Đồ án tốt nghiệp ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CƠNG NGHỆ RNA
INTERFERENCE VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI
GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH
Macrobrachium Rosenbergii
(De Man, 1879)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị An.

Cán bộ hướng dẫn

: Th.S Bùi Thị Liên Hà.

MSSV:

Lớp: 08DSH4


TP. Hồ Chí Minh, 2012

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là lồi tơm
nước ngọt có giá trị quan trọng và đóng vai trị lớn trong nghề nuôi trồng thủy sản ở
nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong những năm gần đây, việc nuôi tôm
càng xanh ở Việt Nam đang phát triển một cách mạnh mẽ, đặc biệt là những khu
vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông đang mở rộng hơn 8000 ha và
sản lượng đã đạt 10000 tấn trong năm 2010 (Hai, 2010). Do đó nhu cầu về con
giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn.
Tuy nhiên, nghề nuôi tôm càng xanh đã và đang gặp nhiều khó khăn do
những đặc điểm sinh học của chúng. Những con tôm càng xanh đực thường lớn
nhanh gấp bốn hoặc năm lần tôm cái trong cùng quần thể và thời gian nuôi, điều
này dẫn tới sự cạnh tranh về thức ăn, môi trường sống và gây ra hiện tượng ăn thịt
đồng loại. Thơng thường, sự khác nhau về kích thước của tơm có thể thấy bằng mắt
trong giai đoạn trưởng thành về giới tính, con cái ngưng phát triển và tập trung
dưỡng chất cho việc sinh sản (Cohen, 1984), trong khi đó con đực vẫn tiếp tục phát
triển và đạt kích thước lớn hơn so với con cái khi trưởng thành. Những vấn đề này
ảnh hưởng tới sản lượng thu hoạch và lợi ích kinh tế do kích thước tơm càng lớn thì
giá thành càng cao.
Việc ni tơm càng xanh tồn đực đạt sản lượng cao hơn việc ni toàn cái
hay đực và cái trong cùng quần thể (Sagi và Ra’anan, 1988). Khối lượng trung bình
của mỗi quần thể lần lượt là 473 g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2. Những nhà khoa học
Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm ni
tơm tồn đực, tồn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997). Điều này thể hiện
rằng việc ni tơm càng xanh tồn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và
mang lại lợi nhuận cao hơn việc ni tồn cái hay hỗn hợp đực và cái. Vì thế, việc

nghiên cứu và phát triển một số kỹ thuật tạo quần thể tơm càng xanh tồn đực là
nhu cầu cần thiết hiện nay.

1


Đồ án tốt nghiệp

Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một
công cụ hiệu quả để hiểu rõ về chức năng của những gene quy định tính trạng bằng
cách tiêm RNA mạch đơi vào trong cơ thể của giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008). Ý
tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thơng tin mã hóa gene tuyến
đực insuline–like của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like
androgeneic gland, Mr–IAG) bằng RNA mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện
thành công tại quy mơ phịng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009). Kể từ đó, kỹ thuật
bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm tồn
đực cho việc ni tơm càng xanh thương mại.
Chính vì những lý do đó mà đề tài “Ứng dụng thử nghiệm cơng nghệ iRNA
vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii”
được tiến hành.
1.2. Mục đích của đề tài.
Mục đích của việc nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA để tạo
ra con cái giả phục vụ cho công tác tạo tôm càng xanh toàn đực với Mr–IAG là
gene mục tiêu.
1.3. Nội dung của đề tài.
Nghiên cứu công nghệ bất hoạt RNA thông qua quy trình tổng hợp double
stranded RNA theo bộ Kit của hãng Promega và Ambion.
Kiểm tra hiệu quả của sợi đôi dsRNA trong thực nghiệm chuyển đổi giới tính
của tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về tuyến đực trên tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii.
2.1.1. Phụ bộ đực.
Phụ bộ đực là cơ quan giao cấu ở tôm càng xanh đực nó xuất hiện ở chân bơi
thứ hai.
Chồi của phụ bộ đực bắt đầu xuất hiện vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi
sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38g; tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94
ngày tuổi thì phụ bộ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006).

Hình 2.1. Chân bơi thứ 2 của tơm càng xanh đực.
2.1.2. Tuyến đực.
Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong
tôm nước ngọt Cambarus montanus (Faxon, 1884). Tuyến hormon đã được xác
định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953 và mơ đó được gọi là
tuyến đực (Charniaux–Cotton, 1953). Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn
về tuyến đực, nó là một lớp mơ mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước
ngọt Procambarus blandingii, P. viaeviridis, Camb. bartonni và Camb. diogenes
(Puckett, 1964). Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua Scylla
serrata (King, 1964).
Ở giáp xác tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormon là tuyến
đực. Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức
năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở tơm càng xanh và có
thể ở nhiều động vật giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda khác hai chức năng

3

Đồ án tốt nghiệp

này thực hiện bởi hai cơ quan riêng lẻ. Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh,
còn tuyến đực (androgenic gland) – một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra
hormon, tham gia vào sự biệt hố giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục
thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng (Sagi, 2001).
Ở những tôm đực lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ. Đó
là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh. Cũng như
tuyến sinh dục và ống dẫn tinh, tuyến đực chịu sự ức chế của một tuyến nội tiết nằm
ở cuống mắt tơm.

Hình 2.2. Tuyến đực ở tơm càng xanh có hình kim tự tháp ở cuối ống dẫn tinh.
Sự tồn tại của tuyến đực được xác nhận ở nhiều loài giáp xác, chúng tiết ra
hormon có tác động lên sự biệt hố giới tính (Chaniaux–Cotton và Payen, 1985;
Katakura, 1989).
Tuyến AG có vai trị lên sự biệt hóa giới tính và q trình lột xác.
Charniaux– Cotton đã chứng minh rằng việc cắt bỏ tuyến AG ở Orchestia
gammarella làm giảm sự sinh tinh trùng ở con đực (Charniaux–Cotton, 1954).
2.1.3. Hormon tuyến đực.
Hormon tuyến đực tinh chế đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều
Armadilidium vulgare là một protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B
(44aa), và C (45aa), ngoài ra trên chuỗi A ở aa thứ 18 cịn có thêm một nhóm
carboxyl (Martin và ctv, 1999). Trọng lượng phân tử hormon khoảng 16.570 Da.
Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho con cái còn nhỏ, sau này con cái này phát
triển thành con đực, khi cho giao vĩ với con cái thì có chức năng sinh sản cho ra thế
hệ con.

4

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực (Martin và ctv, 1999).
2.1.4. Tác động của tuyến đực lên sự phân hóa giới tính ở tơm càng xanh.
Tuyến androgenic (AG) là cơ quan nội tiết của con đực, có vai trị quan trọng
trong việc hình thành giới tính và các đặc tính sinh dục thứ cấp (Ohs và ctv, 2006).
AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục và liên kết lõng lẻo với ống dẫn tinh.
AGH là hormon điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc
điểm sinh dục đực thứ cấp. Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một số
chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái. Ở con
đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết
AGH. Hormon kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong
tinh hồn (Fingerman, 1997).
AG tham gia vào q trình biệt hóa giới tính ở con đực thơng qua việc tiết
hormon. AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong q trình biệt
hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006). Nếu khơng có
AG hoặc sự tiết AGH khơng đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục
cái (Sagi và ctv, 1995). Sự phát triển của AG được cho là dấu hiệu của tín hiệu di
truyền (Ohs và ctv, 2006). Sự cắt bỏ tuyến androgenic ở tôm càng xanh
Macrobrachium rosenbergii giai đoạn cịn non có thể gây đảo giới hồn tồn, với sự
cái hóa các tính trạng sinh dục sơ cấp và thứ cấp và con vật có thể sinh sản như con
cái (Sagi và ctv, 1990; Sagi và ctv, 1997).

5


Đồ án tốt nghiệp

2.2. Cơng nghệ chuyển đổi giới tính tơm càng xanh.
2.2.1. Cơ sở lý thuyết tạo dịng tơm càng xanh tồn đực.
Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con
cái là dị giao tử (WZ). Để tạo dòng đơn tính tồn đực (100% tơm đực ZZ) thì cần
có tơm bố và tơm mẹ có cùng NST ZZ. Để tạo dịng tồn đực việc cần thiết để tạo
tơm cái giả mang NST ZZ.
Male: ♂ (ZZ) X

Female: ♀ (ZZ)

100% ♂ (ZZ)
Hình 2.4. Sơ đồ tạo dịng đơn tính đực.
Sagi và Cohen đã cho biết khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh khi
lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dịng con tồn đực (Sagi, Cohen, 1990).
2.2.2. Các phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả.
2.2.2.1. Vi phẩu loại bỏ tuyến đực.
Tơm chưa trưởng thành có thể thực hiện vi phẫu loại bỏ tuyến androgene ở
tôm đực, dẫn đến sự tạo trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái
trong con đực đã chuyển giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất. Tơm đực sau
đó sẽ phát triển thành con cái. (Nagamine và ctv, 1980). Việc loại bỏ AG ở con đực,
làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực thành con cái mang NST ZZ. Kỹ thuật
vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi (Sagi và ctv,
1990). Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện và thành công năm 2004
(Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004).
Kỹ thuật vi phẫu là kỹ thuật tạo ra tơm cái giả để sản xuất tơm tồn đực phổ
biến hiện nay. Tuy nhiên kỹ thuật này cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần
nhiều người để sản xuất một số lượng tôm cái giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tơm
vi phẫu thành tơm cái giả có thể sinh sản được thì khơng ổn định. Vì vậy, cần tìm ra
các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn
tơm tồn đực để tăng sản lượng cho người nuôi.

6


Đồ án tốt nghiệp

2.2.2.2. Cấy tuyến đực vào tôm cái.
Sự biệt hóa giới tính ngược của con cái isopod Armadillidium vulgare, được
gây ra do việc cấy AG vào trong con cái, sau đó đã bắt đầu biệt hóa hình thái giới
tính. Ở tơm càng xanh, việc cấy AG của con đực trưởng thành vào trong con cái
chưa trưởng thành, kết quả là con cái đã biệt hóa ngược thành con đực (Nagamine
và ctv, 1980). Tuy nhiên, khả năng sống sau khi cấy AG thấp (Ohs và ctv, 2006).
2.2.2.3. Sử dụng hormon.
Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm
hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính. Điều này mang lại hy
vọng trong việc sử dụng hormon để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác. Điều
khiển chế độ ăn chứa hormon được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy
mô thương mại. Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả
năng mất các hormon do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc biệt
là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006).
Dewi và cộng sự đã dùng hormon 17β–estradiol bổ sung vào thức ăn để điều
khiển giới tính tơm càng xanh. Kết quả thu được là 17β–estradiol không ảnh hưởng
đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006).
Baghel và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi cho ấu
trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α–methyltestosterone, dạng
steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α–methyltestosterone có tác
dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực (Baghel và ctv,
2004). Nhưng sau đó, Ohs và cộng sự dùng 17α–methyltestosteron bổ sung vào
thức ăn để chuyển giới tính tơm càng xanh. Tuy nhiên, kết quả lại cho thấy 17α–
methyltestosteron khơng có tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tơm càng xanh

(Ohs và ctv, 2006). Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới
tính ở tơm càng xanh là chưa xác định.
Ohs và cộng sự cho hậu ấu trùng của tôm càng xanh thường (50% đực, 50%
cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm trong vòng
60 ngày (Ohs và ctv, 2006). Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tơm cái là 62,6%,

7


Đồ án tốt nghiệp

trong khi đó 3 nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15;
1,5 và 15 mg/kg có tỷ lệ tơm cái lần lượt là: 80,9%; 88%; và 71%. Kết quả cho thấy
có sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm khơng và có cho ăn thức ăn có bổ sung
dopamine. Thử nghiệm đã tạo ra một tiềm năng sử dụng dopamine để tạo ra tơm
càng xanh tồn đực phục vụ cho sản xuất.
2.3. Giới thiệu cộng nghệ iRNA và ứng dụng trong tạo tôm càng xanh cái giả.
2.3.1. Giới thiệu về iRNA.
Công nghệ iRNA gây bất hoạt gene là một công cụ đầy hứa hẹn và là cơ chế
điều khiển hoạt hóa gene phổ biến ở các cơ thể sống nhân thực. iRNA là quá trình
làm bất hoạt gene một cách đặc thù, nó chỉ làm bất hoạt một gene (gene đích) có
trình tự tương đồng với các tác nhân gây bất hoạt gene (các sợi RNA ngắn khoảng
21–27 nucleotide). iRNA có thể tham gia điều khiển hoạt hóa gene ở giai đoạn
phiên mã gene – ngăn cản sinh tổng hợp RNA hoặc ở giai đoạn sau phiên mã –
phân hủy mRNA và làm triệt tiêu sinh tổng hợp protein (Đỗ Năng Vịnh, 2007).
Can thiệp RNA (iRNA) là sợi đơi RNA (dsRNA), nó có tác động đặc hiệu
với một trình tự mục tiêu, thúc đẩy sự phân hủy và ngăn chặn sự biểu hiện của trình
tự mục tiêu (Chen và ctv, 2003). Sự can thiệp RNA thông qua trung gian dsRNA là
một cơ chế bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) và bảo tồn trong suốt q trình phát
triển. Nó cũng có thể biểu hiện ở mức độ phiên mã hoặc dịch mã của quá trình sao

chép nội sinh và ở mức nhiễm sắc bằng cách hình thành vùng chất nhiễm sắc thể
trong nhân (Hannon, 2002).
iRNA là một hiện tượng trong Neurospora crassa, trình tự RNA tương đồng
có khả năng chế ngự gene nội sinh (Romano và Macino, 1992).
Dựa trên thành tựu của chương trình Geneomics trình tự của hầu hết các
gene quan trọng đều có thể xác định, từ đó thiết kế các dsRNA tương đồng để gây
bất hoạt mọi gene đích. Cơng nghệ iRNA có thể tạo ra cuộc cách mạng trong nghiên
cứu y sinh và chữa bệnh. Ý nghĩa khoa học và tiềm năng ứng dụng to lớn của công
nghệ iRNA đã được nhiều tác giả đề cập, họ cho đây là “một công nghệ đầy uy
lực”, “cuộc cách mạng iRNA” (Archana, 2003; Ajit, 2007). Năm 1998, hai nhà

8


Đồ án tốt nghiệp

khoa học Mỹ Fire và Mello đã xuất bản cơng trình nghiên cứu đột phá về cơ chế
gây bất hoạt gene bởi iRNA đăng trên tạp chí Nature (Fire và Mello, 1998).
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu iRNA.
Trong lịch sử, sự can thiệp RNA hay iRNA được biết đến với những tên gọi
khác như : RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference . . .
Lần đầu tiên, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng RNA sense có hiệu quả
cũng như là RNA antisense trong việc ức chế sự biểu hiện gene ở loài giun với tên
khoa học là C. elegans (Guo và Kemphues, 1995).
Nghiên cứu iRNA được mô tả là một hiện tượng trong C.elegans, bằng cách
tiêm dsRNA vào trong C. elegans đã dẫn đến sự bất hoạt trình tự gene đặc hiệu và
tạo ra thuật ngữ “iRNA – Can thiệp RNA” (Fire và ctv, 1998).
Nghiên cứu quá trình bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) ở thực vật được
báo cáo bởi Hamilton và Baulcombe (Hamilton và Baulcombe, 1999).
Phát hiện hiện tượng PTGS ở cây trồng và khả năng kháng virus được gây ra

bởi dsRNA. Hiện tượng bất hoạt gene sau dịch mã trong cây có tương quan với
phân tử RNA nhỏ (mỗi phân tử có chiều dài khoảng 21–25 nucleotide). Trong quần
thể các phân tử RNA nhỏ có cả các trình tự sense RNA và antisense RNA
(Hamilton và Baucombe, 1999).
Quá trình xử lý dsRNA mạch dài thành những đoạn ngắn 21–23 nucleotide
là nhờ enzyme Dicer RNase III ở ruồi giấm Drosophila (Zamore và ctv, 2000).
Lần đầu tiên mô tả iRNA trên tế bào động vật có vú (Tuschl và ctv, 2001).
Nghiên cứu những đoạn RNA ngắn có cấu trúc kẹp tóc (shRNAs) là nguyên
nhân gây ra sự bất hoạt trình tự đặc hiệu ở những tế bào động vật có vú (Paddison
và ctv, 2003; Sui và ctv, 2003; Paul và ctv, 2003).
Bài báo cáo đầu tiên cho rằng những đoạn iRNA nhỏ được sử dụng trong
chữa bệnh ở động vật có vú (Song và ctv, 2003).
Những đoạn iRNA nhỏ có khả năng bất hoạt gene ở mức độ phiên mã thơng
qua methyl hóa DNA de novo ở người (Kawasaki, Taira và ctv, 2004).

9


Đồ án tốt nghiệp

iRNA kiểm sốt hoạt hóa gene ở giai đoạn phiên mã (TGS – transcriptional
gene silencing), các phân tử siRNA ngăn cản phiên mã khống chế số lượng phân tử
mRNA. Cơ chế này xảy ra trong nhân tế bào và mục tiêu tác động là DNA (Matzke
và ctv, 2004; Huettel và ctv, 2007).
Ở tế bào sinh vật nhân thực, iRNA là một bộ máy sinh hóa quan trọng đóng
vai trị điều hịa hoạt hóa gene và bảo vệ cơ thể (Hannon, 2002; Mello và ctv, 2004;
Meister và Tuschl, 2004; Hammond, 2005).
Giải thưởng Nobel trong sinh học và y học trong việc khám phá cơ chế
iRNA (Andrew Fire và Craig Mello, 2006).
Nghiên cứu những đoạn dsRNA nhỏ tạo ra sự hoạt hóa gene phiên mã “hoạt

hóa RNA” (Li và ctv, 2006).
Chứng minh được siRNA giúp con người có thể sản xuất một gene đặc hiệu
làm giảm lượng mRNA và protein nhờ cơ chế hoạt động của iRNA (Davis và cộng
sự, 2010).
2.3.3. Cơ chế bất hoạt gene của iRNA.
Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã
được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21–23 nucleotide (Tuschl và ctv,
1999). Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA–small interfering RNA) đóng
vai trị phân hủy mRNA. Sau đó, nhóm Fire và Mello; Parrish và cộng sự đã xác
minh rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn khoảng 25 nucleotide và
tiếp theo siRNA gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA
(Fire, Mello và ctv, 2000).
 Cơ chế bất hoạt gene được mô tả như sau:
RNA sợi kép (dsRNA) bị cắt thành những mảnh nhỏ (siRNA) bởi một
endonuclease gọi dicer. Sau đó, sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo ra 2 sợi đơn
ngắn và 1 trong 2 sợi đó là sợi antisense (sợi đối nghĩa). Sợi antisense ngắn
(siRNA) được nạp vào phức hợp RISC. Sau đó, phức hợp RISC có gắn antisense
RNA này bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng giữ các base. Phần dư ra của
sợi mRNA sẽ bị RISC phân cắt. Điều này có nghĩa sợi mRNA thơng tin bị phân hủy

10


Đồ án tốt nghiệp

và kết quả là protein được dịch mã từ mRNA này khơng được tổng hợp. Q trình
dịch mã gene bị bất hoạt.

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của iRNA [68].
A. Trong tế bào, quá trình sao chép nội sinh và ngoại sinh mở đầu cho hoạt

động của những sợi dsRNA dài, chúng được xem như là một chất kích hoạt q
trình can thiệp RNA (iRNA).
B. Đây là quá trình đầu tiên mà dsRNA được xử lý dưới tác dụng của
enzyme RNase III và ATP.
C. dsRNA dài bị cắt thành những đoạn siRNA có kích thước 21–23
nucleotide với 2 nucleotide nhơ ra ở đầu 3’. siRNA cũng có thể được tổng hợp bên

11


Đồ án tốt nghiệp

ngồi tế bào và sau đó được đưa vào trong tế bào nhờ quá trình lây nhiễm hoặc
xung điện.
D. siRNA kết hợp với phức hợp phản ứng lại kích thích iRNA (RISC). Phức
hợp này chứa thành phần chính là Agronaute (Argo), Ago gắn vào siRNA, tách và
loại bỏ sợi sense của siRNA để RISC hoạt động.
E và F. Còn lại là sợi antisense của siRNA mạch kép, được xem là sợi chỉ
dẫn, hướng dẫn RISC bám vào và bắt cặp với mRNA có trình tự tương đồng với
nó, phân hủy mRNA đích. Kết quả là khơng có mRNA cho quá trình giải mã tổng
hợp protein hay hormon của gene đó.
2.3.4. Vai trị của iRNA.
iRNA kìm hãm tổng hợp protein và điều hòa sự phát triển của cơ thể sinh
vật. Hiện nay đã phát hiện khoảng 500 gene ở người và động vật có vú tổng hợp
khoảng 500 phân tử miRNA khác nhau có chiều dài khoảng 21 nucleotide và
khoảng 30% tổng số gene được điều khiển bởi các phân tử miRNA (Ajit, 2007).
iRNA là cơ chế bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của virus. Các cơng trình
nghiên cứu cơng bố năm 1997 cho thấy cây trồng có hàng rào bảo vệ hiệu quả
chống lại sự xâm nhiễm của virus dựa trên cơ chế PTGS (Covey và ctv, 1997;
Ratcliff và ctv, 1997). Bộ máy dsRNA có thể nhận biết được RNA của virus xâm

nhập và ngăn chặn RNA virus bằng cách phân hủy RNA virus, nhận biết sự xâm
nhập của sinh vật ký sinh, tạo ra các phản ứng gây bất hoạt gene ban đầu và sau đó
khuếch đại phản ứng để loại bỏ hồn tồn các nhân tố bên ngoài xâm nhập.
iRNA bảo đảm sự bền vững của genome thông qua sự bất hoạt gene nhảy
(Fire, Melo và ctv, 1998). Các gene nhảy gây ra rất nhiều các đột biến bất lợi trong
cơ thể sống. Trong vùng chứa gene nhảy của genome, cả hai sợi DNA được sao
chép, dsRNA được tạo thành và dẫn đến q trình iRNA loại bỏ những sản phẩm
khơng mong muốn từ gene nhảy. Những phần tử dsRNA ngắn tác động trực tiếp lên
sợi nhiễm sắc và ngăn chặn sự dịch mã (Tabara và ctv, 1999). Cơ chế bất hoạt gene
iRNA tạo nên hệ thống miễn dịch của genome (Plasterk, 2002).

12


Đồ án tốt nghiệp

2.3.5. Các nghiên cứu ứng dụng của iRNA trong nuôi trồng thủy sản.
Can thiệp RNA (iRNA) là một hiện tượng bất hoạt đặc hiệu của gene trong
các sinh vật đa bào gồm Drodophia, Caenorhabditis elegans, động vật có vú và ký
sinh… Cơng nghệ iRNA là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả về chức năng
gene trên động vật thủy sản, điển hình trên cá ngựa vằn Danio rerio,…[71]
iRNA đã được nghiên cứu trên luân trùng Brachionus plicatilis nhằm tăng
cường khả năng đánh giá những tính năng di truyền đặc biệt quan trọng ảnh hưởng
đến vòng đời của chúng (Snell và ctv, 2010).
Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó
trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virus ở đa số loài. Kết quả
là làm bất hoạt gene của Dicer–1 của virus trong tôm sú (Penaeus mondon) làm
tăng tỷ lệ chết của virus, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn
dịch tốt trên tôm (Su, Oanh, Lyons và ctv, 2008). Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào
bạch cầu nó đóng vai trị làm miễn dịch tự nhiên ở trong tơm (Zhang, Song, Zhao và

ctv, 2010).
Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer–2 bao gồm miễn dịch
không đặc hiệu chống lại virus (Chen, Jia, Zhao và ctv, 2011). Dicer–2 góp phần
vào chức năng miễn dịch không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của
iRNA (Kim, Behlke và ctv, 2005).
Ứng dụng siRNA trong nghiên cứu ức chế TFV (tiger frog virus) trong tế
bào cá, cung cấp tiềm năng trong điều trị bệnh do virus trong nuôi trồng thủy sản
(Junfeng Xie và ctv, 2004). iRNA còn được nghiên cứu để bất hoạt gene của virus
gây bệnh đốm trắng (WSD–white spot disease) ở tôm biển (Krishn và ctv, 2009).
iRNA đặc hiệu (21bp) được ứng dụng để ức chế gene mã hóa protein vỏ (VP28)
của virus WSSV trong cơ thể tôm Penaeus japonicas.
Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại
virus đốm trắng (WSSV) hoặc virus Taura ở tơm thẻ chân trắng Thái Bình Dương
(Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc
protein của virus. Sử dụng dsRNAs tác động vào gene mục tiêu của virus đầu vàng

13


Đồ án tốt nghiệp

(YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virus trên tôm sú
Penaeus monodon (Vincent, Breland và Lotz, 2004).
dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất
hoạt gene. Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới
nước bằng cách sử dụng iRNA. Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở
dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti)
Đại Tây Dương. Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để
nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá
ngựa vằn Danio rerio. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của

dsRNA trong cơ thể tơm trưởng thành. Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức
năng của hormon hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được
nghiên cứu (Estrada và ctv, 2007).
Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo
bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonad inhibiting
hormon (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis. dsRNA làm giảm sự biểu hiện của
GIH (Guan, Mark, Chan và ctv, 2004).
Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm hai mảnh, nó
quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas. Việc tiêm dsRNA tương
ứng với gene Oyster vasa–like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế
quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phơi ở sị Crassostrea
gigas (Fabioux và ctv, 2009).
iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch
tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004).
Nghiên cứu tiêm dsRNA vào tôm Macrobrachium rosenbergii ngăn cản sự
phát triển đặc điểm sinh dục thứ phát “gai phụ sinh dục đực” và giảm thông số tăng
trưởng vốn thể hiện mạnh ở con đực (Ventura, 2009).

14


Đồ án tốt nghiệp

2.3.6. Phương pháp chuyển dsRNA, shRNA, siRNA vào trong tế bào.
2.3.6.1. Phương pháp chuyển không cần virus.
Phương pháp này sử dụng những siRNA bình thường và siRNA biến đổi bằng
phương pháp hóa học, được sao chép trong môi trường in vitro. siRNA, shRNA,
dsRNA được biểu hiện bởi plasmid đóng vai trị là vector. Chuyển bằng cách sử
dụng liposome, lipid, protein–antibody, peptide … Các cách trên được phân ra
thành hai dạng: hệ thống và cục bộ (Aigner, 2007).

Những phương pháp chuyển cục bộ chỉ cần một lượng nhỏ siRNA để tránh
việc chuyển nhầm đến những bộ phận khác và giảm thất thoát do sự bài tiết của
thận.
Phương pháp chuyển hệ thống có thể thực hiện nhiều cách như gắn siRNA vào
liposome, lipoplexe, và cationic lipid, tiêm siRNA, xung điện (Aigner, 2007).
Cũng có thể chuyển siRNA hay dsRNA vào vật chủ bằng phương pháp ngâm
như trứng của loài Drosophila melanogaster hấp thu được siRNA/dsRNA trong
những giai đoạn phát triển sớm (Tabara và ctv, 1998; Timmons và ctv, 1998).
2.3.6.2. Phương pháp chuyển bằng plasmid.
Chuyển shRNA hay siRNA vào trong plasmid, khi đó, plasmid này sẽ mã
hóa shRNA, siRNA với hai mạch sense và antisense riêng biệt, có thể biểu hiện
dưới sự kiểm sốt của promoter được chọn.
Promoter có thể là RNA polymerase II (pol–II)–dependent hay RNA
polymerase III (pol–III)–dependent.
U6 là Pol–III promoter được biểu hiện trong hầu hết các tế bào. Q trình
sao chép của nó bắt đầu tại chính xác một điểm và kết thúc tại nucleotide uredine.
Một chuỗi nhiều hơn bốn thymidine cũng có thể được xem như là điểm kết thúc.
Việc này rất có lợi trong việc biểu hiện những đoạn gene ngắn như shRNA nhằm
tránh những nucleotide khơng mong muốn tại điểm kết thúc.
Pol–II promoter có nhiều ưu điểm trong việc biểu hiện shRNA. Những
promoter này có thuận lợi trong việc điều chỉnh sự bất hoạt RNA một cách nhất
thời, tùy thuộc vào tính chất của chúng. Những promoter hoạt hóa như tetracycline

15


Đồ án tốt nghiệp

promoter và metallothionine promoter được sử dụng để hoạt hóa và kiểm sốt q
trình iRNA nhưng những sản phẩm của pol–II promoter không kết thúc tại vị trí

chính xác. Vì vậy, những mạch sao chép sẽ có nhiều nucleotide dư thừa tại điểm kết
thúc. Chúng có thể can thiệp vào q trình hoạt hóa đoạn RNA đích. Những đoạn
dư thừa này có thể làm cho q trình iRNA không nhận biết được đoạn gene mục
tiêu.
Do tác dụng phụ gây độc khi siRNA/shRNA bị biểu hiện quá mức nên
promoter phải được lựa chọn cẩn thận dựa vào chiều dài của chúng để tránh tác
dụng gây độc.
Peng và cộng sự đã phát triển một hệ thống kết hợp những thuận lợi của của
hai phương pháp trên (sự chính xác của của T7 RNA polymerase và điều chỉnh sự
biểu hiện bằng pol–II promoter). Họ tạo ra một plasmid cấu trúc có thể biểu hiện
shRNA bằng T7–RNA polymerase promoter và pol–II promoter kiểm soát sự biểu
hiện của T7–RNA polymerase, nên T7 RNA polymerase có thể được điều chỉnh bởi
pol–II promoter. Kết quả là shRNA được chỉnh sửa biểu hiện trong tế bào. Một
trong những nhược điểm của quá trình này là hiệu quả của phương pháp chuyển có
sự khác biệt giữa những tế bào và các điều kiện thí nghiệm khác nhau (Singh và ctv,
2009).
Q trình iRNA có thể thực hiện bằng cách chuyển dsRNAs vào vi khuẩn. Vi
khuẩn có thể biểu hiện dsRNA dưới sự kiểm soát của T7 RNA polymerase
promoter. Khi tế bào chủ hay sinh vật hấp thụ chúng, dsRNA được biểu hiện trong
vi khuẩn có thể kích hoạt quá trình iRNA trong từng tế bào chủ hay sinh vật tương
ứng (Singh và ctv, 2009).
2.3.6.3. Phương pháp chuyển nhờ virus.
Thế mạnh của việc chuyển siRNA/shRNA bằng virus là có thể chuyển vào
những tế bào mà khó bị nhiễm bởi những phương pháp khác và ngay cả những tế
bào không phân chia. Vector của virus tải nạp vào tế bào một cách tự nhiên và hiệu
quả cao hơn so với cảm nhiễm hay bất kì những cách chuyển khơng dùng virus.
Những virus vector được sử dụng phổ biến nhất để chuyển shRNA bao gồm:

16

Đồ án tốt nghiệp

Adenovirus, Adeno Associated Virus (AAV), Lentivirus, Retrovirus, Herpes và
Baculovirus vector (Singh và ctv, 2009).

17


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.
Thời gian thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng 07 năm
2012.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi
Trồng Thủy Sản 2, 116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ
Chí Minh.
3.2. Vật liệu.
3.2.1. Vật liệu sinh học.
Tơm càng xanh trưởng thành khoảng 18–30 g: 2 con đực và 2 con cái, mục
đích tách chiết tuyến đực để thu RNA. Địa điểm thu mẫu: Cái Bè (Tiền Giang).
Tôm PL25: 60 con sử dụng cho thí nghiệm tiêm sợi dsRNA, thu ở Cái Bè
(Tiền Giang).
Chủng E.coli JM 109 khả nạp được thương mại hóa (Promega).
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm.
3.2.2.1. Primer.
Bảng 3.1. Trình tự của các primer trong nghiên cứu.
Thứ
tự

1

3

4

Sequence primer
Primer

Mr–IAG
Mr–IAG
Sense
Mr–IAG

Forward (5’3’)

Reverse(5’3’)

TCCCGTCCCTGTCCTATAC

CGGTGATTTGACTTTGAGCAT

TTG

C

T7PATGGGATACTGGAATG

CTGGAACTGCAGGTGTTAAG

CCGG
ATGGGATACTGGAATGCC

Antisense GAG

T7PCTGGAACTGCAGGTGTTA
ACG

3.2.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích RNA tổng số.
 Trizol (phenol pH8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate).

18


Đồ án tốt nghiệp

 Chloroform.
 Isopropanol lạnh (bảo quản ở –250C).
 Ethanol 70% lạnh (bảo quản ở –250C).
 Nước DEPC (nước khử RNase).
3.2.2.3. Hóa chất dùng trong phản ứng RT–PCR, PCR.
 Buffer 5X.
 dNTP 10mM.
 MgCl2 25mM.
 Primer F 100pmol/µl.
 Primer R 100pmol/µl.
 Flexi Taq 5U/µl.
 AMV 10U/µl.
 Nước.
3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di agarose.

 Agarose (Bio basic).
 Dung dịch TBE 0,5X.
 Gel red.
 6X DNA Loading Dye (Promega).
3.2.2.5. Hóa chất dùng trong tổng hợp Mr–IAG dsRNA.
 5X colorless buffer.
 dNTP 10 mM.
 MgCl2 25 mM.
 Flexi Taq 5 U/ μl.
 Nuclease free water.
 Nước DEPC.
 RNase A: phân hủy RNA mạch đơn.
 RNase III: phân hủy RNA mạch đôi.
 DNase: phân hủy DNA.
 Primer Mr–IAG sense (T7P) forward và reverse.

19


Đồ án tốt nghiệp

 T7 enzyme mix.
 10X T7 Reaction Buffer.
 TURBO DNase.
 RNA nồng độ 10 ng/ μl.
 RiboMAXTM Express T7 2X Buffer.
 Enzyme Mix T7 Express.
3.2.3. Dụng cụ – thiết bị thí nghiệm.
 Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml.
 Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow).

 Micropipet các loại (Bio – rad).
 Đầu tip các loại.
 Bộ dụng cụ vi phẩu.
 Máy ly tâm lạnh.
 Máy luân nhiệt (Bio – rad).
 Máy điện di (Bio – rad).
 Máy chụp ảnh điện di DNA – RNA (Bio – rad).
 Lị vi sóng (Electrolux – Thụy Điển).
 Tủ mát, tủ âm (–250C, –800C) (Sanyo – Nhật).

20


Đồ án tốt nghiệp

3.3. Phương pháp nghiên cứu.
Tổng hợp cDNA
mạch
khuông
củakhuôn
gene cho
M.rosenbergii
insulin–like androgeneic
Tổng hợp
cDNA
mạch
gene Macrobrachium
gland (Mr–IAG)
rosenbergii insulin–like androgen gland (Mr–IAG).
Tôm càng xanh đực trưởng thành (18–30) g

Trizol
Tách chiết RNA tổng số
RT–PCR
Kiểm tra sản phẩm có kích thước 163 bp
RT–PCR
cDNA mạch khn
Dịng hóa và giải trình tự cDNA
Dịng hóa sản phẩm PCR
Giải trình tự 2 chiều cDNA
Tổng hợp Mr–IAG dsRNA bằng phương pháp in vitro.
Phương pháp 2 bước

Phương pháp 1 bước

Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tơm PL25.
Nồng độ 5 µg Mr–IAG dsRNA/g
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu.

21


Đồ án tốt nghiệp

3.3.1. Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho gene Macrobrachium rosenbergii
insulin–like androgene gland (Mr–IAG).
3.3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực của tôm càng xanh.
RNA được tách chiết từ tuyến đực bằng phương pháp tách chiết phenol –
chloroform (Trizol – Invitrogene, California, Mĩ).
Tôm đực/cái trưởng thành (khoảng 30 g)
Phần gốc chân bò số 5 (150–200 mg)

1 ml Trizol, vortex, ủ 5 phút
200 µl Chloroform, vortex, ủ 3 phút
Ly tâm 12000/phút trong 15 phút, ở 40C
Thu hết dịch nổi
Thêm isopropanol lạnh (–200C)
Ủ ít nhất 10 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C
Loại bỏ dịch nổi, thêm 1 ml ethanol 70%,
vortex
Ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút, ở 40C
Loại bỏ dịch nổi, làm khô cặn RNA bằng block nhiệt ở 550C
Làm tan cặn RNA trong 100 µl nước
DEPC
Bảo quản –250C
Hình 3.2. Sơ đồ tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực tôm càng xanh bằng Trizol –
phenol.

22


Đồ án tốt nghiệp

 Tiến hành.
Mẫu: 2 con tôm đực và 2 con tơm cái trưởng thành có trọng lượng khoảng 30
g. Tiến hành vi phẩu lấy tuyến đực – gốc chân bị số 5 hoặc có thể cắt lấy phần mô
– khu vực tương đương ở con cái, cho vào 2 eppendorf sạch 1,5 ml, đánh dấu
eppendorf chứa mẫu tơm đực và tơm cái.
Tiến hành ly trích RNA: dùng micropipette loại 100 – 1000 µl, hút 1000 µl
trizol cho vào mỗi eppendorf đã chứa mẫu, tiến hành vortex, ủ ở nhiệt độ phịng
trong 5 phút. Khi đó, trizol sẽ được hòa trộn trong mẫu giúp phá vỡ màng tế bào.

Sau đó, tiếp tục thêm vào 200 µl chloroform giúp tạo micel phân tán và tiếp xúc đều
với dung dịch chất tẩy rửa tăng hiệu quả biến tính protein, đem vortex mạnh trong
20 giây để tách rời các thành phần, rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Đem
các eppendorf này đi ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở 40C. Sau
ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 pha: lớp dưới cùng có màu đỏ gồm phenol–
chloroform, lớp giữa là lớp hữu cơ và lớp dung dịch không màu chứa RNA ở trên
cùng. Ly tâm xong tiến hành thu hết dịch nổi (khoảng 500 µl) cho vào eppendorf
1,5 ml khác. Tiếp tục cho 500µl isopropanol lạnh vào các eppendorf chứa dịch nổi
vừa thu được, đảo nhẹ 6 – 7 lần. Sau đó, đem các eppendorf này đi ủ ở nhiệt độ
phịng ít nhất 10 phút. Tiến hành ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Sau
khi ly tâm, tiến hành loại bỏ dịch nổi và hịa tan cặn lóng RNA bằng 1 ml ethanol
70% lạnh, rửa loại muối và isopropanol. Đem các eppendorf này đi vortex, sau đó
tiếp tục ly tâm 7500 vịng trong 5 phút. Sau ly tâm, cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm
khô cặn RNA bằng cách đun trên block nhiệt 550C khoảng 5 – 10 phút. Cuối cùng,
thêm 100 µl nước cất 2 lần vào mỗi eppendorf và đem bảo quản ở –250C.
3.3.1.2. Kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số bằng cặp mồi đặc hiệu Mr–IAG
khuếch đại cho sản phẩm 163 bp.
Sau khi tách chiết RNA tổng số, tiến hành chạy RT–PCR với cặp mồi đặc hiệu
cho tuyến đực Mr – IAG khuếch đại đoạn sản phẩm 163 bp. Nếu vật liệu mẫu chứa
sản phẩm có kích thước 163 bp thí chứng tỏ rằng mẫu RNA tổng số tách chiết được

23