Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN ĐĂNG KHOA

THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM BACTERIOCIN SINH
TỔNG HỢP TỪ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ ỨNG
DỤNG ỨC CHẾ MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRÊN
NHĨM RAU ĂN SỐNG

Chun ngành

: Cơng Nghệ Sinh Học

Mã số

: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2018


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS. Phan Ngọc Hòa
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM

Ngày 21 tháng 07 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên – Chủ tịch Hội đồng
2. TS. Hoàng Anh Hoàng – Thư ký Hội đồng
3. PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng - Ủy viên Phản biện 1
4. PGS.TS. Phan Ngọc Hòa - Ủy viên Phản biện 2
5. TS. Võ Đình Lệ Tâm - Ủy viên Hội đồng
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA………...

PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Đăng Khoa

MSHV: 7140071

Ngày, tháng, năm sinh: 30/05/1990

Nơi sinh: Kiên Giang

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60 42 02 01

I. TÊN ĐỀ TÀI: Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ
Lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm
rau ăn sống.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp và đặc tính bacteriocin từ chủng Lactobacillus
acidophilus.
- Tạo chế phẩm, và đánh giá chế phẩm bacteriocin dạng bột từ dịch nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp sấy thăng hoa.
- Ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên mơ hình trung gian giá đỗ gây
nhiễm trong phịng thí nghiệm.
- Ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22/06/2018
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
Tp. HCM, ngày…. tháng…. năm ….
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(họ tên và chữ ký)

(họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA
(họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành luận văn này, em xin được gởi lời cám ơn chân thành đến
các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại học Bách Khoa TP-HCM đã giúp
em chuẩn bị hành trang kiến thức từ những ngày đại học.
Xin cám ơn cô Hương, vì sự quan tâm, giúp đỡ trong quá trình học tập, làm việc,
nghiên cứu, đồng thời xin lỗi cô vì đã làm cơ lo lắng trong suốt thời gian dài.
Xin cám ơn sự hỗ trợ của các thầy cô, anh/chị cán bộ phịng thí nghiệm, cộng sự,
và các em khóa dưới đã giúp đỡ rất nhiều trong thời gian nghiên cứu ở bộ môn.
Xin cám ơn bạn bè và gia đình vì sự quan tâm, động viên và tin tưởng.
Trân trọng

Nguyễn Đăng Khoa

i


TÓM TẮT
Đề tài thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus
DSM 20079 và ứng dụng chế phẩm ức chế vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn
sống, đại diện là rau xà lách. Kết quả cho thấy: sấy thăng hoa có thể tạo chế phẩm với
hoạt tính cao,1280 AU/mL, từ dịch nuôi cấy Lb. acidophilus sau 3 ngày lên men. Chế
phẩm ức chế các chủng gây bệnh khảo sát với nồng độ ức chế tối thiểu là: 20 AU/mL
đối với 2 chủng Bacillus cereus ATCC 11778, và Staphylococcus aureus ATCC

25923; 40 AU/mL đối với Salmonella typhimurium ATCC 14028, và 80 AU/mL đối
với Escherichia coli ATCC 25922. Chế phẩm có hoạt tính ổn định khi bảo quản ở
4oC, thời gian khảo sát 3 tháng. Nồng độ bacteriocin 80 AU/mL và thời gian xử lý 15
phút được ứng dụng trên mẫu rau xà lách, giúp giảm mật độ vi sinh vật trên mẫu rau
sau xử lý: 91,67 % ÷ 92,98 % đối với E. coli và Salmonella; 96,15 % ÷ 100 % đối
với B. cereus và S. aureus, mà không gây ra sự khác biệt về cảm quan trên mẫu.
ABSTRACT
Development of bacteriocin powder produced by Lactobacillus aciodphilus and
application of this powder for the inhibition of some foodborn pathogens
associated with fresh vegetables
In this paper, bacteriocin powder was produced from Lactobacillus acidophilus
DSM 20079 culture and applied to control some foodborn pathogens on fresh
vegetables, which lettuce was representative sample. The results showed that: freeze
dried bacteriocin powder from 3-day cultivation of Lb. acidophilus has 1280 AU/mL
of inhibitory activity, and ability to inhibit the growth of vegetables indicator
pathogens. The minimum inhibitory concentrations were 20 AU/mL against 2 strains:
Bacillus cereus ATCC 11778 and Staphylococcus aureus ATCC 25923; 40 AU/mL
against Salmonella typhimurium ATCC 14028, and 80 AU/mL against Escherichia
coli ATCC 25922. Inhibitory activity was stable during 3 months of storage at 4oC.
15 minutes and 80 AU/mL of bacteriocin powder concentration were effective to
process vegetable samples, reducing the level of foodborn pathogens on processed

ii


lettuce samples: 91,67 % ÷ 92,98 % against E. coli and Salmonella; 96,15 % ÷ 100 %
against B. cereus and S. aureus without changing sensory attributes of samples.
❖ Một phần kết quả nghiên cứu liên quan được trình bày ở các bài báo:
1. Nguyễn Đăng Khoa, Nguyễn Thị Ái Hồng, Nguyễn Thúy Hương, 2018 “Ứng dụng
chế phẩm bacteriocin để kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách ăn sống”,

Tạp chí Khoa học Đại học Sư Phạm TP.HCM ISSN: 1859-3100, tập 15(6) trang 170
-178.
2. Nguyễn Đăng Khoa, Nguyễn Võ Anh Khoa, Quách Đức Tính, Nguyễn Thúy
Hương, 2013 “Khảo sát độ bền hoạt tính của bacteriocin được Lactobaillus
acidophilus tổng hợp” Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Nhà xuất
bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Trung tâm hội nghị quốc gia, Hà Nội, trang 275
- 279
3. Nguyễn Võ Anh Khoa, Nguyễn Đăng Khoa, Quách Đức Tính, Nguyễn Thúy
Hương, 2013 “Khảo sát một số nguồn carbon và nitơ hữu cơ để nâng cao khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacilus acidophilus”, Hội nghị khoa học
Công nghệ sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, Trung
tâm hội nghị quốc gia, Hà Nội, trang 280-283.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

TP.HCM, ngày… tháng… năm…

Nguyễn Đăng Khoa

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
TÓM TẮT ................................................................................................................. ii

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iv
DANH MỤC VIẾT TẮT ....................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
1.1. Bacteriocin của chủng LAB.............................................................................3
1.1.1. Định nghĩa và lược sử nghiên cứu............................................................3
1.1.2. Phân loại, đặc điểm quá trình sinh tổng hợp và cơ chế tác động .............4
1.1.3. Phổ kháng khuẩn và đặc điểm lý hóa của bacteriocin............................18
1.1.4. Ứng dụng của bacteriocin và tình hình nghiên cứu trong ngoài nước ...19
1.2. Rau sống và mối nguy vi sinh .......................................................................24
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ...........................28
2.1. Địa điểm thời gian thực hiện .........................................................................28
2.2. Vật liệu...........................................................................................................28
2.2.1. Các chủng giống vi sinh. ........................................................................28
2.2.2. Hóa chất dụng cụ và môi trường nuôi cấy .............................................28
2.3. Phương pháp và nội dung thực hiện ..............................................................28
2.3.1. Sơ đồ tổng quát nội dung thực hiện........................................................28
2.3.2. Thuyết minh sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................30
2.3.3. Phương pháp thực hiện ...........................................................................38

v


CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................43
3.1. Giống Lactobacillus acidophilus ...................................................................43
3.2. Q trình sinh tổng hợp và đặc tính bacteriocin ............................................44
3.2.1 Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin ........................................................44
3.2.2. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, và enzyme đến hoạt tính bacteriocin .............46

3.3. Chế phẩm bacteriocin ....................................................................................49
3.4. Đánh giá chế phẩm bacteriocin .....................................................................52
3.4.1. Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh .....................................52
3.4.2. Nồng độ ức chế tối thiểu ........................................................................53
3.4.3. Độ ổn định hoạt tính chế phẩm theo thời gian .......................................54
3.5. Ứng dụng chế phẩm kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên mơ hình trung gian
giá đỗ .....................................................................................................................56
3.5.1. Gây nhiễm đơn từng chủng gây bệnh.....................................................56
3.5.2. Gây nhiễm hỗn hợp các chủng gây bệnh ...............................................60
3.6. Ứng dụng chế phẩm trên mẫu rau xà lách thực tế .........................................62
3.6.1. Đánh giá vi sinh mẫu rau sau xử lý ........................................................62
3.6.2. Đánh giá cảm quan mẫu rau sau xử lý ...................................................65
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................67
4.1. Kết luận ..........................................................................................................67
4.2. Kiến nghị .......................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................69

vi


DANH MỤC VIẾT TẮT
AP

Active Packaging

GRAS

Generally Recognized as Safe

LAB

Lactic Acid Bacteria

MAP

Modified Atmosphere Pakaging

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương ...................................5
Bảng 1.2. Một số mối nguy vi sinh trên rau sống ................................................26
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, enzyme đến hoạt tính dịch bacteriocin .47
Bảng 3.2. Chế phẩm bacteriocin ..........................................................................50
Bảng 3.3. Đường kính vịng kháng khuẩn............................................................52
Bảng 3.4. Nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm với các chủng khảo sát .........53
Bảng 3.5. Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên rau trước và sau xử lý bacteriocin .....63
Bảng 3.6. Đánh giá cảm quan mẫu rau xà lách bằng phép thử tam giác .............66

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ trình tự amino acid của các lantibiotic .........................................7
Hình 1.2. Sơ đồ tổ chức cụm gen và các bước chỉnh sửa lantibiotic .....................9

Hình 1.3. Sơ đồ điều hịa sinh tổng hợp lantibiotic ............................................10
Hình 1.4. Mơ hình tạo lỗ trên màng .....................................................................12
Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp bacteriocin lớp II ................................................14
Hình 1.6. Protein vận chuyển ABC có vùng liên kết protease ở đầu N ..............15
Hình 1.7. Cơ chế tác động của bacteriocin ..........................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ..................................................................29
Hình 2.2. Thí nghiệm khảo sát sinh tổng hợp bacteriocin ...................................30
Hình 2.3. Thí nghiệm khảo sát đặc tính bacteriocin ............................................31
Hình 2.4. Thí nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin ..................................................33
Hình 2.5. Thí nghiệm đánh giá chế phẩm bacteriocin .........................................34
Hình 2.6. Thí nghiệm ứng dụng trên mơ hình trung gian giá đỗ .........................36
Hình 2.7. Thí nghiệm ứng dụng trên mẫu rau xà lách .........................................37
Hình 2.8. Thiết bị sấy thăng hoa FDU-2100 ........................................................41
Hình 3.1. Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin .....................................................44
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính dịch bacteriocin............48
Hình 3.3. Độ ổn định hoạt tính của chế phẩm bacteriocin ...................................55
Hình 3.4. Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mơ hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn
sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 20 AU/mL ...........................................................57
Hình 3.5. Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mơ hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn
sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 40 AU/mL ...........................................................58

ix


Hình 3.6. Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mơ hình trung gian giá đỗ gây nhiễm đơn
sau khi xử lý bacteriocin nồng độ 80 AU/mL ...........................................................59
Hình 3.7. Mật độ vi khuẩn gây bệnh trên mơ hình trung gian giá đỗ gây nhiễm hỗn
hợp khi xử lý chế phẩm bacteriocin ..........................................................................61

x

MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Bacteriocin là những protein được sinh tổng hợp từ vi khuẩn có thể ức chế sự sinh
trưởng phát triển của vi khuẩn khác [30]. Sự tạo thành bacteriocin trong vi khuẩn rất
đa dạng, trong đó nhóm bacteriocin bắt nguồn từ vi khuẩn lactic (LAB_Lactic acid
bacteria) sở hữu nhiều tiềm năng ứng dụng khác nhau trong y học và thực phẩm [37].
Các bacteriocin này là những peptide, tích điện dương, kỵ nước, chủ yếu tấn công lên
màng tế bào và gây ức chế các chủng vi sinh vật nhạy cảm [30].
Trong các bacteriocin của chủng LAB, nhóm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lb.
acidophilus ức chế được nhiều vi sinh vật gây bệnh như: Bacillus cereus, L.
monocytogenes, Clostridium sp…Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin được xem
như một trong những nguyên nhân quan trọng giúp chủng Lb. acidophilus thể hiện
tiềm năng probiotic vượt trội. Ngoài ra, các bacteriocin này thường bền nhiệt, pH,
nên có khả năng sử dụng như chất phụ gia sinh học, nhằm thay thế một số phụ gia
thực phẩm truyền thống [50].
Rau thuộc nhóm thực phẩm khơng thể thiếu trong bữa ăn ở khắp nơi. Tuy vậy, bắt
nguồn từ thói quen canh tác, sự ơ nhiễm vi sinh ở rau, với các chủng vi khuẩn gây
bệnh như E. coli, Salmonella, B. cereus…[2], trở thành vấn đề đầy quan ngại.
Đặc biệt, với nhu cầu giữ lại nhiều nhất những thành phần dinh dưỡng trong rau,
và phong cách ẩm thực, nhóm rau ăn sống vốn khơng qua chế biến xử lý nhiệt trước
khi ăn, nên mối nguy vi sinh càng cao và có thể tác động trực tiếp đến sức khỏe người
tiêu dùng. Trong đó, rau xà lách là loại rau ăn sống phổ biến cùng với xà lách xoong,
rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô…
Với khả năng kháng khuẩn và tính an tồn như đã nêu, bacteriocin từ chủng Lb.
acidophilus có thể được sử dụng như một phương thức mới để ức chế vi sinh vật gây
bệnh trong thực phẩm và đặc biệt trên nhóm rau ăn sống, đại diện trong nghiên cứu
này là rau xà lách.

1


Từ những ngun nhân trên nhóm chúng tơi đã thực hiện đề tài: “Thử nghiệm tạo
chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lactobacillus acidophilus và ứng dụng ức chế
một số vi sinh vật gây bệnh trên nhóm rau ăn sống”.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện nhằm:
- Thử nghiệm tạo chế phẩm bacteriocin sinh tổng hợp từ Lactobacillus acidophilus.
- Khảo sát khả năng ứng dụng của chế phẩm bacteriocin trong việc kiểm soát một
số vi sinh vật gây bệnh trên rau ăn sống.
Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu nêu trên, nội dung nghiên cứu của đề tài như sau:
Nội dung 1: tạo chế phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus.
- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp và một số đặc tính bacteriocin từ chủng
Lactobacillus acidophilus.
- Tạo chế phẩm bacteriocin dạng bột từ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus
acidophilus bằng phương pháp sấy thăng hoa, và đánh giá chế phẩm.
Nội dung 2. Ứng dụng chế phẩm bacteriocin nhằm ức chế vi sinh vật gây bệnh
trên nhóm rau ăn sống, đại diện là rau xà lách.
- Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh của chế phẩm trên mơ hình trung
gian giá đỗ được gây nhiễm trong phịng thí nghiệm.
- Khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh trên rau xà lách: đánh giá mật độ
vi sinh và chỉ tiêu cảm quan của mẫu rau sau xử lý.

2


CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bacteriocin của chủng LAB

1.1.1. Định nghĩa và lược sử nghiên cứu
Định nghĩa bacteriocin được Klaenhammer đưa ra năm 1993 và được chấp nhận
rộng rãi trong cộng đồng nghiên cứu: “bacteriocin là những peptide hoặc protein
ngoại bào, rất đa dạng, có hoạt tính sinh học, được sinh tổng hợp bởi ribosome, có
khả năng ức chế vi khuẩn khác” [31].
Năm 1877, Pasteur cùng cộng sự của mình Joubert, khi đang tìm cách ức chế sự
sinh trưởng của Bacillus anthrax, đã phát hiện sự ức chế sinh trưởng in vivo và in
vitro ở các vi sinh vật. Các nghiên cứu về sau đã chứng minh: chính các hợp chất
được sinh ra trong quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật với một nồng độ
rất thấp là tác nhân quan trọng cho các phản ứng đối kháng xảy ra. Các hợp chất ấy
được gọi chung là antibiotic (kháng sinh) [30].
Năm 1925 lần đầu tiên Gratia phát hiện ra hợp chất nhỏ và bền nhiệt do chủng
E.coli V tổng hợp có khả năng ức chế sự phát triển của chủng E.coli Φ ở một nồng
độ thấp. Hợp chất trên được gọi là colicin, được sản xuất bởi E.coli và các vi khuẩn
trong họ Entorobacteria [30].
Năm 1953 Jacob lần đầu sử dụng tên gọi bacteriocin cho các hợp chất kháng khuẩn
có bản chất protein được tổng hợp ở vi sinh vật. Trong khoảng thời gian này bản chất
protein của colicin được khám phá, cơ chế tổng hợp, hoạt động, khối lượng phân tử
và cụm gen có chức năng tổng hợp colicin lần lượt được công bố. Những bacteriocin
khác mersacidin và epidermin (thuộc nhóm lantibiotic) cho thấy tác dụng trong việc
điều trị bệnh gây ra bởi Staphylococcus ở chuột.
Năm 1928, Rogers và cộng sự phát hiện bacteriocin đầu tiên của vi khuẩn Gram
dương, trước penicillin, do các vi khuẩn nhóm lactococci (nhóm streptococci N) sinh
tổng hợp. Năm 1947, Hirsh và cộng sự đặt tên bacteriocin này là nisin, với ý nghĩa:
“hoạt chất kháng khuẩn của nhóm N”. Nisin được tách chiết và xác định tính chất
năm 1971. Đến nay, nisin đã có gần 50 năm sử dụng như chất bảo quản thực phẩm
3


đặc biệt với các sản phẩm từ sữa. Thành công về thương mại của nisin đã mở đường

cho những nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn Gram dương về đặc tính phân tử, di
truyền và khả năng ứng dụng thực tế.
Năm 1976, Tagg và cộng sự công bố nghiên cứu tổng quan đầu tiên về bacteriocin
của vi khuẩn Gram dương, đánh dấu cột mốc cho sự phát triển của hướng nghiên cứu
những hợp chất tương tự nisin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương [42].
1.1.2. Phân loại, đặc điểm quá trình sinh tổng hợp và cơ chế tác động
Bacteriocin bao gồm những nhóm peptide và protein đa dạng, khác nhau về kích
thước, vi khuẩn mục tiêu, cơ chế kháng khuẩn, và tính miễn nhiễm bacteriocin của vi
sinh vật chủ… Nhiều nỗ lực trong việc phân loại bacteriocin của các chủng vi khuẩn
Gram dương, và LAB đã được thực hiện.
Dựa trên cấu trúc, đặc điểm hóa lý, đặc điểm phân tử, bacteriocin của chủng LAB
được Klaenhammer chia thành 3 nhóm lớn [31]. Cùng với việc phát hiện những
bacteriocin mới, hệ thống phân loại cũng tiếp tục được thay đổi và cập nhật dựa trên
khóa phân loại ban đầu của Klaenhammer. Khóa phân loại giới thiệu ở bảng 1.1 được
chấp nhận rộng rãi trong cộng đồng nghiên cứu. Trong đó, các bacteriocin thuộc lớp
I và II chiếm tỷ lệ lớn và đã được nghiên cứu rõ các đặc tính phân tử, di truyền, cơ
chế tác động…

4


Bảng 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
Đặc điểm

Lớp

Đại diện

Lantibiotic, trải qua chỉnh sửa sau dịch mã, chứa các acid amin khơng mã hóa: Lan và Melan.

I
IA

Peptide dạng chuỗi thẳng, tích điện dương.

Nisin, Lacticin 481

IB

Peptide hình cầu, khơng tích điện.

Cinnamycin

Những peptide khơng trải qua chỉnh sửa sau dịch mã, kích thước nhỏ (< 10 kDa) tích điện dương,

II

bền nhiệt.
IIA

Peptide như pediocin, ức chế Listeria.

Pediocin PA1

IIB

Peptide gồm 2 hay nhiều thành phần.

Enterocin L50

IIC

Những peptide nhỏ không chỉnh sửa sau dịch mã khác.

Sakacin Q

III

Protein kích thước lớn (> 10 kDa), cấu tạo phức tạp, chịu nhiệt.

Helveticin J

IV

Những bacteriocin cyclic, cấu trúc vịng, kị nước, tích điện dương.

Enterocin AS-48

[33, 42, 52]

5


1.1.2.1. Lớp I: các lantibiotic
Lantibiotic là tên gọi của các peptide kháng khuẩn, chứa các amino acid hiếm
khơng

mã

hóa

như:

Lanthionine

(Lan),

3-methyllanthionine

(MeLan),

dehydroalanine (Dha), hay Dehydrobutyrine (Dhb) (hình 1.1). Các aminoacid này
xuất hiện do quá trình chỉnh sửa sau dịch mã. Các bacteriocin thuộc lớp này có số
lượng lớn và đa dạng, đặc điểm chung là đều trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã
để tạo peptide trưởng thành, có hoạt tính, từ các tiền peptide. Các lantibiotic được
phát hiện đến nay đều được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương, và có phổ kháng
khuẩn đối với các vi khuẩn Gram dương rộng hơn so với các vi khuẩn Gram âm.
Lớp I bao gồm 2 phân lớp nhỏ, được chia theo cấu trúc và đặc tính sinh học: phân
lớp IA bao gồm những peptide ở dạng chuỗi thẳng, tích điện dương, phân lớp IB gồm
những peptide hình cầu, khơng tích điện. Phân lớp IA được chia tiếp thành hai phân
nhóm nhỏ dựa trên kích thước, điện tích và trình tự peptide leader: phân nhóm A1 và
phân nhóm A2. Dựa trên những bacteriocin mới được phát hiện, nhiều tác giả đề xuất
phân lớp IC bao gồm các lantibiotic 2 thành phần [42].
a. Quá trình điều hịa sinh tổng hợp và tính miễn nhiễm
Cụm gen mã hóa các lantibiotic có thể nằm trên chromosome [22], hoặc plasmid
hoặc transposon [25]. Thông thường, cụm gen sẽ bao gồm các gen mã hóa trình tự:
của tiền peptide, các protein hỗ trợ tạo bacteriocin ở dạng hoạt động [25], các protein
hỗ trợ vận chuyển bacteriocin qua màng tế bào , protein điều hịa và protein tạo tính
miễn nhiễm ở vi sinh vật chủ [22] .
Sinh tổng hợp: con đường sinh tổng hợp của nisin có sự đồng tham gia biểu hiện

của 11 cụm gen, tương đối ít so với các lantibiotic khác. Cụ thể nisA mã hóa tiền
peptide, protein NisB, NisC khử nước ở các gốc Ser/Thr, hình thành liên kết thioether
(Lan và MeLan) với gốc Cys, ở đầu C của phân tử peptide [25, 33]. NisT là protein
vận chuyển ABC, có nhiệm vụ giải phóng đoạn peptide ra khỏi tế bào. NisP là protein
bám trên màng tế bào, có nhiệm vụ cắt đoạn peptide leader, tạo bacteriocin có hoạt
tính.

6


Hình 1.1. Sơ đồ trình tự amino acid của các lantibiotic
Những gốc (β-methyl) lanthionine được tô xám (Ala-S-Ala lanthionine; Abu-SAla, β-methyllanthionine); những gốc chỉnh sửa khác được tô đen (Dha
dehydroalanine, Dhb dehydrobutyrine, D-Ala D-alanine, Obuoxobutyrate) [24]

7


Tính miễn nhiễm: NisI là protein tham gia vào quá trình tự miễn nhiễm nisin của
tế bào vi sinh vật chủ. Các NisI có thể được gắn trên màng nguyên sinh, và tạo liên
kết với các phân tử nisin bên ngoài và gây tủa trên bề mặt tế bào. Khi biểu hiện NisI
ở các chủng nhạy cảm, sẽ làm giảm tính nhạy cảm của các chủng này với nisin. Tuy
nhiên tính miễn nhiễm sẽ khơng thể hiện hồn tồn nếu khơng có mặt của NisFEG.
NisFEG là một phức hợp protein vận chuyển ABC, thể hiện vai trò miễn nhiễm bằng
cơ chế tương tự như các kênh vận chuyển đa thuốc (multi-drug transporters), giúp
giảm nồng độ nisin tiếp xúc trực tiếp với màng tế bào [42].
Điều hòa cảm ứng: NisK và NisR cùng tạo thành một sensor kinase (Histindine
protein kinase_HPK) giúp cảm ứng các yếu tố điều hòa đáp ứng (Respone
regulator_RR) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp nisin. Sensor kinase thể hiện hoạt
tính vào giai đoạn tăng trưởng, đặc biệt nisin được nhận biết và liên kết với NisK,
nên nisin có thể tự điều hịa biểu hiện [42].

Con đường sinh tổng hợp nisin cơ bản được bảo toàn cho tất cả các lantibiotic. Tuy
nhiên, một số thay đổi được ghi nhận ở các lantibiotic khác: phản ứng khử nước và
tạo vịng được thực hiện nhờ enzyme LanM thay vì phức hợp LanB/C. Một số
lantibiotic mã hóa LanD, có vai trị trong việc hình thành những amino acid lạ như S[(Z)-2-aminovinyl]-D-cysteine(AviCys) và S-[(Z)-2-aminovinyl] -(3S)-3methyl-Dcysteine (AviMeCys). Tính miễn nhiễm của vi sinh vật chủ ở các lantibiotics khá đa
dạng như: chỉ phụ thuộc vào LanI (Pep 5) hoặc Lan FEG (lacticin 481), hay có sự
tham gia của nhân tố phụ như LanH giúp tăng cường phản ứng miễn dịch qua trung
gian Lan FEG (epidermin và gallidermin) [42].
Quá trình nghiên cứu phát hiện nhiều biến thể của nisin A, trong đó nisin U là một
biến thể bao gồm 31 amino acid (khác nisin A 12 amino acid), được sinh tổng hợp
bởi Streptococcus uberis, có độ tương đồng 82 %. Chủng chủ sinh tổng hợp nisin A
và nisin U miễn nhiễm chéo, protein NsuI, giúp thể hiện tính miễn nhiễm của nisin U
với chủng chủ, chỉ tương đồng 55 % so với NisI. Ngược lại, khơng có ghi nhận về
tính miễn nhiễm chéo giữa nisin và subtilin mặc dù độ tương đồng của 2 peptide trên
là 60 % [33].

8


Hình 1.2. Sơ đồ tổ chức cụm gen và các bước chỉnh sửa lantibiotic
(A) Sơ đồ tổ chức cụm gen sinh tổng hợp các lantibiotic phân lớp IA: nisin A, nisin
U, SA-SFF2, (B): Các bước chỉnh sửa nisin từ prepetide đến nisin có hoạt tính, dấu
* đánh dấu vị trí các gốc chỉnh sửa; A, B, C, D, E kí hiệu các liên kết vòng [42]

9


Phân nhóm A2 khác phân nhóm A1 ở việc cầu nối thioether được hình thành do
tác động enzyme LanM, thay vì sự tác động kết hợp của LanB và LanC. Phân nhóm
này thường có trình tự bảo tồn tương đồng E(L/V) và E(L/M) trong peptide leader.
Peptide leader chứa thêm trình tự glycine kép (GG/GA/GS) ngay sau vị trí cắt, đặc

điểm này tương đồng đồng với các bacteriocin lớp II. Lacticin 481 là đại diện tiêu
biểu cho lantibiotic phân nhóm A2, bao gồm 27 amino acid. Cụm gen lacticin 481
không mã hóa sensor kinase, q trình điều hịa được thay thế bằng hai promoter P1
và P3 bằng cách kiểm soát pH [42].

Hình 1.3. Sơ đồ điều hịa sinh tổng hợp lantibiotic [18]
Phân lớp IB bao gồm các peptide hình cầu, cấu trúc bền vững, khơng tích điện
hoặc tích diện âm trong pH trung tính. Trong đó, cinamycin là bacteriocin gồm 19
amino acid được sinh tổng hợp bởi S. cinnamoneus. Cấu trúc đặc trưng: có 2 vịng
MeLan tạo bởi cystine ở đầu N và Dhb, có liên kết vịng lysinoalanine từ đầu đến
đi, và có leader peptide dài hơn so với các tiền peptide của các lantibiotic khác.
Cinamycin được vận chuyển bằng đường vận chuyển Sec thay vì phức hợp protein
ABC [42].

10


Qua đó, nhận thấy cơ chế điều hịa sinh tổng hợp các lanbitotic khá đa dạng:
• Khơng chứa gen mã hóa yếu tố điều hịa bên trong cụm gen (lacticin 481)
• Tự điều hịa (nisin)
• Điều hịa bởi peptide tín hiệu nhưng khơng phải các lantibiotic (SA-FF22)
• Điều hịa thơng qua 2 peptide, mỗi peptide cảm ứng biểu hiện những gen khác
nhau, trong cụm gen (mersadin có 2 yếu tố đáp ứng điều hòa: MrsR1 và
MrsR2; MrsR1 cảm ứng biểu hiện gen miễn nhiễm và MrsR2 cảm ứng gen
sinh tổng hợp [42]).
b. Cơ chế tác động
Mặc dù có nhiều khác biệt cấu trúc và các đặc tính hóa lý giữa bacteriocin thuộc 4
lớp, cơ chế tác động chung của bacteriocin là tương tác với màng sinh chất và hình
thành lỗ rỗng, hoặc các kênh ion trên màng của các tế bào vi khuẩn, làm mất điện thế
màng (Δψ), gradien pH, và các thành phần tế bào cuối cùng gây chết tế bào.

Những nghiên cứu trước đây cho thấy nisin hình thành lỗ trên màng các tế bào
đích tích điện âm và môi trường kiềm (bên trong màng). Liên kết được hình thành
giữa bacteriocin và màng tế bào được giải thích dựa trên đặc điểm cấu tạo của các
phân tử peptide: bacteriocin là những phân tử tích điện dương có các gốc kị nước, có
thể hình thành tương tác tĩnh điện với các gốc phosphate tích điện âm có trên màng
tế bào [20]. Các liên kết kị nước giữa bacteriocin và tính kị nước của màng cũng được
mơ phỏng để dự đoán khả năng liên kết. Các gốc kị nước sẽ chèn vào màng và hình
thành các lỗ.
Có 2 kiểu tạo lỗ ở nisin: tán nổi, và hình nêm. Theo mơ hình tán nổi, mỗi phân tử
bacteriocin định hướng vng góc với màng, hình thành kênh ion xun qua màng.
Theo mơ hình nêm, một số lượng cần thiết phân tử nisin đã liên kết với màng, sẽ
xuyên qua màng đồng thời hình thành các lỗ nhọn hình nêm. Những nghiên cứu khác,
cho thấy sự phức tạp trong việc thể hiện hoạt tính bacteriocin: trong một số trường
hợp, nisin cần phải liên kết với các phân tử lipid II (lipid II đóng vai trò phân tử cập

11


bến_docking molecule) trên màng các vi sinh vật nhạy cảm để tạo lỗ và tiêu diệt vi
sinh vật [35].

Hình 1.4. Mơ hình tạo lỗ trên màng
(A): kiểu hình nêm; B: kiểu tán nổi [35]
1.1.2.2. Lớp II các peptide nhỏ không trải qua quá trình chỉnh sửa
Lớp II rất đa dạng và được chia thành 3 phân lớp nhỏ. Trong đó phân lớp IIA còn
được gọi là các bacteriocin giống pediocin, thể hiện hoạt tính ức chế Listeria
monocytogenes. Đại diện điển hình của phân lớp này là pediocin PA-1, gồm 44 amino
acid được sinh tổng hợp bởi P. acidilactici. Pediocin PA-1 được ứng dụng kháng
Listeria trong bảo quản thực phẩm [43].
Ngoài đặc tính kháng listeria, bacteriocin thuộc phân lớp IIA đặc trưng bởi trình

tự amino acid bảo tồn Tyr-Gly-Asn-Gly-Val/leu (YGNGV hay còn gọi là pediocin
box) ở cuối đầu N, và sự hiện diện của cầu nối disulfite, do đó các petide này khá
tương đồng về phổ kháng khuẩn, nhưng giá trị MIC (Minimum inhibitory
concentration_nồng độ ức chế tối thiểu) khác nhau đối với các chủng vi khuẩn đích.
Nhìn chung trình tự peptide sở hữu 2 cầu nối disulfite có phổ kháng khuẩn rộng hơn
những peptide chỉ có 1 cầu nối [42].
Tính kháng đặc hiệu Listeria monocytogenes được quy định ở trình tự bảo tồn.
Nếu trình tự bị thay đổi có thể làm giảm hoạt tính bacteriocin như trường hợp acidocin
A, được sinh tổng hợp từ Lb. acidophilus. Nếu pedioxin box có vai trò trong thể hiện

12