Phát hiện các đột biến trên gen Beta Globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược REVERSE DOT BLOT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ
THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Thu Hà

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ
THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan

Hà Nội - Năm 2017

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc nhất tới PGS.TS. Võ Thị Thƣơng Lan. Cô là ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn,
chỉ dạy và giúp đỡ em tận tình trong suốt q trình học tập và làm việc. Cơ
khơng chỉ truyền đạt cho em kiến thức mà còn dạy cho em cách giải quyết
vấn đề, cách bố trí thí nghiệm hiệu quả, tác phong làm việc khoa học. Cơ cịn
quan tâm, giúp đỡ em giải quyết những khó khăn trong cuộc sống.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Tạ Bích Thuận. Cơ đã ln động
viên, quan tâm, chỉ dẫn em tận tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cơ
ln khích lệ em rất nhiều những lúc em gặp khó khăn, giúp em có thêm động
lực để có thể hồn thành luận văn này.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt cho em các kiến thức khoa học, tạo điều
kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Phạm Anh Thùy Dƣơng, ThS. Ngô
Thị Hà, các bạn và các em thuộc Phòng thuộc phòng thí nghiệm Sinh Y,
Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà
Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và chia sẻ khó khăn trong suốt quá trình em thực
hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã
động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 4 năm 2017

Lê Thị Thu Hà


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chƣơng 1- TổNG QUAN .................................................................................. 2
1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA ..................................................................... 2
1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam............................ 2
1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin ......................... 3
1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia ................... 4
1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia ..................................... 7
1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh .................................................. 10
1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY
MUTATION SYSTEM - PCR) ................................................................... 13
1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR............................................. 13
1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR ........................................ 14
1.2.3 Ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật ARMS-PCR ........................ 16
1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia ........... 16
1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) .............. 17
1.3.1 Nguyên tắc chung của kỹ thuật lai axit nucleic .............................. 17
1.3.2 Đầu dò trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc............................................. 18
1.3.3 Màng sử dụng trong kỹ thuật lai điểm ngƣợc ................................. 20
1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc trong chẩn đoán bệnh β-thalassemia ....... 21
Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................... 23
2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................... 23
2.1.1 Nguyên liệu ..................................................................................... 23
2.1.2 Hóa chất........................................................................................... 23
2.1.3 Trình tự các đầu dị oligo sử dụng trong nghiên cứu ...................... 25
2.1.4 Trình tự các mồi .............................................................................. 26
2.1.5 Thiết bị ............................................................................................ 27
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 28


2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................. 28

2.2.2 Tách ADN tổng số........................................................................... 29
2.2.3 Phƣơng pháp PCR ........................................................................... 29
2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR .............................................................. 31
2.2.5 Phƣơng pháp điện di........................................................................ 33
2.2.6 Quá trình lai điểm ngƣợc................................................................. 34
2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng ................................................................... 35
Chƣơng 3- KẾT QUẢ ..................................................................................... 38
1. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ
THUẬT PCR ĐA MỒI ................................................................................ 39
2. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT
ARMS-PCR ................................................................................................. 42
2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR .... 42
2.2 Sàng lọc đột biến Cd 26 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR .... 43
2.3 Sàng lọc đột biến Cd 41/42 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR44
3. SO SÁNH KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC MẪU
BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI VỚI KẾT QUẢ CHẨN
ĐỐN SINH HĨA ...................................................................................... 47
3.1 Đặc điểm Hb các đột biến trong nghiên cứu ...................................... 48
3.2 Giá trị HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26 .......................................... 52
3.3 So sánh kết quả chẩn đốn sinh hóa với kết quả phân tích PCR đa mồi
.................................................................................................................. 53
4. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở NHĨM NGƢỜI BÌNH THƢỜNG
...................................................................................................................... 55
5. BIẾN NẠP, TÁCH DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN βGLOBIN ....................................................................................................... 58
5.1 Biến nạp, tách dịng ............................................................................ 58
5.2 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17 ............................ 61
5.3 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26 ............................ 62
5.4 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42 ....................... 64

5.5 Giải trình tự đoạn gen β-globin khơng có đột biến ............................ 66
6. LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) ...................................... 67
6.1 Đánh dấu trình tự đích cho q trình lai điểm ngƣợc ........................ 67
6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc ........................................................ 68
6.3 Kết quả lai một số mẫu bệnh phẩm .................................................... 73
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 76
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 77

KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

(-)

Âm tính

(+)

Dƣơng tính

3‟UTR

3‟ Untranslated Region (Vùng 3‟ khơng dịch mã)

5‟UTR

5‟ Untranslated Region (Vùng 5‟ không dịch mã)

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System-PCR
ARN

Acid ribonucleic

BCIP

5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate- BCIP

bp

base pair

Cd

Codon

DCIP

Dichlorophenol Indophenol

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

dUTP

Deoxyuridine triphosphate

EDC

1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide
hydrochloride

H2O

Nƣớc

Hb

Hemoglobin huyết sắc tố

HbA

Adult hemoglobin

HbA2

Adult hemoglobin 2

HbE

Hemoglobin E

HbF

Fetal hemoglobin

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu
năng cao)

HPV

Human papillomavirus

IVS

Intervening sequence (Intron)

LB

Luria Bertani

MCH

mean corpuscular hemoglobin (Lƣợng hemoglobin trung
bình trong một hồng cầu)

MCV

mean corpuscular volume (Thể tích trung bình hồng cầu)

NBT

nitro-blue-tetrazalium

SA-AP

Streptavidine alkaline phosphatase

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SSC

Saline Sodium Citrate

TBE

Đệm Tris - Borate - EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)

WHO

World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới)

α

alpha

β

beta

γ

Gama


δ

Delta

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1.

Cụm gen β-globin (A) và cấu trúc gen β-globin (B)

3

Hình 1.2.

Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia

6

Hình 1.3.

Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia

11

Hình 1.4.

Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát hiện đột biến điểm

13

Hình 1.5.

Cấu trúc của oligonucleotide amino-linkers và spacer
arm

17

Hình 1.6.

Cơ chế phát hiện màu của quá trình lai điểm ngƣợc

18

Hình 2.1.

Sơ đồ minh họa vị trí các mồi sử dụng trong nghiên cứu

24

Hình 2.2.

Sơ đồ thí nghiệm phát hiện các đột biến trên gen β-

26


globin
Hình 3.1.

Kết quả điện di minh họa ADN tổng số tách từ mẫu máu

35

Hình 3.2.

Kết quả điện di minh họa sản phẩm PCR đa mồi

37

Hình 3.3.

Kết quả sàng lọc đột biến Cd 17 bằng kỹ thuật ARMSPCR

38

Hình 3.4.

Kết quả sàng lọc đột biến Cd 26 bằng kỹ thuật ARMSPCR

39

Hình 3.5.

Kết quả sàng lọc đột biến Cd41/42 bằng kỹ thuật ARMSPCR

40

Hình 3.6.

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen βglobin bằng cặp mồi 95 NF/Control R

52

Hình 3.7.

Kết quả PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi vector
M13F/R

52

Hình 3.8.

Kết quả tách plasmid

53

Hình 3.9.

Kết quả PCR kiểm tra plasmid 1.1, 2.1, 4.1 lần lƣợt với
mồi đột biến Cd 17, Cd 41/42, Cd 26

53

Hình 3.10.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T57
với ngân hàng dữ liệu NCBI

54

Hình 3.11.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu
T365 với ngân hàng dữ liệu NCBI

56

Hình 3.12.

Kết quả so sánh đột biến tại Cd 42 (TTT→CTT) với cơ
sở dữ liệu HbVar

57

Hình 3.13.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T57
với ngân hàng dữ liệu NCBI

58

Hình 3.14.

Kết quả so sánh trình tự đoạn gen β-globin của mẫu T99
với ngân hàng dữ liệu NCBI

59

Hình 3.15.

Minh họa kết quả đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin

60

Hình 3.16.

Kết quả tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc

62

Hình 3.17.

Chuẩn hóa nồng độ đầu dò CD26 chấm lên màng

63


Hình 3.18.

Kết quả lai điểm ngƣợc trên mẫu ADN ngƣời khơng có 3
đột biến khảo sát với các đầu dị CD 17, CD 26, CD
41/42

64

Hình 3.19.

Kết quả lai điểm ngƣợc trên ba mẫu bệnh phẩm phát hiện
ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen β-globin

65

Hình 3.20.

Kết quả lai điểm ngƣợc trên một số mẫu bệnh phẩm phát
hiện ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên gen βglobin

66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang


Bảng 1.1.

Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia

7

Bảng 1.2.

Đặc điểm các mồi bình thƣờng và mồi đột biến của phản
ứng ARMS-PCR

14

Bảng 2.1.

Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm
ngƣợc

22

Bảng 2.2.

Trình tự các đầu dị oligo dùng trong kỹ thuật lai điểm
ngƣợc

23

Bảng 2.3.

Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

24

Bảng 2.4.

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi sàng lọc
đồng thời các đột biến tại Cd 17, Cd 26 và Cd 41/42 trên
gen β-globin

27

Bảng 2.5.

Thành phần và điều kiện phản ứng không đánh dấu và
đánh dấu trình tự đích cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc

28

Bảng 2.6.

Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu
để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 17

29

Bảng 2.7.

Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu
để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 26

29

Bảng 2.8.

Thành phần và điều kiện phản ứng ARMS-PCR đã tối ƣu
để sàng lọc kiểu gen đột biến Cd 41/42

30

Bảng 2.9.

Thành phần gel polyacrylamide 8%

30

Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn
gen đích cần tách dịng

32

Bảng 2.11. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi
M13F/R

33

Bảng 3.1.

Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu máu thalassemia T1T10

36

Bảng 3.2.

Kết quả sàng lọc đột biến tại Cd 17, Cd 26, Cd 41/42, Cd

95 trên mẫu thalassemia và ngƣời bình thƣờng bằng kỹ
thuật PCR đa mồi

36


Bảng 3.3.

Tỉ lệ các đột biến trên 288 mẫu bệnh phẩm

41

Bảng 3.4.

Tỉ lệ các đột biến kép trên 288 mẫu bệnh phẩm

41

Bảng 3.5.

Tỉ lệ các loại đột biến β-thalassemia ở ngƣời Việt Nam

42

Bảng 3.6.

Trung bình thành phần Hb các trƣờng hợp đột biến trong
nghiên cứu

43

Bảng 3.7.

Trung bình HbE ở các mẫu có đột biến Cd 26

47

Bảng 3.8.

So sánh kết quả chẩn đốn sinh hóa với kết quả phân tích
PCR đa mồi

47

Bảng 3.9.

Tỉ lệ các loại đột biến β-thalassemia ở nhóm ngƣời kiểm
tra sức khỏe

49

Bảng 3.10. Tỉ lệ mang gen bệnh β-thalassemia ở một số nghiên cứu
tại Việt Nam

50

Bảng 3.11. Nồng độ các đầu dò chấm lên màng

64

MỞ ĐẦU

Beta thalassemia (β-thalassemia) là bệnh di truyền lặn do đột biến gen
beta globin (β-globin) nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 quy định, gây
giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β-globin. Tại Việt Nam, đây là nguyên nhân
hàng đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em. Bệnh gây ra những hậu quả
nặng nề về thể chất và tinh thần cho ngƣời bệnh. Phƣơng pháp điều trị kinh
điển là truyền máu định kỳ và thải sắt thƣờng xuyên. Ghép tế bào gốc máu là
phƣơng pháp điều trị mới nhƣng rất tốn kém và hiệu quả chƣa cao. Vì vậy,
chƣơng trình tầm sốt bệnh thalassemia trong cộng đồng gồm xét nghiệm
trƣớc hơn nhân và chẩn đốn trƣớc sinh đƣợc coi là biện pháp hiệu quả làm
giảm nguy cơ các ca bệnh nặng.
ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) là kỹ
thuật đang đƣợc sử dụng phổ biến để phát hiện các đột biến β-thalassemia.
Bên cạnh đó, với ƣu điểm cho phép phát hiện đồng thời nhiều đột biến, kỹ
thuật lai điểm ngƣợc hiện nay đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu trên
thế giới cũng nhƣ các hãng phát triển thành các kit thƣơng mại để phát hiện
đột biến β-thalassemia. Tuy nhiên tại Việt Nam, ứng dụng của kỹ thuật này
vẫn còn rất hạn chế. Với mong muốn áp dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc để
phân tích đồng thời một số đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia
ở ngƣời Việt Nam, từ đó tự chủ thêm kỹ thuật xét nghiệm hiệu quả, chúng tôi
thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phát hiện các đột biến trên gen beta globin
bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngƣợc (reverse dot blot)”. Đề tài đƣợc
thực hiện tại Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân
tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

1

Chƣơng 1- TổNG QUAN

1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA
1.1.1 Tình hình mắc bệnh trên thế giới và tại Việt Nam
Beta thalassemia (β-thalassemia) là nhóm các bệnh thiếu máu di truyền,
xảy ra do đột biến gen beta globin (β-globin) quy định việc tổng hợp chuỗi βglobin của hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc
vận chuyển oxy trong cơ thể. Theo tổ chức Y tế thế giới WHO, hiện nay, ƣớc
tính khoảng 1,5% dân số thế giới mang gen bệnh β-thalassemia. Hằng năm,
khoảng 50000 đến 100000 trẻ bị chết vì mắc bệnh β-thalassemia thể nặng ở
những quốc gia có thu nhập thấp và trung bình [73]. Bệnh phổ biến ở các khu
vực Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Ấn Độ, Bắc Phi, Trung Đông và Trung Á
[69]. Ngày nay, do quá trình di cƣ và hơn nhân giữa các dân tộc khác nhau,
bệnh trở nên phổ biến ở nhiều quốc gia châu Âu, châu Mỹ, châu Úc. Khu vực
Đông Nam Á chiếm khoảng 50% số ngƣời mắc bệnh trên thế giới, xấp xỉ 40
triệu ngƣời và khoảng một nửa số đó bị ảnh hƣởng sau sinh. Tần suất mang
gen bệnh ở khu vực này từ 0,5% đến 10% [69]. Các nƣớc phát triển châu Âu
và châu Mỹ chỉ chiếm khoảng 10% đến 30% số ngƣời mắc bệnh trên thế giới
[69]. Trung Đông và Tây Á, tần số mắc bệnh từ 2% đến 5% ở hầu hết các
nƣớc. Tại Bắc Phi, tần số mắc bệnh từ 2 đến 9%, trong khi Mỹ có tần số mắc
bệnh thấp, chủ yếu ở dân nhập cƣ [14].

2


Việt Nam là một trong những nƣớc có tỉ lệ mắc bệnh cao trên bản đồ βthalassemia thế giới. Ƣớc tính hiện nay có khoảng 20000 ngƣời bị thalassemia
thể nặng, mỗi năm có thêm khoảng 2000 trẻ em sinh ra bị bệnh, có khoảng 10
triệu ngƣời mang gen bệnh thalassemia [76]. Đặc biệt, tỷ lệ gặp cao ở một số
dân tộc ít ngƣời khi vấn đề hơn nhân cận huyết vẫn còn tồn tại nhƣ: Stiêng
(63,9%), Êđê (32,2%), Khơme (28,2%), Mƣờng (21,74%) [76].

1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin
Gen β-globin nằm trong cụm gen dài 70 kb thuộc cánh ngắn nhiễm sắc
thể 11 (11p15.4). Cụm gen bao gồm các gen chức năng: ε - Gγ - Aγ - ѱβ - δ - β
đƣợc sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể. Cách
gen ε khoảng 6-20 kb về phía đầu 5‟ là vùng điều khiển nhóm gen (Locus
Control Region) chứa các vị trí HS từ HS1 đến HS5 rất nhạy với DNAse 1
(DNase 1 hypersensitive) (Hình 1.1A). Các vị trí này có motif gắn yếu tố hoạt
hóa phiên mã giúp điều khiển mở các vùng domain của nhóm gen β-globin và
tăng cƣờng biểu hiện gen [9].
Gen β-globin dài 1600 bp, bao gồm 3 exon, 2 intron, vùng 5‟ và 3‟
không dịch mã, mã hóa cho 146 axit amin. Exon đầu tiên dài 89 bp, exon 2
dài 221 bp và exon 3 dài 123 bp. Intron 1 có kích thƣớc nhỏ, dài 130 bp, trong
khi intron 2 có kích thƣớc lớn hơn, dài 850 bp (Hình 1.1B) [18].
Các trình tự bảo thủ có vai trị quan trọng đối với sự biểu hiện của gen
β-globin đƣợc tìm thấy ở các vùng promoter, chỗ nối intron-exon, vùng 5‟ và
3‟ không dịch mã. Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân dẫn tới
β-thalassemia [70].

3


Hình 1.1. Cụm gen β-globin (A) và cấu trúc gen β-globin (B) [61].
Promoter gen β-globin chứa các trình tự bảo thủ TATA box (từ vị trí –
28 đến –31), CCAAT box (từ vị trí –72 đến –76) và vùng lặp lại CACCC (từ
vị trí –86 đến –90 và vị trí –101 đến –105) có vai trị điều hịa hoạt động gen
[18].
Vùng 5‟ không dịch mã (5‟-UTR) dài 50 bp, nằm giữa vị trí CAP và
codon mở đầu ATG. Có hai trình tự bảo thủ là CTTCTG nằm trƣớc vị trí
CAP 8-13 nucleotide và trình tự CACCATG [18].

Vùng 3‟ khơng dịch mã (3‟-UTR) nằm giữa codon cuối cùng TAA và
đuôi poly A, dài 132 bp, chứa trình tự bảo thủ AATAAA. Trình tự bảo thủ
này là tín hiệu gắn đi poly A vào sợi mARN [18].
1.1.3 Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia
Có khoảng 200 đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia đã
đƣợc tìm thấy, chủ yếu là các đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [70]. Các
đột biến này có thể xảy ra tại các trình tự exon hoặc intron, promoter, vùng 3‟
và 5‟ khơng dịch mã (Hình 1.2).
Tùy theo đột biến làm giảm hay mất khả năng tổng hợp chuỗi β-globin
mà có thể dẫn tới mức độ nặng của bệnh β-thalassemia. Trƣờng hợp hoàn
4


tồn khơng cịn sự tổng hợp chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia.
Trƣờng hợp giảm tổng hợp một phần chuỗi β-globin dẫn tới kiểu hình β+thalassemia. Trong khi đó, giảm tổng hợp chuỗi β-globin rất nhẹ dẫn tới kiểu
hình β++-thalassemia [11].
Đột biến điểm ảnh hƣởng tới sự biểu hiện của β-globin đƣợc chia thành
ba nhóm chính:
 Đột biến ảnh hƣởng đến quá trình phiên mã
 Đột biến vùng promoter: Các đột biến trên vùng promoter xảy ra tại
các trình tự bảo thủ là vị trí bám của các nhân tố phiên mã có vai trị
trong việc điều hịa biểu hiện gen, làm giảm hiệu suất quá trình phiên
mã từ 20-30% so với bình thƣờng [70]. Ví dụ, đột biến tại các vị trí -28
(A→G) và -29 (A→G) phổ biến ở ngƣời Trung Quốc và da đen, đột
biến tại các vị trí -87 (C→G) và -101 (C→T) phổ biến ở khu vực Địa
Trung Hải [70].
 Đột biến vùng 5’ không dịch mã: Bao gồm các đột biến đơn và mất
đoạn nhỏ. Đột biến ở vùng 5‟ không dịch mã làm giảm hiệu suất dịch
mã. Ví dụ, đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm hiệu suất dịch mã
khoảng 33% so với bình thƣờng [70].

 Đột biến ảnh hƣớng đến quá trình cải biến mARN
 Đột biến trình tự bảo thủ: Quá trình cắt nối intron và exon xảy ra sau
phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) ở đầu 5‟, AG (vị trí
nhận nối) ở đầu 3‟ của các intron và vùng trình tự bảo thủ xung quanh
[70]. Vùng trình tự bảo thủ bao gồm 3 nucleotide cuối của exon và 6
nucleotide đầu tiên của intron ở vị trí cho nối đầu 5‟, 10 nucleotide cuối
của intron và nucleotide đầu tiên của exon ở vị trí 3‟ nhận nối. Đột biến
tại các nucleotide GT và AG dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia, trong khi
đó, các đột biến trong vùng trình tự bảo thủ dẫn tới giảm hiệu quả của

5


quá trình ghép nối, tạo kiểu hình β-thalassemia từ nhẹ tới nặng. Ví dụ,
đột biến IVS1.6 (T→C) dẫn tới kiểu hình β++-thalassemia trong khi đột
biến IVS1.5 (G→C, G→T, hoặc G→A) làm giảm tổng hợp chuỗi βglobin, dẫn tới kiểu hình β+-thalassemia [58].
 Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc các
exon và intron đều chứa các trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng
biên intron-exon nhƣng thƣờng không đƣợc sử dụng cho quá trình cắt
nối. Các đột biến xảy ra tại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống
với trình tự cắt nối bình thƣờng. Có 2 đột biến tại intron 1 và 3 đột biến
tại intron 2 tạo vị trí ghép nối giả [70]. Trong một số trƣờng hợp, các vị
trí này đƣợc ƣu tiên sử dụng cho quá trình cắt nối (90% tại đột biến
thay thế IVS1.110 (G→A) và 100% tại đột biến IVS1.116 (T→G) tạo
kiểu hình βo-thalassemia hoặc β+-thalassemia [39,54]. Tại exon 1, có 6
đột biến thay thế dẫn tới hoạt hóa vị trí ghép nối giả bao gồm: đột biến
tại Cd 10 (C→A), Cd 19 (A→G) tạo biến thể Hb Malay, Cd 24
(T→A), Cd 26 (G→A) tạo biến thể HbE, Cd 26 (A→C) tạo biến thể
Hb Tripoli hoặc Cd 27 ( G→T) tạo biến thể Hb Knossos [16,43,44,74].
 Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ khơng dịch mã: Có 4 đột biến

thay thế nucleotide và hai đột biến mất đoạn nhỏ ảnh hƣởng tới trình tự
bảo thủ AATAAA đã đƣợc cơng bố [70]. Các đột biến này thƣờng dẫn
tới kiểu hình nhẹ β+-thalassemia. Đột biến tại vùng 3‟ không dịch mã
(C→G vị trí +1480) gây β+-thalassaemia [70].
 Đột biến ảnh hƣởng đến quá trình dịch mã mARN
 Đột biến codon mở đầu: Có 9 đột biến liên quan tới codon ATG là tín
hiệu bắt đầu dịch mã dẫn tới kiểu hình βo-thalassemia [70].
 Đột biến vô nghĩa: Một số đột biến thay thế dẫn tới kết thúc sớm chuỗi
β-globin. Nguyên nhân là do đột biến trực tiếp tạo codon kết thúc hoặc
thêm hay mất một vài nucleotide dẫn tới thay đổi khung đọc mở, tạo
6


codon kết thúc sớm. Ví dụ, đột biến tại Cd 17 (A→T) của exon 1, làm
thay đổi axit amin lysine chuyển thành thymine, đƣợc phiên mã thành
bộ ba kết thúc UAG ở mRNA là đột biến phổ biến ở Thái Lan và Việt
Nam [12,57].
 Đột biến khung: Thêm hoặc mất một hoặc vài nucleotide làm thay đổi
khung đọc mở tạo kiểu hình β+-thalassemia. Điển hình nhƣ đột biến
mất nucleotide A tại Cd 6 phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, đột biến
gây lệch khung đọc do mất 4 nucleotide TCTT tại Cd 41 và 42 phổ biến
ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam [15,57].

Hình 1.2. Các đột biến trên gen β-globin gây bệnh β-thalassemia [45].
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 8 đột biến
thƣờng gặp, chiếm khoảng 95% các trƣờng hợp β-thalassemia bao gồm: Cd
17 (A→T), Cd 41/42 (-TCTT), -28 (A→G), Cd 71/72 (+A), IVS1.1 (G→T),
IVS1.5 (G→C), IVS2.654 (C→T) và Cd 26 (G→A) tạo biến thể HbE [57].
1.1.4 Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia
Dựa vào biểu hiện lâm sàng, bệnh β-thalassemia đƣợc chia thành ba thể

chính: thể nặng, thể trung gian, thể nhẹ (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Đặc điểm kiểu hình của bệnh β-thalassemia [30]
Kiểu hình

Kiểu gen đột biến

Chỉ số hồng cầu
7

Đặc điểm Hb


βthalassemia
thể nặng

β+/β+
βo/βo
β+/β+

Hb <7 g/dL
MCV: 50-60 fL
MCH: 14-20 pg

HbA2 tăng
HbF: 70-90%

βthalassemia
thể trung
gian

β+/β++
β+/βo
βo/βo + yếu tố ảnh
hƣởng

Hb: 6-10 g/dL
MCV: 55-70 fL
MCH: 15-23 pg

HbA2 tăng
HbF tăng
100%

β++/β
β+/β
βo/β

Hb nam: 9-15 HbA2 >3.2%
g/dL
HbF: 0,5-6%
Hb nữ: 9-13
g/dL
MCV: 55-75 fL
MCH: 19-25 pg

βthalassemia
thể nhẹ

đến

β-thalassemia thể nặng: Trẻ sơ sinh mắc bệnh β-thalassemia thể nặng
có biểu hiện lâm sàng rất sớm, từ 6 tháng đến 24 tháng tuổi. Trẻ bị tình trạng
thiếu máu nghiêm trọng. Do đó, cần đƣợc điều trị bằng truyền máu thƣờng
xuyên. Trẻ kém phát triển, có thể gặp các vấn đề nhƣ tiêu chảy, sốt, bụng to,
lách to, xanh xao, vàng da, dị tật xƣơng bao gồm xƣơng dài ở chân, điển hình
là thay đổi hộp sọ và mặt [23]. Bệnh nhân thalassemia thể nặng có số lƣợng tế
bào hồng cầu tăng lên, thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) thấp, lƣợng
hemoglobin trung bình trong mỗi hồng cầu (MCH) ở mức trung bình [13].
β-thalassemia thể trung gian: Bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian
có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng
phải truyền máu. Trẻ em biểu hiện bệnh rõ ràng ở độ tuổi từ 2 đến 6. Trẻ bị
chậm phát triển hoặc hồn tồn khơng có biểu hiện gì cho tới khi trƣởng
thành ngoại trừ thiếu máu nhẹ [23].
β-thalassemia thể nhẹ: Bệnh nhân thể nhẹ thƣờng khơng có biểu hiện
lâm sàng, nhƣng thỉnh thoảng thiếu máu nhẹ. Khi cả hai bố mẹ bị thể nhẹ thì
xác suất 25% con sinh ra có nguy cơ mắc bệnh β-thalassemia thể nặng [23].

8


Các đặc điểm huyết học đặc trƣng là tế bào hồng cầu nhỏ và nhợt nhạt hơn so
với bình thƣờng, tăng HbA2 [13].
Ngồi ra, cịn có các thể β-thalassemia khác nhƣ: thể phối hợp
Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và αthalassemia.
Thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia: Đột biến ở Cd
26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi axit amin glutamate thành lysin, tạo thể
HbE [70]. Kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà khơng phối hợp với
β-thalassemia chỉ gây kiểu hình β-thalassemia thể nhẹ. Tuy nhiên ở những trẻ
này vẫn có biểu hiện chậm phát triển ở mức độ vừa phải, thiếu máu nhẹ, ảnh
hƣởng đến phát triển thể lực và tinh thần [70].

Sự kết hợp của HbE với β-thalassemia làm cho biểu hiện lâm sàng trở
nên đa dạng, có thể thay đổi giống nhƣ thalassemia từ thể nặng đến thể nhẹ
[70]:
- β-thalassaemia/HbE thể nhẹ: không cần điều trị và hiếm khi biểu hiện
các triệu chứng lâm sàng, nồng độ hemoglobin từ 9-12 g/dl. Thể HbE kết hợp
với các đột biến -28 (A→G) hoặc Cd 19 (A→G) có thể dẫn tới kiểu hình thể
nhẹ [70].
- β-thalassaemia/HbE thể trung gian: triệu chứng giống với βthalassemia thể trung gian, nồng độ hemoglobin từ 6-7 g/dl. Thể HbE kết hợp
với đột biến IVS1.5 (G→C) có thể tạo kiểu hình thể trung gian [70].
- β-thalassaemia/HbE thể nặng: triệu chứng giống với β-thalassemia thể
nặng, nồng độ hemoglobin thấp, chỉ từ 4-5 g/dl. Thể HbE kết hợp với các đột
biến Cd 17 (A→T) hoặc Cd 41/42 (-TCTT) có thể dẫn tới kiểu hình thể nặng
[70].

9


Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: Sự kết hợp đột biến αthalassemia có thể làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia thể nặng
thành thể trung gian. Trong hầu hết các trƣờng hợp bệnh đều có liên quan đến
kết hợp 3 gen α-globin (ααα/). Thừa hai gen α-globin (ααα/ααα) hoặc
(αααα/αα) kết hợp với β-thalassemia thể nhẹ tạo thalassaemia thể trung gian
[8,24]. Tuy nhiên, khi thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình lâm sàng phụ
thuộc vào mức độ nghiêm trọng của đột biến β-thalassemia [10,62].
1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh
1.1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng
Trẻ bị thalassemia thể nặng sau hai tuổi bị nghi ngờ mắc bệnh βthalassemia với các biểu hiện thiếu máu nặng, vàng da, lách to. Trẻ bị
thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn. Với trẻ mang gen
bệnh thƣờng khơng có triệu chứng, đơi khi chỉ là thiếu máu nhẹ [22].
1.1.5.2 Chẩn đốn huyết học
Chỉ số hồng cầu: Bệnh nhân thalassemia thể nặng có nồng độ

hemoglobin (Hb) giảm (<7 g/dl), thể tích trung bình hồng cầu (MCV) trong
khoảng 50-60 fl và lƣợng hemoglobin trung bình trong một hồng cầu (MCH)
từ 14-20 pg. Bệnh nhân thalassemia thể trung bình có nồng độ Hb từ 6-10
g/dl, MCV từ 55-70 fl và MCH từ 15-23 pg. Bệnh nhân thalassemia thể nhẹ
có nồng độ Hb từ 9-15 g/dL đối với nam và 9-13 g/dL (đối với nữ), MCV từ
55-75 fL, MCH từ 19-25 pg (Bảng 1) [30].
Phân tích tế bào máu ngoại vi: Quan sát dƣới kính hiển vi, ngƣời bị
bệnh thalassemia có hồng cầu nhợt nhạt, nhỏ hơn so với bình thƣờng, phần
lớn có hình dạng bất thƣờng [13].
Phân tích hemoglobin: Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân
thalassemia hiện nay đều sử dụng phƣơng pháp phân tích các chỉ số hồng cầu
10


để sàng lọc ban đầu. Sau đó, sử dụng kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chromatography - HPLC) để phân tích hemoglobin trong
mẫu dựa trên các chỉ số MCV nhỏ hơn 78 fl và/hoặc MCH nhỏ hơn 27 pg
[19]. Tuy vậy, quy trình này khơng đƣợc sử dụng phổ biến ở vùng nông thôn
các khu vực Đông Nam Á, Nam Á do điều kiện vật chất và thiết bị khơng đủ.
Thay vào đó, tại các quốc gia nhƣ Thái Lan và Ấn Độ, việc sử dụng xét
nghiệm tủa HbE để sàng lọc HbE (Dichlorophenol Indophenol Test - DCIP)
là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia
[22].
Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của
cơ thể. Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF,
đƣợc tạo thành từ 2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2). Sau khi sinh,
chuỗi γ (HbF) khơng đƣợc tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β, tạo
hemoglobin ở ngƣời trƣởng thành gồm HbA1 với 2 chuỗi alpha globin và
beta globin (α2β2) và HbA2 với 2 chuỗi alpha globin và delta globin (α2δ2)
[11]. Trong điều kiện bình thƣờng, hồng cầu ngƣời trƣởng thành có khoảng

98% HbA1, 2% HbA2 và rất ít HbF [11]. Các trƣờng hợp bệnh β-thalassemia,
chuỗi β-globin không đƣợc tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ,
α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2. Đối với các trƣờng hợp
có đột biến Cd 26 gây thể HbE sẽ có hiện diện HbE≥25% trên điện di Hb
[11]. Do đó, HbA1, HbF, HbA2, HbE đƣợc coi là các tiêu chuẩn điện di
hemoglobin đóng vai trị quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia [11].
HbA2≥4,0% là chỉ số thƣờng đƣợc dùng để chẩn đoán β-thalassemia. Trƣờng
hợp HbA2≥4,0% và chỉ số hồng cầu giảm, đƣợc chẩn đoán là mang gen bệnh
β-thalassemia. Khi HbA2>4,0%, nhƣng chỉ số hồng cầu bình thƣờng, ngƣời
bệnh có thể thiếu vitamin B12/folate, bệnh gan hoặc nhiễm HIV. Các trƣờng
hợp có HbA2 từ 3,3-3,9% cần khẳng định bằng phân tích ADN. Tuy nhiên,

11


mức độ HbA2 và/hoặc chỉ số hồng cầu có thể bình thƣờng ở ngƣời bệnh βthalassemia có gen β-globin bị đột biến vùng promoter hoặc đuôi poly A. Khi
đỉnh HbA2>10%, ngƣời bệnh có thể có các biến thể hemoglobin khác, ví dụ
HbE, HbS,... [25]. Sơ đồ sàng lọc ngƣời lành mang gen bệnh β-thalassemia
đƣợc trình bày ở Hình 1.3.

Hình 1.3. Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia [14].
1.1.5.3 Phân tích di truyền phân tử
Hầu hết các kỹ thuật phát hiện các đột biến trên gen β-globin hiện nay
thƣờng dựa trên PCR, đƣợc chia thành hai nhóm chính: lai oligonucleotide
đặc hiệu allen và mồi đặc hiệu allen [23].

12


Lai oligonucleotide đặc hiệu allen (Allele - specific oligonucleotide

hybridization): Trong nhóm phƣơng pháp này, yêu cầu thiết kế hai đầu dị
oligonucleotide, một đầu dị bổ sung với trình tự ADN đột biến và một đầu dị
bổ sung với trình tự bình thƣờng tại cùng vị trí. Các đầu dị này thƣờng chỉ sai
khác nhau một nucleotide. Dựa trên nguyên tắc này, kỹ thuật lai điểm (dot
blot) đã đƣợc phát triển và áp dụng thành cơng ở nhiều phịng thí nghiệm. Tại
Địa Trung Hải năm 1989, kỹ thuật này đã đƣợc Ristaldi và cs. sử dụng để
sàng lọc 8 đột biến trên gen β-globin [48]. Trong kỹ thuật lai điểm, trình tự
ADN đích đƣợc cố định trên màng nylon, sau đó lai với đầu dò đƣợc đánh
dấu. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp sàng lọc nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm
gây tốn thời gian do các bƣớc lai và rửa cần riêng biệt đối với từng đột biến.
Do đó, kỹ thuật lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) đã đƣợc phát triển cho phép
phát hiện đƣợc đồng thời nhiều đột biến. Đầu dị đƣợc cố định trên màng
nylon, sau đó lai với ADN đƣợc đánh dấu. Các bƣớc lai và rửa đƣợc tiến hành
đồng thời đối với tất cả các đột biến [53].
Mồi đặc hiệu allen (Allele - specific priming): Nhóm phƣơng pháp
này dựa trên nguyên tắc mồi PCR bắt cặp hoàn tồn với khn sẽ có hiệu quả
kéo dài hơn so với mồi có nucleotide bắt cặp sai, đặc biệt tại đầu 3‟ [42].
Trong đó, ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) là
kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến tại nhiều quốc gia do các ƣu điểm nhanh, đơn
giản, ít tốn kém, có thể sàng lọc đƣợc nhiều đột biến trong một phản ứng [42].
1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY
MUTATION SYSTEM - PCR)
1.2.1 Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR
ARMS-PCR còn đƣợc gọi là PCR đặc hiệu allen (Allele-specific PCRASP) hay PCR khuếch đại allen đặc hiệu (PCR Amplification of Specific
Alleles-PASA), đƣợc sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến
13