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của các dạng chế phẩm acid ursolic ........ 45


MỞ ĐẦU
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây ra bởi virus gây suy giảm
miễn dịch ở ngƣời (HIV). Đây là virus thuộc họ Retroviridae và có hai type chính là
HIV-1 và HIV-2, trong đó type 1 xuất hiện phổ biến và là nguyên nhân chính gây ra
AIDS ở ngƣời. Cho đến nay, dù đã có những chƣơng trình hành động tồn cầu cùng
với sự phát triển của các phƣơng pháp điều trị, AIDS vẫn là đại dịch của toàn nhân loại
và cần thiết phải tăng cƣờng các biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu quả.

Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp rất nhiều khó khăn
và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, thƣờng xuyên xảy ra đột biến
ở vùng gen mã hóa cho kháng ngun. Vì vậy, cho đến hiện nay, ngƣời nhiễm HIV-1
muốn kéo dài cuộc sống chỉ có con đƣờng duy nhất là sử dụng liệu pháp dùng thuốc
kháng retrovirus (ART) [39].
Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease là enzyme có tác dụng phân cắt
các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng
trong quá trình trƣởng thành của virus. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây
đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus vẫn hình thành nhƣng khơng
đƣợc đóng gói phù hợp để tạo thành virus hồn chỉnh nên chúng khơng có khả năng
xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [26]. Vì vậy, một số chất ức chế protease HIV-1 (PI)
đã đƣợc phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. Tuy nhiên, việc sử
dụng thuốc trong thời gian dài với nồng độ cao cùng với tốc độ đột biến lớn của
HIV-1 dẫn đến sự xuất hiện các chủng virus kháng thuốc là một trong những
nguyên nhân chính gây thất bại điều trị với ART nói chung và PI nói riêng. Hơn
nữa, việc thiết kế các chất PI mới không phải dễ dàng, không định hƣớng, phải sàng
lọc trên số lƣợng khá lớn các hợp chất thiết kế tƣơng tự nhau trên cơ sở hiểu biết về
cấu trúc và chức năng của protease HIV-1. Mặt khác, những chất này nhiều khi
không thân thiện với con ngƣời, phải trải qua nhiều bƣớc thử nghiệm. Chính vì vậy,
bên cạnh các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học trên thế giới cũng khơng
ngừng tìm kiếm và chọn lọc các chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức
chế protease của HIV-1 (protease HIV-1).
1


Việt Nam với nguồn thực vật phong phú và nhiều cây thuốc, vị thuốc có
giá trị lớn với sức khỏe con ngƣời. Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam
có hơn 12.000 lồi thực vật, trong đó có gần 4.000 loài đƣợc dùng làm thuốc
trong y học dân gian và y học cổ truyền. Nhƣ vậy, thực vật Việt Nam cũng s là
nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế

protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân
HIV/AIDS. Tuy nhiên, cho đến nay chúng ta chƣa khai thác nguồn tài nguyên
phong phú của đất nƣớc theo hƣớng này.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết của lá cây Thạch
châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) và Ma hoàng (Ephedra
distachya)” nhằm thu nhận đƣợc chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ
dƣợc liệu Việt Nam.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1

1.1.1. Giới thiệu chung về HIV
Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình phát
triển xã hội. Sau 3 thập kỷ phát hiện mà đầu tiên là ở các nƣớc phát triển, HIV/AIDS
đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Phi và các nƣớc châu Á. Đến
nay vẫn chƣa có vaccine phịng ngừa HIV hay thuốc chữa trị AIDS đặc hiệu.
Theo chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính đến
cuối năm 2014, thế giới có khoảng 36,9 triệu ngƣời (dao động trong khoảng từ 34,3
triệu đến 41,4 triệu) đang mang căn bệnh AIDS, trong đó số đối tƣợng nhiễm mới là
2 triệu ngƣời và có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS trong năm 2014.
Khu vực các nƣớc Châu Phi gần Sahara (Sub-Saharan Africa) vẫn là nơi có số
ngƣời nhiễm HIV cao nhất trên thế giới với hơn 2/3 dân số, tiếp đến là châu Á Thái
Bình Dƣơng với 5,0 triệu ngƣời nhiễm HIV [91].
Ở Việt Nam, theo số liệu mới nhất của Cục phòng chống HIV/AIDS, Bộ Y tế

(Báo cáo số 561/BC-BYT của Cục phòng chống HIV/AIDS, ngày 18/6/2015) trong
6 tháng đầu năm 2015, số ngƣời xét nghiệm phát hiện mới nhiễm HIV là 3.204
ngƣời, số ngƣời nhiễm HIV chuyển sang giai đoạn AIDS là 1.326 ngƣời, số ngƣời
nhiễm HIV tử vong là 438 và số tử vong báo cáo bổ sung quý II/2015 là 1500
ngƣời. Lũy tích số ngƣời nhiễm HIV đang còn sống 227.114 ngƣời, số bệnh nhân
AIDS là 71.115 và số tử vong là 74.442 ngƣời. Nhìn chung, lây truyền HIV/AIDS
qua đƣờng tình dục ngày càng gia tăng liên tục từ 2007 trở lại đây; số ngƣời nhiễm
HIV phát hiện mới tiếp tục có xu hƣớng giảm, nhƣng lũy tích số ngƣời nhiễm HIV
cịn sống tiếp tục gia tăng.
Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phƣơng thức điều trị phổ biến nhất
hiện nay vẫn là liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug therapy)
bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase và thuốc ức chế

3


protease (PI) [39]. Trong đó, protease đƣợc mã hóa bởi gen pol của virus có chức
năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành
các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hồn chỉnh. Nếu protease bị mất
hoạt tính, HIV-1 khơng đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hồn chỉnh [26]. Vì vậy,
protease của HIV-1 (protease HIV-1) là một trong những đích quan trọng để phát
triển thuốc điều trị AIDS.
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1
Về cấu trúc, protease HIV-1 là một protease aspartyl (có chứa gốc aspartic
trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A 2. Năm 1989, Navia và tập thể từ
phịng thí nghiệm của Merck là nhóm đầu tiên cơng bố cấu trúc tinh thể của
protease HIV-1. Sau đó, một cấu trúc chính xác hơn đã đƣợc báo cáo bởi Kent và
tập thể [16]. Đến năm 2010, với sự đóng góp đáng kể của phƣơng pháp nhiễu xạ
tia X, hơn 400 cấu trúc của protease HIV-1 (kiểu dại và dạng đột biến) trong phức
hệ với các chất ức chế khác nhau đã đƣợc làm sáng tỏ. Những dẫn liệu này giúp

các nhà nghiên cứu có đƣợc hiểu biết sâu sắc về các kiểu liên kết của enzyme với
chất ức chế và cơ sở phân tử của kháng thuốc [10, 83].
Protease HIV-1 là một homodimer, mỗi monomer gồm 99 acid amin và đƣợc
sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng. Mơ hình cấu trúc bậc hai đƣợc thể hiện rõ ràng
ở phiến nếp gấp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [37].
Cấu tạo của protease HIV-1 có thể chia thành ba vùng chính: vùng dimer
hóa, vùng lõi và vùng mũ (Hình 1.1.). Trong đó, vùng dimer hóa đƣợc hình thành
nhờ tƣơng tác giữa 8 gốc acid amin 1 - 4 (vùng N đầu cùng) và 96 - 99 (vùng C tận
cùng) từ mỗi monomer và các acid amin trong trung tâm hoạt động 24 - 29. Các gốc
acid amin này là 2 đầu C của phiến gấp nếp β đƣợc cấu tạo theo nguyên tắc các acid
amin kỵ nƣớc Pro1, Ile3, Leu97 và Phe99 hƣớng vào nội phân tử enzyme còn các
gốc phân cực Gln2, Thr4, Thr96 và Asn98 thì quay ra ngồi tiếp xúc với dung môi
[22]. Bốn gốc ở đầu C tận cùng tham gia vào tƣơng tác giữa các chuỗi để duy trì sự
ổn định của cấu trúc dimer, bao gồm 34 liên kết hydro và 4 cầu muối. Tƣơng tác

4


giữa các gốc Ile50 và Gly51’; Asp29, Arg87 và Arg88’ cũng ảnh hƣởng đến sự ổn
định của cấu trúc dimer. Khi enzyme gắn thêm chất ức chế hoặc cơ chất, sự ổn định
của cấu trúc dimer đƣợc tăng cƣờng. Vùng lõi gồm 4 đầu N sợi β (các gốc acid
amin 10 - 32 và 63 - 85 của mỗi monomer) có vai trị quan trọng đối với sự ổn định
cấu trúc dimer và hoạt tính xúc tác của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme
nằm trong vùng lõi và bao gồm ba gốc acid amin từ mỗi monomer. Vùng mũ đƣợc
mở rộng tạo thành một vùng gấp xuống đóng vai trò giống nhƣ một giá đỡ cho
chuyển động của vùng mũ. Vùng mũ nằm ở phần rộng nhất của enzyme bao gồm
các acid amin từ 33 - 43 và 44 - 63 bao quanh trung tâm hoạt động. Đầu N của vùng
này rất giàu glycine, do đó tăng cƣờng tính linh hoạt về hình dáng của các enzyme ở
dạng tự do [37, 78, 85].

Hình 1.1. Cấu trúc dạng dimer (A) và cấu trúc chi tiết (B) của protease HIV-1 [43]
(Vùng dimer hóa (D), vùng mũ (F), và trung tâm hoạt động (A))

Trung tâm hoạt động của protease chứa bộ ba Asp - Thr - Gly nằm tại mặt
phân giới của dimer. Tại một monomer nhóm bộ ba xúc tác đƣợc đặt ở vị trí 25 - 26 27 và do tính đối xứng ở monomer cịn lại là 25’ - 26’ - 27’. Trung tâm hoạt động
đƣợc làm ổn định nhờ mạng lƣới các liên kết hydro giữa các gốc acid amin chính tại
vị trí này với các gốc acid amin xung quanh. Cấu trúc khắt khe của trung tâm hoạt
động là do gốc Thr26 hình thành các liên kết hydro với nhóm amin của Thr26' và với
nhóm oxygen carbonyl của Leu24 nằm ở bên cạnh gốc Asp đóng vai trò xúc tác. Mỗi
gốc Asp25 cũng đƣợc liên kết với nhóm NH của Gly27'. Phân tử Asp là cần thiết cho
cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease. Vai trò quan trọng của Asp25 đƣợc làm
rõ khi thay thế Asp bằng các acid amin khác dẫn đến enzyme bị bất hoạt [27].
5


Để làm rõ cơ sở phân tử và đánh giá những tiềm năng của một chất ức chế
chống lại sự kháng thuốc, Hou và tập thể đã tiến hành nghiên cứu vai trò của các
gốc riêng biệt trên phân tử protease HIV-1 dựa trên sự kết hợp giữa enzyme với 6
loại cơ chất và 8 chất ức chế đƣợc FDA cơng nhận. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự
đóng góp của các gốc khác nhau vào liên kết giữa enzyme với cơ chất là khác
nhau. Những gốc đóng góp đáng kể vào liên kết giữa protease với cơ chất chủ yếu
nằm ở ba vùng, trung tâm hoạt động (Asp25, Gly27, Ala28, Asp29, và Asp30),
vùng mũ (Ile47, Gly48, Gly49, và Ile50) và vùng đầu C tận cùng (Pro81 và Ile84).
Trong đó, các gốc Asp25, Gly27, Ala28, Asp29, và Gly49 có tính bảo thủ cao. Đột
biến kháng thuốc thƣờng xảy ra tại các gốc ít có tính bảo thủ, làm suy yếu sự gắn
kết của enzyme với chất ức chế nhiều hơn so với cơ chất. Trong 5 gốc nêu trên, 4
gốc trong số đó nằm ở lõi enzyme chứa trung tâm hoạt động bao gồm Asp25,
Gly27, Ala28, và Gly49. Tất cả các thuốc ức chế nghiên cứu đều có tƣơng tác
mạnh với cả 4 gốc này. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã đƣa ra kết luận Asp29 là quan
trọng hơn so với 4 gốc còn lại nếu chúng ta muốn thiết kế các chất ức chế ít xảy ra

tình trạng kháng thuốc [40].
Về chức năng, sau khi đƣợc giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1
tồn tại nhƣ một hạt virus khơng có khả năng lây nhiễm đƣợc gọi là virion. Để trở
thành một hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua quá trình sắp xếp lại cấu trúc
một cách mạnh m . Sự chuyển đổi trạng thái này là nhờ khả năng phân cắt các
chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) của protease để tạo thành các protein cấu trúc và
chức năng cần thiết cho sự hình thành virus hồn chỉnh (Hình 1.2.). Cụ thể,
protease HIV-1 phân cắt các polyprotein tiền thân: gag (gagPr55) thành các
protein cấu trúc: matrix (MA, p17), capsid (CA, p24), nucleocapsid (NC, p7) có
vai trị trong lắp ráp và xác định hình thái lớp vỏ virus trƣởng thành cùng protein
p6 và hai peptide spacer nhỏ (p1 và p2); gag-pol Pr160 thành 3 enzyme quan
trọng: protease, reverse transcriptase và intergrase cần thiết cho quá trình sao chép
của virus HIV [32].

6


Hình 1.2. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol [9]

Ngồi vai trị phân cắt các tiền chất của virus, protease HIV-1 cũng cắt các
protein của tế bào chủ. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự phân giải và suy
giảm các protein của tế bào dẫn tới cả quá trình chết hoại tử và chết tự hủy ở các tế bào
CD4+ T. Sự suy giảm các tế bào CD4+ T là một dấu hiệu của HIV/AIDS. Theo nghiên
cứu của Blanco và tập thể, sự biểu hiện của protease HIV-1 trong các tế bào thận khỉ
COS7 dẫn đến các q trình có liên quan tới hoại tử tế bào nhƣ: sự tích lũy các mảnh
vỡ tế bào, sự trƣơng phồng tế bào, hình thành các khơng bào và mất màng plasma toàn
vẹn. Khi tiến hành xử lý cho các tế bào COS7 và các tế bào lympho ngƣời C8166 có
biểu hiện protease HIV-1 bằng chất ức chế protease - Saquinavir, nhóm nghiên cứu
nhận thấy q trình hoại tử của tế bào bị ức chế. Hơn nữa, khi loại bỏ Saquinavir khỏi
các tế bào C8166 có biểu hiện protease thì protease HIV-1 lại đƣợc hoạt hóa và quá

trình hoại tử của tế bào diễn ra. Những kết quả này gợi ý rằng quá trình hoại tử là kết
quả trực tiếp của sự phân giải protein bởi protease HIV-1[14].
Protease HIV-1 cảm ứng quá trình chết tự hủy ở các tế bào CD4+ T bằng
cách giảm nồng độ protein Bcl-2, một thành viên của họ các protein Bcl-2 có vai trị
chống lại q trình tự hủy của tế bào. Thơng thƣờng, Bcl-2 tạo dimer hóa với các
nhân tố pro-apototic (nhân tố tự hủy) của họ protein Bcl-2, do đó ức chế quá trình tự
hủy của tế bào. Protease HIV-1 cũng gây ra chết tự hủy thông qua sự phân giải

7


Procaspase 8 ở giữa gốc 355 và 356 để tạo thành Casp8p41, một dạng cắt ngắn của
Procaspase 8 là tín hiệu cho quá trình chết của tế bào [88]. Nhƣ vậy, có thể dễ dàng
nhận thấy vai trị quan trọng của protease HIV-1 trong việc phân cắt các protein tiền
thân của virus, lắp ráp của các virion trƣởng thành và góp phần gây độc cho tế bào
vật chủ trong quá trình xâm nhiễm.
1.1.3. Phân tích hoạt độ của protease HIV-1
Protease HIV-1 có chức năng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và
gag-pol của virus. Trung tâm hoạt động của protease bao gồm bộ ba Asp25, Thr26
và Gly27; nếu đột biến xảy ra tại Asp25 s dẫn đến mất hoạt tính của protease
HIV-1. Protease HIV-1 cũng có hoạt tính tự cắt xảy ra sau khi protein gag-pol
hình thành dimer hóa, qua đó cho phép giải phóng chính nó ra khỏi polyprotein
tiền thân. Hoạt tính của enzyme này là tuyệt đối cần thiết cho q trình hình thành
virus hồn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng của protease trong liệu pháp dùng
thuốc chống HIV-1. Một trong các chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 đƣợc phát
hiện sớm nhất là pepstatin A - chất ức chế protease aspartyl - làm mất hoạt tính
của protease HIV-1 dẫn đến tạo ra các chủng virus không hồn chỉnh và khơng có
khả năng nhiễm vào tế bào chủ [68].
Phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 cần thiết phải có các phƣơng pháp xác
định hoạt độ của protease phù hợp. Khác với các protease khác, protease HIV-1 chỉ

cắt các cơ chất có liên kết đặc hiệu tƣơng tự nhƣ các vị trí cắt của enzyme trong cấu
trúc tự nhiên của HIV. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và
gag-pol đƣợc nêu ở Bảng 1.1. Tại vị trí P1 và P1’, các gốc kỵ nƣớc kích thƣớc lớn
chiếm ƣu thế nhƣng khơng có Val và Ile. Pro thƣờng xuất hiện tại P1’, hầu nhƣ
không có ở P1, trong khi đó Phe chủ yếu xuất hiện ở P1. Các gốc phân cực kích
thƣớc nhỏ thƣờng xuất hiện ở P2, P2’; các gốc đa dạng hơn từ P3 trở đi và thƣờng
là Gln hoặc các gốc acid amin phù hợp khác, P4 thƣờng là acid amin có khối lƣợng
phân tử nhỏ. Vị trí cắt ƣa thích của protease HIV-1 là liên kết Aro-Pro, trong đó Aro
là một trong ba acid amin thơm Tyr, Phe hoặc Trp [78].

8


Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol [78]
Các vị trí cắt

P4

P3

P2

P1

P1’

P2’

P3’

MA-CA

Ser

Gln

Asn

Tyr

Pro

le

Val

CA-p2

Ala

Arg

Val

Leu

Ala

Glu

Ala

p2-NC

Ala

Thr

Ile

Met

Met

Gln

A g

NC -p1

Arg

Gln

Ala

Asn

Phe

Leu

Gly

p1-p6

Pro

Gln

Asn

Phe

Le

Gln

Ser

Trên p6

Lys

Glu

Leu

Tyr

Pro

Leu

Thr

TFP-p6pol

Asp

Leu

Ala

Phe

Leu

Gln

Gly

p6pol - PR

Ser

Phe

Asn

Phe

Pro

Gln

Ile

PR-RT

Thr

Leu

Asn

Phe

Pro

Ile

Ser

p66-p51

Ala

Glu

Thr

Phe

Tyr

Val

Asp

RT-IN

Arg

Lys

Ile

Leu

Phe

Leu

Asp

Trên protein gag

Trên protein pol

Do protease HIV-1 chỉ thủy phân peptide hay protein chứa những trình tự đặc
hiệu, không thủy phân các protein thông thƣờng nên việc xác định hoạt độ của protease
chỉ có thể đƣợc thực hiện khi sử dụng các cơ chất đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự
phân cắt của protease HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất là các chuỗi peptide có trình tự
giống với một trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi
polyprotein gag và gag-pol của HIV-1 [34]. Tùy vào phức chất hóa học khác nhau gắn
với chuỗi peptide cơ chất mà s có phƣơng pháp đo hoạt độ thích hợp. Dƣới đây là một
số phƣơng pháp xác định hoạt độ của protease HIV-1 đƣợc sử dụng phổ biến.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed Phase HPLC) định
lƣợng sản phẩm phân cắt từ cơ chất tổng hợp: Billich và tập thể (1988) đã sử dụng
một số peptide tổng hợp có 7 - 18 acid amin chứa trình tự cắt đặc hiệu của protease
HIV-1 tƣơng tự nhƣ ở gag và gag-pol [13]. Các cơ chất đƣợc ủ với protease HIV-1
trong vòng từ 1 - 8 giờ ở 37 ºC. Sản phẩm cắt đƣợc phân tích bằng HPLC pha đảo

9


trên cột Peptid-TS 250 × 4,6 mm, rửa chiết với nồng độ tăng dần của acetonitrile
trong acid phosphoric 50 mM. Phƣơng pháp có độ nhạy cao nhƣng nhƣợc điểm là:
tiêu tốn nhiều thời gian, khơng thích hợp làm nhiều mẫu và thiếu tính liên tục. Những
hạn chế này của HPLC đã dần đƣợc khắc phụ bằng cách sử dụng phƣơng pháp sắc ký
lỏng siêu hiệu năng UPLC (Ultra performance liquid chromatography) để tăng độ
phân giải, độ nhạy và số lƣợng. So với HPLC, UPLC có q trình chuẩn bị mẫu đơn
giản, thời gian phân tích ngắn và có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời
nhiều chất ức chế. Phƣơng pháp này có thể hữu ích trong việc xác định nồng độ của
các chất ức chế protease trong huyết tƣơng để theo dõi, điều trị thuốc và trong các
nghiên cứu lâm sàng [55].
Phƣơng pháp quang phổ kế với cơ chất peptide có liên kết đặc hiệu của
protease HIV-1: cơ chất peptide hấp thụ cực đại tại bƣớc sóng nhất định trong
vùng tử ngoại. Dƣới tác dụng của protease, liên kết bị phân cắt, độ hấp thụ ánh sáng

giảm dần theo thời gian tác dụng của enzyme. Dựa trên nguyên tắc này, Richards và
tập thể (1990) đã tổng hợp 11 peptide dựa trên trình tự 7 acid amin tƣơng ứng với vị
trí phân cắt giữa p17 và p24 trên polyprotein gag để làm cơ chất cho phân tích hoạt
độ protease HIV-1. 11 cơ chất này có gốc P1 là norleucine (Nle- có cơng thức phân
tử giống leu nhƣng mạch C chỉ gồm 5 C, có một nhánh metyl ở C5); Met, Phe, Ala
hoặc Tyr ở gốc P1’ đƣợc thay thế bằng 4-NO2-phenyalanine (Nph) [64]. Các gốc
P1-P1’ hấp thụ cực đại trong dải bƣớc sóng 284 - 324 nm, khi bị phân cắt s mất khả
năng hấp thụ ánh sáng, do đó độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng s giảm dần theo thời
gian. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện nhanh, không tốn nhiều thời gian, liên tục và cho
số liệu chính xác.
Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Dựa trên trình tự cắt của protease
HIV-1, Taylor và tập thể (1992) đã tổng hợp một cơ chất huỳnh quang DABCYLSerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS để đo hoạt độ của enzyme [76]. Cơ chất đƣợc
đặc trƣng bởi chất phát quang là acid 5 - [(2'aminoethyl)-amino] naphtalenesulfonic
(EDANS) và chất thu tín hiệu acid 4 - [4 '- (dimetylamino) phenyl] azo-benzoic
(DABCYL) (Hình 1.3.). Vùng bƣớc sóng phát huỳnh quang của chất huỳnh quang

10


phải trùng khớp với bƣớc sóng kích thích của chất thu tín hiệu, qua đó đảm bảo sự
phát huỳnh quang đƣợc dập tắt thông qua truyền năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh
quang (Fluorescent resonance energy transfer - FRET). Vị trí các chất phát và thu tín
hiệu huỳnh quang trên chuỗi peptide phải nằm cách nhau một khoảng nhất định,
thƣờng 10 - 100 Å. Khi protease HIV-1 thủy phân liên kết Tyr-Pro, DABCYL tách ra
khỏi phần gắn EDANS, nhờ đó EDANS phát ra huỳnh quang có thể đo đƣợc dƣới tác
dụng của ánh sáng kích thích. Mức độ phát huỳnh quang tăng tùy thuộc vào mức độ
hoạt động của enzyme.

Hình 1.3. Nguyên tắc hoạt động cơ chất huỳnh quang của protease HIV-1 [93]

Phƣơng pháp này ít tốn thời gian, dễ thao tác, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao
hơn quang phổ thơng thƣờng và đƣợc xem là phƣơng pháp hiện đại nhất hiện nay để
xác định hoạt độ protease HIV-1. Tuy nhiên, u cầu bắt buộc là phịng thí nghiệm
phải có máy quang phổ kế huỳnh quang với các hệ thống ánh sáng kích thích phù hợp.
Dựa trên nguyên tắc này, nhiều cơ chất huỳnh quang của protease HIV-1 với trình
tự acid amin và cặp huỳnh quang khác nhau đã đƣợc phát triển.
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG
ĐIỀU TRỊ AIDS
Những nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, thành phần và chức năng của các protease
HIV-1 là cơ sở tạo ra các PI đầu tiên vào những năm đầu thập kỷ 90. Thiết kế chất ức
chế dựa trên nghiên cứu cấu trúc là ứng dụng lớn nhất của protease giúp kéo dài cuộc

11


sống của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những chất ức chế này đã đƣợc cải biến bằng
nhiều cách để ăn khớp chính xác vào trung tâm hoạt động của protease HIV-1 [49].
1.2.1. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hố học
Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị
HIV/AIDS [15]. Những hiểu biết đầy đủ về cấu trúc của protease HIV-1 ở dạng
dimer và tính đặc hiệu của enzyme với cơ chất là cơ sở để thiết kế các chất ức chế
protease một cách chính xác [26]. Nhìn chung, các chất ức chế protease có thể
phân chia thành hai nhóm lớn: i) các chất ức chế có bản chất peptide và ii) các
chất ức chế khơng phải peptide [85]. Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ
chất tự nhiên mang liên kết đặc hiệu của protease HIV-1. Chúng đƣợc thiết kế
giống với dạng trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trong quá trình protease
xúc tác. Cấu hình này giúp cho chất ức chế gắn chặt vào trung tâm hoạt động của
protease. Trong khi đó, nhóm chất ức chế khơng phải peptide lại gắn với phân tử
H2O trong trung tâm hoạt động của protease làm cho protease không gắn đƣợc với
các polyprotein tiền thân của HIV-1 để thực hiện chức năng của mình.

Cho đến nay, đã có 8 thuốc PI đƣợc FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân
nhiễm HIV, bao gồm: Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, Indinavir, Nelfinavir,
Saquinavir, Tipranavir và Ritonavir. Tất cả các thuốc này, ngoại trừ Tipranavir đều
thuộc nhóm chất ức chế có dạng peptide và liên kết với trung tâm hoạt động của
protease nhƣ là chất ức chế cạnh tranh [44]. Để đánh giá mức độ mạnh yếu của
các chất ức chế các nhóm nghiên cứu trƣớc thƣờng sử dụng giá trị IC 50 và IC90
(nồng độ của chất ức chế mà tại đó 50% và 90% hoạt tính của enzyme bị ức chế).
Saquinavir, phát triển bởi Công ty Roche, là chất ức chế đầu tiên đƣợc FDA
phê duyệt trong tháng 12 năm 1995. Cơ sở của thiết kế dựa trên khả năng phân cắt
các liên kết bất thƣờng giữa Tyr-Pro hoặc Phe-Pro trên chuỗi polypeptide pol tiền
thân của protease. Do liên kết amide của gốc Pro không dễ bị phân cắt bởi các
endopeptidase của động vật có vú, thiết kế chất ức chế protease dựa trên tiêu chuẩn
này s tạo ra các chất ức chế đặc hiệu và có ái lực cao với protease [10]. Các nghiên

12


cứu trong phịng thí nghiệm cho thấy, Saquinavir có hoạt tính ức chế cao với giá trị
IC90 là 6 nM [65]. Tuy nhiên, Saquinavir lại có hoạt tính sinh học thấp theo đƣờng
uống và nhanh chóng bị phân hủy trong cơ thể.
Indinavir, Nelfinavir và Ritonavir đều đƣợc thiết kế dựa trên chức năng nhận
biết trình tự acid amin tƣơng tự nhƣ Saquinavir. Trong đó, Ritonavir đƣợc phát triển
bởi phịng thí nghiệm của Abbott là chất ức chế protease HIV thứ hai đƣợc cấp phép
tại Hoa Kỳ. Đây là một chất ức chế mạnh và có chọn lọc của các protease HIV.
Trong điều kiện in vitro, Ritonavir đã đƣợc chứng minh có khả năng ức chế các
chủng HIV-1 phân lập với IC90 vào khoảng 70 - 200 nM [51]. Tác dụng phụ của
thuốc là tƣơng tác thuốc cao nên nhiều thuốc bị chống chỉ định khi đang dùng
Ritonavir, xảy ra nhiều rối loạn chuyển hóa, giảm chức năng gan.
Indinavir, đƣợc phát triển bởi Merck & Co., là chất ức chế protease HIV thứ
ba đƣợc cấp phép. Đây là một chất ức chế mạnh và chọn lọc của protease ở nồng độ

0,6 nM. Indinavir đƣợc tăng cƣờng độ hịa tan, hoạt tính sinh học theo đƣờng uống
rất tốt và ức chế virus với nồng độ từ 50-100 nM [31]. Mặc dù vậy, có một số vấn
đề liên quan đến Indinavir đó là thuốc gây sỏi thận ở khoảng 5 - 25% số bệnh nhân.
Ngồi ra, thuốc cịn có tác dụng phụ trên da, niêm mạc và nhiều bệnh nhân bị tăng
bilirubin không triệu chứng. Do đó, hiện nay Indinavir vẫn có vai trò thứ yếu trong
điều trị HIV.
Nelfinavir cũng là một trong các chất ức chế protease đƣợc sử dụng nhiều
nhất. Ở điều kiện in vitro, Nelfinavir ức chế protease HIV-1 mạnh với Ki là 2,0 nM
[47]. Thuốc này đã đƣợc chứng minh có khả năng kháng lại một số chủng HIV-1 và
HIV-2 trong phịng thí nghiệm và trên lâm sàng với IC50 là 9 - 60 nM [60]. Tác
dụng của Nelfinavir đƣợc tăng cƣờng khi sử dụng cùng các thuốc kháng retrovirus
khác [59]. Các dữ liệu lâm sàng cho thấy thuốc có nồng độ cao trong các hạch bạch
huyết ở mạc treo ruột, lá lách và có hoạt tính sinh học tốt theo đƣờng uống [71].
Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir và Tipranavir cũng đều là các thuốc có hiệu
lực kháng virus mạnh. Tuy nhiên, việc sử dụng các thuốc này cũng đi kèm với các tác
dụng phụ không mong muốn nhƣ: tăng bilirubin, rối loạn mỡ máu, tăng men gan…

13


Bên cạnh các tác dụng phụ, khi sử dụng các thuốc tổng hợp hóa học để điều
trị cho các bệnh nhân nhiễm HIV, một vấn đề quan trọng phải xem xét tới đó là đột
biến kháng thuốc của HIV-1. Nguyên nhân là do HIV thuộc nhóm retrovirus (hệ
gen RNA) nên có tốc độ đột biến cao, trong số này có nhiều đột biến mã hóa cho
các enzyme đích, làm cho chúng trở nên kháng lại các thuốc điều trị. Quá trình
kháng thuốc của protease thƣờng phát triển chậm, cần có nhiều đột biến tích lũy
trƣớc gọi là hàng rào di truyền. Có thể phân biệt thành các đột biến chính và các đột
biến phụ. Các đột biến chính chịu trách nhiệm cho sự kháng về kiểu hình. Đây là các
đột biến đƣợc chọn lọc sớm trong quá trình hình thành kháng thuốc và nằm ở trung
tâm hoạt động của protease HIV-1. Chúng làm giảm khả năng liên kết của protease

HIV-1 với chất ức chế và giảm hoạt động của enzyme. Các đột biến phụ nằm bên
ngoài trung tâm hoạt động và thƣờng xảy ra sau đột biến chính. Đột biến phụ đặc
biệt thƣờng đƣợc tìm thấy ở các vị trí đa hình của các phân type khơng phải B và có
thể bù đắp cho sự giảm hoạt động của protease gây ra bởi các đột biến chính [39].
Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến PI rất rộng, có thể do sự
đa hình xảy ra ở 49 gốc acid amin trong tổng số 99 gốc acid amin của protease. Khi
điều trị bằng các thuốc ức chế protease khơng tăng cƣờng, các đột biến chính làm
giảm rõ rệt hoạt tính của các thuốc chẳng hạn nhƣ: khi điều trị Saquinavir đột biến
G48V làm giảm độ nhạy với Saquinavir 10 lần, nếu kèm thêm đột biến L90M mức
độ nhạy cảm với Saquinavir giảm rõ rệt trên 100 lần [45]; điều trị bằng Nelfinavir
cũng có thể gặp thất bại nếu có đột biến L90M. Đối với các chất ức chế protease
tăng cƣờng phải cần sự xuất hiện của nhiều đột biến đồng thời mới xảy ra tình trạng
kháng thuốc, chẳng hạn hiệu lực của Saquinavir tăng cƣờng chỉ bị giảm khi có ít
nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V, G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A,
I84V và L90M [82].
1.2.2. Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên
Mặc dù PI tổng hợp hố học có tính đặc hiệu cao nhƣng nhƣợc điểm là gây ra
nhiều tác dụng phụ không mong muốn khi sử dụng trong thời gian dài và khả năng
kháng thuốc cao. Do đó, sự ra đời của các loại thuốc PI mới chống HIV/AIDS là hết

14


sức cần thiết. Tuy nhiên, việc thiết kế các chất mới thƣờng khá phức tạp, phải trải qua
nhiều bƣớc thử nghiệm và khơng thân thiện với con ngƣời. Chính vì vậy, bên cạnh
các thuốc tổng hợp hóa học, các nhà khoa học cũng khơng ngừng tìm kiếm và chọn
lọc các chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1.
Nhiều dịch chiết từ thực vật và vi sinh vật đã đƣợc sử dụng để chống nhiễm
trùng, chống lại sự phát triển của các khối u cũng nhƣ có hoạt tính kháng HIV-1 và
protease HIV-1. Otake và tập thể đã nghiên cứu tác dụng của 30 dịch chiết thực vật

lên hoạt động của HIV-1 và nhận thấy khả năng ức chế nhiều nhất là dịch chiết
methanol của cây xà cừ Tây Ấn [59]. Ba mƣơi sáu dịch chiết trong chloroform,
methanol và nƣớc của một số thực vật ở Thái Lan đã đƣợc sử dụng để sàng lọc hoạt
tính ức chế protease HIV-1. Kết quả cho thấy, các dịch chiết chloroform và
methanol từ thân, rễ của cây Ngãi bún (Boesenbergia pandurata) thể hiện khả năng
ức chế mạnh nhất chống lại protease HIV-1 tƣơng ứng là 64,92 và 51,92% ở nồng
độ 100 µg/ml. Các lồi thực vật khác cũng có khả năng ức chế 40 - 50% hoạt tính
của protease HIV-1 tại nồng độ 100 µg/ml nhƣ dịch chiết methanol thân rễ của cây
Riềng nếp (Alpinia galangal) ức chế 48,70% và cây Nhọ nồi (Eclipta prostrate) ức
chế 42,53% [77].
Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, có dạng dimer và mang những
đặc điểm tƣơng đồng với pepsin về cấu trúc cũng nhƣ cơ chế xúc tác. Cả protease
HIV-1 và pepsin đều có trung tâm hoạt động là Asp-Thr-Gly, đều bị ức chế bởi
pepstatin A và bị bất hoạt khi đột biến xảy ra ở vùng hoạt tính chứa Asp [11, 28].
Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu cơ chất cao nên gần nhƣ không thể sử dụng nó
trong các khâu sàng lọc sơ bộ, vì các chất có mặt s ảnh hƣởng đến phép phân
tích. Chính vì vậy, trong nhiều nghiên cứu, pepsin thƣờng đƣợc dùng nhƣ enzyme
đích để bƣớc đầu sàng lọc các chất ức chế của protease HIV-1 [36, 62, 70]. Chẳng
hạn nhƣ, Rege và tập thể đã sử dụng pepsin thay thế cho protease HIV-1 để đánh
giá hoạt tính ức chế của các dịch chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy, dịch chiết
ethanol của Hƣơng nhu tía (Ocimum sanctum) và Thần thơng (Tinospora cordifolia)
có hoạt tính ức chế với IC50 tƣơng ứng là 123,73 và 11,20 µg/ml [62].
15


Từ các dịch chiết thực vật và vi sinh vật ban đầu, một loạt các hợp chất thứ
cấp có khả năng ức chế protease HIV-1 đã đƣợc phân tách và tinh sạch. Trong
nghiên cứu của Singh và tập thể [69], các hợp chất tự nhiên có khả năng chống HIV
đã đƣợc mơ tả thành từng nhóm dựa trên tính chất hóa học. Nhiều chất chuyển hóa
quan trọng và các dẫn xuất của chúng có khả năng kháng HIV đã đƣợc phát hiện

bởi Hattori và tập thể trong khoảng thời gian từ 2005 đến 2012 [38]. Theo nghiên
cứu này, các hợp chất với IC50< 10 µM, 10 - 50 µM và 50 - 100 µM đƣợc coi là có
khả năng ức chế protease HIV-1 tƣơng ứng mạnh, vừa và yếu. Các hợp chất có
IC50> 100 µM đƣợc coi là khơng có khả năng ức chế.
Các flavonoid: Đây là nhóm chất lớn nhất (các hợp chất polyphenol) đƣợc
tổng hợp trong các tế bào thực vật. Chúng đƣợc biết đến với nhiều tác dụng sinh
học quan trọng và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa. Hiện tƣợng stress oxy hóa
xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự
do và hoạt động của các chất chống oxy hóa. Hiện tƣợng này là nguyên nhân của
nhiều bệnh nhƣ: ung thƣ, Parkinson và AIDS. Sự có mặt của các chất chống oxy
hóa có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngƣợc quá trình oxy hóa các hợp
chất trong tế bào của cơ thể. Hoạt tính kháng HIV-1 của các flavonoid khác nhau đã
đƣợc chứng minh. Một số chalcone trong nhóm flavonoid nhƣ: hydroxypanduratin
A và panduratin A từ dịch chiết metanol của thân, rễ cây Gừng (Boesenbergia
pandurata Holtt) thể hiện khả năng ức chế hoạt độ protease HIV-1 với IC50 tƣơng
ứng là 5,6 µM và 18,7 µM [18]. Ngoài ra, quercetin 3-O-(2’-galloyl) α-Larbinopyranose và ester flavonoid gallate đƣợc phân lập từ dịch chiết ethanol của
cây Acer okamotoanum ức chế integrase HIV-1 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 18,1 ±
1,3 và 24,2 ± 6,6 mg/ml [69].
Các lignin: Lignin là các hợp chất cao phân tử, có mặt chủ yếu ở các thực
vật có mạch. 03 lignin mới là longipedunin A, B, C và hai lignin đã biết benzoylbinankadsurin A, acetyl-binankadsurin A đƣợc phân lập từ cây Na rừng (Kadsura
longipedunculata Finet et Gagnet, họ Schisandraceae) bởi Sun và tập thể [73].
Trong đó, longipedunin A ức chế khá mạnh protease HIV-1 với giá trị IC50 là 50
16


µM. Nhóm nghiên cứu của Gao đã phân lập và xác định đƣợc 26 lignin (và hai
triterpenoid) từ một thực vật ở Kadsura, cây Oải hƣơng (K.angustifolia (Bertol.) O.
Kuntze) [33]. Trong số này, binankadsurin A đã thể hiện hoạt tính kháng HIV với
IC50 là 3,86 µM. Ngồi ra, (±)-gomisin M1 đƣợc tách chiết từ quả của cây Ngũ vị
hoa đỏ (Schisandra rubriflora Rehd. &Wils., họ Schisandraceae) cũng thể hiện khả

năng kháng HIV mạnh với IC50 và giá trị chỉ số điều trị (tỉ số giữa liều gây độc và
liều có tác dụng ở ngƣời) tƣơng ứng là <0,65 µM và > 68 µM [20].
Các triterpen và dẫn xuất của chúng: Triterpen là những terpene chứa 6
đơn vị isoprene, có cơng thức C 30H48, một số kết hợp với đƣờng gọi là saponin
triterpen. Những triterpen này thƣờng có cấu trúc gồm 4 vòng (tetracylclic
triterpenoid) hoặc 5 vòng (pentacyclic triterpenoid). Hợp chất triterpen 5 vịng với
nhóm carboxyl tại C-28 và C-30 thay cho methyl nên có tính acid và cịn đƣợc gọi
là acid sapoid. Trong đó, các acid sapoid có hoạt tính ức chế protease HIV-1 đã
đƣợc biết đến là: acid maslinic, acid ursolic, và acid oleanolic [35]. Cụ thể, acid
ursolic và các dẫn xuất malonate mono-este có hoạt tính ức chế protease HIV-1
với IC50 tƣơng ứng 8 và 6 µM [54]. Acid ursolic, acid maslinic và một số triterpen
khác cũng đã đƣợc phân lập từ một thực vật của Trung Quốc Geum japonicum,
trong đó acid maslinic thể hiện hoạt tính ức chế protease HIV-1 mạnh nhất [87].
Các nghiên cứu cũng chỉ ra vai trị quan trọng của nhóm carboxyl tại mạch bên C3 và C-17 đã tƣơng tác với các gốc acid amin của protease qua liên kết hydrogen
và tƣơng tác tĩnh điện, qua đó ức chế hoạt động của enzyme [35]. Cụ thể nhƣ, acid
oleanoic phân lập từ dịch chiết methanol của gỗ cây Văn quan (Xanthoceras
sorbifolia) ức chế HIV-1 trong các tế bào H9 với IC50 là 1,7 µg/ml. Tuy nhiên,
este hóa nhóm carboxyl ở vị trí C-3 đã tạo ra acid 3-oxotirucalla-7,24-dien-21-oic
có khả năng ức chế các tế bào H9 tăng lên đáng kể với IC 50 là 0,0039 µg/ml và ức
chế protease HIV-1 với IC50 là 10 µg/ml [69]. Không chỉ ức chế protease HIV-1,
các triterpen cũng đƣợc cơng bố làm ngăn chặn q trình xâm nhập của HIV: dẫn
xuất của betulin ức chế HIV-1 với IC50 rất thấp 0,4 µM, tuy nhiên các đột biến tại
gp120 của virus s dẫn đến kháng thuốc này [72]; ức chế enzyme phiên mã ngƣợc

17