Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình lên men thu nhận kefiran của chủng lactobacillus từ hạt kefir

..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------- FG -------

Người thực hiện: ĐỖ QUANG HUY

ĐỂ TÀI:

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN
KEFIRAN CỦA CHỦNG LACTOBACILLUS TỪ HẠT KEFIR

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
T.S NGUYỄN VĂN ĐẠO

Hà nội 2011


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này do bản thân tôi thực hiện, những kết quả
nghiên cứu được đưa ra trong luận văn là của bản thân tôi và chưa từng được
ai công bố trên các tạp chí khoa học trước đây. Các số liệu và kết quả được
thực hiện một cách khoa học, trung thực và chính xác.

1

LỜI CẢM ƠN
Trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Đạo – Phó 
chủ nhiệm Khoa  Cơng Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, người đã 
tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, chỉ bảo, động viên và giúp 
đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành luận văn. 
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cơ giáo Khoa Cơng Nghệ Sinh Học, 
Viện Cơng Nghệ Sinh Học & Cơng Nghệ Thực Phẩm, Viện Đào tạo sau Đại 
Học, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình dạy bảo tạo điều kiện 
thuận lợi để tơi hồn thành luận văn và khóa học thạc sĩ tại trường. 
Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Cơng ty TNHH MTV Bia Rượu 
Eresson, anh chị em lớp cao học, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã giúp đỡ 
tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài. 
Tơi xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, tháng 9 năm 2011
Học Viên

Đỗ Quang Huy

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Giải thích từ viết tắt

EPS

Exopolysaccharit

CS

Cộng sự

PYG10

Dịch gạo thủy phân

MT

Mơi trường

TB

Tế bào

VSV

Vi sinh vật

Lb

Lactobacillus

MRS

The formulations of deMan, Rogosa and Sharpe

OD

Optic density (mật độ quang)

AMG

Glucoamylase

rRNA

Ribosome ribonucleic acid

3


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các vi sinh vật trong nấm Kefir
Bảng 1.2: Giá trị nhiệt độ và pH tối ưu cho sự sinh trưởng của một số loại vi khuẩn
Lactic
Bảng 1.3: Danh sách các EPS
Bảng 3.1: Một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir
Bảng 3.2: Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập được
Bảng 3.3: So sánh khả năng sinh tổng hợp kefiran của một số chủng vi khuẩn lactic
từ hạt kefir
Bảng 3.4: So sánh sự tương đồng về trình tự ribonucleotide của 16S rRNA của
chủng vi sinh vật phân lập được và 16S rRNA của Lactobacillus plantarum, partial
sequence, strain: NRIC 1594
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến quá trình sinh tổng hợp
kefiran

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp kefiran trong
mơi trường nước mía
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ nước mía đến khả năng sinh tổng hợp kefiran.
Bảng 3.8: Hàm lượng kefiran sinh tổng hợp theo thời gian trong mơi trường nước
mía 15Bx
Bảng 3.9 Các yếu tố ảnh hưởng nghiên cứu
Bảng 3.10. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken 3 yếu tố và hàm lượng Kefiran trong
các điều kiện khác nhau
Bảng 3.11. Phân tích phương sai ANOVA của mơ hình
Bảng 3.12:Hàm lượng kefiran sinh tổng hợp theo thời gian lên men trong môi trường
dịch gạo thủy phân
Bảng 3.13: So sánh q trình sinh tổng hợp kefiran trong mơi trường nước mía và
trong mơi trường dịch gạo thủy phân
Bảng 3.14: Hàm lượng kefiran được tổng hợp khi bổ sung N vào mơi trường nước
mía
Bảng 3.15: So sánh ảnh hưởng của một số nguồn C đến khả năng sinh tổng hợp
Kefiran

4


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Hình dạng kích thước hạt nấm Kefir
Hình 1.2: Ảnh chụp nấm Kefir dưới kính hiển vi
Hình 1.3. Sản phẩm sữa kefir
Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo Curdlan
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo chitosan
Hình 1.6: Cấu trúc phân tử gellan
Hình 1.7: Cấu trúc phân tử Indican
Hình 1.8: Cấu trúc phân tử pullulan

Hình 1.9: Cấu trúc phân tử Welan
Hình 1.10: Cấu trúc phân tử Xanthan gum
Hình 1.11: Cấu trúc phân tử Kefiran
Hình 2.1: Phản ứng tạo màu của Polysacchart và Anthrone
Hình 3.1: Hình dáng khuẩn lạc vi khuẩn lactic phân lập được dự đoán là vi
khuẩn lactobaciluss sp.
Hình 3.2: Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập được chụp bằng kính hiển vi
điện tử
Hình 3.3: Trình tự 16S rRNA của chủng vi sinh vật phân lập được
Hình 3.4: Hình chụp dưới kính hiển vi chủng L. Plantarum
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH mơi trường lên men đến q
trình sinh tổng hợp kefiran
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh Kefiran
từ môi trường nước mía
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ nước mía đến khả năng sinh
Kefiran
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp theo thời gian trên
mơi trường nước mía
5


Hình 3.9. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng Kefiran
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng kefiran được sinh tổng hợp trong mơi
trường dịch gạo thủy phân
Hình 3.11: Đồ thị so sánh hàm lượng Kefiran sinh tổng hợp từ mơi trường
nước mía và dịch gạo thủy phân
Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn hàm lượng Kefiran được sinh tổng hợp khi bổ
sung Nitơ vào mơi trường nước mía
Hình 3.13: Đồ thị so sánh sự ảnh hưởng của một số nguồn Cacbon đến khả
năng sinh tổng hợp Kefiran

Hình 3.14: Sơ đồ quy trình thu nhận kefiran ở quy mơ phịng thí nghiệm
Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm Kefiran đã được sấy khơ có độ tinh sạch trên
96%

6


LỜI MỞ ĐẦU
Trong thời đại phát triển mạnh mẽ về công nghệ và những nghiên cứu khoa
học, vấn đề mà con người quan tâm hàng đầu là những sản phẩm phục vụ sức
khỏe nhân loại. Như chúng ta đã biết, sức khỏe của con người phụ thuộc vào
các yếu tố như di truyền, mơi trường sống, dinh dưỡng và phịng trị bệnh,
trong đó việc dinh dưỡng để phịng ngừa các bệnh tật đóng vai trị vơ cùng
quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe. Cơ thể chúng ta cần được cung cấp đầy
đủ các vitamin và khoáng chất mỗi ngày để đảm bảo năng lượng cần thiết cho
các hoạt động, nhưng nhu cầu này có thể khơng được thỏa mãn do nhiều yếu
tố.
Ngày nay, việc sử dụng thực phẩm chức năng mỗi ngày là một biện pháp
có hiệu quả, có những tác động rất tích cực trong việc hỗ trợ điều trị và phịng
chống một số bệnh. Nhờ tính chất chống oxy hóa, tăng miễn dịch giúp các tế
bào cơ thể chống lại sự lão hóa, giúp bổ sung cho cơ thể Vitamin và khống
chất là những nhóm chất hữu cơ cần thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được.
Nhiều lồi thực vật và vi sinh vật có khả năng tổng hợp được
exopolysaccharit – các chất có hoạt tính sinh học đã và đang được con người
khai thác để làm thuốc và thực phẩm chức năng phục vụ cho mục đích chữa
bệnh và tăng cường sức khỏe của con người. Kefiran là một trong những
exopolysaccharit có lợi đã được con người biết đến từ lâu. Kefiran có bản chất
polysaccharit, là chất xơ, bộ khung, giá đỡ của các mô, tế bào thực vật và có
sức chống đỡ với các loại men tiêu hóa của con người. Vi khuẩn lên men tạo
Kefiran phần lớn là Lactobacillus có trong hạt kefir. Các thực phẩm chức năng

loại này thường được chế biến từ các sản phẩm của sữa, gạo lên men, nước
dừa, nước hoa quả và nước mía,… Đây là những nguyên liệu sẵn có, giá thành
rẻ, nguyên liệu dồi dào phong phú, dễ tìm là một mơi trường khá tốt để lên
men các vi khuẩn lactic, có khả năng sinh tổng hợp kefiran cao. Kefiran được
7


biết đến là thực phẩm chức năng để duy trì sự cân bằng vi sinh vật trong
đường ruột, kích thích sự tăng trưởng hay hoạt động của một số vi khuẩn
đường ruột, tạo điều kiện cho vi khuẩn có lợi phát triển, giúp cải thiện sức
khỏe. Ngoài ra Kefiran cũng đã được chứng minh là một hợp chất có tác dụng
nâng cao khả năng miễn dịch ở người, chống ung thư, có lợi cho hệ tuần hồn
và tim mạch. Chính vì vậy chúng tơi đã thực hiện đề tài:
“ NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH LÊN MEN THU NHẬN

KEFIRAN CỦA CHỦNG LACTOBACILLUS TỪ HẠT KEFIR “
Để hoàn thành đề tài chúng tôi đã tập trung nghiên cứu một số nội dung chính:
- Phân lập và tuyển chọn chủng giống vi khuẩn lactic sinh tổng hợp kefiran
cao.
- Nghiên cứu phương pháp phân tích Kefiran.
- Nghiên cứu tối ưu mơi trường ni cấy thích hợp, rẻ tiền từ nguồn ngun
liệu trong nước.
- Nghiên cứu tối ưu một số điều kiện ảnh hưởng đến năng suất thu nhận
kefiran từ chủng phân lập như nhiệt độ, pH môi trường, nguồn C, N, thời
gian lên men,….
- Đưa ra quy trình lên men tối ưu thu nhận kefiran ở quy mơ phịng thí
nghiệm.
- Nghiên cứu phương pháp thu nhận kefiran ở dạng khô.

8

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình nghiên cứu Kefir và những lợi ích
1.1.1 Hạt nấm kefir và nguồn gốc của chúng
1.1.1.1 Nguồn gốc hạt nấm kefir
Kefir là sản phẩm lên men sữa đã có từ rất lâu đời. Sản phẩm này bắt
nguồn từ các tu sĩ ấn Tạng ở vùng núi Caucasus thuộc Liên Xô cũ. Hàng ngàn
năm qua đối với người dân vùng núi Caucasus, nấm Kefir được dùng để phòng
và trị bệnh. Từ Kefir được cho là bắt nguồn từ tiếng Thổ Nhĩ Kỳ “Keif” có
nghĩa “ cho cảm giác tốt”. Sữa lên men từ nấm Kefir trở thành đồ uống quý
báu và yêu thích của người dân ở Caucasus. Họ sử dụng đồ uống này thường
xuyên như một phần các sản phẩm trong chế độ ăn uống. Điều đặc biệt họ
không hề biết đến bệnh ung thư, các bệnh về đường tiêu hoá (như bệnh dạ dày,
bệnh đại tràng), bệnh lao, u bướu…và tuổi thọ của họ rất cao, trung bình tới
110 tuổi. Sữa chua Kefir là sản phẩm sữa lên men có vị chua đặc trưng và mùi
rượu nhẹ. Sữa chua Kefir có độ đặc vừa phải, đồng nhất có vị chua dịu với
hương thơm tự nhiên của nấm men tươi. Khác với các sữa chua khác là thêm
vào đó nấm Kefir tự sản sinh ra CO2 tạo cho sản phẩm có lượng ga nhỏ như
Sâm banh và lượng rượu nhỏ (0.6 – 3%). Tạo nên một sản phẩm giải khát hấp
dẫn hoàn hảo, để lại cho người sử dụng một ấn tượng khó quên. Cho tới thế kỉ
IXX vùng núi Cacasus nằm dưới sự kiểm soát của Nga và các bác sĩ người
Nga chính là người đầu tiên kiểm nghiệm về những lợi ích to lớn của nấm
Kefir đến sức khoẻ của con người [6].
Nấm Kefir chính thức được phổ biến vào những năm đầu của thập niên
1900 ở Matxcova do Irina Sakharova – một người phụ nữ trẻ đã mang một cốc
nấm Kefir về Matxcova. Ngày nay hầu hết nấm Kefir trên toàn thế giới là thế
hệ con cháu của cốc nấm Kefir này, một số ít có nguồn gốc từ nấm Kefir Tây
9

Tạng. Càng ngày nấm Kefir càng được tiêu thụ ở nhiều nơi trên thế giới. Có
những nơi sử dụng nấm Kefir như một phong trào dầm rộ (Nhật Bản, Hàn
Quốc, Mỹ). Đặc biệt với những người dị ứng với sữa, dị ứng với đường
Lactose, rối loạn tiêu hố thì họ được bác sĩ khuyên dùng sản phẩm sữa chua
Kefir.
Mặc dù cho tới nay việc nghiên cứu mới chỉ bắt đầu, chưa có một cơng bố
chính thức nào về nấm Kefir và những ứng dụng của nó. Nên có thể nói chúng
ta vẫn chưa hiểu biết hết về cấu trúc sinh khối của nấm Kefir được cấu tạo như
thế nào và vi sinh vật có trong nấm có mối liên hệ tới nhau ra sao.
1.1.1.2 Hạt nấm kefir
Nấm Kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất Polysaccharit, bao
gồm chủ yếu là vi khuẩn Lactic và nấm men. Nhóm vi khuẩn Latic lactobacilli
chiếm khoảng 65 – 80% tổng số vi sinh vật trong nấm men Kefir. Chúng là
những lồi ưa ẩm và nhiệt thực hiện q trình lên men Lactic theo cơ chế lên
men đồng hình.
Cịn nấm men chiếm khoảng 5 – 10% tổng số vi sinh vật trong nấm men
Kefir, gồm những loài lên men được và khơng lên men được đường Lactose.
Các lồi nấm men lên men được Lactose thường được tìm thấy tại các vị trí
gần bề mặt nấm Kefir, cịn các loại nấm men khơng lên men được Lactose lại
được tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt nấm [16].

10


Bảng 1.1: Các vi sinh vật trong nấm Kefir [5][11].
Giống vi sinh vật

Loài
Vi khuẩn

Lactobacilli

Lb.brivis,
Lb.cellobiosus,
Lb.kefir,
Lb.lactic,
Lb.plantarum, Lb.kefuranofaciens, Lb.kefirgarnum
sp.Now,
Lb.parakefir
sp.now,
Lb.hilgardii,
Lb.acidepphilus, Lb.casei ssp.Alactosus, Lb.case
ssp.Rhamnosus,
Lb.haelevecticus
ssp.lactis,
Lb.deibruevii ssp.Lactis, Lb.paracasei ssp.Paracasei,
Lb.casei,
Lb.delbrueckki
ssp.Hulgaricus,
Lb.fructivoram,….

Streptococci

S. thermophilus, S. lactis, S. Filant, S. durans

Lactococci

Lc. lactis. ssp. Plactis
Lc. lactis. ssp. Lactis var diacetylactis

Lc. lactis. ssp. Cremoris

Leuconostoc

Leuc. Mesesteroides. Ssp. Dextranicum
Leuc. Mesesteroides. Ssp. Cremoris

Acetobacter

Acetobacters casei
Nấm men

Kluyveromyces

K. lactic
K. marxinnus. ssp. Bulgalrricus
K. morxianus. ssp. Marxianus

Saccharomyces

S. lactic, S.cerevisiae, S.florentinus, S.globous,
S.unisporus, S.carlsbergensis, S.ssp.Torulópí holmii

Candida

C. kefir,C. preseudotropicalis,C. tenuis, C. rancens

Torulaspora

T. delbrueckii

11


1.1.1.3 Đặc điểm hình thái hạt nấm Kefir
Nấm Kefir có màu trắng đến vàng nhạt. Khơng có hình dạng nhất định,
thường kết thành chùm với nhau nhìn bề ngồi giống như hoa súp lơ thái nhỏ.
Kích thước đường kính trung bình của nấm Kefir là 15 – 20 mm.
Nấm Kefir không tan trong nước và hầu hết các dung môi. Khi thả vào sữa
Kefir thấm nước và có màu trắng đục.

Hình 1.1. Hình dạng kích thước hạt nấm Kefir [36], [37]
Bề mặt ngoài của hạt nấm Kefir biến đổi phức tạp. Có những chỗ ở dạng
thẳng, có những chỗ lại ở dạng lồi lõm rải rác khắp bề mặt. Một số nghiên cứu
có đưa ra kết luận: những chỗ bề mặt phẳng thường là nơi vi khuẩn chiếm ưu
thế, còn những vùng khơng phẳng xù xì thường tập chung nhiều nấm men [6].
Hạt nấm Kefir được hình thành từ những màng mỏng dạng gel chứa hỗn
hợp protein, lipid, polysaccharide. Ngoài tế bào VSV, hạt Kefir chứa khoảng
30% tổng chất khô và Carbohydrat (25-50%). Thành phần hạt giống sấy khô
đông lạnh với hàm ẩm 3.5% được tìm thấy bao gồm: chất béo 4.4%, chất tro:
12.1%, Kefiran 45.7%, Protetin tổng số 34.3%.

12


Nấm Kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi hệ gel Polysaccharit hoà
tan và đặt tên là Kefiran. Kefiran được tạo thành từ hai Monosaccharide với tỉ
lệ gần bằng nhau: Glucoza và Galactoza. Kefiran được tạo ra từ trung tâm của
hạt nấm, và do Lb.kefirannofaciens tổng hợp nên.

Hình 1.2: Ảnh chụp nấm Kefir dưới kính hiển vi [38]
Nấm Kefir có cấu trúc tương đối ổn định. Là một cơ thể sống nên nấm Kefir
có khả năng phát triển, trưởng thành, sinh sản và di truyền cho thế hệ sau. Nấm
Kefir sinh sản theo phương thức tự nhân giống. Các hạt giống được hình thành
giống hệt mẹ. Trong vài trường hợp đặc biệt, có những hạt khơng thể cho ra
bất cứ hạt nào trong một thời gian dài. Mà thay vào đó chúng hình thành nên
một khối lớn (khối hạt Kefir).
1.1.2 Tình hình nghiên cứu Kefir trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu Kefir trên thế giới
Sau khi nhận giải thưởng Nobel, Elie Metchnikoff đã bắt đầu nghiên cứu
những lợi ích của kefir vào đầu những năm 1900. Năm 1900, một loạt các
nghiên cứu đã chỉ ra rằng kefiran là sản phẩm của vi khuẩn trong tự nhiên,
việc ni cấy chúng có ảnh hưởng tích cực cho q trình tiêu hóa, nâng cao
khả năng phân giải lactose, tăng cường miễn dịch, và giảm đáng kể mức độ
nghiêm trọng và thời gian tiêu chảy do điều trị bằng thuốc kháng sinh.

13


Những người Nga tin rằng việc sử dụng thường xuyên sản phẩm kefir sẽ cải
thiện sức khỏe tổng thể, giúp chống lại bệnh tật, nhiễm trùng, tốc độ phục hồi
thương tích và bệnh nhanh. Ngành khoa học và y tế Nga đã có nhiều bài viết
về việc sử dụng kefir cho nhiều loại bệnh do nhiễm trùng. Kefir đã được các
nước Liên Xô cũ sử dụng trong điều trị viêm loét dạ dày, bệnh đường mật, ruột
mãn tính, viêm phế quản và viêm phổi.
Tại Nhật Bản đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng kefir hay hạt
kefir có thể bảo vệ cơ thể chống lại căn bệnh ung thư. Đây thực sự là một thử
thách lớn, việc sử dụng kefir trước khi cơ thể tiếp xúc với chất gây ung thư, tỷ
lệ của động vật phát triển ung thư được giảm xuống. Nếu kefir được đưa vào
sau khi cơ thể tiếp xúc với các chất gây ung thư thì tốc độ tăng trưởng của ung

thư được giảm xuống. Cho đến hiện nay vẫn chưa có một ấn phẩm khoa học
thực sự nghiên cứu sử dụng kefir trong điều trị ung thư.
Trên thế giới Kefir được nghiên cứu ở rất nhiều nước và đặc biệt là ở các
nước Đơng Âu. Với những lợi ích thiết thực trong đời sống kefir thương phẩm
đã trở thành một thành phần trong khẩu phần ăn của người dân ở nhiều nước
phát triển. Các nghiên cứu mới đây càng mở ra nhiều hơn khả năng ứng dụng
của kefir trong lĩnh vực y học phục vụ con người.
1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu nấm kefir tại Việt Nam
Ở Việt Nam sữa chua Kefir có từ rất lâu, nhưng chưa được phổ biến và chưa
có một cơng trình nghiên cứu nào cơng bố về nấm Kefir và những ứng dụng
của nó. Việc nghiên cứu mới chỉ bắt đầu ở một số phịng thí nghiệm, chưa có
một dự án nào về nấm Kefir. Nấm Kefir chỉ được sử dụng chủ yếu ở quy mơ
hộ gia đình, và được biết đến như một loại nước uống có tác dụng chữa bệnh
đường ruột hay bệnh dạ dày mà thôi. Trên thị trường hiện nay có sản phẩm sữa
chua khơng đường của hãng Vinamilk. Tuy nhiên sản phẩm này hiện tại mới
bán được ở một số đại lý của hãng với số lượng ít, nên chưa được nhiều người
14


tiêu dùng biết đến. Đây là một hạn chế rất lớn, bởi sản phẩm sữa chua Kefir là
một sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và có lợi ích chữa bệnh mà
lại rất hiệu qủa, ít tốn kém. Vì thế việc nghiên cứu về nấm Kefir và tìm ra
những sản phẩm có giá trị phù hợp với thực tế, khí hậu con người Việt Nam
đưa sản phẩm ra thị trường là điều rất cần thiết.
1.1.3. Các quá trình lên men Kefir
1.1.3.1 Phương pháp lên men truyền thống
Theo phương pháp truyền thống của những người dân ở miền núi Cacasus
sữa chua Kefir được làm với nguyên liệu là sữa bò, sữa dê, hoặc sữa cừu. Nấm
Kefir và sữa tươi nguyên liệu được cho vào những túi da dê hay cho vào
những bình gỗ sồi. Rồi để ở những nơi thống mát, khi trời lạnh thì những túi

da dê, bình gỗ sồi này được đặt ở ngồi trời suốt cả ngày, cịn buổi tối thì đặt
cạnh bếp lửa. Sau 24 giờ lên men họ tách sữa đã lên men và nấm Kefir ra khỏi
nhau. Nấm Kefir được rửa bằng nước sạch hoặc bằng sữa tươi rồi tiếp tục bổ
sung lên men thêm sữa để lên men tiếp. Sữa đã lên men sau khi được tách khỏi
nấm có thể sử dụng ngay hoặc được rót vào thùng gỗ đóng kín để một vài ngày
(có thể bổ sung thêm sữa) để tiếp tục lên men phụ [14]. Sản phẩm sau khi lên
men phụ có hàm lượng CO2 và nồng độ rượu cao hơn một chút so với trước
khi lên men. Nhưng sản phẩm vẫn giữ được nguyên chất lượng mà lại có cấu
trúc mịn và đồng nhất, hương vị hài hồ hơn và có một lượng nhỏ gas nhẹ cho
sản phẩm như sâm banh.
1.1.3.2 Phương pháp lên men quy mô công nghiệp
Ở quy mơ cơng nghiệp, lên men có thể theo nhiều phương thức khác nhau
nhưng cơ bản vẫn dựa trên một số nguyên tắc chung của phương pháp lên men
truyền thống. Sữa nguyên liệu để sản xuất sữa chua Kefir phải là do sữa có
chất lượng cao. Hàm lượng chất béo có thể thay đổi theo thị hiếu người tiêu
dùng.
15


Sữa chua được đồng hoá ở 70 – 750C, 175 – 200 bar. Sau đó thanh trùng 90
– 950C trong 5 phút. Hạ nhiệt độ này, toàn bộ Protein hoà tan bị biến tính hồn
tồn và chính Protein bị biến tính này có khả năng giữ nước rất cao, sẽ có tác
dụng cải thiện độ đặc và độ mịn của sữa chua Kefir [29].
Sau đó sữa được làm nguội xuống 23 – 250C, cấy 2 – 3% chủng và lên men
ở nhiệt độ trong 12 – 14 giờ. Khi đạt pH 4.5 – 4.6 thì làm lạnh nhanh xuống 14
–160C (hạn chế tối đa các tác động cơ học). Sau khi đã làm lạnh, sữa chua
Kefir còn được giữ một thời gian ở nhiệt độ thấp gọi là thời gian ủ chín. Trong
giai đoạn này, vi khuẩn Lactic khơng hoạt động nhưng nấm Kefir lại hoạt động
mạnh, tạo ra rượu, khí CO2 và một số chất thơm. Kết thúc giai đoạn ngâm
chín, sản phẩm được bảo quản 4 – 80C cho đến khi tiêu thụ, tên thương mại

thường được gọi là sữa chua kefir [29]. Sữa chua Kefir có tính chất giải khát,
tăng tính dịch vị, được sử dụng như một thực phẩm ăn kiêng, điều trị bệnh.
1.1.4 Những lợi ích khi sử dụng Kefir [16]
Sản phẩm từ quá trình lên men Kefir có rất nhiều lợi ích đối với sức khoẻ
của con người: Trước hết có thể khẳng định sữa chua Kefir là một món ăn bổ
dưỡng, vị chua và men của Kefir giúp dễ dàng tiêu hoá thức ăn khác. Trong
thành phần của sữa chua Kefir có hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ
thể: cung cấp năng lượng, chất béo, protein, lactose, axit lactic, khoáng chất,
các axit amin chủ yếu,… giúp chữa bệnh và duy trì các chức năng cho cơ thể.
Ngồi ra sữa chua Kefir còn giàu các Vitamin B ( B1, B12, B6), Vitamin K,
Canxi, các axit amin. Đây là nguồn Biotin tuyệt vời giúp cơ thể hấp thụ những
Vitamin B có trong Kefir có tác dụng điều hồ hoạt động của thận, gan, hệ
thần kinh cũng như các rối loạn về da, có khả năng tăng cường và kéo dài tuổi
thọ. Trytophan là một trong những axit amin cần thiết có trong sữa chua Kefir
có tác dụng thư giãn hệ thần kinh. Các nguyên tố Canxi, Magie có trong sữa
chua Kefir cũng đóng vai trị giúp hệ thần kinh được thư giãn [14].
16


Hình 1.3: Sản phẩm sữa kefir [34]
Kefir cịn cung cấp một lượng lớn Phospho, là khoáng chất nhiều thứ hai
trong cơ thể con người. Tạo điều kiện phân giải Gluxit, chất béo, Protein giúp
sản sinh năng lượng và tham gia sự phát triển của tế bào. Các Protein hoàn
chỉnh trong Kefir được tiêu hố hồn tồn nên cơ thể rất dễ hấp thụ [21].
Sữa chua Kefir còn chứa một lượng lớn các vi khuẩn có lợi cho cơ thể (đặc
biệt là hệ tiêu hóa). Nghiên cứu do tổ chức Society of chemical Industry (UK)
thực hiện cho thấy chính các vi sinh vật tự nhiên có trong Kefir làm giảm các
kích thích gây ra bệnh dị ứng do vi sinh vật có hại gây ra. Khi uống sữa chua
Kefir các vi sinh vật có ích sẽ vào ruột cạnh tranh với vi khuẩn gây hại
(thường sinh độc tố) có trong ruột già. Đặc biệt đối với những bệnh nhân bị

nhiễm khuẩn phải sử dụng kháng sinh liều cao dài ngày, sẽ bị rối loạn hay bị
hỏng hệ vi sinh vật đường ruột có lợi cho tiêu hố. Đối với những người này
sử dụng sữa chua Kefir sẽ giúp phục hồi hệ vi sinh vật cho cơ thể. Đặc biệt
nấm Kefir còn có khả năng tạo chất kháng sinh chống được Staphylococus và
một số tác nhân gây bệnh đường ruột khác.
Đối với những người mẫn cảm với sữa, đường Lactose (khi ăn các sản phẩm
chứa nhiều đường Lactose hay uống sữa có hiện tượng đầy bụng khó chịu) thì
sữa chua Kefir là giải pháp dành cho họ. Bởi khác với chủng nấm men khác,
nấm Kefir chỉ phân giải được đường Saccharose mà còn phân giải được đường
17


Lactose. Nên lượng đường Lactose trong sữa sẽ được nấm Kefir sử dụng triệt
để trong quá trình lên men, chuyển hoá Lactose thành những hợp chất dễ hấp
thụ khác, sản phẩm sau khi lên men hầu như khơng cịn đường Lactose [16].
Trong y học sữa chua Kefir được sử dụng trong rất nhiều trường hợp. Đây là
phương thuốc đặc trị cho các bệnh đường ruột, rối loạn quá trình trao đổi chất,
các bệnh mãn tính do vi sinh vật có hại gây ra, thậm chí cịn được sử dụng
trong điều trị các bệnh ung thư, bệnh lao, bệnh thận và một số bệnh ảnh hưởng
đến hệ thần kinh.
1.2. Hệ vi khuẩn lactic trong hạt nấm Kefir và khả năng thu nhận Kefiran
1.2.1. Vi khuẩn Lactic
1.2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactic
1.2.1.1.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về
vitamin và Nito. Chẳng hạn, loài Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có
địi hỏi chất dinh dưỡng cao nhất. Chúng địi hỏi khơng chỉ các chất phức tạp
chứa cacbon, nito, photphat và lưu huỳnh mà cịn có nhu cầu lớn về các yếu tố
cần cho sự phát triển như vitamin, muối vô cơ [20], [26].
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic rất phức tạp, khơng một đại diện

nào của chúng có thể phát triển trên mơi trường muối khống thuần khiết chứa
glucoza và NH4+. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin lactoflavin, tiamin, axit
pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin… và các axit amin trong q trình
sinh trưởng, phát triển [1]. Vì vậy mơi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic thường
chứa một lượng lớn các chất cung cấp axit amin và vitamin như: cao nấm men,
peptone. Ngoài ra, để tăng cường khả năng sinh trưởng, phát triển của vi
khuẩn lactic, người ta bổ sung thêm các muối khống (Mn2+, Mg2+, Fe2+…)
thậm chí bổ sung máu. Ví dụ: ở Hoa Kì, người ta bổ sung 5% máu cừu vào

18


môi trường thạch để nuôi cấy Streptococcus, ở Anh người ta thường dùng 5%
máu ngựa để bổ sung vào môi trường thạch…[27].
Một loại axit hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của
hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axit oleic (có thể thay thế bằng axit linoleic
và axit linolenic). Đó là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween – 80,
một dẫn xuất của axit oleic (Polyoxyethlene sorbiton monoleate), trong thành
phần môi trường phân lập, ni cấy vi khuẩn lactic.
1.2.1.1.2. Q trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong đời sống thực tiễn là do vi
khuẩn lactic có khả năng sinh ra axit lactic thơng qua q trình trao đổi chất và
năng lượng của chúng. Để thực hiện việc trao đổi chất và năng lượng, vi khuẩn
lactic buộc phải tiến hành quá trình lên men lactic, lên men lactic là q trình
chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy axit lactic trong mơi trường [1], [2].
a. Trao đổi cacbon:
Chất đầu tiên tham gia vào quá trình lên men lactic là đường glucoza hoặc
fructoza. Các đường đôi hay đường đa trước khi tham gia vào quá trình lên
men phải được thủy phân thành glucoza và fructoza nhờ các enzyme tương
ứng.

b. Trao đổi nitơ:
Nitơ dưới dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng
cho quá trình phát triển của vi khuẩn lactic bởi vì các vi khuẩn sinh tổng hợp
rất khó khăn các axit amin. Trong quá trình lên men mà chỉ có nguồn cacbon
duy nhất là saccaroza hoặc lactoza thì cần phải bổ sung vào môi trường các
nguồn dinh dưỡng nitơ. Nitơ ở dạng peptit đặc biệt cần cho sự phát triển sinh
khối [24].
Cơ chế trao đổi nitơ ở vi khuẩn lactic rất phức tạp và người ta mới bắt đầu
tìm hiểu nó.Có rất nhiều nguồn nitơ mà vi khuẩn lactic có thể sử dụng như:
19


cao thịt, cao nấm men, peptone, tryptone, dịch thủy phân cazein sữa, cao đậu
tương, muối amoni… Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng
nhiều nhất và có hiệu quả nhất cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Tuy nhiên
trên thực tế không sử dụng nguồn nitơ này ở quy mơ cơng nghiệp vì rất tốn
kém.
1.2.1.1.3. Ảnh hưởng điều kiện mơi trường đến q trình trao đổi chất
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng của
vi khuẩn lactic. Tùy thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sinh trưởng,
vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: loại ưa nhiệt và loại ưa ấm. Loại ưa nhiệt
gồm có: Lb.bulgaricus, Lb.thermophilus, Lb.delbrueckii…phát triển tốt ở 4562oC… Loại ưa ấm gồm có: Lb.causasicus, Lb.lactic, Lb.heleveticus,
Lb.acidophilus, Lb.bifidus phát triển tốt ở 28-32oC. Ảnh hưởng của nhiệt độ có
lẽ nhiều nhất là đến các phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục
tăng nhiệt độ sẽ xảy ra sự biến tính protein.[27].
b. Ảnh hưởng của pH
Hoạt độ của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng chịu tác
động mạnh của pH. Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của
enzyme là cao nhất. Tuy nhiên pH nội bào của vi khuẩn lại không tương ứng

với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nó chứa. Điều này có thể được giả
thiết rằng tác động của pH lên hoạt tính enzyme dựa trên sự tác động vào các
yếu tố trao đổi chất của tế bào [25].
Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức
chế các loại vi sinh vật khác. Sau đó khi lượng axit tích lũy đủ lớn thì chính vi
khuẩn lactic cũng bị ức chế. Sự axit hóa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào
axit lactic. Vì vậy chính axit lactic lại là một chất ức chế.

20


Vai trò của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm không chỉ giới hạn ở
việc hạ thấp pH của sản phẩm lên men mà còn liên quan chặt chẽ đến việc giải
phóng ra các enzyme ngoại bào và sau đó là các enzyme nội bào sau khi tế bào
bị phân hủy vào mơi trường. Chính các enzyme này đã cải thiện khả năng dễ
tiêu hóa cũng như tính chất cảm quan của sản phẩm lên men. Các enzyme này
rất nhạy cảm với pH, hoạt tính của chúng gần như bằng 0 khi pH thấp hơn 4,5.
Chẳng hạn, hoạt tính proteaza cao nhất của chúng nằm trong khoảng 5 – 7,5
trong khi hoạt tính lipaza cao nhất lại nằm trong khoảng 7,5 – 9 [25]. Thế
nhưng trong chế biến thực phẩm bằng lên men lactic thì pH thường thấp hơn 5.
Do đó protein chỉ bị tác động của proteaza nếu hệ vi sinh vật trong thực phẩm
có thể sinh ra các chất trung hòa axit. Sự phát triển của hệ vi sinh vật kiểu này
nhìn chung là cần được tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chế biến lên men
các nguyên liệu có nguồn gốc động vật (phomat, xúc xích khơ, nước mắm…)
và cần được tránh trong trường hợp chế biến các nguyên liệu có nguồn gốc
thực vật (dưa cải bắp, ủ chua cỏ…).
Bảng1.2: Giá trị nhiệt độ và pH tối ưu cho sự sinh trưởng của một số loại vi
khuẩn Lactic [5]
Topt (oC)

pHopt

Latococus lactic

29 – 34

6.0 – 6.5

Latococus cremoris

28 – 32

6.0 – 6.5

Latococus diacetylactis

30 – 34

6.0 – 6.5

Streptococus thermophilus

40 – 42

6.0 – 6.5

Lactobacillus bulgaricus

43 – 46

5.5 – 6.0

Lactobacillus helveticus

43 – 46

5.5 – 6.0

Lactobacillus casei

30 – 37

—

Loài vi sinh vật

21


Lactobacillus kefir

30

—

Lactobacillus acidophilus

37

5.5 – 6.0

Lautoconotoc lactic

20 – 27

5.5 – 6.0

Lautoconotoc cremoris

25 – 30

—

Bifidobacterium bifidum

37 – 40

—

1.2.2. Hệ vi khuẩn lactic trong hạt nấm kefir và vai trò của chúng [15]
Sữa được lên men chủ yếu là khu hệ vi khuẩn Latic và men sữa (Kefir).
Dưới tác động của nhóm vi sinh vật này, đường Lactose của sữa sẽ được
chuyển hoá thành axit Lactic và một lượng nhỏ rượu Ethanol (nếu sử dụng
men sữa). Cịn Protein trong sữa thì bị Pepton hố, sau đó chuyển thành các
Amino axit – những sản phẩm dễ tiêu hố.
Thành phần mơi trường có ảnh hưởng đến hình dạng tế bào (thường ở dạng
hình cầu, hình que). Trong mơi trường có hàm lượng rượu cao làm tế bào dài
ra. Rượu Etylic cịn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với
sự sinh trưởng của vi khuẩn. Vi khuẩn Lactic là thể kị khí, vi hiếu khí. Trong
điều kiện kị khí chúng sinh trưởng và hoạt động mạnh, nhưng ở điều kiện hiếu

khí chúng vẫn sống và hoạt động kém [15]. Một số vi khuẩn Latic điển hình
ảnh hưởng lên quá trình lên men ở sữa:
Giống Streptococus lactic có tế bào hình trịn hoặc hình ovan đường kính
khoảng 0.5 - 1µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Vi khuẩn
này phát triển tốt trong môi trường sữa và một số môi trường pha chế từ sữa,
trong khi lại phát triển kém trong môi trường nước thịt Pepton. Đây là loại vi
khuẩn hiếu khí tuỳ tiện nên có thể phát triển sâu trong trong thạch và cho
khuẩn lạc hình cây có nhánh. Đặc điểm sinh hóa quan trọng là lên men
Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Dextrin, khơng lên men Saccharose. Vì
22


vậy Streptococus lactic đóng vai trị quan trọng trong cơng việc chế biến sữa
chua. Phát triển tốt ở nhiệt độ 300 – 350C, ở nhiệt độ này vi khuẩn gây đông tụ
sữa chua 10 – 12 giờ, độ axit giới hạn do Streptococus lactic tạo nên thường
dao động trong khoảng 110 – 1200T, mặc dù có những chủng yếu chỉ tạo
khoảng 90 – 1000T. Sữa được lên men chua bởi Streptococus lactic ln có
hương vị đặc trưng của sản phẩm sữa chua.
Giống Betabacteriu phát triển trên môi trường thạch tạo những khuẩn lạc
giống như khuẩn lạc trực khuẩn Lactic ưa nhiệt. Khi phát triển trong sữa vi
khuẩn này cho ít axit, nếu cho dịch tự phân nấm men vào môi trường, vi khuẩn
này phát triển hẳn lên, đường sữa bị lên men bởi vi khuẩn này không chỉ tạo
thành axit Lactic àm còn tạo nhiều axit dễ bay hơi. Trong sữa thường có hai
loại chính là Betabacterium causasium và Betabacterium breve.
Giống Leuconostoc là nhóm gồm những vi khuẩn lên men Lactic điển hình.
Chúng có dạng hình cầu đường kính từ 0.5-0.8 µm và chiều dài khoảng 1.6 µm
nhưng trong mơi trường axit chúng nhọn ở hai đầu và dài ra sinh ra lượng axit
có hạn vì thế khơng làm đơng sữa. Trái lại chúng hình thành từ các đường,
Acetyl metyl cacbonyl hoặc Acetoin làm cho bơ thơm. Loại vi khuẩn điển
hình này là Leuconostoc citrovosium được ứng dụng trong sản xuất bơ.

Giống Lactobacillus có dạng hình que. Đây là loại vi khuẩn lactic phổ
biến nhất. Hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu méo ngắn cho đến hình
que dài. Chẳng hạn Lactobacillus Plantarum có dạng hình que kích thước từ
0,7- 1,1µm đến 3- 8µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ
(Pederson,1936), trong khi Lactobacillus casei có dạng hình que ngắn hoặc
hình que dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay
chuỗi.
Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này phụ thuộc vào môi trường nuôi
cấy. Chiều dài tế bào thay đổi phụ thuộc rất lớn vào thành phần của môi
trường ni cấy, sự có mặt của ơxy cũng như điều kiện nuôi cấy.
23


1.2.3. Vi khuẩn lactic lên men sản xuất kefiran
Ngày nay sữa chua được tiêu thụ nhiều nhất ở các quốc gia vùng Địa Trung
Hải, Trung Âu và Châu Á. Sữa chua có nhiều loại như: yohurt, kefiran,
komiss… các sản phẩm này được thu nhận nhờ quá trình lên men một phần
đường lactoza trong sữa thành axit lactic.
Sữa chua nói chung và kefiran nói riêng có giá trị dinh dưỡng cao và có
hương vị thơm ngon nên được nhiều người ưa thích. Vì có hàm lượng axit
lactic cao nên protein của sữa khơng bị tiếp tục phân giải, mặt khác vì có các
q trình lên men phụ tạo ra diaxetyl các este và các axit hữu cơ bay hơi nên
kefir có hương vị thơm ngon. Các thành phần dinh dưỡng của kefiran được cơ
thể hấp thụ dễ dàng, khả năng đồng hóa cao. Ngồi việc dùng để ăn, kefiran
cịn dùng để chữa bệnh đường ruột, dạ dày, lao, thận… Vì trong kefiran có tích
tụ các chất như Lizin, Streptominxin… Kefiran cịn giúp tăng tuổi thọ cho con
người.
1.3. Exoplolysaccharit và những hiểu biết chung về Kefiran
1.3.1 Exopolysaccharit
Exopolysaccharit là một polymer có phân tử lượng lớn bao gồm các gốc

đường, được tiết ra mơi trường xung quanh trong q trình trao đổi chất của vi
sinh vật. Chúng tổng hợp một phổ rộng các polysaccharit đa chức năng bao
gồm các polysaccharits nội bào, polysaccharits cấu trúc và polysaccharits
ngoại bào hoặc exopolysaccharits (EPS). Exopolysaccharits nói chung bao
gồm các monosaccharide và một số nhóm chức carbonhydrate ( như acetate,
pyruvate, succinate, và phosphate) [18]. Với những đặc tính đa dạng bởi sự kết
hợp khác nhau giữa các gốc đường, exopolysaccharits đã được ứng dụng nhiều
trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. Các sản
phẩm EPS do vi khuẩn tổng hợp qua quá trình đồng hóa có trạng thái dạng
gơm keo hiện nay đang được đưa vào sử dụng. Việc tìm ra ngày càng nhiều
24