khảo sát đặc tính của thực khuẩn thể aeromonas hydrophila phân lập từ ao nuôi cá tra tại tỉnh đồng tháp và an giang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA THỰC KHUẨN THỂ
Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI CÁ TRA
TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập-Tự do-Hạnh Phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Dương Hồ Diễm Trâm

MSHV: 1570774

Ngày sinh: 12/03/1993

Nơi sinh: Lâm Đồng

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

1.

Tên đề tài
KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA THỰC KHUẨN THỂ
Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ AO NUÔI CÁ TRA
TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ AN GIANG

2.

Nhiệm vụ và nội dung

- Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm (chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân) và xác định phổ xâm
nhiễm của các thực khuẩn thể đã phân lập sẵn.
- Khảo sát, đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể đơn
lẻ.
- Khảo sát, đánh giá việc phối trộn các thực khuẩn thể (phage cooktail) với nhau để
kiểm soát vi khuẩn.
- Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong môi
trường nước ao tiệt trùng.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, em
đã được học tập và nhận được sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cơ, điều đó đã giúp em
trang bị được nhiều kiến thức để có thể hồn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ
Chí Minh, các thầy cơ khoa Kỹ thuật Hóa học và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Công
nghệ Sinh học đã cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, đã nhiệt tình chỉ dạy và
tạo mọi điều kiện để em có thể tiến hành luận văn thuận lợi.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy hướng dẫn - TS. Hồng Anh Hồng
đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn đến chị Yến, chị Xuân, bạn Tâm , và các thành viên phòng 107B2 đã cùng
đồng hành và chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
(Nafosted) đã hỗ trợ kinh phí thực hiện thơng qua đề tài mã số 10/2019/TN
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln là chỗ dựa tinh thần vững chắc. Một lần
nữa, xin chân thành cảm ơn!


TĨM TẮT
Trong những năm gần đây, ngành ni trồng thủy sản ở Đồng bằng Sông Cửu
Long (ĐBSCL) đang là ngành rất phát triển và có đóng góp đáng kể trong kim ngạch
xuất khẩu. Cá tra là một trong những đối tượng cá ni nước ngọt chủ lực của ĐBSCL
nói chung và Đồng Tháp, An Giang-là 2 tỉnh có sản lượng ni cá tra lớn nhất ở ĐBSCL
nói riêng.
Theo thống kê của chi cục Thủy sản Đồng Tháp và An Giang, diện tích cá tra
tồn tỉnh Đồng Tháp là khoảng 2.450 ha và diện tích thả ni cá tra tồn tỉnh An Giang
hơn 1200 ha. Bên cạnh đó, theo thống kê thì sản lượng cá tra tăng đều qua mỗi năm do
nhu cầu sử dụng số lượng cá tra tăng mạnh dẫn đến tình hình dịch bệnh trên cá tra đang

ngày càng gia tăng và gây ra nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người dân. Trong khi
việc sử dụng kháng sinh khơng cịn mang lại hiệu quả cao, bên cạnh đó còn mang lại
nhiều tác hại nghiêm trọng. Lúc này, liệu pháp thực khuẩn thể xuất hiện như một liệu
pháp đầy tiềm năng và an toàn trong việc thay thế kháng sinh được sử dụng để phòng
và trị bệnh cho cá tra.
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính các phage xâm nhiễm
đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra đã được phân
lập sẵn trong nghiên cứu trước. Sau khi khảo sát, chúng tôi thấy chu kỳ xâm nhiễm nằm
trong khoảng 40-65 phút. Hệ số nhân thuộc khoảng 44-190. Tiếp theo, các phage được
khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn đích trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn,
khả năng ức chế được khảo sát riêng rẽ hoặc kết hợp các phage với nhau. Bằng việc đo
OD600, khả năng ức chế được thể hiện trong khoảng 7-7,5 giờ. Ngoài ra khả năng ức
chế vi khuẩn của thực khuẩn thể cũng được thực nghiệm trong môi trường nước ao tiệt
trùng. Khả năng ức chế của thực khuẩn thể được thể hiện tốt trong 48 giờ khảo sát. Đây
được xem là những kết quả ban đầu quan trọng nhằm đưa liệu pháp thực khuần thể vào
trong phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra.


ABSTRACT
In recent years, the aquaculture industry in the Mekong Delta (Mekong DELTA)
is a very developed industry and has contributed significantly in export turnover. Catfish
is one of the major freshwater fish objects of the Mekong DELTA in general and Dong
Thap, An Giang-is the two provinces with the largest aquaculture production in the
Mekong DELTA in particular.
According to the statistics of Dong Thap and An Giang Fisheries Department,
the area of fish of Dong Tower is about 2,450 hectares and fish breeding area of An
Giang province more than 1200 ha.In addition, according to statistics, the production of
fish is increased through each year due to the need to use a strong increase in the number
of individuals resulting in the disease situation on the catfish is increasing and causing
serious damage to people. While the use of antibiotics no longer delivers high

efficiency, it also provides serious harm. At this, bacteriological therapy may appear as
a potential and safe therapy in the replacement of antibiotics used for prevention and
treatment of fish.
In this study, we conduct an active survey of infectious phages for the bacteria
Aeromonas Hydrophila-causing hemorrhagic disease on the already isolated catfish in
the previous study. Latent period of three phages were about 40 to 65 minutes. Burst
size of these phages were about 44-190. Secondly, inactivation of host bacteria by single
phage or cocktail of phages were evaluated. By measuring OD600, inactivation was
shown for 7-7,5 hours. In addition, the challenge was conduted in sterilize pond water
and inactivation was well shown for 48 hours. These are considered important advances
in prevention and treatment of hemorrhagic disease on fish.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học, thực nghiệm của thầy hướng dẫn bộ môn và các số liệu, kết quả
mà tôi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ
cơng trình nào trước đây.

Tác giả

DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... 3
TÓM TẮT ..................................................................................................................... 4
ABSTRACT .................................................................................................................. 5
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... 6

MỤC LỤC ...................................................................................................................... 7
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... 1
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................ 3
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... 4
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 6
1.1.

Tổng quan tình hình ni cá tra ở Việt Nam .................................................... 6

1.2.

Cá tra ................................................................................................................. 7

1.3.

Bệnh xuất huyết trên cá tra ............................................................................... 9

1.4.

Các phương pháp phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra ............................ 10

1.4.1.

Sử dụng thuốc kháng sinh ........................................................................ 10

Cơ chế tác động của kháng sinh ............................................................................ 11
Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn A.hydrophila ...................................... 11
Thực khuẩn thể .......................................................................................................... 13
1.4.2.

Phân loại thực khuẩn thể .......................................................................... 14

1.4.3.

Cấu tạo của phage .................................................................................... 15

1.4.4.

Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn: .............................. 16

1.4.5.

Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản............. 16

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................... 19
Vật liệu ............................................................................................................... 19


Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 20
Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn A.hydrophila trong môi trường nước ao ... 26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................. 27
Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila của các thực khuẩn thể
đã phân lập .................................................................................................................... 27
Khảo sát phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể đối với một số vi khuẩn khác ..... 29
Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn
sử dụng thực khuẩn thể riêng lẻ.................................................................................... 31
Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn
sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể................................................................................... 35
Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện mơi trường dinh dưỡng chuẩn

sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể................................................................................... 37
Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong
môi trường nước ao tiệt trùng. ...................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 41
4.1.

Kết luận ........................................................................................................... 41

4.2.

Kiến nghị ......................................................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 42
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 43


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐBSCL

: Đồng bằng Sông Cửu Long

LB

: Môi trường Luria-Bertani

TSB

: Môi trường Tryptic Soy Broth

MOI

: Multiplicity of infection - Tỷ lệ giữa số
lượng thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn

VK

: Vi khuẩn

CFU

: Colony-Forming Unit

PFU

: Plaque-Forming Unit

VTS

: Viện thủy sản

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

1


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm
Hình 1.2. Hình thái cá tra
Hình 1.3. Vi khuẩn A. hydrophila
Hình 1.4. Dấu hiệu cá bị xuất huyết

Hình 1.5. Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn
Hình 1.6. Ảnh hiển vi điện tử các phage bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn (trái); hình
mặt cắt (giữa) và hình dạng ngồi phage T2
Hình 1.7. Sự nhân lên của phage T4
Hình 2.1. Tỉ lệ thực khuẩn thể tương đối theo thời gian
Hình 3.1. Sơ đồ biều thị hệ số nhân của các phage được khảo sát
Hình 3.2. Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas hydrophila A1
Hình 3.3. Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas hydrophila VTS, Edwardsiella ictaluri E1,
Edwardsiella ictaluri E2, Edwardsiella ictaluri E3, Edwardsiella ictaluri E4,
Edwardsiella ictaluri VTS, Aeromonas sorbia VTS, Aeromonas veronii VTS
Hình 3.4. Phổ xâm nhiễm trên Aeromonas dhakensis
Hình 3.5. Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4
Hình 3.6. Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 2.3
Hình 3.7. Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 4.6
Hình 3.8. Biến thiên giá trị OD600 của pAG 10.1
Hình 3.9. Hình điện di chạy chủng kháng thực khuẩn thể của 4 phage được khảo sát
Hình 3.10. Kết quả “Spot test” của mẫu đối chứng A. hydrophila
Hình 3.11. Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pĐT 1.4 (pĐT 1.4R)
Hình 3.12. Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pĐT 2.3 (pĐT 2.3R)
Hình 3.13. Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pĐT 4.6 (pĐT 4.6R)
Hình 3.14. Kết quả “Spot test” của mẫu chủng kháng pAG 10.1 (pAG 10.1R)
Hình 3.15. Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4 và pĐT 2.3
Hình 3.16. Biến thiên giá trị OD600 của pĐT 1.4 và pĐT 4.6
Hình 3.17. Biến thiên OD600 của các nghiệm thức theo thời gian khảo sát

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

2

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của cá tra
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng một số loài cá
Bảng 1.3. Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)
Bảng 1.4. Tỷ lệ phần trăm (%) kháng, nhạy của dòng A. hydrophila trên 15 loại kháng
sinh
Bảng 1.5. Bảng phân loại thực khuẩn thể
Bảng 1.6. Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trên bệnh thủy sản
(Richards GP, 2014)
Bảng 2.1. Các phage đã được phân lập sẵn của 2 tỉnh Đồng Tháp và An Giang.
Bảng 2.2. Ví dụ bảng tính số lượng thực khuẩn sinh ra theo thời gian
Bảng 2.3. Danh sách các chủng vi khuẩn dùng để khảo sát
Bảng 3.1. Chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) các phage.
Bảng 3.2. Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) các
phage.

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

3


MỞ ĐẦU
Cá tra là một trong những đối tượng cá ni nước ngọt chủ lực của ĐBSCL nói
chung và Đồng Tháp, An Giang là 2 tỉnh có sản lượng ni cá tra lớn nhất ở ĐBSCL
nói riêng.
Theo thống kê của hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sàn Việt Nam (Vasep),
tổng diện tích canh tác 5.400 ha (năm 2018) tăng 3,3% so với năm 2017, sản lượng đạt
1,42 triệu tấn, tăng 8,4% so với năm 2017.
Chính vì thế, do nhu cầu sử dụng số lượng cá tra tăng mạnh qua mỗi năm dẫn
đến tình hình dịch bệnh trên cá tra đang ngày càng gia tăng và gây ra nhiều thiệt hại

nghiêm trọng cho người dân. Trong q trình ni, người dân đã sử dụng kháng sinh để
điều trị các hầu hết các bệnh nhiễm khuẩn trên thủy sản.Tuy nhiên, việc sử dụng kháng
sinh lâu dài với liều lượng cao không những gây tồn dư lượng kháng sinh trong thủy
sản và mơi trường mà cịn tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh
phát triển.
Vào thập niên đầu thế kỉ XIX, thực khuẩn thể (phage) trong điều trị bệnh nhiễm
trùng đã được quan tâm đến nhưng thời điểm kháng sinh đầu tiên được tìm thấy vào
1940, nghiên cứu về phage chậm lại, nhường chỗ cho nghiên cứu kháng sinh. Nhưng
đến thời điểm con người nhận ra rằng kháng sinh không phải là phương pháp tốt nhất
để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh thì khuynh hướng sử dụng phage trong phòng trị bệnh
lại được nghiên cứu trở lại với tên gọi là liệu pháp phage . Điểm đặc biệt của liệu pháp
này là phage có tính đặc hiệu kí chủ, tác động chọn lọc vào vi khuẩn đích Aeromonas
hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết chính trên cá tra, do đó việc phân lập và xác
định được một số đặc tính liên quan đến thực khuẩn thể xâm nhiễm đối với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra chính là bước đầu tiên trong việc ứng dụng
liệu pháp thực khuẩn thể trong thực tế.
Bệnh xuất huyết hay còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu do
vi khuẩn Aeromonas hydrophila ở cá. Tại Việt Nam, bệnh được ghi nhận trước năm
1993. Hiện nay, bệnh xuất hiện ở khắp các vùng nuôi cá nước ngọt và gây thiệt hại lớn
về kinh tế cho người nuôi ở các tỉnh ĐBSCL. Hiện nay việc điều trị bệnh xuất huyết
trên cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn chủ yếu dựa vào kháng sinh. Tuy nhiên,
HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

4


việc sử dụng kháng sinh vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ dẫn đến xuất hiện ngày
càng nhiều các vi khuẩn kháng một hoặc thậm chí nhiều loại kháng sinh, gây nhiều khó
khăn trong q trình điều trị. Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị an tồn và hiệu quả
lâu dài thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay.

Với nhiều ưu điểm và an toàn cho đối tượng sử dụng cũng như là đối tượng được
sử dụng, liệu pháp thực khuẩn thể đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng
và điều trị bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra (Richards GP, 2014). Thực
khuẩn thể là những virus chỉ xâm nhiễm đặc hiệu vi khuẩn. Tuy nhiên, liệu pháp thực
khuẩn thể trong phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá tra còn chưa được nghiên cứu
nhiều. Do đó, đây chính là động lực cho tơi thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc tính của
thực khuẩn thể Aeromonas hydrophila phân lập từ ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng
Tháp và An Giang.”
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
Khảo sát đặc tính thực khuẩn thể và một số yếu tố liên quan nhằm hướng tới phát
triển liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra do vi khuẩn
Aeromonas hydrophila gây ra tại An Giang và Đồng Tháp.
Nội dung nghiên cứu:
- Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm (chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân) và xác định
phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể đã phân lập sẵn.
-Khảo sát, đánh giá khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn
thể đơn lẻ.
- Khảo sát, đánh giá việc phối trộn các thực khuẩn thể (phage cooktail) với nhau
để kiểm soát vi khuẩn.
- Khảo sát khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh sử dụng thực khuẩn thể trong
môi trường nước ao tiệt trùng.

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

5


1.1.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Tổng quan tình hình ni cá tra ở Việt Nam
Nghề nuôi cá tra thương phẩm ở ĐBSCL bắt đầu xuất hiện từ những năm của

thập niên 1950 với quy mô nhỏ và cá nuôi chủ yếu là dựa vào nguồn cá giống sẵn có
trong tự nhiên. Tuy nhiên, từ cuối thập niên 1990 nghề nuôi cá tra đã phát triển vượt
bậc do sự thành công trong việc sản xuất giống nhân tạo loài cá này cùng với các hệ
thống và phương pháp nuôi đa dạng như từ ni bè cho đến ni trong ao đất.
Theo ước tính của Tổng cục Thủy sản, năm 2018, diện tích ni cá tra toàn vùng
ĐBSCL đạt 5.400 ha (tăng 3,3% so với năm 2017), sản lượng đạt 1,42 triệu tấn, tăng
8,4% so với 2017. An Giang và Đồng Tháp là những vùng nuôi lớn nhất cá tra ở Đồng
bằng sông Cửu Long, chiếm hơn 75% tổng sản lượng cá tra cả nước.

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

6


Hình 1.1. Tình hình xuất khẩu cá tra qua các năm
Đáng chú ý , hai tỉnh Đồng Tháp và An Giang được xem là nơi nuôi và xuất khẩu
cá tra lớn của ĐBSCL. Mặt khác, Đồng Tháp còn là tỉnh có diện tích ni cá tra lớn
nhất cả nước (chiếm trên 40% tổng diện tích cả nước). Sản lượng cá tra quý I/2019 tại
Đồng Tháp ước đạt 80.298 tấn, tăng 2,4%, diện tích sử dụng 1,377 ha và An Giang ước
đạt 81.583 tấn, tăng 11,3%, diện tích sử dụng 284 ha.
1.2.

Cá tra
Cá tra là loài cá kinh tế phổ biến nhất khu vực châu Á, là một trong 30 loài cá

thuộc họ Pangasiidae. Tên loài Pangasianodon hypopthalmus được Rainboth W.J sử
dụng lần đầu tiên vào năm 1996 để chỉ định cho lồi cá Tra và sau đó được nhiều tác

giả sử dụng phổ biến đến nay (Nguyễn Văn Thường, 2008).
Đặc điểm hình thái:
- Cơ thể dẹp theo chiều hơng.
- Vi lưng ngắn với 1-2 gai cứng.
- Vi mỡ khá phát triển.
- Vi hậu mơn dài.
- Có hai đơi râu hàm.

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

Hình 1.2. Hình thái cá tra

7


- Lược mang phát triển.
- Có cấu tạo miệng trước.
- Có bong bóng khí một thùy.
Tình hình dịch bệnh trên cá tra
Với xu hướng thâm canh trong nghề nuôi cá tra thì bệnh cá xảy ra là điều khó có
thể tránh khỏi. Cá tra dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bênh cho
cá gồm 2 nhóm: bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và bệnh không
truyền nhiễm do môi trường.
Một số bệnh thường gặp ở cá tra:
Bảng 1.1. Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)
Tên bệnh

Xuất huyết

Nguyên nhân

VK Aeromonas
hydrophila

Dấu hiệu bệnh lý
Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, chung
quanh miệng và nắp mang, phía mặt
bụng.
Da bị mất màu, bụng căn to và mắt hơi

Gan thận mủ

VK Edw. ictaluri

lồi, khi mổ ra thì gan, thận, tỳ tạng có
nhiều đốm trắng.

Tuột nhớt

VK Flexibacter

Phù đầu

Trắng mang,
trắng gan

Vàng da

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

colummaris

Môi trường

Đầu tiên xuất hiện một đốm trắng ở đi,
sau đó lan về phía trước thân và cuối
cùng cả đoạn thân sau đều có màu trắng.
Phần đầu bị phù, mắt thường lồi ra, da
nhợt nhạt.
Cá thường nổi đầu bơi lờ đờ trên mặt

Môi trường

nước, bỏ ăn, xuất huyết nhẹ ngồi da,
mang nhợt nhạt.

Mơi trường

Cá bỏ ăn, bơi lảo đảo, da cá có màu vàng
tái nhạt hoặc vàng nghệ.

8


1.3.

Bệnh xuất huyết trên cá tra
Tại Việt Nam bệnh xuất huyết hay còn được gọi là bệnh đốm đỏ (Huizinga và

cs., 1979), bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ hoặc bệnh nhiễm trùng máu được ghi nhận trước năm
1993, là một trong những bệnh có tần số xuất hiện cao nhất trên cá tra ni. Bệnh lây
lan nhanh, tỷ lệ chết có thể lên đến 90% trong trường hợp bệnh nặng. Ở ĐBSCL, bệnh

xuất hiện hầu như quanh năm, phổ biến nhất là mùa khô, lúc bị sốc do vận chuyển, ao
nuôi có hàm lượng nitrite và ammonia cao, oxy hồ tan thấp. Bệnh có thể xuất hiện ở
tất cả giai đoạn phát triển của cá tra nuôi.
Tác nhân gây bệnh: là do vi khuẩn Aeromonas hydrophila, loài vi khuẩn đặc
thù vùng nước ngọt. Vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn đầu trịn, khuẩn lạc hình trịn
lồi, màu kem, đường kính 2-3 mm. A. hyrophila thuộc nhóm Aeromonas và là tác nhân
chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng huyết (MAS). Trong điều kiện bình thường,
A. hydrophila khơng gây bệnh đối với các sinh vật sống, nhưng khi môi trường ô nhiễm,
cá bị stress, thay đổi sinh lý đột ngột hay bị nhiễm những mầm bệnh khác thì
A. hydrophila là tác nhân gây bệnh tiềm tàng (Plumb và cs., 1976; Fang và cs., 2000).
Phân loại vi khuẩn A. hydrophila:
- Giới (regnum): Bacteria
- Ngành (phylum): Proteobacteria
- Lớp (class): Gamma Proteobacteria
- Bộ (ordo): Aeromonadales
- Họ (familia): Aeromonadaceae
Hình 1.3. Vi khuẩn A. hydrophila
- Chi (genus): Aeromonas
- Lồi (species): A. hydrophila
Vi khuẩn A. hydrophila không sinh bào tử, thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-), thân
trắng, dạng hình que ngắn, di động nhờ một tiên mao. Vi khuẩn có kích thước 0,5x11,5 um. Trên mỗi mơi trường ni cấy khác nhau, thể hiện đặc tính khác nhau
( Boulanger và cs., 1977). Trên môi trường đặc hiệu, môi trường thạch máu có bổ sung

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

9


kháng sinh ampicillin và máu cừu, khuẩn lạc mọc trên mơi trường này có màu trắng
đục, có khả năng gây dung huyết trên thạch máu do cơ chế độc lực của nó. Cịn trên

mơi trường LB, khuẩn lạc bóng, trong, có màu nâu nhạt (Baba và cs., 1988).
A. hydrophila có thể tồn tại và tồn tại trong bất kì mơi trường nào, điều kiện chịu nhiệt
rất cao, lên tới 42oC.
Dấu hiệu bệnh lý bệnh xuất huyết và các biến đổi mơ học:

Hình 1.4. Dấu hiệu cá bị xuất huyết
Bệnh xuất huyết là một trong những bệnh có tần số xuất hiện cao nhất trên cá tra
nuôi. Cá bị nhiễm bệnh xuất huyết thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh nhẹ hay
nặng. Bệnh xuất huyết trên cá tra thường có các biểu 4 hiện đặc trưng như xuất hiện các
đốm xuất huyết (petechial haemorrhage) ở da, tập trung nhiều ở gốc vây, xung quanh
miệng, hầu, hậu môn. Bên cạnh đó, bụng cá phình to, bên trong chứa dịch màu vàng
hoặc màu hồng. Các nội tạng như bóng hơi, ruột, tuyến sinh dục cũng xuất huyết. Ngoài
ra, gan tái nhạt, thận và tỳ tạng xưng to, mềm nhũn, màu đỏ sậm (Ly và cs., 2009;
Crumlish và cs., 2010; Từ Thanh Dung và cs., 2015).
1.4.

Các phương pháp phòng và trị bệnh xuất huyết trên cá tra
1.4.1. Sử dụng thuốc kháng sinh
Kháng sinh là 1 hợp chất được sản xuất bởi sinh vật mà ở nồng độ thấp có thể

ức chế hoặc giết chết sinh vật khác. Thuật ngữ kháng sinh đôi khi được sử dụng với tên
gọi khác là chất kháng khuẩn (antimicrobial agents). Kháng sinh có thể là các chất tự
nhiên, bán tổng hợp hoặc là các chất hoàn toàn tổng hợp nhưng chúng gây ít hoặc khơng
làm tổn thương tế bào chủ. Các kháng sinh có tác dụng làm ngừng sự sinh trưởng của
vi khuẩn hoặc nấm được gọi là chất kiềm khuẩn (bacteriostatic agents) hoặc giết chết
chúng, gọi là chất diệt khuẩn (bactericidal agents) (Prescott và cs, 2000; Walsh, 2003).
HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

10

Cơ chế tác động của kháng sinh
Theo Tenover (2006) và Levy, Marshall (2004) kháng sinh tác động lên tế bào
vi khuẩn theo 1 số cơ chế chủ yếu sau:
- Can thiệp vào q trình tổng hợp vách tế bào (nhóm β-lactam: penicillin,
ampicillin,amoxicillin, cephalosporin, monobactams; nhóm glycopeptide: vancomycin,
teicoplanin)
- Ức chế sinh tổng hợp protein (nhóm macrolide, chloramphenicol, clindamycin,
quinupristin-dalfoppristin, linezolid)
- Can thiệp vào q trình tổng hợp acid nucleic (nhóm flouroquinolone và
rifampin)
- Ức chế q trình biến dưỡng acid folic (nhóm sulfonamide, trimethoprim và
nhóm đồng phân của acid folic)
- Kháng sinh có thể phá hủy cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm (các kháng
sinh polymyxin và daptomycin).
Một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến hiện nay: Amoxicillin,
Ampicillin, Cephalosporin, Tetracylin, Quinolon…(Vũ Tiến Dũng, 2013).
Cho đến nay, thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một các phổ biến để phòng trị bệnh vi
khuẩn trong nuôi thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới.
Trường hợp cá giống bị bệnh xuất huyết, trị bằng thuốc kháng sinh và đưa thuốc
vào cơ thể cá bằng đường miệng (trôṇ thuốc vào thức ăn) chỉ có kết quả khi cá mới
chớm bệnh. Phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm là rất quan trọng trong điều trị; khi cá bệnh
nặng, cá sẽ ăn ít hoăc ̣ bỏ ăn nên việc điều trị thường sẽ khơng mang lại kết quả. Bên
cạnh đó, việc sử dụng thuốc kháng sinh còn thiếu những quy định chặt chẽ trong giấy
phép sử dụng và cần có sự thống nhất về những quy định quốc tế trong nuôi trồng thủy
sản. Do đó việc điều trị bằng thuốc kháng sinh chưa mang lại hiệu quả tối ưu và tiết
kiệm về mặt thời gian.
Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila
Nghiên cứu gần đây của Quách Văn Cao Thi và cs (2014) về khả năng kháng thuốc của
30 chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ các ao nuôi ở ĐBSCL được thể hiện trong

bảng 1.2 dưới đây:

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

11


Bảng 1.2. Tỷ lệ phần trăm (%) kháng, nhạy của dòng A. hydrophila trên 15 loại kháng
sinh
Thuốc kháng sinh

Kháng (%)

Nhạy
(%)

Ampicillin

26.7

70

Amoxicillin

30

66.7

Cefalexin

46.7

46.7

Cefotaxim

43.3

40

Ciprofloxacin

30.3

36.7

Enrofloxacin

80

13.3

Norfloxacin

46.7

23.3

Doxycyclin

26.7

50

Tetracyclin

26.7

6.67

Florfenicol

93.3

6.67

Chloramfenicol

90

6.67

Neomycin

43.3

33.3

Gentamycin

46.7

40

Streptomycin

80

13.3

Trimethoprim/
sunfamethoxazol

100

0

Vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao với kháng sinh doxycyclin, cefotaxim và
ciprofloxacin (>80%) và norfloxacin (66,7%). Tuy nhiên, vi khuẩn này kháng cao với
các kháng sinh tetracyclin (93,3%), florfenicol (63,3%) và kháng hoàn toàn với kháng
sinh trimethoprim/sunfamethoxazol, cefalexin và các kháng sinh thuộc nhóm penicillin.
Đặc biệt hầu hết tất cả 15 loại thuốc kháng sinh, vi khuẩn A. hydrophila đều thể hiện
sự đa kháng thuốc.
Ngoài ra, sự kháng thuốc của vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra ở khu vực
ĐBSCL cũng được nhiều tác giả nghiên cứu. Nghiên cứu của Từ Thanh Dung và cs,
(2004) cho thấy vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang, Cần Thơ,
HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

12

Đồng Tháp và Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracyline, oxolinic acid và sulfonamide.
Kết quả nghiên cứu của Phạm Thanh Hương (Phạm Thanh Hương và cs., 2010) cũng
cho thấy tỷ lệ kháng streptomycin cao của vi khuẩn A. hydrophila là 55,7%. Điểm đặc
biệt, nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam Kha (2012) cũng ghi nhận 92,4% vi khuẩn
Aeromonas phân lập từ cá tra ở ĐBSCL đa kháng thuốc. Sự kháng thuốc và khả năng
kháng thuốc của vi khuẩn A. hydrophila đang diễn biến rất phức tạp và ảnh hưởng đến
hiệu quả việc điều trị bệnh vi khuẩn trên cá tra nói riêng và trong ni trồng thủy sản
nói chung. Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh đang ngày càng
trở nên cấp bách hiện nay.
1.4.2. Thực khuẩn thể
Thực khuẩn thể (phage) là những thể phong phú nhất trên trái đất, thực khuẩn
thể là một phần quan trọng góp phần ổn định quần thể vi sinh vật, chúng cũng rất linh
hoạt và có khả năng thích nghi với rất nhiều ứng dụng. Thực khuẩn thể là loại virus xâm
nhiễm vi khuẩn, sự sao chép của chúng phụ thuộc vào việc sử dụng các vật liệu di truyền
từ tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm.
Twort (1877-1950) đã quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc trong suốt phát triển
trên bề mặt nuôi cấy vi khuẩn. Khi chuyển các khuẩn lạc trong suốt sang bề mặt vi
khuẩn mới cũng tạo ra các khuẩn lạc trong suốt tương tự. Sau khi kiểm tra vi khuẩn từ
các khuẩn lạc trong suốt, Twort nhận thấy rằng vi khuẩn đã phân hủy thành những mảnh
nhỏ và ông đã đưa ra giả thuyết rằng các virus truyền nhiễm nhỏ hơn vi khuẩn đã gây
ra sự phân hủy vi khuẩn (Summers, 2005). D'Herelle quan sát thấy những gì mà ơng
gọi là "bacteriophage" đã gây ra sự ly giải, hoặc vỡ vi khuẩn trong chất lỏng cũng như
trong các đốm rõ ràng trên thạch, ông cho rằng bacteriophage là ký sinh trùng của vi
khuẩn. Các nghiên cứu của ông cũng cho thấy rằng các tế bào bacteriophage cần các tế
bào chủ (vi khuẩn) để tăng sinh. Sáng chế của kính hiển vi điện tử trong những năm
1940 cho phép các nhà khoa học quan sát các vi khuẩn và quan hệ giữa các thực khuẩn
thể và vi khuẩn, chứng minh rằng các lồi thực khuẩn thể có các hình thái khác nhau và
các tế bào thực khuẩn thể chứa DNA. Năm 1952, Hershey và Chase cho thấy rằng khi
một tế bào chủ gắn vào một tế bào chủ, DNA của nó sẽ được tiêm vào tế bào và lớp

protein của chúng không vào tế bào chủ (Summers, 2005).

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

13


Hình 1.5. Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn
1.4.3. Phân loại thực khuẩn thể
Dựa vào kiểu gen và hình thái, Ủy ban quốc tế về phân loại virus (International
Committee on Taxonomy of Viruses hay ICTV) đã xếp thực khuẩn thể vào 10 họ.
Bảng 1.3. Bảng phân loại thực khuẩn thể
Họ

Hình thái vỏ
capsid

Đặc trưng

Kiểu gen

Ví dụ

Myoviridae

Khối 20 mặt

Có đi ( có thể co rút)

dsDNA, thẳng

T4

Siphoviridae

Khối 20 mặt

dsDNA, thẳng

λ

Podoviridae

Khối 20 mặt

dsDNA, thẳng

T7

Tectiviridae

Khối 20 mặt

dsDNA, thẳng

PRD1

Corticoviridae

Khối 20 mặt

dsDNA, vịng

PM2

Plasmaviridae
Microviridae

Đa hình
Khối 20 mặt

dsDNA, vịng
ssDNA, vịng

L2
X174

Inoviridae

Hình sợi

ssDNA, vịng

M13

Cystoviridae

Khối 20 mặt
Khối 20 mặt

dsRNA, thẳng,
phân đoạn
ssRNA, thẳng

6

Leviviridae

Có đi (dài khơng co
rút)
Có đi (ngắn khơng có
rút)
Có màng trong phía
trong vỏ capsid
Có màng trong phía
trong vỏ capsid
Có màng bao
Khơng có màng bao
Dài, linh động hoặc
ngắn, khơng linh động
Có màng bao, có nhiều
lớp
Khơng có màng bao

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

MS2
14

1.4.4. Cấu tạo của phage
 Cấu trúc: phage có 3 dạng cơ bản :
- Cấu trúc hình khối khơng đi.
- Cấu trúc hình khối có đi.
- Cấu trúc dạng sợi hay dạng que.
Đối với dạng có đi (chẳng hạn phage T4) gồm đầu hình lục giác, cổ, đi có
dạng hình trụ, cuối đi có các sợi lơng như chân để bám vào vi khuẩn và đĩa gốc với
6 sợi lông đi.
 Thành phần hóa học gồm:
- ADN: có hầu hết ở các phage, thường có 2 chuỗi xoắn vào nhau, một số có ADN
một chuỗi, những phage khơng chứa ADN thì chứa ARN và thường ARN một
chuỗi.
- Protein: vỏ capsid được cấu tạo bằng những đơn phân gọi là capsome, chính là
những hạt protein.
- Enzyme: ở đi của phage có chứa một số loại enzyme.

Hình 1.6. Ảnh hiển vi điện tử các phage bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn
(trái); hình mặt cắt (giữa) và hình dạng ngồi phage T4.

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

15


1.4.5. Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn:

Hình 1.7. Sự nhân lên của phage T4
Sự nhân lên của phage trong vi khuẩn thường diễn ra theo các giai đoạn sau:
Giai đoạn hấp phụ và xâm nhập: Muốn xâm nhập và nhân lên trong vi khuẩn,
trước hết phage phải tìm thấy chỗ tiếp nhận đặc hiệu trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Nhiều

nghiên cứu cho thấy khi vi khuẩn biến dị, thay đổi tính chất bề mặt thì phage khơng có
khả năng xâm nhập vào vi khuẩn. Khi đã bám vào bề mặt tế bào vi khuẩn, enzyme ở
đuôi của phage sẽ làm tan vách (thành) tế bào vi khuẩn, sau đó đi co bóp đẩy lõi của
đuôi vào vi khuẩn, tiếp theo DNA của phage sẽ được bơm vào tế bào vi khuẩn. Vỏ
capsid sẽ ở lại ngoài vi khuẩn.
Giai đoạn sinh tổng hợp các thành phần : Sau 2-3 phút, enzyme
deoxyribonuclease của phage xuất hiện phá hủy DNA của tế bào vi khuẩn, mRNA và
kèm theo hàng loạt enzym cần thiết cho phage được tổng hợp. DNA của phage được
hình thành cùng với protein (tạo vỏ capsid) của phage được tổng hợp ở ribosome của tế
bào chủ.
Giai đoạn lắp ghép và giải phóng: Các thành phần DNA lắp ghép với protein
tạo thành phage. Các phage mới được hình thành sau thời gian khoảng 12 phút và sự
giải phóng phage mới thường xảy ra ở phút thứ 25. Trung bình mỗi vi khuẩn có thể giải
phóng từ 100 đến vài trăm phage.
1.4.6. Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản
Liệu pháp thực khuẩn thể (liệu pháp phage) là việc sử phage để điều trị bệnh do
vi khuẩn. Liệu pháp phage có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y học con người cũng
như trong thú y và nông nghiệp. Chỉ số điều trị của phương pháp phage rất cao vì ít có

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

16


tác dụng phụ. So với việc sử dụng liệu pháp kháng sinh, liệu pháp phage có nhiều ưu
điểm (Richards GP, 2014):
(1) Tính đặc hiệu, phage tấn cơng một cách đặc hiệu cao với từng lồi, thậm chí
từng chủng vi khuẩn riêng biệt, giúp giảm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong ruột cá
cũng như các vi khuẩn tự nhiên khơng phải chủng đích.
(2) Hạn chế sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn.

(3) Một ưu điểm khác của phage so với kháng sinh là chúng có thể tự nhân lên,
cũng như tự hạn chế số lượng. Chúng nhân lên nhanh chóng theo cấp số mũ như vi
khuẩn và giảm dần khi lượng vi khuẩn giảm. Tùy trường hợp điều trị đôi khi chỉ cần
dùng 1 liều nhỏ ban đầu, chúng sẽ nhân lên thông qua các tế bào vi khuẩn mà khơng
cần tiêm nhắc lại.
(4) Bởi phage có nguồn gốc tự nhiên, rất đa dạng và phong phú nên hạn chế đáng
kể khó khăn trong việc phê chuẩn và cấp giấy phép sử dụng so với kháng sinh.
(5) Khả năng chống chịu cao của phage với điều kiện môi trường khác nhau.
Phage được tìm thấy trong mơi trường có sự hiện diện của vi khuẩn đích, kể cả những
nơi có điều kiện khắc nhiệt như nhiệt độ cao, hay mơi trường có tính acid cao. Ngồi
ra, khả năng thích nghi của chúng còn cao hơn vi khuẩn.
(6) Phage giảm dần sau khi tiêu diệt chủng vi khuẩn đích, và được thải ra ngồi
mơi trường mà khơng gây bất kì rủi ro nào.
(7) Sản xuất nhanh, linh động và rẻ tiền. Phage được sản xuất thơng qua q trình
lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn đặc hiệu chỉ trong vài giờ, và khơng cần sử dụng hóa
chất đắt tiền.
Liệu pháp phage đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng và điều trị
bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra. Bảng dưới đây là một số các nghiên
cứu ứng dụng liệu pháp phage:

HVTH: DƯƠNG HỒ DIỄM TRÂM

17