Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng lên quá trình nuôi cấy cây thanh hao hoa vàng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
KHOA KHOA HỌC T ự NHIÊN VÀ XÃ HỘI
------------------ . . .

-----------------------

ĐINH VĂN THIỆU

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT s ố CHÂT
KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH
NI CÂY CÂY THANH HAO HOA VÀNG

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
C huyên ngành: D i truyền học

Giáo viên hướng dẫn: ThẽS. Nguyễn Thị Hải Yến

THÁI NGUYÊN ■ 2007


£ u â tv •lănVlẩ t naKiêO' S)ạv &Ọ&

M à i o á i i ỉ tì t t

Lời đầu tiên cho tơi được b à y tỏ lị n g b iết ơn tcti Ths N gu yễn
Thị Hải Yến bộ m ôn Sinh h ọc - K h oa K h oa h ọc Tự Iửủẽn Se X ã h ội
- Đại học Thải N gu yên là người đ ã tậ n tìn h hư ớng dẫn v à g iú p đ ỡ
tôi tro n g s u ố t quá trìn h là m luận văn.
Đ ồng thời tôi cũ n g x in được gửi lời b iết ơn tới tấ t cả các th ầ y
cô, các cán bộ tro n g bộ m ôn Sinh h ọc - K h oa K h o a h ọc Tự n h iên

&> X ả hội - Đ ại h ọc Thải N gu yên v à các bạn bè đã đ ó n g góp nh ữ n g

ý k iến v ơ cù n g q u ý báu g iú p tơi h ồn th àn h đ ề tài n à y .
Tôi x in được b à y tỏ lò n g b iết ơn tới n h ữ n g người th ẫ n tro n g
gia, đình v à bạn bè đã luôn đ ộn g viên , k h u y ê n bảo tôi v à tạo điều
k iện tố t n h ấ t cho tơi h ọc tậ p v à h ồn thêưih luận v ă n n ậ y .
Cuối cù n g tôi x in chẩn th à n h cảm ơn các cản bộ p h ò n g th i
n gh iệm K h o a Sinh h ọc - KTN N - Đẹù. h ọc Sư ph ạ jn Thải N gu yên đả
tạo điều k iện th u ận 1 0 đ ể tơi h ồn th àn h đề tài n à y . Tôi v ô cù n g
cảm ơn n h ữ n g tìn h cảm tố t đ ẹp đó.

Thái Ngun, ngày 20 tháng 05 năm 2007
Sinh viên
Đinh Vân Thiệu

4 \T H III ■Họ
LỚPc CNSH
- KHOA
NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóaHINH
bởi \Trung
tâm
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự

1


Jluuh <ỉăn- tấ t naKiêa- 3^ai ííạc-

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

2,4-Dichlorphenoxyacetic acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

MS

Môi trường nuôi cấy theo Murashige và Skoog

NAA

Naphthylacetic acid

IAA

Inolylacetic acid

BAP

Benzin aminopurine

IBA

Indolyl britiric acid

GA3

Giberelin A3

BC

Trước cơng ngun

cs

Cộng sự

RNA

Ribo nucleic acid

KTST

Kích thích sinh trưởng

ART

Artesunate

PPM

Partper million

T H IF
.I- LỚP
- KHOA
H IẺ N & XÃ HỘI
Số hóaHĨNH
bởi V4V
Trung
tâm
HọcCNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC TựN

2


t i u â n \ỉăn tấ t nqẮiêa-

flạ&

MỤC LỤC

MỞ Đ Ẩ U

6

I. Đặt vấn đ ề

6

II. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI..................................................................................................... 7
III. NỘI DUNG ĐÊ TÀI.............................................................................................................. 7

C hư ơ n g 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN c ứ u .......................... 8
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THANH HAO HOA VÀNG.................................. 8

1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật.......................................................... 8
1.1.2. Thành phần hoá h ọ c .............................................................................. 9
1.1.3. Đặc tính dược học.................................................................................. 9
1.1.3.1. Hoạt tính chống sốt rét ......................................................................9
1.1.3.2. Tác dụng chống các ký sinh trùng và vi trùng k h ác...................... 11
1.1.3.3. Những hoạt tính miễn nhiễm............................................................12
1.1.3.4. Tác dụng chống ung thư và bệnh bạch cầu ....................................12
1.1.4..Thanh hao hoa vàng trong Y học cổ truyền.......................................13
1.1.5. Nuôi cấy mô tế bào thực vật...............................................................15
1.1.5.1. Lược sử về nuôi cấy tế bào...............................................................15
1.1.5.2. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................18
1.1.5.3. Các yếu tơ' ảnh hưởng tới q trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật.. 20
1.1.6. Thành tựu của nuôi cấy mô tế bào thực vật........................................26
C h ư ơ n g 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ..29
2.1. NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIÊT BỊ.................................................................... 29
2.2. PHUƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u .................................................................................... 29

2.2.1. Khử trùng m ẫ u ..................................................................................... 29
2.2.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo............................................................................29
2.2.3. Nhân ch ồ i..............................................................................................30

Số hóaĐINH
bởi VÀN

Trung
tâm- LỚP
HọcCNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự
THIỆU
- KHOA
NHIÊN & XÃ HÔI

3


c Ê í ậ t t tlă tv

i ấ t m iK iê p . ỹ ) ạ i

Ẩ ạc

2.2.4. Tạo r ễ ................................................................................................... 30
2.2.5. Ra cây................................................................................................... 30
2.2.5.1. Chuẩn bị cây......................................................................................30
2.2.52. Đưa cây ra.........................................................................................30
2.2.6. Môi trường nuôi c ấ y ........................................................................... 31
2.2.7. Điều kiện thí nghiệm........................................................................... 31
2.2.8. Các chỉ tiêu đánh giá và phương pháp xử lý số liệu.......................... 31
Chương 3: KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 32
3.1..KHỬTRÙNG MAU

n u ô i c ấ y ....................................................................................32

3.1.1. Nghiên cứu khử trùng mẫu với H gQ 2................................................ 32
3.1.2. Khử trùng mẫu với nước javen............................................................34
3.2..KẾT QUẢ TẠO MÔ SẸO................................................................................................3 6
3.3. NHÂN CHỒI CÂY THANH H A O ............................................................................... 38

3.3.1. Ảnh hưởng của BAP lên hệ số nhân c h ồ i.......................................... 38
3.3.2. Ảnh hưởng của kinetin lên hệ số nhân chồi.......................................40
3.3.3. Ảnh hưởng phối hợp giữa BAP với NAA lên hệ số nhân chồi......... 42
3.4. GIAI ĐOẠN RA R Ễ ........................................................................................................4 4
3.5. KẾT QUẢ RA C ÂY.......................................................................................................... 4 6

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ......................................................................... 47
1. Kết luận ......................................................................................................47
2. Đề nghị........................................................................................................ 47
PHỤ LỤC: MÔI TRƯỜNG MURASHING-SKOOG (MS)..................................48

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................49
1. Tài liệu tiếng Việt....................................................................................... 49
2. Tài liệu tiếng Anh....................................................................................... 49

THIỆU
- KHOA
& XÃ HƠI
Sớ hóĐINH
a bởiVÃN
Trung
tâm- LỚP
HọcCNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự NHIÊN

4


£uận^ sỉăttí t ẩ í niêa< ă^ai' Ể ẹ o

TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1. Khử trùng mẫu hạt Thanh hao hoa vàng bằng HgCl2 0,1% với thời
gian 6 đến 8 phút cho kết quả tốt nhất, tỉ lệ nhiễm khá thấp (4.67 - 11,33%) và
tỉ lệ nảy mầm cao đạt (88,11 %- 92,48%)
2. Với dung dịch javen 60% thời gian khử trùng tốt nhất là 20 phút (tỉ lệ
nhiễm là 55%, tỉ lệ nảy mầm rất cao đạt 91.67%).
3. Nồng độ NAA thích hợp cho việc tạo mô sẹo là 3 mg/1, tỷ lệ tạo mô
sẹo là (100%).
4. Nồng độ BAP thích hợp cho việc nhân chồi là 2mg/l (hệ số nhân chồi
là 3,2 lần).
5. Nồng độ kinetin thích hợp cho việc nhân chồi là lmg/1 (hệ số nhân
chồi 2,45 lần).
6. Phối hợp cytokinin (BAP) với auxin (NAA) để tạo chồi Thanh hao
hoa vàng có nồng độ thích hợp là 2mg/l BAP+ 0,2 mg/1 NAA với hệ số nhân
chồi (1,652 lần).
7. Nồng độ NAA thích hợp cho việc sinh trưởng của rễ Thanh hao hoa
vàng là 0,3 mg/1 (số lượng rễ là 12,6 chiều dài trung bình của rễ là 3,03cm).
8. Ra cây ( tỷ lệ sống 76% các cây con phát triển tốt).

THIỆU
- KHOA
& XÀ HỘI
Số hóĐINH

a bởiVẢN
Trung
tâm- LỚP
HọcCNSH
liệu KI
– ĐH
TN KHOA HỌC T ự NHIÊN


5


£ u ậ n •¿ăn t ấ l n n íU ê a ỹ ^ a i K ạ c

MỞ ĐẨU
I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Thanh hao hoa vàng còn gọi là cây Thanh cao, Rau hao có tên khoa
học là Artemisia annua L. Thuộc họ cúc (Asteracae) (Trung Quốc có hai tên
gọi là Quinhao và Quinggao). Nhân dân Trung Quốc đã sử dụng cây Thanh
hao để chữa bệnh 2000 năm nay. Theo tài liệu đời Hán thì Thanh hao chữa
được bệnh sốt rét và một số chứng bệnh khác. Ở Việt Nam, Tuệ Tĩnh (thế kỉ
14) và Hải Thượng Lãn Ông (thế kỉ 19) đã xác định Thanh hao có vị đắng
mát, tính lành, chữa được chứng lao tổn, nóng âm ỉ, đổ mồ hơi trộm, sốt rét và
chứng tích trệ [4]Ế
Năm 1972 các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết qunghaosu từ cây
Thanh hao và đặt tên khoa học là artemisinine. Từ năm 1987 ở Việt Nam
artemisinin đã được chiết xuất từ cây Thanh hao có tại Việt Nam và đưa vào
thử nghiệm có tác dụng diệt chủng Plasmodium palciparam gây bệnh sốt rét.
Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới

có khoảng 210 triệu người đến 220 triệu người mắc bệnh sốt rét. Trong đó có
63 nước phát hiện có kí sinh trùng sốt rét Plasmodium palciparum kháng
thuốc. Việt Nam mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp mắc bệnh sốt rét
trong đó có 85% là do Plasmodium palciparum [4].
Tuy nhiên trong những năm gần đây cây Thanh hao đang bị thối hóa
nghiêm trọng đã làm cho năng suất, chất lượng cây giảm đi rất nhiều.Vì vậy
vấn đề bảo tồn giống Thanh hao năng suất cao, chất lượng tốt là rất cần thiết.
Một trong những biện pháp hữu hiệu là tuyển chọn những giống Thanh hao tốt
và nhân giống vơ tính bằng kỹ thuật nhân nhanh in vitro.
Hiện nay đã có rất nhiều phịng thí nghiệm tiến hành nhân giống Thanh
hao bằng kỹ thuật ni cấy mơ nhưng vẫn chưa có nhiều cơng bố về quy trình
ni cấy Thanh hao một cách hồn thiện vì vậy chúng tơi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
lên q trình ni cày cày Thanh hao hoa vàng”.

THIỆU
- KHOA
& XÃ HỘI
Số hóĐINH
a bởiVÃN
Trung
tâm- LỚP
HọcCNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự NHIÊN


6

£ u ậ n - <ỉăn< lẩ k n g iU ề a ,

ííạ v

II. MỰC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất KTST lên quá trình nuôi cấy Thanh
hao hoa vàng in vitro.
III. NỘI DƯNG ĐỀ TÀI

3.1. Nghiên cứu thời gian và nồng độ thích hợp của một số hợp chất trong khử
trùng mẫu hạt Thanh hao hoa vàng.
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một sô' chất kích thích sinh trưởng lên q
trình ni cấy Thanh hao hoa vàng.
Đề tài được thực hiện tại phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Đại học Sư
phạm Thái Ngun và phịng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học Tự nhiên
& Xã hội - Đại học Thái Nguyên.

THIỆU
- KHOA
& XẢ HỘI
Số hóĐINH
a bởiVÀN
Trung
tâm- LỚP
HọcCNSH
liệu KI
– ĐH
TN KHOA HỌC T ự NHIÊN

7


j6 u ậ ív t ó n tó ĩ lui/tiỉn 3 )'ai' flạc.

C hương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN

cứu

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THANH HAO HOA VÀNG

l . l ẵl. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật
Gia đình Artemisia, thuộc họ thực vật Compositae ịAsteraceae) gồm
khoảng 300 loài cây cỏ, bụi hằng niên, lưỡng niên hay lưu niên mọc tự
nhiên trong những vùng khô của Bắc Bán cầu. Nam Mỹ chỉ có vài lồi,
cịn Nam Phi chỉ có một loài duy nhất. Linnaeus đã đặt tên cho cày là
Artemisia annua (1753). Tên Artemisia được đặt là để ghi nhớ nhà nghiên
cứu Y học và Thực vật Artemisia- phu nhân của Mausolus là người cai trị
vùng Caria (350-353 BC) [3].
Thanh hao có nguồn gốc từ vùng Đơng Nam Châu Âu qua Trung Hoa,
Nhật, Siberia, Korea, Ấn Độ và Tây Á. Cây sau đó thích ứng với vùng Trung
và Nam Âu, mọc hoang dại tại Trung Hoa, nhưng khoảng 20 năm gần đây đã
được nuôi trồng cả ở Hoa Kỳ (trong những tiểu bang như Alabama,
Tennessee, Arkansas, Missouri và Kansas) [3],
Thanh hao thuộc loại cây thảo mọc hằng năm, có mùi thơm, thân có
rãnh. Lá có phiến xoan, kép 2 - 3 lần, có thể dài đến 10 cm. Các lá thấp và lá
giữa thuộc loại 3 lần kép, lá cao chỉ 1 - 2 lần kép. Lá mọc cách, phiến lá xẻ
lơng chim 2 lần thành những dải hẹp, có lông mềm bao phủ. Lá già vàng rồi

chết khô, không rụng vì cuống lá rất dai. Hoa hình ống nhỏ, màu vàng xanh,
hoa phía ngồi là hoa cái, phía trong lưỡng tính, đường kính 1,5 cm. Cụm hoa
hợp thành 1 chùy kép, mỗi cành nhỏ có 3 - 7 cụm hoa. Mỗi cụm hoa có 25 35 hoa trong đó có 20 - 25 hoa lưỡng tính ở giữa, có 5 - 8 hoa cái ở xung
quanh, kích thước hoa rất nhỏ.
Thanh hao hoa vàng là cây ưa ẩm, ưa sáng, chịu hạn nhưng kém chịu
úng ngập. Phát triển tốt trên đất từ cát pha đến đất thịt nhẹ, lượng mưa trung

VĂN THIỆU
LỚP
• KHOA
NHIÊN & XẢ HƠI
Sớ hóaĐINH
bởi Trung
tâm-Họ
c CNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự

8


£n< Jăiv tấ t HíiKiẻp ă^ại £ọe/

bình hàng năm từ 1400 - 1600mm. Nhiệt độ khơng khí thấp nhất khơng dưới
10° c, cao nhất không quá 40° c. Chu kỳ sinh trưởng từ khi nẩy mầm đến khi
hạt chín từ 240 - 300 ngày [5].
1.1.2ễ Thành phần hoá học
Chất tác dụng chính của cây là artemisinin, thuộc loại sesquiterpene
lactone có nhóm hoạt tính peroxyde: chủng Trung Hoa chứa từ 0,01 - 0,5 %
artemisinin. Artemisinin khơng tìm thấy trong các lồi Artemisia khác,

ngoại trừ Artemisia lancea [15]. Artemisinin khơng ly trích bằng nước hay
ethanol, nhưng được ly trích trong phần hịa tan bằng dung mơi hữu cơ ở
nhiệt độ sơi thấp.
Ngồi ra còn một số sesquiterpenes khác đáng chú ý như: artenannuic
acid, arteannuin B, trans-pinocarveol, beta-Selinene...
Thanh hao hoa vàng cũng chứa các flavonoids trong đó có 2 chất
flavonols có tác dụng đặc biệt: chrysosplenol-D và chrysosplenetin, ngồi ra
cịn có các flavones có nhóm methoxy như casticin, artemetin, cirsilineol.
Phần trên mặt đất của cây Artemisia annua L mọc hoang ở Việt Nam
có: tinh dầu 0,6%, artemisinin 0,3 - 0,4%. (Tinh dầu chứa 35 thành phần,
trong đó các chất chính là campho, beta-farsenen, beta - caryophyllen, beta cubeben, beta - myrcen, artemisia ceton). Ngồi các chất trên, Artemisia
annua L cịn có các terpen và các hợp chất có liên quan: artenuin A, artenuin
B, acid artemisic, benzyl isovaleat, bomeol acetat, cadinen, camphen,
coumarin, cuminal, hydro artenuin, L - beta-pinen, scopoletin, scopolin,
stigmasterol [5].
1.1.3ẳĐặc tính dược học
/ Ễ/.3 ẻ/. Hoạt tính chống sốt rét
Thanh hao hoa vàng đã được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới chú
trọng vào khả năng trị sốt rét của cây. Trong những thập niên 70 và 80, Trung
Hoa đã tập trung nghiên cứu về Thanh hao và ly trích được artemisinin (1972).

VÃN THIỆU
- LĨP
CNSH
- KHOA
NHIÊN & XÃ HỘI
Sớ hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ

u – KI
ĐH
TN KHOA HỌC T ự

9


£n* ứăit' lẩl naKiêp^ Q ạ l ílạcs
Sau đó artemisinin được tổng hợp nhân tạo tại Thụy Sĩ, Trung Hoa và Hoa Kỳ,
nhưng giá thành cao hơn so với ly trích từ cây. Ngồi Trung Hoa cịn có nhiều
nơi khác trên giới như Pháp, Đức., và cả Việt Nam đã nghiên cứu artemisinin.
Artemisinin là một sesquiterpen lactone endoperoxyd, kết tinh hình kim,
khơng màu, ít tan trong nước và trong dầu, dễ tan và khá bền trong các dung
môi không phân cực. Nó có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét thể vơ tính
trong hồng cầu (đây là giai đoạn ký sinh trùng sốt rét hủy diệt hồng cầu, gây
phản ứng rét run ở người bệnh). Cơ chế tác dụng là: cầu peroxyd nội của
artemisinin kết hợp với sắt tạo ra gốc tự do. Gốc tự do mới tạo thành có tác
dụng mạnh, hủy diệt protid và lipid của ký sinh trùng sốt rét, nhung không
ảnh hưởng đến protid và lipid của người bệnh. Artemisinin bao vây và cô lập
phân tử cung cấp năng lượng cho Plasmodium falciparum ngăn chặn sự phát
triển của nó.
Hoạt tính chống sốt rét in vitro của artemisinin trên Plasmodium
falciparum được ghi nhận là tương đương nơi các chủng ký sinh trùng chưa
hoặc đã kháng chloroquin. Khi chích dưới da cho chuột bị nhiễm Plasmodium
berghei, artemisinin có tác dụng gây hủy hoại các cơ phận và nhân của ký
sinh trùng [11]. Nơi khí bị nhiễm Plasmodium inue, artemisinin gây ra sự phù
trương ty thể của ký sinh trùng.
Khi so sánh với mefloquine trong việc điều trị các bệnh nhân bị nhiễm
Plasmodium falciparum đã kháng chloroquin: artemisinin có tác dụng nhanh
hơn và ức chế mạnh hơn lên sự trưởng thành của ký sinh trùng. Trong một thử

nghiêm trên 527 bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum, khi cho chích IM
nhũ dịch artemisinin trong dầu, ký sinh trùng bị diệt và biến mất rất nhanh, tỷ
lệ tái xuất hiện rất thấp. Trong thử nghiệm khác nơi 738 bệnh nhân nhiễm
Plasmodium vivax, thuốc viên diệt ký sinh trùng nhanh nhất và dung dịch IM
tạo tỷ lệ tái hiện thấp nhất, không thấy những phản ứng phụ nơi tất cả 2089
bệnh nhàn dùng artemisinin [17].

VÃN THIỆU
- LỚP
CNSH
KI - KHOA
ự NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – ĐH
TN KHOA HỌC T

10


£ u ậ n '¿¿UPtấ t lULỈỈtép

dạc*

Về phương diện dược lực học, artemisinin được hấp thu khá nhanh sau
khi uống (khoảng 45 phút), nhưng khơng hồn tồn, tỷ lệ sinh khả dụng so với
chích IM là 32 %. Thời gian ở trong máu trung bình là 3,4 giờ (khi uống) so
với 10,6 giờ (khi dùng IM).

Các nghiên cứu tại Anh đã giải thích cơ chế tác động của artemisinin:
Artemisinin phản ứng với hemin, và với sự hiện diện của màng tế bào
hồng cầu, đưa đến sự oxy hóa protein thiols. Vì ký sinh trùng sốt rét có nhiều
hemin nên artemisinin có thể tác động chuyên biệt vào ký sinh trùng. Cơ chế
tác động gồm 2 giai đoạn : (1) Khởi động ở sắt trong cơ thể ký sinh trùng xúc
tác sự phân cắt cầu peroxide nội bào và tạo ra các gốc tự do (2) Phản ứng alkyl
hóa, các gốc tự do chuyển hóa từ artemisinin tạo các nối covalent với protein
của ký sinh trùng [19]. Rất nhiều nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng về
artemisinin đã được thực hiện tại Thái Lan (1994, trên 1000 bệnh nhân), Việt
Nam (1993, trên 600 bệnh nhân ; 1994, trên 450 bệnh nhân..) đưa đến kết luận
là liều tối ưu thuốc uống, được xác định là 50 mg artemisinin/kg, dùng liên tục
trong 3 ngày. Artemisinin có hoạt tính đặc biệt trong các trường hợp sốt rét
cấp tính và khơng có tác dụng ngừa bệnh.
/ Ế/.3.2ễ Tác dụng chông các ký sinh trùng và VIỆtrùng khác
Artemisinin có khả năng diệt các ký sinh trùng khác nhau. Thí nghiệm
trên chuột và thỏ cho thấy artemisinin có khả năng diệt giun móc Schistosoma
japonicum, kí sinh trùng Clonorchis sinensis. Nó cịn có khả nãng ức chế sự
tăng trưởng của ký sinh trùng trong các môi trường nuôi cấy Pneumocystis
carini. Ngồi ra artemisinin và cấc chất chuyển hóa cho thấy có hoạt tính
chống lại ký sinh trùng Leishmania major, in vitro và in vivo. Các hợp chất
này hoạt động ở cả hai dạng uống và trích [16].
Nồng độ artemisinin tối thiểu để ức chế sự tăng trưởng của các vi trùng
Gram dương (Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis) và các vi trùng
Gram âm (Klebsiella, Enterobơcter, Shigella dysenteriae, E.coỉi) được xác
định là cao hơn 32 microgram/ml.

VÀN THIỆU
- LỚP
CNSH
ự NHIÊN & XÀ HỘI

Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – KI
ĐH- KHOA
TN KHOA HỌC T

11


Ẩuầrv Jãn, tấl ngÂiêa,

Hạc.

Nghiên cứu tại Đại học Colorado State University, Fort Collins năm
2002 ghi nhận các flavonols chrysosplenol D và chrysoplenetin có hoạt tính
tăng cường tác dụng của berberine và norfloxacin chống lại chủng
Staphylococcus aureus đã kháng nhiều trụ sinh khác [18].
1.1.3.3. Những hoạt tính miễn nhiễm
Artemisinin gia tãng hoạt động thực bào nhưng lại ức chế sự biến đổi tế
bào lympho. Liều thấp kích ứng hoạt động của hệ miễn nhiễm nhưng liều cao
lại có tác dụng ức chế hoạt động và đè nén chức năng của tủy sống.
Artemisinin và 2 chất chuyển hóa tổng hợp khác cho thấy có hoạt tính
ức chế rõ rệt các đáp ứng thể dịch nơi chuột, nhưng không làm thay đổi đáp
ứng q mẫn loại trì hỗn đối với mitogens. Artemisinin cũng có hoạt tính ức
chế miễn nhiễm loại có tính chọn lựa, do đó có thể có khả năng trị được bệnh
lupus (systemic lupus erythematosus) [13]. Trong những nghiên cứu điều trị
lupus (SLE) lâu dài, kết quả ghi nhận liều dùng 0,3 g artesiminin mỗi ngày
(tương ứng với 50 gram cây tươi) đưa đến kết quả thuyên giảm rõ rệt sau 50

ngày dùng thuốc.
Artesiminin làm tãng thêm đáp ứng miễn nhiễm loại do tế bào lympho
T làm trung gian, nơi chuột bình thường đồng thời gia tăng sự tái tạo miễn
nhiễm nơi chuột được ghép tuỷ sống.
L l.3.4. Tác dụng chống ung thư và bệnh bạch cầu
a, Tác dụng chống ung thư
Các nhà khoa học Mỹ thuộc Đại học Washington đã phát hiện tác dụng
chữa ung thư vú và bệnh Bạch cầu của artemisinin. Cơ chế tác dụng là: tế bào
ung thư có hàm lượng sắt cao (cả phía trong và trên bề mặt tế bào) nên dễ bị
artemisinin tiêu diệt. Chỉ cần cho bệnh nhân ung thư uống hoặc tiêm
artemisinin hoặc dẫn chất. Với ung thư vú: sau khi dùng artemisinin 8h, 75%
tế bào ung thư đã bị tiêu diệt, sau 16h thì hầu hết các tế bào ung thư bị tiêu
diệt. Các tế bào bình thường khơng bị ảnh hưởng [14].

ĐINH
VÃN THIỆU
- LỚP
KI - TN
KHOA KHOA HỌC T
ự NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa bở
i Trung
tâm Họ
c liệCNSH
u – ĐH

12


c Ê a â í v t ó » t ấ t n q à iêỊis S ^ ạiy fíọ .o

Chất chuyển hóa, bán tổng hợp từ artemisinin, artesunate (ART) (cịn
gọi là artesunic acid, dihydroqinghaosu hemisuccinate, ngồi tác dụng diệt
được các ký sinh trùng Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax, đã được
nghiên cứu tại Đức về khả năng diệt tế bào trên 55 loại tế bào ung thư trong
chương trình phát triển tn liệu của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ. Kết quả
cho thấy ART có hoạt tính mạnh nhất diệt được các tế bào leukemia và tế bào
ung thư ruột già, hoạt tính tương đối yếu với các tế bào ung thư phổi và trung
bình với các tế bào ung thư melanoma, ung thư vú, buồng trứng, tuyến nhiếp
hộ. Điểm đặc biệt quan trọng là khi so sánh về độc tính, ART tương đối ít độc
hại hơn các tác nhân hóa học đang được sử dụng, và vẫn có tác dụng trên các
tế bào CEM leukemia đã kháng doxorubicin, vincristin, methotrexate [14].
b, Với bệnh bạch cầu
Artermisinin tiêu diệt các bạch cầu bị bệnh mà không ảnh hưởng đến tế
bào lành.
Độc tính: ở liều điều trị artemisinin và các dẫn chất là loại thuốc an tồn
khơng độc hại kể cả với phụ nữ có thai và người suy gan, thận.
Nhược điểm: artemisinin bán phân hủy nhanh (sau 4 giờ). Vì vậy
phải dùng thuốc liên tục sau 4 giờ. Artemisinin không có tác dụng trên thể
gian bào của ký sinh trùng sốt rét nên không chống được muỗi anophen
truyền bệnh sốt rét.
1.1.4. Thanh hao hoa vàng trong Y học cổ truyền
Tại Trung Hoa, việc sử dụng Thanh hao đã được ghi chép trong tập sách
Ngũ Thập Nhị Bệnh Phương tìm được trong những cổ mộ thời Hán (168 BC)
dùng làm thuốc chữa bệnh trĩ. Sách thuốc Zhou Hou Bei Ji Fang của Danh Y
Ge-hong nãm 340 là sách thuốc đầu tiên dùng Thanh hao để trị sốt rét. Trong
tập đơn thuốc chữa 52 loại bệnh viết vào nãm 168 trước công nguyên đã ghi
bài thuốc chữa sốt rét bằng Thanh hao (dùng một nắm to lá Thanh hao ngâm
trong 1 bát nước rồi sắc lấy nước uống) [5],

ĐINH
VÀN THIỆU
- LỚP
KI - TN
KHOA KHOA HỌC T
ự NHIÊN & XẢ HỎI
Số hóa bở
i Trung
tâm Họ
c liệCNSH
u – ĐH

13


£ u ậ n sỉú n t ấ t i u t ìliẻ ii'3 ) a .íf íạ c ?

Thanh hao có vị đắng, tính hàn tác động vào các kinh mạch thuộc Thận,
Can và Bàng Quang và được cho là có những đặc tính:
- Thanh nhiệt, Giải thử: trị các chứng sốt nhẹ, nhức đầu, choáng váng và
tức ngực.
- Trừ chứng, Triệt ngược: trị các chứng sốt do suy huyết hay dư chứng
của sốt, nhất là sốt ban đêm, lạnh ban sáng...không mồ hôi.
- Lương Huyết, Chỉ huyết: trị nổi mẩn đỏ, chảy máu mũi do nhiệt nơi
huyết: dùng chung với Biệt giáp (mu rùa) và Sinh địa để giúp thanh nhiệt tại
những bộ phận thuộc âm.
Năm 1972 các nhà khoa học Trung Hoa đã chiết được artemisinin trong
cây Thanh hao hoa vàng và thử nghiệm dùng artemisinin để chữa sốt rét cho
2353 người đạt kết quả tốt.
Ở Việt Nam từ thế kỷ XIV Tuệ Tĩnh và thế kỷ XVIII Hải Thượng Lãn

Ông đã dùng Thanh hao hoa vàng để chữa sốt rét [3],
* M ột sô'bài thuốc đông y của Thanh hao hoa vàng
- Trị đau trong xương do nhiệt, ngày nhẹ đêm nặng
Thanh hao lOg, Sơn chi tử nhân lOg, Miết giáp lOg, Hoàng kỳ lOg,
Tang bạch bì lOg, Bạch truật lOg, Tri mẫu lOg, Hồng liên 4g, Sài hồ 7g,
Long đởm thảo 7g, Cam thảo 7g sắc nước uống mỗi ngày một thang đến
khi khỏi.
- Chống sốt, nhức đầu, miệng khát do nắng nóng
Thanh hao lOg, Bạch phục linh lOg, Bạch biển đậu lOg, Liên kiều lOg,
Dưa hấu lOg (tươi 50g), Sinh cam thảo 6g, Thông thảo 6g, Hoạt thạch (tán
nhỏ) 12g sắc nước uống mỗi ngày 1 thang.
- Cắt cơn sốt rét
Thanh hao 40g, cắt nhỏ ngâm nước 1 giờ rồi sắc uống mỗi ngày 1
thang [5].

ĐINH
VÃN THIỆU
- LỚP
KI - KHOA
ự NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa bở
i Trung
tâm Họ
c liệCNSH
u – ĐH
TN KHOA HỌC T

14

£ u â t v i ă n , l o i n td x iẻ ỹ , ă ^ ạ i

Ểạc

1.1.5. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
i . / ẽ5Ể/ ặLược sử về nuôi cấy tê'bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã hình thành từ vài thập kỷ trước
mà cơ sở của nó là giả thuyết của nhà thực vật học người Đức Haberland
(1902). Ông cho rằng tất cả các tế bào của thực vật đều có tính tồn năng
(totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền
của cơ thể. Theo Haberland mỗi tế bào thực vật đều có khả năng phát triển
thành cơ thể hoàn chỉnh khi gập điều kiện thuận lợi. Ơng chính là người đầu
tiên để xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn
năng của tế bào [8],
Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt và Robbins (Mỹ) lập lại thí
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hồ thảo.
Trong mơi trường lỏng gồm có muối khống và glucose, đầu rễ sinh trưởng
khá mạnh tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Tuy nhiên sinh trưởng như vậy
chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù các tác
giả đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934 bắt đầu giai đoạn hai trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực
vật khi White (Mỹ) nuôi cấy thành công một thời gian dài đầu rễ cà chua trên
một mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose và dịch chiết nấm men.
Nãm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng
của nước dừa trong ni cấy phơi cây họ cà. Sau đó nãm 1948, Seward xác
nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt.
Năm 1954, Skoog (Mỹ) tình cờ thấy, nếu thêm một ít chế phẩm đã được
để lâu cửa axit deoxyribolucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường
nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng
trở nên rất rõ rệt. Phịng thí nghiệm Skoog đã tìm bản chất hiện tượng kích

thích sinh trưởng của DNA. DNA mới chiết ly từ tinh dịch cá bẹ không có tác
dụng nhưng đem hấp trong hơi axit thì mẫu DNA mới cũng có hoạt tính như

VẢN THIỆU
- LỚP
CNSH
NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – KI
ĐH- KHOA
TN KHOA HỌC T ự

15


Ấuận ¿ăn* tấ t nafUea- ẩ w Kạo
mẫu DNA cũ. Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sản phẩm phân giải của
DNA. Năm 1955 chất này được xác lập là chất 6-furfury-lamin-purine và được
Skoog đặt tên là kinetin do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, người ta
chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hoá
học tương tự như kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm
cytokinin. Chất đầu tiên thuộc nhóm cytokinin được tách từ thực vật bậc cao là
zeatin lấy từ mầm ngô.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu vẻ ảnh
hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường ni cây đối với sự hình thành
cơ quan của mơ sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỉ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có
khuynh hướng phát triển rễ ngược lại nếu tỉ lệ kinetin/auxin tãng thì dẫn tới

khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều
cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát
sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller
dẫn tới nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch
sử nuôi cấy mô thực vật.
Trong thời gian từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào
đơn, các tế bào sống độc lập khơng dính với các tế bào khác, đã được phát
triển. Muir, Hildebrant và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một
huyển phù các tế bào đơn bằng cách đưa lắc trên máy lắc. Nikell (1956) nuôi
liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu. Melchers và Beckman
(1959) đã nuôi liên tục tế bào đơn trong các bình dung tích khá lớn bằng cách
sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung dịch dinh dưỡng
mới. Người ta bắt đầu chú ý tới kỹ thuật nuôi cấy túi phấn sau khi Guha và
Mahesvvari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn
cây cà độc dược. Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch (1967) tạo thành cơng
cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Đến nay, việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi
cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây và đã đóng góp vơ cùng
lớn vào việc tăng thêm các kiến thức di truyền và thực tiễn chọn giống.

VĂN THIỆU
- LỚP
CNSH
KI - KHOA
ự NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – ĐH
TN KHOA HỌC T

16


c Ễ u ậ n •ĩă tị' t ấ t n a tíiề a Q ạ i Ệạ&

Nãm 1960, Cooking ở trường đại học Nottingham (Anh) cơng bố có thể
dùng men cellulase để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu
được các tế bào trần, không có vỏ bọc, gọi là protoplast. Người ta thực sự chú
ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những nãm 1970, khi các tác giả Nhật
Nagata và Takebe thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô
thuốc lá tái tạo vỏ xellulo, phân chia và tạo nên một quần lạc tế bào trong môi
trường lỏng. Đồng thời Takebe labib và Melchers đã sử dụng kỹ thuật gieo tế
bào của Bergman vào protoplast và đã tạo được cây hoàn chỉnh từ protoplast.
Do các protoplast có khả nãng dung hợp vói nhau trong các điều kiện nhất
định và hấp thụ các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan tử từ bên ngồi, các
nhà ni cấy mơ thực vật đật hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn
giống có kết quả hơn. Hy vọng này đến nay hồn tồn được thực tế xác nhận
sau khi nhiều nhóm khác nhau trên thế giới đã công bố lai thành công giữa
các lồi nhờ kỹ thuật protoplast, một việc khơng thể thực hiện được bằng lai
hữu tính cổ điển, v ề mặt lý luận di truyền học, protoplast là công cụ không
thể thay thế được để nghiên cứu hiện tượng nhiễm sắc thể hịa hợp của các tế
bào khác lồi sau khi dung hợp, vai trò của DNA trong các cơ quan tử và quan
hệ của chúng với DNA trong nhân tế bào.
Úng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân
giống và phục tráng cây trồng. Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh
sinh trưởng của các lồi địa lan khi ni cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi
chia cắt các protocorm và ni cấy tiếp thì lại thu được các protocorm mới.
Khi để trong những điều kiện nhất định thì các protocorm có thể phát triển
thành cây lan con. Hơn nữa, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng thực vật chứa rất ít

hoặc hồn tồn khơng chứa virut, do đó với phương pháp ni cấy đỉnh sinh
trưởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dịng vơ tính khơng bị nhiễm bệnh
virut. Kỹ thuật này đặc biệt với khoai tây, dâu tây, cây ãn quả và nhiều cây
nhân giống vơ tính khác.

«

THAI

ưu
H(?c
NGUVÊN
KHOA KHOA HOC T Ư N u ic m /i v2 ằễ£ ế

THƯ VIỆN
VÃN THIỆU
- LỚP
CNSH
NHIE\-& XÃ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – KI
ĐH- KHOA
TN KHOA HỌC T ự

17

cLuâ/v¿ ă n t ấ í n q  iê a ' 3 ) ạ i - dạcy
Chúng ta đang bước vào giai đoạn phát triển thứ tư của nuôi cấy mơ
thực vật. Đó là giai đoạn ni cấy mơ thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào
thực tiễn chọn giống, nhân giống vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt
tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.
Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong mơi
trường nhân tạo nhu cầu chất khống, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn cacbon
của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, ni cấy, điều khiển sự phân hố từ
các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được chuẩn bị trong
các giai đoạn trước.
Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình
chọn giống nhân giống hiện đại. Mặc dù cịn rất nhiều vấn đề phải đi sâu
nghiên cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt
Nam đã thốt khỏi giai đoạn phơi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng
góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp [6].
1.1.5.2. Các kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật
Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật khác nhau phục vụ các mục
đích khác nhau. Bao gồm một sô' kỹ thuật như sau:
a, Nuôi cấy phơi
Người có cơng đầu tiên về ni cấy phơi là Charles Bonnet ở thế kỷ 18.
Ơng đã tách phơi Phascolus và Fagopvrum trồng trong đất và nhận được cây
nhung là cây lùn. Hanning (1904) đã nuôi cấy phôi trong môi trường chứa
muối khống, đường và đã nhận được cây hồn chỉnh.
Năm 1922 Knudson đã nuôi cấy thành công phôi cây lan (Orchid) trong
mơi trường có chứa đường khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phơi
khơng thể phát triển thành protocorm.
Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai
đoạn tự dưỡng và dị dưỡng.

VÀN THIỆU

- LỚP
CNSH
- KHOA
NHIÊN & XẢ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – KI
ĐH
TN KHOA HỌC T ự

18


JLmộ»v «ỈÕÍV t ấ t n a K iề p ' Ẩ ) ạ i/ Ẩ ạ o

Laibach (1925) đã có nhiều đóng góp trong nghiên cứu cứu phơi đặc
biệt là ni cấy các phơi lai giữa các lồi cây xa nhau về mật phân loại.
Những cơng trình của Tukey đã đặt nền móng cho ni cấy phơi các giống
cây ăn quả. Thường để nuôi cấy phôi người ta sử dụng các phương pháp sau:
- Cấy ghép phôi vào mô nhũ của cây khác trong điều kiện tự nhiên
(Stingl, 1907).
- Cấy ghép phôi vào mô nhũ trong điều kiện in vitro.
- Nuôi cấy in vitro.
Đối với nuôi cấy phôi đường giữ vai trò quan trọng. Trong nhiều trường
hợp đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Nồng độ sucrose có
thể dùng từ 0,5% đến 18%.
Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytoknin thường được
dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng nồng độ thấp kinetin có

vai trị đặc biệt cho sự phát triển của phơi.
Ni cấy phôi được sử dụng để phá ngủ nghỉ của hạt, thử sức sống của
hạt, duy trì những phơi yếu và cứu những phôi lai xa. Phương pháp nuôi cấy
phôi đã có đóng góp đáng kể trong việc duy trì các lồi, các giống cây có khả
năng nảy mầm của hạt kém (nho, mận đào, ovacado.v.v.), đặc biệt là giống
nho không hạt và nhân giống cây cà phê qua phôi vơ tính.
b, Ni cấy mơ phân sinh
Mơ phân sinh là các mơ đỉnh chồi và đỉnh cành và có kích thước từ
0,1 mm đến lcm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm
non. Các công trình ni cấy mơ phân sinh được tiến hành từ đầu những năm
50 với cơng trình của Morel, Martin (1952). Tiếp sau đó là các cơng trình của
Murashige và Skoog (MS) Gamborg... có bổ sung đường sacaroza hoặc
glucoza và vitamin.
Ni cấy mô phân sinh (meristem) để loại virus tạo cây sạch virus (cây
khoai tây) và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mơ phân sinh cịn sử dụng để nghiên
cứu q trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội thơng qua xử lí colchicin.

VÃN THIỆU
- LỚP
CNSH
KI - KHOA
ự NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóa ĐINH
bởi Trung
tâm Họ
c liệ
u – ĐH
TN KHOA HỌC T

19

£ u ậ t v v ã n l ấ l nqKi& n* 3 )a i< ílạ cs

c, Ni Cấy bao phấn hoặc hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn để tạo dòng thuần, nghiên cứu thể
hiện các gen lặn vì các gen lận khơng thể hiện ở các cơ thể dị hợp tử. Sử dụng
để tạo nguyên liệu cho chọn dòng đột biến. Ở những cơ thể đồng hợp tử mang
gen lận thì các gen lặn được biểu hiện. Ngồi ra những cây đơn bội nhận được
bằng ni cấy bao phấn và hạt phấn là những nguyên liệu tốt cho chọn dịng
đột biến.
d, Ni cấy tế bào đơn
Ni cấy tế bào đơn nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào, ảnh hưởng của
các điều kiện khác nhau lên các q trình sinh trưởng, phát triển và phân hố
tế bào. Ni cấy tế bào đơn cịn sử dụng trong việc chọn dịng tế bào.
e, Ni cấy Protoplast
Ni cấy Protoplast được phát triển nhờ cơng trình của Cooking (1960).
Ơng là người đầu tiên dùng enzym thuỷ phân thành tế bào và tách được
protoplast từ tế bào rễ cà chua. Sau khi loại bỏ thành xellulo tế bào chỉ còn
màng nguyên sinh bao bọc tất cả các cấu trúc của tế bào vì thế được gọi là tế
bào trần hay Protoplast.
Ni cấy Protoplast (tế bào trần) nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào. Do
Protoplast khơng có thành xellulo nên trở thành đối tượng lý tưởng trong
nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật. Dùng phương pháp dung hợp hai loại
Protoplast có thể tạo ra cây lai soma. Ngồi ra có thể sử dụng kỹ thuật dung
hợp Protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gen [1].
/ . / ẻ5ềJ. Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình ni cấy mơ, tê bào thực vật
a, Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Thành phần của môi trường nuôi cấy mô, tế bào thay đổi tuỳ theo lồi
thực vật, loại tế bào, mơ và cơ quan được nuôi cấy.

VÃN THIỆU
LỚP
CNSH
- KHOA
NHIÊN & XẢ HỘI
Số hóaĐINH
bởi Trung
tâm -Họ
c liệ
u –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự

20


£uậtì/ v ỉă ív lấl tiuỉỉt ¿1? 3)ại/ Hạx.

Đối với cùng một loại mơ, cơ quan, nhưng mục đích ni cấy không
giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau cơ bản. Mơi trường ni cấy
cịn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cây.
Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất. Nhưng tất cả
các loại môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: các nguyên tố
khoáng đa lượng, các nguyên tố khoáng vi lượng, nguồn cacbon, vitamin, các
chất điều hoà sinh trưởng và các thành phần khác.
b, Ảnh hưởng của các ngun tơ'khống đa lượng
Bao gồm các ngun tơ' khống được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm
(phần triệu = partper million), tức là trên 30mg/l.
Các nguyên tố khống đa lượng có vai trị quan trọng, chúng tham gia
vào cấu trúc tế bào, là thành phần của các đại phân tử trong tế bào (protein,

lipit, axit nucleic,...) Các ngun tố khống đa lượng cịn ảnh hưởng đến tính
chất của hệ thống keo trong chất nguyên sinh như: điện tích bề mặt, độ ngậm
nước, độ nhớt và độ bền vững của hệ thống keo.
Những ngun tơ' khống đa lượng bao gồm Nitơ (N), Lưu huỳnh (S),
Phospho (P), Kali (K), Manhê (Mg) và Canxi (Ca).
* Ni tơ ( N):
Được sử dụng dưới hai dạng NO và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với
3

nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả nãng khử nitrat thành amonium thơng
qua hệ thống nitrat reductase (NR). Amonium được các tế bào thực vật đồng
hoá trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như amino acid. Điều
đáng lưu ý là nếu chỉ dùng amonium (khơng có nitrat) thì sinh trưởng của tế
bào giảm, thậm chí ngừng hồn tồn. Ngun nhân chính là do q trình trao
đổi ion của các tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng làm thay đổi độ pH của
môi trường. Cụ thể: khi chỉ dùng nitrat, độ pH của môi trường tăng dần và khi
chỉ dùng riêng amonium, độ pH của môi trường giảm dần do tế bào hấp thu
NO hoặc N H / và thải ra mơi trường loại ion có hố trị tương đương. Khi pH
3

VÃN THIỆU
LỚP
CNSH
- KHOA
NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóaĐINH
bởi Trung
tâm -Họ
c liệ
u –KI

ĐH
TN KHOA HỌC T ự

21


Ắ tiùệi Jăn tấ t naÂiậa- Ổ ^ ại Rạc*

giảm thì q trình trao đổi Fe của mơi trường kém đi, kết quả là tế bào sinh
trưởng chậm lai. Vì vậy hầu hết các loại môi trường đều sử dụng nitrat và
amonium ở dạng phối hợp, nhưng tuỳ theo đặc tính hấp thu nitơ của lồi cây
đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp.
* Lưu huỳnh (S):
Chủ yếu và tốt nhất là muối S042 các dạng khác như S 03 hoặc S02
thường kém tác dụng, thậm chí cịn độc. Lưu huỳnh tham gia vào một số
protein và coenzym.
* Phospho (p):
Mơ và tế bào thực vật ni cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho
là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử axit nucleic, Adenin
triphotphat (ATP), cần cho sự nở hoa, đậu quả và phát triển hệ rễ. Ngoài ra khi
phospho ở dạng H2P 0 4 và HP042' cịn có tác dụng như một hệ thống đệm làm
ổn định pH của mơi trường trong q trình ni cấy [10].
c, Ảnh hưởng của các ngun tơ'khống vi lượng
Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Các
nguyên tố vi lượng thường là thành phần không thể thiếu được của hầu hết các
enzym. Chúng hoạt hố cho các enzym này trong các q trình trao đổi chất
của cơ thể.Những nguyên tố vi lượng bao gồm: sắt (Fe), Bo (B), Mangan (M),
Đồng (Cu), Kẽm (Zn), Niken (Ni), Coban (Co).
Sắt (Fe): thiếu Fe, tế bào mất khả nãng phân chia. Thí nghiệm với Fe
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy Fe được dự trữ trong nhàn rất

nhiều. Thiếu Fe làm giảm RNA và giảm sinh tổng hợp protein, nhưng làm
tăng lượng DNA và amino acid tự do kết quả là giảm phân bào.
Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường
thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu
trao đổi chất trong tế bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ờ dạng phức chelat với
citrat hoặc với EDTA ( Ethylen Diamin Tetraactic acid). Từ phức chất này Fe
được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng.

VÃN THIỆU
LỚP
- KHOA
NHIÊN & XẢ HỘI
Số hóaĐINH
bởi Trung
tâm -Họ
c CNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự

22


£ u â n \ỉăn tấ t niLỈítệp. Ổ ^ ạ i Ể ọ c

Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do
và DNA tăng lên, nhưng hàm lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn
tới phân bào kém.
Bo (B): thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì
thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mơ ni
cấy có biểu hiện mơ sẹo hố mạnh, nhưng thường là loại mơ sẹo xốp, mộng

nước, kém tái sinh.
Molypden (Mo): là ion đóng vai trị co-factor trong hệ thống nitrat
reductase, như vậy Mo tác động trực tiếp nên quá trình trao đổi đạm trong tế
bào thực vật [10].
d, Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức
dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ
điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả nãng quang hợp. Vì vậy việc
đưa vào mơi trường ni cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn
cacbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose. Nồng độ thích hợp
phổ biến là 2 - 3%, song vẫn còn phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay
đổi, có khi xuống tới 0,2% (chọn dòng) và tăng lên đến 12% (nhằm gây cảm
ứng stress nước).
e, Ảnh hưởng của vitamin
Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzym và
cofactor của nhiều phản ứng sinh hoá. Quan trọng nhất là các vitamin nhóm B.
Thiamin (vitaminB,) cần cho sự trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp
một số aminaxit, hàm lượng sử dụng 0,1 đến 5,0 mg/1.
Axit nicotimic (vitamin B3, niacin) tham gia tạo coenzym của chuỗi hô
hấp, sử dụng 0,1 đến 5,0% mg/1.
Pyridoxin (vitamin B6) là một coenzym quan trọng trong nhiều phản
ứng trao đổi chất, sử dụng 0,1 đến 1,0%.

VÃN THIỆU
LỚP
- KHOA
NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóaĐINH
bởi Trung
tâm -Họ

c CNSH
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự

23


Ẩ u ậ í v J ã n l ấ t n íiK ìệ p y 3 ) ạ i tuỊC<

Cả 3 loại vitamin trên đều được cung cấp ở dạng có chứa HC1. Ngồi ra
mơi trường ni cấy cịn chứa một số vitamin khác: Biotin (vitamin H),
vitamin M, vitamin B2, vitamin c [7].
/, Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần khơng thể thiếu trong ni
cấy mơ, tế bào. Nó quyết định sự thành công hay thất bại của việc ni cấy.
Hiệu quả tác động của các chất điều hồ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử
dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hồ sinh trưởng, mẫu ni cấy. Trong
nuôi cấy mô, tế bào thực vật các chất kích thích sinh trưởng sử dụng phổ biến
là: nhóm auxin và nhóm cytokinin.
* Nhóm Auxin:
Được đưa vào mơi trường ni cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và
giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất,
kích thích hình thành rễ và tham gia vào q trình phát sinh phơi vơ tính.
Các loại auxin thường được sử dụng: IAA (indole acetic acid), IBA (
indole bulyric acid), a- NAA (a- Naphthalence acetic acid),...
* Nhóm cytokinin
Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in
vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo thành rễ và sự sinh trưởng của
mơ sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính đến sự phát sinh phơi vơ tính của mẫu
ni cấy. Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy bao gồm: zenatin,

kinetin, BAP. Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 đến 2,0
mg/1. Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi ni cấy. Trong
ni cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc khơng cần cả hai, cịn
đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ
hợp tỷ lệ khác nhau [7],

24
THIỆU
LỚPc CNSH
- KHOA
NHIÊN & XÃ HỘI
Số hóaĐINH
bởi VĂN
Trung
tâm- Họ
liệu –KIĐH
TN KHOA HỌC T ự