Nghiên cứu phương pháp phân tích chất bảo quản acid benzoic acid sorbic và muối của chúng ứng dụng khảo sát thực trạng sử dụng trong một số loại thực phẩm

..

PHẠM THỊ HỒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

PHẠM THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN
ACID BENZOIC, ACID SORBIC VÀ MUỐI CỦA CHÚNG,
ỨNG DỤNG KHẢO SÁT THỰC TRẠNG SỬ DỤNG TRONG
MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

KHOÁ 2011-2013
Hà Nội – Năm 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------------------PHẠM THỊ HỒNG

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT BẢO QUẢN
ACID BENZOIC, ACID SORBIC VÀ MUỐI CỦA CHÚNG,
ỨNG DỤNG KHẢO SÁT THỰC TRẠNG SỬ DỤNG TRONG MỘT SỐ
LOẠI THỰC PHẨM

Chuyên ngành: CÔNG NG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN THỊ MINH TÚ

Hà Nội – Năm 2013


Trong q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn này tơi đã nhận đƣợc sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp, những ngƣời thân
trong gia đình và các cơ quan có liên quan.
Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn tới:
PGS.TS. Nguyễn Thị Minh Tú
cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hồn
thành đề tài này.
Tơi vơ cùng biết ơn
đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho tôi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban giám h

- Trường Đại học Kỹ
thuật Y tế Hải Dương, cho tôi cơ hội đƣợc đi học

-

, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và cơng tác để tơi hồn thành đề tài nghiên
cứu.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Tập thể cán bộ nhân viên Khoa An toàn Vệ sinh

Thực phẩm – Viện Dinh Dưỡng Quốc Gia, đã giúp đỡ và chia sẻ cho tôi kiến thức
và kinh nghiệm để tơi thực hiện và hồn thành đề tài này.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lịng
ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tơi hồn thành tốt đề tài.
Phạm Thị Hồng

I


Phạm Thị Hồng
-2013

II


MỤC LỤC
……………………………………………………………………… I
II
III
VII
IX
XI
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN……………………………………………………… 3
1.1. Đặc điểm và tính chất của acid benzoic, acid sorbic................................…….. 3
1.1.1. Acid benzoic………………………………………………………………… 3
1.1.2. Acid sorbic…………………………………………………………………..

3

1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid benzoic, acid sorbic………………

4

1.2.1. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid benzoic ………………………… 5
1.2.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic…………………………...

5

1.3. Giới hạn cho phép acid benzoic, acid sorbic trong thực phẩm……………….. 6
1.4. Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid benzoic, acid sorbic………….

6

1.4.1. Phƣơng pháp so màu………………………………………………………..

6

1.4.2. Phƣơng pháp chuẩn độ………………………………………………………

7

III


1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)…………………………...

8

1.5. Nguyên tắc chung về HPLC…………………………………………………..

9

1.5.1. Pha tĩnh trong HPLC………………………………………………………..

10

1.5.2. Pha động trong HPLC………………………………………………….........

11

1.5.3. Các loại Detector trong HPLC………………………………………………

12

1.5.4. Một số đại lƣợng đặc trƣng…………………………………………………

12

1.5.4.1. Thời gian lƣu………………………………………………………………

12

1.5.4.2. Hệ số đối xứng peak……………….………………………………………

13

1.5.4.3. Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết………………………………………….

14

1.5.4.4. Độ phân giải……………………………………………………………….
1.5.5. Phân tích định tính và định lƣợng trong HPLC……………………………..

14
14

1.5.5.1. Phân tích định tính………………………………………………………… 14
1.5.5.2. Phân tích định lƣợng………………………………………………………

15

CHƢƠNG 2 – Đối tƣợng và Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………...

17

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………………. 17
2.1.1. Đối tƣợng mẫu………………………………………………………………

17

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu…………………………………………...

17

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ …………………………………………………………

17

2.1.4. Hóa chất, thuốc thử………………………………………………………….

18

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………………..……….

20

IV


2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ…………………………………..

20

2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid benzoic và acid sorbic……………..

20

2.2.3. Nghiên cứu phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid benzoic và acid sorbic

20

2.2.4. Phƣơng pháp thẩm định……………………………………………………..

23

2.2.4.1. Tính phù hợp của hệ thống sắc ký………………………………………… 23
2.2.4.2. Tính chọn lọc và đặc hiệu…………………………………………………

23

2.2.4.3. Khoảng tuyến tính…………………………………………………………

23

2.2.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)…………………..

23

2.2.4.5. Độ lặp lại………………………………………………………………….

24

2.2.4.6. Độ đúng…………………………………………………………………..

25

2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………………......

27

Chƣơng 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ…………………………………….. 28
3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích acid benzoic và acid sorbic ………… ……

28

3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích acid benzoic và acid sorbic………………

28

3.1.1.1. Lựa chọn detector………………………………………………………….

28

3.1.1.2. Lựa chọn cột tách…………………………………………………………

29

3.1.1.3. Lựa chọn pha động……………………………………………………….

30

3.1.2. Xử lý mẫu trong phân tích acid benzoic và acid sorbic……………………..

33

3.1.2.1. Khảo sát thời gian chƣng cất………………………………………………

33

3.1.2.2. Lựa chọn phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………………… 36

V


3.1.3. Qui trình phân tích của nghiên cứu………………………………………….

40

3.2. Thẩm định phƣơng pháp………………………………………………………

41

3.2.1. Kết quả nghiên cứu tính phù hợp của hệ thống…………………………….

41

3.3.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc……………………………………………………...

42

3.2.3. Khoảng tuyến tính…………………………………………………………...

43

3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)……………………..

46

3.2.5. Độ lặp lại…………………………………………………………………….

46

3.2.6. Độ đúng……………………………………………………………………...

50

3.3. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích để phân tích định lƣợng cid benzoic và
acid sorbic trong một số thực phẩm……………………………………………….

54

Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………

59

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..

61

VI


ACN:

AOAC:

Acetonitril
Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân
tích chính thức)

DAD:

Diode Array Detector (Detector mảng diod)

GC:

Gas chromatography (Sắc ký khí)

HPLC:

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

R (%):
BA

Acid benzoic

SA

Acid sorbic

KPH:
MeOH:

Methanol

LOD:

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ:

Limit of Quantification (Giới hạn định lƣợng)

S/N:

Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

SOP:

Standard Operation Procedure (Quy trình thao tác chuẩn)

ppm:
QC:

Quality control (Kiểm tra chất lƣợng).

RSD:

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)

UV-VIS:

Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến)

VII


TCVN:

INS

ADI

Tiêu chuẩn Việt Nam.
International numbering system (hệ thống mã số quốc tế về phụ gia thực
phẩm).
Acceptable daily intake (lƣợng ăn vào hằng ngày có thể chấp nhận đƣợc)

Maximum Level (lƣợng phụ gia tối đa của một chất phụ gia thực phẩm),

ML

tính bằng mg/kg thực phẩm dạng rắn và mg/l đối với thực phẩm dạng
lỏng

VIII


DANH
Bảng1.1: Ảnh hưởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật………………….

4

Bảng 2.1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC…

25

Bảng 2.2: Độ thu hồi chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC………... 26
Bảng 3.1: Ảnh hưởng bản chất cột đến thời gian lưu và diện tích peak…………

30

Bảng 3.2: Tính chất của một số loại dung môi dùng làm pha động………………

31

Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích peak

31

Bảng 3.4: Điều kiện chạy sắc ký tối ưu………………………………………………

32

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến kết quả phân tích acid
benzoic…………………………………………………………………………………...

34

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến kết quả phân tích acid sorbic 35
Bảng 3.7: Kết quả phân tích acid benzoic trên một mẫu xúc xích theo 2 phương
pháp………………………………………………………………………………………..

37

Bảng 3.8: Kết quả phân tích acid sorbic trên một mẫu xúc xích theo 2 phương
pháp………………………………………………………………………………………..

38

Bảng 3.9: Kết quả tính tốn sự phù hợp của hệ thống……………………………… 42
Bảng 3.10: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid benzoic……………… 44
Bảng 3.11: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid sorbic…………….....

45

Bảng 3.12: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid benzoic trong
khoảng 0,05 ÷ 2,5 ppm….......................................................................................

47

Bảng 3.13: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid sorbic trong khoảng
0,05 ÷ 2,5 ppm…....................................................................................................

IX

47


Bảng 3.14: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid benzoic trong
khoảng 1 ÷10 ppm……………………………………………………………………….. 48
Bảng 3.15: Phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ acid sorbic trong khoảng
1 ÷ 10 ppm…..........................................................................................................

48

Bảng 3.16: Kết quả phân tích acid benzoic lặp lại 6 lần…………………………… 49
Bảng 3.17: Kết quả phân tích acid sorbic lặp lại 6 lần……………………………. 50
Bảng 3.18: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên nền mẫu xúc
xích…………………………………………………………………………………………

51

Bảng 3.19: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên nền mẫu Bánh
bông lan…………………………………………………………………………………… 52
Bảng 3.20: Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên nền mẫu thạch
rau câu…………………………………………………………………………………….

53

Bảng 3.21: Hàm lượng acid benzoic và sorbic trong một số thực phẩm…….......

54

X


Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của acid benzoic …………………………………………. 3
Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo của acid sorbic …………………………………………

4

Hình 1.3: Hình ảnh chất phân tích tách khỏi nhau trong cột tách……………………

9

Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC…………………………………………………

10

Hình 1.5: Sắc đồ một chất………………………………………………………………….

12

Hình 1.6: Tính bất đối của peak...…………………………………………………………

13

Hình 2.1:Hệ thống HPLC 1200 hãng Agilent……………………………………………

17

Hình 2.2: Thiết bị chưng cất bán tự động hãng Berh-Đức…………………………….

18

Hình 3.1: Phổ 3D của acid benzoic………………………………………………………

28

Hình 3.2: Phổ 3D của acid sorbic……………………………………………………….

28

Hình 3.3: Chồng phổ 3D của acid benzoic và acid sorbic……………………………

29

Hình 3.4: Sắc đồ ở tỷ lệ pha động 90%A : 10%B………………………………………

32

Hình 3.5: Sắc đồ phân tích acid benzoic và acid sorbic (xử lý mẫu theo phương
pháp chưng cất)……………………………………………………………………………...

39

Hình 3.6: Sắc đồ phân tích acid benzoic và acid sorbic (xử lý mẫu theo phương

pháp loại tạp bằng dung dịch carrex)…………………………………………………….

39

Hình 3.7: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B)…………….

43

Hình 3.8: Đường chuẩn của acid benzoic trong khoảng nồng độ 0.05 ÷ 50 ppm…..

44

Hình 3.9: Đường chuẩn của acid sorbic trong khoảng nồng độ 0.05 ÷ 50 ppm…..

45

XI


Hình 3.10: Sắc đồ chạy mẫu tại giới hạn phát hiện acid benzoic và acid sorbic…..

46

Hình 3.11: Đường chuẩn của acid benzoic trong khoảng nồng độ 0.05 ÷ 2,5 ppm... 47
Hình 3.12: Đường chuẩn của acid sorbic trong khoảng nồng độ 0.05 ÷ 2,5 ppm…

47

Hình 3.13: Đường chuẩn của acid benzoic trong khoảng nồng độ 1 ÷ 10 ppm…….

48

Hình 3.14: Đường chuẩn của acid sorbic trong khoảng nồng độ 1 ÷ 10 ppm……... 48
Sơ đồ 2.1: Qui trình phân tích 1…………………………………………………………...

21

Sơ đồ 2.2: Qui trình phân tích 2…………………………………………………………...

22

Sơ đồ 3.1: Qui trình phân tích của nghiên cứu........................................................... 40
Hình 4.1: Sắc đồ ở tỉ lệ pha động (90%A : 10%B)…………………………………

74

Hình 4.2:Sắc ký đồ phân tích acid benzoic và sorbic trong mẫu xúc xích
( xử lý mẫu theo phương pháp chưng cất)………………………………………………..

75

Hình 4.3: Sắc ký đồ phân tích acid benzoic và sorbic trong mẫu xúc xích………….. 76
Hình 4.4:Sắc đồ phân tích mẫu tại giới hạn phát hiện acid benzoic và acid sorbic.

77

Hình 4.5: Sắc đồ phân tích mẫu trắng…………………………………………………… 78
Hình 4.6: Sắc đồ phân tích mẫu trắng thêm chuẩn……………………………………..

79

Hình 4.7: Sắc đồ phân tích mẫu sate……………………………………………………... 80
Hình 4.8: Sắc đồ phân tích mẫu pate……………………………………………………..

81

Hình 4.9: Sắc đồ phân tích mẫu tương ớt………………………………………………... 82
Hình 4.10: Sắc đồ phân tích mẫu mứt dâu tây…………………………………………..

83

Hình 4.11: Sắc đồ phân tích mẫu bánh dẻo……………………………………………… 84

XII


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất lƣợng thực phẩm nói chung, chất lƣợng an tồn vệ sinh thực phẩm nói
riêng là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe con
ngƣời và nền kinh tế của xã hội.
Bên cạnh sự đòi hỏi về chất lƣợng dinh dƣỡng của các loại thực phẩm thì vấn
đề an tồn thực phẩm ln đƣợc đặt lên hàng đầu.Có thể nói cùng với sự phát triển
của khoa học kỹ thuật con ngƣời đã sử dụng rất nhiều các chất phụ gia thực phẩm
tạo đƣợc nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của ngƣời tiêu dùng, giữ
đƣợc chất lƣợng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, tạo đƣợc sự dễ dàng
trong sản xuất, chế biến thực phẩm và tăng giá trị thƣơng phẩm hấp dẫn trên thị
trƣờng, kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm. Lợi ích từ việc sử dụng phụ gia
trong chế biến thực phẩm đem lại là rất lớn, việc sử dụng phụ gia trong chế biến,
bảo quản thực phẩm là một việc cần thiết. Tuy nhiên, nếu sử dụng phụ gia không
đúng quy định nếu liều lƣợng dùng quá giới hạn cho phép nhiều lần có thể gây ngộ

độc cấp tính; nếu dùng với thời gian kéo dài, liên tục với liều thấp hơn có thể gây
ngộ độc mạn tính, nguy cơ gây hình thành khối u, ung thƣ, đột biến gen, qi thai...
Chính vì vậy việc sử dụng phụ gia phải tuân thủ các quy định hiện hành.
Chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề bức xúc hiện nay,
công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm chƣa thực sự hiệu
quả, vẫn liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại các địa phƣơng cũng nhƣ việc xuất hiện
nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng những phụ gia ngoài
danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lƣợng cho phép.Theo Tổ chức Y tế Thế
giới, ở Việt Nam hàng năm có khoảng hơn 3 triệu trƣờng hợp nhiễm độc, gây thiệt
hại hơn 200 triệu USD (khoảng 4000 tỷ VND).
Acid sorbic, acid benzoic và một số muối của chúng là những phụ gia đƣợc
phép sử dụng có tác dụng hạn chế sự hƣ hỏng, ngăn ngừa sự phát triển của vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc và tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm.Với nồng độ đủ
để bảo quản sản phẩm thì chúng khơng gây độc cho cơ thể con ngƣời. Tuy nhiên do
quá lạm dụng các chất phụ gia, một số nhà sản xuất đã dùng quá hàm lƣợng cho
phép ảnh hƣởng tới sức khoẻ, gây ngộ độc cấp và mãn tính. Tổ chức Y tế thế giới,

1


tổ chức Nông Lƣơng thế giới đã thử nghiệm chất natri benzoat trên chuột sau nhiều
ngày trọng lƣợng chuột giảm, hại gan và thận dẫn tới chết: thử nghiệm trên chó thì
dẫn tới thần kinh, khi kết hợp với acid ascobic trong thực phẩm natri benzoat có thể
gây ung thƣ do tạo ra benzen.
Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hƣơng trên địa bàn tỉnh
Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm acid benzoic là 291 có 69 mẫu thực
phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử
dụng chất bảo quản acid benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn
cho phép là 46,4%.Tổng số mẫu xét nghiệm acid sorbic là 286 có 50 mẫu thực
phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử

dụng chất bảo quản acid sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho
phép là 50%.
acid benzoic
và acid sorbic, nhƣng

phòng kiểm nghiệm cụ

thể

,v
hành phù hợp với điều kiện

của mình.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
ột số loại thực
phẩm» với các mục tiêu:
- Xây dựng và chuẩn hóa phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid sorbic, acid
benzoic và muối của chúng trong một số sản phẩm thực phẩm trên sắc ký lỏng hiệu
năng cao
- Ứng dụng phƣơng pháp phân tích một số mẫu thực phẩm để xác định hàm
lƣợng các chất bảo quản acid sorbic, acid benzoic và muối của chúng.

2


CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm và tính chất của acid sorbic, acid benzoic
1.1.1. Acid benzoic [8]
- Tên hóa học: Acid benzoic, acid benzencarboxylic, acid phenol arboxylic

- Công thức phân tử C7H6O2 (hoặc C6H5COOH)
- Phân tử gam: 122,12 g/mol
- Công thức cấu tạo

Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo acid benzoic
Tính chất vật lý là một chất rắn tinh thể không màu thƣờng gặp ở dạng hình
vẩy hay hình kim và là dạng acid cacboxylic thơm đơn giản nhất, có màu trắng, có
mùi khó chịu, tan ít trong nƣớc, tan vơ hạn trong etanol.
Acid benzoic đƣợc tìm thấy trên cây mận, cây quế, táo chín. Acid benzoic
và muối benzoat từ lâu đã đƣợc sử dụng để ức chế sự phát triển của vi sinh vật
Theo hệ thống mã số quốc tế về phụ gia thực phẩm (International Numbering
System – INS) của ủy ban Codex ký hiệu của acid benzoic và các muối của nó sử
dụng trong thực phẩm với các ký hiệu E210, E211 (Natribenzoat), E212 (Kali
benzoat), E213 (Canxibenzoat)
1.1.2. Acid sorbic[8]
- Acid sorbic là một hợp chất hữu cơ đƣợc sử dụng nhƣ là một chất bảo quản
thực phẩm.
- Tên hóa học: Acid sorbic, 2.4 – hexadienoic acid
- Công thức phân tử : C6H8O2

3


Hình 1.: Cơng thức cấu tạo acid sorbic
- Phân tử gam: 112,12 g/mol
- Điểm nóng chảy: 135°C, điểm sơi 228°C, tính acid 4.76 ở 25°C
Tính chất vật lý: Là chất rắn ở dạng tinh thể hình kim, khơng màu hoặc ở
dạng bột rời màu trắng, có mùi đặc trƣng nhẹ, ít tan trong nƣớc, tan nhiều trong
ethanol, methanol.
Sorbic lần đầu tiên đƣợc tách chiết từ một loại quả non là thanh hƣơng trà, có

tên khoa học là Sorbus aucuparia. Đây là chất đƣợc sử dụng để chống nấm men,
nấm mốc.
Ký hiệu của acid sorbic và các muối của nó trong thực phẩm là E200,
E201(Natri sorbat), E202 (Kali sorbat).
1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và muối của
chúng.
Bảng 1.1 Ảnh hƣởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật [1]
Chất chống vi sinh vật

Vi khuẩn

Nấm men

Nấm mốc

Nitrit

++

-

-

Sulfit

++

++

+

Acid formic

+

++

++

Acid propionic

+

++

++

++

+++

+++

+

+++

+++

++

+++

+++

-

++

++

Acid benzoic
Acid sorbic
Acid este-p hydrobenzoic
Biphenyl

4


Chú thích:

-

Khơng tác dụng

+

Tác dụng yếu

++

Tác dụng trung bình

+++

Tác dụng mạnh

1.2.1 Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid benzoic [4], [5]
Acid benzoic đã đƣợc phát hiện vào thế kỷ 16. Acid benzoic và các benzoat là
chất sát trùng mạnh đối với nấm men và các nấm mốc, có tác dụng yếu đối với các vi
khuẩn. Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi trƣờng acid pH = 2.5 - 3.5. Muốn đảm
bảo hiệu quả tác dụng bảo quản, nồng độ natri benzoat có trong sản phẩm phải đạt tới
0.07 -0.1%. Các nồng độ này của Acid benzoic và natri benzoat khơng có hại đối với
cơ thể con ngƣời. Khi sử dụng đúng liều quy định, acid benzoic khơng gây hại cho
sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
Độc tính - Acid benzoic và các benzoat không gây độc khi dùng đúng liều quy
định mà chỉ ảnh hƣởng tới mùi và vị của sản phẩm khi cảm quan (natri benzoat cho
dƣ vị ở nồng độ 0,04%). Nƣớc quả và rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat
thƣờng có màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hoá. Trong cơ thể acid benzoic và
các benzoat tác dụng với acid ascorbic (vitamin C, E300) hình thành benzen, một
chất gây ung thƣ. Natri benzoat có thể phá huỷ và khử hoạt tính của ADN trong ti
thể tế bào. Ti thể tiêu thụ ôxi để tổng hợp ATP, cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, khi
ADN bị phá huỷ sẽ gây ra các triệu chứng về thần kinh bao gồm hội chứng
Parkinson và các hội chứng thoái hoá thần kinh khác, làm tăng quá trình lão hóa của
cơ thể.
1.2.2 Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic[4], [5]
Acid sorbic và các sorbate có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và
nấm mốc, các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu thƣơng gây hƣ hỏng sản phẩm
rau quả, tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn. Vì vậy khi sử dụng Acid sorbic vẫn có thể
giữ đƣợc khả năng hoạt động của một số vi khuẩn có lợi nhƣ vi khuẩn latic. Sử dụng

Acid sorbic đem lại kết quả tốt trong công nghiệp chế biến rau quả, trong công
nghiệp rƣợu nho, trong sản xuất đồ hộp sữa và các sản phẩm sữa, các sản phẩm cá,

5


các sản phẩm thịt loại thịt dồi, xúc xích, các sản phẩm bánh mỳ...
Việc sử dụng Acid sorbic trong sản xuất đồ hộp có thể giảm đƣợc nhiệt thanh
trùng. Thêm vào cà chua nghiền 0,05% kali sobat có thể thu đƣợc sản phẩm cà chua
nghiền 12% chất khô không bị mốc ở nhiệt độ bình thƣờng hơn hai tháng. Sử dụng
acid sorbic xử lý bề mặt các sản phẩm không đƣa vào đóng hộp, nhƣ các loại mứt quả
bằng cách phun acid sorbic trên bề mặt sau khi đã đóng gói mứt vào bao bì hay dùng
giấy chống ẩm hoặc giấy bóng kính đã tẩm chất bảo quản này để phủ lên bề mặt của
mứt.
Độc tính của acid sorbic Khi sử dụng acid sorbic với hàm lƣợng vƣợt mức
cho phép sẽ ảnh hƣởng không tốt đến sức khoẻ ngƣời sử dụng. Trƣớc mắt, các chất
này có thể gây dị ứng, gây hiện tƣợng đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu. Nếu tích tụ lâu
ngày sẽ gây hại cho gan, thận, thậm chí có thể gây ung thƣ.
1.3. Giới hạn cho phép acid sorbic và acid benzoic trong thực phẩm[14]
Bộ Y tế đã quy định giới hạn tối đa cho phép trong chế biến thực phẩm đối
với acid benzoic, cid sorbic và các muối của chúng tại Thông tƣ số 27/2012/TTBYT hƣớng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm.
Trong đó, hàm lƣợng tối đa (ML) của acid benzoic trong thịt và các sản
phẩm từ thịt, trong nƣớc chấm và các sản phẩm tƣơng tự 1000mg/kg; trong các loại
thủy sản, sản phẩm thủy sản ngâm dấm, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai
2000mg/kg.
Hàm lƣợng tối đa (ML) của acid sorbic trong các loại pho mát cao nhất là
3000mg/kg; trong các loại bánh nƣớng là 2000mg/kg; trong nƣớc chấm và các sản
phẩm tƣơng tự : 2000mg/kg; viên xúp và nƣớc thịt: 1000mg/kg.
1.4. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic
1.4.1. Phƣơng pháp so màu

Nguyên tắc của phƣơng pháp so màu để xác định hàm lƣợng acid benzoic
trong các mẫu thực phẩm là: Mẫu thử đƣợc đồng hóa, sau đó đƣợc pha lỗng và
acid hóa phần mẫu thử. Acid benzoic đƣợc chiết bằng dietyl ete, rồi đƣợc chiết

6


tiếp bằng kiềm tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat trong mơi trƣờng acid.
Acid benzoic tinh sạch hịa tan trong dietyl ete đƣợc xác định bằng cách đo quang ở
bƣớc sóng 267,5 nm, 272 nm và 276,5 nm.
Tính kết quả hàm lƣợng acid benzoic:
Độ hấp thụ tính theo acid benzoic trong công thức này đối với phƣơng pháp
so sánh ở bƣớc sóng 272 nm là: A2 – (A1 + A3)/2
A1 là độ hấp thụ ở 267.5nm
A2 là độ hấp thụ ở 272nm
A3 là độ hấp thụ ở 276.5nm
Chuẩn bị dãy chuẩn acid benzoic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo
độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid
benzoic trong mẫu phân tích.[10]
Nguyên tắc của phƣơng pháp so màu để xác định hàm lƣợng acid sorbic trong
các mẫu thực phẩm là: Cất acid sorbic từ mẫu bằng hơi nƣớc, oxy hóa bằng acid
crom, dùng acid barbituric tạo phức màu hồng, đo cƣờng độ màu của phức bằng
máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 532nm.
Tính kết quả hàm lƣợng acid benzoic: Chuẩn bị dãy chuẩn acid sorbic với
các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào
đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu phân tích.[11]
Phƣơng pháp này tuy có độ chính xác cao nhƣng phức tạp và tốn nhiều dung
mơi hóa chất. Đặc biệt là khơng phân tích đƣợc đồng thời 2 acid.
1.4.2 Phƣơng pháp chuẩn độ [8], [10], [17]
Cân 50g mẫu chính xác đến 0,001g chuyển tồn bộ vào bình định mức

250ml, dùng NaOH 10% trung hịa đến trung tính thử bằng giấy đo pH. Thêm 10ml
kali feroxyanua 15% lắc đều, để lắng sau đó lọc.
Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCL 10%,
thử bằng giấy đo pH sau đó thêm 5ml HCL 10%. Thêm 30ml clorofooc vào phễu
chiết lắc trong 5 phút để phân lớp, chiết phần dung dịch nƣớc sang phễu chiết khác,
cho thêm 15 ml clorofooc và chiết lại hai lần nữa. Gộp tồn bộ clorofooc, có thể cho
vào bộ cất thu hồi bớt clorofooc ở 650 đến cịn lại ¼ thể tích. Chuyển phần cặn cịn

7


lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp ở 500 để nguội, dùng 50ml etanol hòa tan
cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphthalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N.
Phƣơng pháp này tốn dung mơi hóa chất, độc hại đặc biệt là phƣơng pháp này phân
tích đối với mẫu có hàm lƣợng lớn.
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng
acid benzoic, acid sorbic và muối của chúng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tơi
nhận thấy rằng có nhiều phƣơng pháp xử lý mẫu khác nhau trong phân tích các chất
này. Sau đây là một số phƣơng pháp xử lý mẫu chiết tách acid benzoic, acid sorbic
và muối của chúng:
Phƣơng pháp 1: Mẫu phân tích đƣợc đồng nhất rồi hịa tan vào trong nƣớc, và
đƣợc khử tạp bằng hỗn hợp Carrez I (K4[Fe(CN)6].3H2O) và Carrez II (ZnSO4
.7H2O). Sau đó lọc, thu dịch lọc đem phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp
(HPLC) bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với đầu dò UV-Vis.[13]
Phƣơng pháp 2: Đồng nhất toàn bộ mẫu rồi tiến hành chiết acid benzoic và
sorbic khỏi nền mẫu bằng NaOH , sau đó loại tạp bằng K3Fe(CN)6, (CH3COO)2
-VIS.[15]
Phƣơng pháp 3: Mẫu đƣợc đồng nhất và đƣợc acid hóa bằ

-VIS [2], [12], [16]
Tuy nhiên các phƣơng pháp này đều tuân theo một nguyên lý chung là: Mẫu
đƣợc đồng nhất và đƣợc tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu, sau đó đƣợc làm
sạch và bơm vào HPLC với detector DAD hoặc UV-VIS ở bƣớc sóng tối ƣu, dựa
vào thời gian lƣu, diện tích peak để định tính và định lƣợng.
P

phân tích hàm lƣợng acid benzoic, acid sorbic và muối của

chúng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có những

8


có thể tự động hố phân tích hàng

-

loạt mẫu. Vì thế nó rất thuận lợi cho việc tách và xác định hàm lƣợng axit benzoic
và axit sorbic trong việc điều tra và nghiên cứu với số lƣợng lớn.
* Tóm lại: Qua q trình nghiên cứu chúng tơi đã lựa chọn phƣơng pháp
HPLC là phƣơng pháp tốt nhất để xác định hàm lƣợng acid sorbic, acid benzoic và
muối của chúng trong thực phẩm.
1.5. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp hóa lý dùng để tách, định tính
và định lƣợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với hai pha luôn tiếp xúc nhƣng không trộn lẫn với nhau: Pha tĩnh (đƣợc bao bên
ngoài chất mang và nhồi trong cột), pha động (dung môi rửa giải)
Khi dung dịch của hỗn hợp các chất phân tách đƣợc đƣa vào cột, chúng sẽ đƣợc hấp
phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất cột và chất cần phân tách. Khi

chạy sắc ký, các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ liên tục xảy ra từ lúc nạp mẫu
vào đến khi chất đi ra khỏi cột.
Dung môi pha động đƣợc bơm mẫu qua cột dƣới áp suất cao, các chất cần
phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực
của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất. Sự tách này đạt đƣợc là do quá
trình phân bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion …. Các chất phân tích dịch chuyển từ đầu
cột tách tới cuối cột tách và tách khỏi nhau ở một khoảng thời gian nhất định nào
đó.

Hình 1.3 Hình ảnh chất phân tích tách khỏi nhau trong cột tách

9


Các chất sau khi ra khỏi cột đƣợc nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector
(tử ngoại, huỳnh quang, độ dẫn, chỉ số khúc xạ…). Tùy theo banr chất của chất cần
phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Các tín hiệu đƣợc chuyển qua bộ phận xử
lý kết quả và đƣợc ghi hoặc hiển thị trên màn hình (có thể đƣợc trợ giúp của máy vi
tính).
Hệ thống HPLC đơn giản đƣợc mơ tả trên hình vẽ:

1

1-Bình chứa dung môi

4
3

2- Lọc dung môi

1

5

4- Bộ tiêm mẫu
5- Cột sắc ký
1

1

2

1

6

6- detectơ
7 - Máy ghi tín hiệu

1

7

–
1

8
Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
1.5.1 Pha tĩnh trong HPLC
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất

phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ 3 -7 µm. Tùy theo
bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết thƣờng chia làm
2 loại: sắc ký pha thƣờng (NP – HPLC) và sắc ký pha ngƣợc (RP –HPLC)
- Sắc ký pha thƣờng: Pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc silica đƣợc gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân
cực: -NH2, -CN …), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực nhƣ: n-

10


hexan, toluene…Hệ này có thể tách đa dạng các chất khơng phân cực hay ít phân
cực.
- Sắc ký pha ngƣợc: pha tĩnh thƣờng là các silica đã đƣợc alkyl hóa, khơng
phân cực, loại thơng dụng nhất là –C18, cịn pha động phân cực: nƣớc, methanol,
acetonitril,… Hệ này đƣợc sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ
rất phân cực, ít phân cực tới khơng phân cực
1.5.2 Pha động trong HPLC
Pha động trong HPLC nói chung có những yêu cầu sau:
-

Pha động phải trơ với pha tĩnh

-

Bền vững và khơng bị phân hủy trong q trình chạy sắc ký

-

Hịa tan đƣợc mẫu

-

Phải có độ tinh khiết cao

-

Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

-

Khơng q đắt

Một pha động phù hợp là một dung môi hoặc hỗn hợp dung mơi góp phần tốt
nhất vào phép tách. Phù hợp ở đây là phù hợp về độ phân cực, về detector cũng nhƣ
các tính chất cần thiết khác.
Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha động có
độ phân cực thấp.
Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất
hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc
dùng trong sắc ký pha liên kết ngƣợc.
Loại thứ 2 là các dung mơi ít phân cực nhƣ n-hexan, n-heptan,
toluene,….Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả
năng rửa giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung mơi có
độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu
phức tạp ngƣời ta phải dùng pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi. Sự
thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời
ta gọi là rửa giải gradient nồng độ.

11