Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng

..

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.

Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Sinh viên thực hiện luận văn

Trần Thanh Thảo


ỜI C M

N

Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ
TP. HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường. Em cũng xin chân
thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của tồn thể q thầy cơ Viện Khoa học Ứng dụng
Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã cho chúng em những kiến thức quan
trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá
để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho
em những kiến thức bổ ích và ln theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời
hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất. Cô
luôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm
vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được.

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự
bình n trong tâm hồn, ln bên em những lúc khó khăn. Em cũng xin được cảm ơn
tới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Cuối c ng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian
đọc và nhận x t đồ án tốt nghiệp này. Em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe va.
Trong quá tr nh làm đồ án, do kinh nghiệm c n thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có
nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cơ bỏ qua.

Sinh viên thực hiện
Trần Thanh Thảo


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... v
DANH MỤC B NG ......................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................vii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯ NG I: TỔNG QUAN .......................................................................................... 6
1.1.Tổng quan về nấm ...................................................................................................... 6
1.1.1.Tổng quan về Aspergillus sp. .................................................................................. 6
1.1.1.1.Phân loại khoa học ............................................................................................... 6
1.1.1.2.Đặc điểm hình thái ............................................................................................... 7
1.1.1.3.Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng ................................................................... 7
1.1.2.Tác hại của độc tố Aflatoxin ................................................................................... 8
1.1.2.1.Tác hại của nấm gây ra cho con người ................................................................ 9
1.1.2.2.Tác hại của nấm gây ra cho động vật ................................................................... 9
1.1.3.Các phương pháp khử nhiễm độc tố ....................................................................... 9
1.1.3.1.Phương pháp vật lý học ........................................................................................ 9

1.1.3.2.Phương pháp hóa học ......................................................................................... 11
1.1.3.3.Phương pháp sinh học ........................................................................................ 12
1.2.Tổng quan về bảo quản hạt giống ............................................................................ 15
1.3.Tổng quan về vi khuẩn lactic ................................................................................... 16
1.3.1.Giới thiệu chung .................................................................................................... 16
1.3.2.Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 17
1.3.3.Đặc điểm sinh lý – sinh hóa .................................................................................. 19
1.3.4.Nhu cầu dinh dưỡng .............................................................................................. 20
1.3.4.1.Nguồn cacbon..................................................................................................... 20
1.3.4.2.Nguồn nito .......................................................................................................... 20

i


1.3.4.3.Nguồn vitamin .................................................................................................... 21
1.3.4.4.Các chất hữu cơ khác ......................................................................................... 21
1.3.4.5.Các muối vô cơ khác .......................................................................................... 21
1.3.4.6.Nguồn oxy .......................................................................................................... 22
1.3.5.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic và các hợp chất kháng nấm ................. 22
1.3.5.1.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic .......................................................... 22
1.3.5.2.Các hợp chất kháng nấm .................................................................................... 23
CHƯ NG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29
2.1.Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................ 29
2.2.Thời gian thực hiện .................................................................................................. 29
2.3.Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 29
2.3.1.Vật liệu .................................................................................................................. 29
2.3.2.Hóa chất sử dụng ................................................................................................... 29
2.3.3.Môi trường sử dụng ............................................................................................... 30
2.3.4.Thiết bị .................................................................................................................. 30
2.4.Phương pháp luận..................................................................................................... 30

2.4.1.Mục tiêu đồ án ....................................................................................................... 30
2.4.2.Nội dung ................................................................................................................ 30
2.5.Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 31
2.5.1.Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................... 31
2.5.2. . Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus
sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc
Aspergillus sp. CDP1. .................................................................................................... 32
2.5.2.1.Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic....................................................... 33
2.5.2.2.Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 ............................................................. 38
2.5.3. ... Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm
mốc Aspergillus spp. ...................................................................................................... 39

ii


2.5.4.Phương pháp khảo sát mơi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic ........... 40
2.5.5.Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp.
CĐP1 .............................................................................................................................. 43
CHƯ NG III: KẾT QU VÀ TH O LUẬN ........................................................... 51
3.1.Khảo sát tính thuần khiết của 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N ....................... 51
3.1.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc ................................................................................. 51
3.1.2.Nhuộm gram.......................................................................................................... 52
3.1.3.Nhuộm bào tử ........................................................................................................ 53
3.1.4.Thử nghiệm Catalase............................................................................................. 54
3.1.5.Thử nghiệm khả năng lên men đường .................................................................. 55
3.1.6.Thử nghiệm khả năng di động .............................................................................. 57
3.2.1.Xác định hàm lượng acid tổng .............................................................................. 59
3.2.2.Khả năng tạo màng biofilm ................................................................................... 63
3.3.Khảo sát sự phát triển của chủng Aspergillus sp. CĐP1 và khả năng kháng nấm của
vi khuẩn lactic ................................................................................................................ 63

3.3.1.Sự phát triển của nấm CĐP1 ................................................................................. 63
3.3.2.Khả năng kháng nấm trực tiếp của vi khuẩn lactic ............................................... 65
3.4.Lên men vi khuẩn lactic ........................................................................................... 66
3.4.1.Sinh khối của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp cải ....................... 66
3.4.2.Hàm lượng acid tổng (%) của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp
cải .................................................................................................................................. 68
3.4.3.Sự tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS và bắp
cải ................................................................................................................................... 70
3.4.4.Khả năng kháng nấm CĐP1 của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS
và bắp cải. ....................................................................................................................... 71
3.5.Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng ............................................................. 73

iii


3.6.Sơ đồ quy trình bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3
........................................................................................................................................ 77
CHƯ NG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 79
4.1. Kết luận ................................................................................................................... 79
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................. 79
TÀI LIỆU THAM KH O ........................................................................................... 80
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 82

iv


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
LAB

Lactic acid bacteria/ Lactobacillales

VSV

Vi sinh vật

VK

Vi Khuẩn

BVTV

Bảo vệ thực vật

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

PDA

Potato Detrose Agar

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

NT

Nghiệm thức

KĐC

Khơng điều chỉnh

v


DANH MỤC B NG

Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn
Bảng 1.2: Text sinh hóa của Lactobacillus
Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998)
Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất được tóm tắt qua bảng dưới đây
Bảng 1.5: Bảng tóm tắt về 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3 và L2N
Bảng 1.6: Acid lactic

và giá trị OD ở bước sóng 6

nm sau 66 giờ nuôi cấy của

các chủng Lactobacillus spp.
Bảng 1.7: Số liệu thống kê tỉ lệ phần trăm ức chế sự phát triển của nấm CĐP1
Bảng 1.8: Số ngày mọc nấm ở 2 thí nghiệm khơng cảm nhiễm và cảm nhiễm

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus
Hình 1.2: Hình dáng tế bào Lactobacillus
Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm: (a) 4-hydroxy-phenyllactic
acid, (b) 3-phenyllactic acid, (c) 3-hydroxydecanoic acid, (d) 3-hydroxydodecanoic
acid, e) 3-hydroxytetradecanoic acid, (f) 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid, (g)
Cyclo(Gly-Leu)

methylhydantoin

mevalonolactone,

(h)

methylhydantoin,

(i)

mevalonolactone, (j) Caproic acid, (k) Propionic acid, (l) Butyric acid, (m) Acetic aicd,
(n) Formic acid, (o) n-valeric acid
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu
Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng Lactobacillus spp. trên đĩa MRS Agar
Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn (từ trái qua phải) vi khuẩn E.coli gram
âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5
Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn (từ trái qua qua phải) vi khuẩn
Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 khơng sinh bào tử
Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (trái qua phải: thử
nghiệm âm tính vi khuẩn L5, đối chứng âm vi khuẩn lactic trong nước cất, thử nghiệm
dương tính với vi khuẩn Bacillus subtilis)

Hình 3.5: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn Lac obacillus sp. L3 A –
Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Manose; E – Manitol; F – Galactoe
Hình 3.6: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn
đối chứng Bacillus subtilis.

vii


Hình 3.7: So sánh acid lactic

và giá trị OD ở bước sóng 6

nm sau 24 giờ ni cấy

của các chủng Lactobacillus spp.
Hình 3.8: Đồ thị so sánh 3 chủng vi khuẩn lactic tạo màng ở điều kiện lắc và không lắc
Hình 3.9: (trái qua phải Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên
môi trường MRS Agar cải tiến và PDA
Hình 3.1 : Đồ thị so sánh sự kháng nấm trực tiếp của 3 chủng vi khuẩn
Hình 3.11: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp. L5 trên 2 mơi trường
Hình 3.12: Độ đục dịch ni cấy của Lactocbacillus sp. L2N trên 2 mơi trường
Hình 3.13: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp. L2N trên 2 môi trường
Hình 3.14: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L5 trên 2 mơi trường
Hình 3.15: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L2N trên 2 mơi trường
Hình 3.16: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L3 trên 2 mơi trường
Hình 3.17: Đồ thị so sánh khả năng tạo màng biofilm của 3 chủng vi khuẩn trên 2 mơi
trường
Hình 3.18: Khả năng kháng nấm mốc của chủng vi khuẩn L5 trên 2 môi trường nuôi
cấy so với đối chứng + Daconil

.5g l và đối chứng (- nước cất (A – đối chứng (+),

B – đối chứng (-), C – môi trường MRS, D – mơi trường bắp cải)
Hình 3.19: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ kháng nấm (%) của 3 chủng vi khuẩn trên 2 môi
trường với đối chứng (+) Daconil

viii


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, với sự phát triển của nhiều lĩnh vực khoa học – kỹ thuật nhằm phục vụ
cho con người, cùng với cuộc cách mạng 4. đã đưa con người tới nên nền văn minh
hiện đại. Nhờ sự phát triển đó thì con người ngày càng chú trọng tới sức khỏe của mình
hơn, do vậy vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên cần thiết và quan trọng.
Song song với việc phát triển kinh tế, chính trị và xã hội thì lĩnh vực Công nghệ
sinh học cũng đang được phát triển và mở rộng ở nước ta.
Ở nước ta, nơng nghiệp đóng vai tr chủ yếu và những người nông dân phải luôn
đảm bảo năng suất và nhu cầu lương thực cho người tiêu d ng trong và ngoài nước. Đa
số các loại cây trồng đều sử dụng hạt giống và khi gieo trồng sẽ chịu ảnh hưởng của
các yếu tố như: thời tiết khí hậu, điều kiện đất, … ngồi những yếu tố đó c n có vi sinh
vật, cơn trùng, nấm mốc làm ảnh hưởng đến sự phát triển của cây.
Có khoảng 50 lồi nấm mốc có mặt trong thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn ngũ
cốc) gây hại cho vật ni và con người vì chúng sản sinh ra đốc tố, người ta thường gọi
tên chúng là độc tố nấm mốc (mycotoxin). Theo số liệu của Tổ chức Nơng lương Thế
giới (FAO) thì khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin làm thiệt hại kinh
tế nặng nề, nhiều nhất là các nhà chăn nuôi, sản xuất thức ăn gia súc và thực phẩm cho
con người.
Điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Châu Á thuận lợi cho việc nấm mốc phát triển như

trong lúc canh tác, lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc chế biến thức ăn, lúc bảo quản, lúc vận
chuyển và ngay trong cả quá trình cho ăn. Họ biết sự có mặt độc tố trong thức ăn
không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà c n sản sinh ra các độc tốt

1


gây bệnh cho vật ni. Có thể kể điển hình là Aflatoxin – là độc tố của nấm Aspergillus
flavus và parasiticus – có nhiều ở hạt bắp, đậu phộng và một vài loại hạt khác có chứa
dầu. Nó khơng chỉ là độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, gây rối loạn chức năng, gây suy
giảm miễn dịch, thối hóa gan thận mà còn gây chết gia súc. Aflatoxin c n được chứng
minh là chất độc gây ung thư cho động vật, do đó rất nguy hiểm cho con người.
Các nhà nghiên cứu đã ứng dụng từ những kiến thức và những tư liệu trên Thế
Giới, bên cạnh đó kết hợp với những kỹ thuật tiên tiến cho ra các sản phẩm ưu việt hơn
như giống cây trồng, vật nuôi, thức ăn mới, các loại thuốc chữa bệnh, các loài vi sinh
vật sử dụng trong chế biến – bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa các loại vi khuẩn, nấm
mốc gây bệnh nhằm phục vụ đời sống cho con người, phát triển kinh tế - xã hội và bảo
vệ môi trường.
Trước thực trạng đó, con người ln tìm kiếm những vi sinh vật có khả năng bảo vệ
thực phẩm mà cũng bảo vệ sức khỏe con người và động vật. Theo các nghiên cứu thì vi
khuẩn sinh acid lactic được ứng dụng nhiều nhất. Vi khuẩn này có hoạt tính sinh học
khá cao, an tồn, có khả năng tiêu diệt những vi sinh vật có hại và cũng là nguồn vi
sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột.
Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic, chúng cịn có khả năng ức chế sự phát triển
của nấm mốc. Do đó, đây cũng chính là lý do em chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát
khả năng ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng.”
2. Tình hình nghiên cứu
Trên thế giới, có rất nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng về khả năng kháng nấm
do vi khuẩn lactic sinh ra.
 ―Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium

in vitro trong nấu mạch nha lúc mạch‖ của A. Laitila và cộng sự (2002).

2


 ―Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất
kháng nấm trong thực phẩm‖ của Cassandra De Muynck và cộng sự (2004).
 ―Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi
kháng Aspergillus fumigatus‖ của Kim Jeong Dong (2005).
 ―Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid
lactic và Saccharosemyces cerevisae‖ của R Moz và cộng sự (2010).
Ở nước ta, cũng có một vài nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic.
 ―Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm
Trichoderma‖ của Lương Thị Phương Thảo (2015).
 ―Chủng nấm men Saccharosemyces cerevisae sử dụng bổ sung vào thức ăn
chống tác hại của Aflatoxin và bệnh đường tiêu hóa‖ của Đậu Ngọc Hào và
Phạm Minh Hằng.
3. Mục đích nghiên cứu
Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt đậu phộng khỏi sự phát triển nấm mốc
sinh Aflatoxin.
4. Mục tiêu nghiên cứu
Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt giống.
5. Nội dung nghiên cứu
Hoạt hóa các chủng lactic Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus
sp. L2N và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1.
Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic: Lactobacillus
sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N.
Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với Aspergillus sp.
CĐP1.

3


Khảo sát hoạt tính sinh học của 3 chủng vi khuẩn vi khuẩn lactic (sinh khối, tổng
hợp acid lactic, tạo biofilm, ức chế nấm mốc) khi nuôi cấy trên môi trường bắp cải so
sánh với môi trường MRS.
Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng khi xử lý với các tổ hợp vi khuẩn lactic.
6. Tính mới của đề tài
Đã tuyển chọn và kết hợp được 3 chủng vi khuẩn lactic Lactocbacillus sp. L5, L3
và L2N.
Xây dựng được quy trình để bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng lactic.
Tạo sản phẩm hạt đậu phộng xử lý vi khuẩn lactic kéo dài thời gian bảo quản khỏi
nấm mốc sinh Aflatoxin.
7. Phương pháp nghiên cứu
7.1.

Phương pháp luận

Để ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt đậu phộng thay cho chất bảo quản hóa
học, các vi khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được
khảo sát tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối
kháng nấm. Đồng thời ảnh hưởng của các mơi trường lên men lên các tính chất trên
cũng được khảo sát.
Cuối cùng khả năng chống mốc của hạt đậu phộng xử lý dịch nên cấy trong môi
trường tối ưu sẽ được chứng minh.
7.2.

Phương pháp xử lý số liệu

 Phần mềm Excel 2 16 để vẽ đồ thị.

 Phần mềm thống kê SAS 9.1.

4


8. Kết quả đạt được
Xác định khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối kháng nấm của
3 chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với chủng nấm mốc
Aspergillus sp. CĐP1.
Xác định môi trường lên men thích hợp của các chủng vi khuẩn lactic.
Xây dựng được quy trình bảo quản hạt đậu phộng.

5


CHƯ NG I: TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về nấm

Nấm (tên khoa học: Fungi) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của
R.H.Whittaker (1996). Nấm tồn tại và phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước,
xác sinh vật chết, động vật, thực vật,… chúng đóng vai tr quan trọng trong việc phân
giải các hợp chất trong tự nhiên như Cellulose, Protein, Lipid, Chitin,… đảm bảo vịng
tuần hồn vật chất trong tự nhiên. Chúng cịn có khả năng sinh độc tố gây hại cho con
người, động vật và thực vật.
1.1.1. Tổng quan về Aspergillus sp.
Aspergillus là một chi gồm vài trăm khn lồi được tìm thấy ở vùng khí hậu
khác nhau trên thế giới, được nhà hóa học và nhà sinh học người Ý Pier Antonio

Micheli xếp vào danh mục đầu tiên vào năm 1729.
1.1.1.1.

Phân loại khoa học

 Giới:

Fungi

 Ngành:

Ascomycota

 Lớp:

Eurotiomycetes

 Bộ:

Eurotiales

 Họ:

Trichocomaceae

 Chi:

Aspergillus

Aspergillus gồm hơn 185 loài, nhiều loài gây bệnh cho con người và động thực vật.

Nhiều loài được con người ứng dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme.

6


1.1.1.2.

Đặc điểm hình thái

Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh, có vách ngăn ngang hồn chỉnh.
Nhiều khuẩn ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biết vách
ngăn ngang có 1 lỗ nhỏ để cho tế bào chất trao đổi qua lại giữa hai tế bào. Khuẩn ty đứt
thành khúc, và mỗi khúc hay đoạn đều có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới.

Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus
1.1.1.3.

Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng

Các lồi nấm sinh trưởng khơng cần ánh sáng. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát
triển là từ 2 – 500C, tối ưu từ 22 – 270C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng
được 35 – 400C. Nói chung, nấm có thể phát triển ở môi trường acid nhưng pH tối ưu

7


là 5 – 6.5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9. Oxy cũng
cần cho sự phát triển của nấm vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và nước là yếu tố
cần thiết cho sự phát triển.
Nấm có thể phát triển liên tục trong 4

năm hoặc hơn nếu các điều kiện mơi

trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng. Nấm mốc khơng có diệp lúc tố nên
chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngồi (nhóm dị dưỡng), một số sống sót
và phát triển nhờ khả năng ký sinh sống ký sinh trong cơ thể động vật hoặc thực vật)
hay hoại sinh trên xác,… Nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm là C, O, H, N, P, K, Mg,
S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn
vô cơ đơn giản như Glucose, muối Ammino,… sẽ được hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn
thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngồi các loại enzyme thích hợp
để cắt các đại phân tử thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào.
1.1.2. Tác hại của độc tố Aflatoxin
Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối
lượng phân thử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối
với động vật và con người. Điểm đặc biệt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở
nồng độ thấp.
Các loại đốc tố do Aspergillus sp. tiết ra: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic.
Độc tố gây ngộ độc và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm
mốc A. flavus, A. parasiticus, A. nomius sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số hạt.
Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan, nếu mức độ ơ nhiễm thấp sẽ tích lũy
dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản và về lâu dài sẽ gây ung thư.

8


Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại
trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây
ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004).
1.1.2.1.

Tác hại của nấm gây ra cho con người

Aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao
trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: xuất huyết, hủy
hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong. Trong khi đó, nếu hấp
thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết,
một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hóa thức ăn k m, sụt cân, nhưng rõ
nhất chính lả ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan.
1.1.2.2.

Tác hại của nấm gây ra cho động vật

Các triệu chứng nhiễm độc Aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc
tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính Aflatoxin có tính di
truyền theo 3 kiểu: gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả của việc nhiễm Aflatoxin
cịn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, lồi, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc.
Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao.
 Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong
số các Aflatoxin. Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần
kinh.
1.1.3. Các phương pháp khử nhiễm độc tố
1.1.3.1.

Phương pháp vật lý học

Phân hủy Aflatoxin bằng khơng khí nóng: dùng khơng khí nóng thổi qua ngun
liệu có chứa Aflatoxin để làm giảm liều lượng Aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên
cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ khơng khí nóng
đưa vào là 1

0

C – 1450C ở ngơ hạt thì lượng Aflatoxin có thể giảm tử 877 ppb còn

9


452 ppb, tử 378 ppb còn 223 ppb. Nếu nhiệt độ tang lên tới 1650C có thể làm cho
lượng Aflatoxin B1 giảm đến 65

Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

Phân hủy Aflatoxin bằng hấp ướt ở áp xuất cao: phương pháo hấp ướt ở nhiệt độ
cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Q trình này nhanh chóng
phá hủy vịng lacton trong cấu trúc phân tử của Aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận
ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C

thấy nếu gạo nhiễm Aflatoxin từ 40 – 4

thêm nước vào gạo tỉ lệ 1:4) có thể làm giảm hàm lượng Aflatoxin đến 68%. Ở đậu
phộng có độ ẩm 10%, chứa 7

ppb Aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ

giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng Aflatoxin thấp 76 ppb được hấp ở 1.5 atm trong
vịng 1 giờ đã phân hủy hồn toàn Aflatoxin Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,
2003).
Làm giảm Aflatoxin bang các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp
phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt

cao. Các chất có khả năng hấp phụ Aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu
vơ cơ có bản chất aluminosilicate như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium
alumino – silicate), một số chất s t đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite),
một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl,
polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra
ngoài Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).
Phân hủy Aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím.
Ở bước song 365 nm, khả năng hấp phụ Aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận
thấy lượng Aflatoxin ở bắp (150ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10
giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

10


1.1.3.2.

Phương pháp hóa học

Tách Aflatoxin bằng dung mơi hữu cơ: đây là phương pháp có thể áp dụng đối
với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác
từ Aflatoxin và có thể thu hồi được dung mơi mà khơng ảnh hưởng đến thành phần
dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc
dùng hệ thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan – methanol, hexan – ethanol, hexan –
ethanol – nước và hexan – acetone – nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44%
hexan và 2

nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành cơng nhất được tìm thấy

có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư
lượng lipid gần bằng 1% và mức Aflatoxin thấp hơn 4 µg kg.

Phương pháp sử dụng các chất oxy hóa – khử: các chất oxy hóa – khử như Natri
Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2 được sử dụng để làm mất độc tính
của Aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaoCl để sử lý hạt nhiễm Aflatoxin có thể làm mất
màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí Ozone (O3 cũng được thử nghiệm về
khả năng phân hủy Aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng
là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein và vitamin.
Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Amonium Hydroxide (NH4OH) và Natri
Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vơ hạt Aflatoxin. Các chất này
đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vịng lacton trong cấu trúc phân tử của Aflatoxin.
Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của
việc dùng khí NH3 làm vơ hoạt Aflatoxin. Xử lý ngơ bằng khí NH3 được đặc biệt quan
tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0.5 – 1.5% và nhiệt
độ bên ngoài là 250C, trong 14 ngày liên tiếp, lượng Aflatoxin từ 200 ppb có thể giảm
xuống c n 1 ppb Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003).

11


1.1.3.3.

Phương pháp sinh học

Khử nhiễm độc tố Aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa
như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực
tiếp nhờ vi sinh vật.
Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Aflatoxin dễ bị một số vi sinh vật
như nấm, vi khuẩn và nấm men phân hủy sinh học. Một số loài vi khuẩn, chẳng hạn
như Lactobacilli, Bacillus, Pseudomonas, Ralstonia và Burkholderia spp. đã cho thấy
khả năng ức chế sự phát triển của nấm và sự sản xuất Aflatoxin bởi Aspergillus sp.
trong phòng thí nghiệm (Reddy và cộng sự, 2010).

Streptomyces sp. tổng hợp được Aflastatin A, là hợp chất có bản chất là protein,
ức chế một số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp Aflatoxin của nấm A.
paraciticus (Ono. M và cộng sự, 1997).
Độc tố Aflatoxin bị ức chế bởi các vi khuẩn lactic như Lactobacillus casei có
hoạt động mạnh chống sự phát triển của nấm và sự này mầm của bào tử nấm (Kim,
2007).
Petchkongkaew và cộng sự 2

8 xác định B. licheniformis có khả năng ức chế

sự phát triển của A. flavus và loại bỏ được 74% Aflatoxin B1, còn B. subtilis có thể ức
chế sự tang trưởng của A. flavus và loại bỏ 85% Aflatoxin B1.
Taylor và cộng sự

2 1

đã nghiên cứu một số enzyme thuộc nhóm

Actinomicetales ở Mycobacterium smegmatis có khả năng tác động vào nhóm este của
Aflatoxin bằng cách kích hoạt các phân tử cho q trình tự thủy phân và khử nhiễm.
Theo Niu và cộng sự (2008), một số vi sinh vật sử dụng coumarin như một
nguồn cacbon, kết quả chỉ ra rằng tác động làm giảm Aflatoxin được thực hiện bởi
enzyme protease.

12


Phương pháp kiểm soát Aflatoxin bằng vi sinh vật rất đáng được quan tâm sử dụng
vì giá thành rẻ, sử dụng thuận tiện, có lợi cho sản xuất, tạo ra sản phẩm sạch, đảm bảo
sức khỏe và quyền lợi cho người tiêu d ng Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp,

2003).
Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn
Tên vi khuẩn

Đối tượng

Cơ chế khử nhiễm

Bacillus

Aspergillus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi C. Munimbazi và

pumilus

parasiticus

chất ngoại bào, sinh ra trong LB.

Tác giả

Bullerman,

quá trình ni cấy B. pumilus, 1997
ức chế sự phát triển và quá
trình

tổng

aflatoxin

độc

hợp
của

nấm

chất
Asp.

parasiticus.
Streptomyces

Aspergillus

Streptomyces sp. tổng hợp được Ono. M và cộng

sp.

parasiticus

aflastatin A, là hợp chất có bản sự, 1997
chất là protein, ức chế 1 số
enzyme esterase tham gia quá
trình

tổng

aflatoxin

độc

hợp
của

nấm

chất
Asp.

parasiticus.
Achromobacter Aspergillus

A. xylosoxidan tổng hợp Cyclo PS. Yan và cộng

xylosoxidans

(L-leucyl-L-prolyl),

parasiticus

là

1 sự, 2004

cyclodipeptide, ức chế sự phát
triển và sự tổng hợp aflatoxin
của nấm Asp. parasiticus.

13


Lactobacillus

Aspergillus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi Kim, 2007.

casei

flavus

chất ngoại bào, sinh ra trong
q trình ni cấy L. casei, ức
chế sự phát triển và quá trình
tổnghợp độc chất aflatoxin của
nấm Asp. flavus.

Bacillus

Aspergillus

Ting Zang và cộng

Hợp chất thứ cấp

subtilis B-FS06 flavus

sự, 2007

Bacillus

Aspergillus

B.

subtilis

subtilis

flavus

enzyme

tổng

ngoại

protease,

hợp
bào

chitinase,

các R.

Thakaew

và

như cộng sự, 2013
β-

1,3glucanase làm ức chế sự
phát triển của nấm Asp. flavus.

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê,
tiêu, điều, thanh long, vú sữa... Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao
trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta. Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải
sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và khơng ít các
loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa
chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng. Phương pháp sinh
học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng
có những ưu điểm sau:
 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như
thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất.
 Cân bằng hệ sinh thái trong mơi trường đất nói riêng và mơi trường nói chung.

14


 Khơng làm thối hóa đất mà cịn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất.
 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất
lượng nông phẩm.
 Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh
của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc
BVTV có nguồn gốc hóa chất. Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh

như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu.
 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nơng nghiệp,
cơng nghiệp, góp phần làm sạch mơi trường.
 Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng.
1.2.

Tổng quan về bảo quản hạt giống

Hạt giống là yếu tố quan trọng quyết định đến hiệu quả gieo trồng bởi chất lượng
hạt giống có tốt thì khả năng nảy mầm và phát triển mới cao. Muốn đảm bảo chất
lượng hạt giống cây trồng, có thể sử dụng sang vụ sau ta cần phải bảo quản hạt giống
đúng cách.
Mục đích của bảo quản hạt giống là phải giữ được độ nảy mầm của hạt, hạn chế tổn
thất về số lượng và chất lượng hạt giống, duy trì tính đa dạng sinh học của hạt giống.
Tiêu chuẩn hạt giống phải có chất lượng cao, thuần chủng và không bị sâu bệnh.
Trước khi đem hạt giống đi bảo quản ta cần phải loại bỏ các hạt không đạt yêu cầu,
tạo môi trường sạch không cho vi sinh vật và cơn trùng xâm nhiễm. Sau đó làm khơ hạt
bằng cách phơi hoặc sấy, đây là bước không thể bỏ qua khi bảo quản hạt giống. Để
tránh hạt giống bị mối mọt, ẩm mốc ta cần phải phơi – sấy hạt đúng cách, thóc khi sấy
phải ở nhiệt độ từ 40 – 450C đến khi độ ẩm đạt 13%, có các loại hạt có dầu thì sấy ở
nhiệt độ từ 30 – 400C đến khi độ ẩm đạt 8 – 9 . Không nên phơi trực tiếp hạt dưới ánh
nắng quá to hay trên nền sân bê tông, sân gạch bởi có thể làm biến dạng hạt. Sau khi
phơi sấy hạt giống, tốt nhất nên để hạt nguội trước khi đem đi bảo quản. Việc để nguội

15