CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM đặc BIỆT (THỰC HÀNH VI SINH)

Buổi 7

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ĐẶC BIỆT
LẤY MÁU CHIẾT XUẤT HUYẾT THANH
CÁCH PHA LOÃNG HUYẾT THANH


NHA BÀO
• Vi khuẩn có khả năng hình thành 1 cấu trúc nghỉ
gọi là: nội bào tử hay nha bào
• Mỗi tế bào chỉ làm phát sinh 1 nội bào tử
• Những vi khuẩn có khả năng sinh nha bào thuộc
giống: Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum,
Sporolactobacillus,
Sporosarcina, …

Thermoactinomyces,


NHA BÀO
• Bào tử có thể nằm ở giữa, đầu mút hay gần đầu
nút tùy theo lồi

Vị trí và hình thái của nội bào tử
(1, 2: Bào tử không làm biến dạng tế bào nằm chính tâm hay lệch tâm;
3-6: Bào tử làm biến dạng tế bào một đầu, chính tâm, nằm lệch tâm
hay một bên).


NHA BÀO
Trong nhóm Clostridium có bốn vi khuẩn chủ yếu

gây bệnh cho con người:
o C. botulinum: sinh độc tố trong thức ăn, vết
thương gây ra bệnh độc thịt
o C. difficile: mầm bệnh cơ hội ở ruột (phát triển
khi có điều kiện nhất khi điều trị bằng kháng
sinh) →viêm đại tràng màng giả


NHA BÀO
o C. perfringens, ban đầu có tên C. welchii, là
nguyên nhân gây ra một loạt các hội chứng khác
nhau, từ ngộ độc thức ăn cho đến bệnh hoại thư
sinh hơi. Loài này cũng sản sinh ra độc tố ruột
huyết gây ra bệnh nhuyễn thận ở cừu và dê.Lợi
ích của C. perfringens là thay thế nấm men trong
phương pháp bánh mì muối
o C. tetani, gây ra bệnh uốn ván


NHA BÀO
Bào tử:
• 1 vi khuẩn dinh dưỡng→1 bào tử
• Bào tử hình thành: Vi khuẩn ở ẩn (gần như khơng hoạt
động theo năm-hàng chục năm)
• Cấu tạo bào tử:
Lớp áo: Protein sừng không thấm nước, tránh bị tác động
bởi tia cực tím, enzym (lyzozyme, protease,..)
Lớp vỏ: peptidoglycan có phân tử calcium dipicolinate
(DPA-Ca) →lớp vỏ cứng chắc

NHA BÀO
Bào tử:
• Cấu tạo bào tử:
Lớp vỏ:
o canxi giúp DNA của bào tử chắc hơn DNA ban đầu dưới
tác động bất lợi từ bên ngồi
o có tính thấm cao với nước →loại bỏ nước khỏi tế bào
→kháng nhiệt, kháng bức xạ, ức chế hoạt động của
enzym bên trong lõi


NHA BÀO
1. Chuẩn bị:
a. Dụng cụ, thiết bị:
- Phiến kính (slide), KHV quang học nền sáng, dầu soi kính.
- Đèn cồn, nước cất, que cấy đầu vòng, giấy lọc, cốc bese
500ml, giá đỡ, chậu rửa, bếp điện.
b. Vật liệu, hóa chất:
- Mẫu giống:
Các loài vi khuẩn: Bacillus subtilis; Clostridium
pasteurianum đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch
nghiêng, hoặc mẫu sinh thiết nghi nhiễm vi khuẩn có nội
bào tử


NHA BÀO
1. Chuẩn bị:
b. Vật liệu, hóa chất:
- Thuốc nhuộm:

+ Dung dịch lục malachite 5%. Hòa tan malachite vào cồn
950, khuấy cho tan, sau đó nhỏ thuốc nhuộm vào ly
thủy tinh màu tối có nút mài.
+ Dung dịch safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với
nước cất theo tỉ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin ziehl: fuchsin
kiềm 1g, phenol 5g, ethanol, 90% 10 ml, nước cất
200 ml (hòa tan fuchsin với ethanol; hịa tan phenol với
nước cất sau đó trộn lại).


NHA BÀO
2. Ngun tắc nhuộm:
• Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh lục malachite
với tiêu bản có đun nóng 5- 10 ph, thuốc xâm nhập vào
nội bào tử và làm chúng nhuộm màu lục. Khi rửa vết bôi
bằng nước cất các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn
bào tử sẽ giữ màu lục. Khi nhuộm bổ sung bằng đỏ
safranin hay fuchsin sẽ làm phần bao quanh bào tử bắt
màu phân biệt (màu đỏ hồng)


NHA BÀO
• Bacillus subtilis: bào tử bắt màu xanh, tế bào chất bắt
màu hồng
.


XOẮN KHUẨN

Xem trực tiếp


Nhuộm thấm bạc


XOẮN KHUẨN
Nhuộm xoắn khuẩn: Leptospirae
* Phương pháp Fontana-Tribondeau: Nhuộm Nitrate
bạc
1. Thuốc nhuộm:
a. Dung dịch Rouge: (Fixative)
- Formalin
2ml
- Acid Acetic glacial 1ml
- DW
100ml
b. Dung dòch Tannic acid (Mordant)
- Tannic acid
5g
- Phenol tinh theå
1g
- DW
100ml


XOẮN KHUẨN
1. Thuốc nhuộm:
c. Dung dịch bạc:

AgNO3 (Nitrate bạc):1g

1%

DW 100ml
Dung dịch ammonium hydroxyte 10% (Ammonia)
* Hoàn chỉnh AgNO3
- Hút 10ml AgNO3 1% cho vào ống nghiệm để dành.
- Cho ammonia 10% vào phần AgNO 3 1% từng giọt một
vừa nhỏ vừa lắc để làm tan chất tủa vừa hiện
ra rồi biến mất và dung dịch trong trở lại.
- Lại cho dung dịch AgNO3 từng giọt vào cho đến khi
dung dịch trở nên đục trở lại


XOẮN KHUẨN
2. Phương pháp nhuộm:
• Làm phết vi khuẩn để khô ngoài
không khí
• Phủ dung dịch Rouge lên miếng lam để
30'' (lặp lại 2 - 3 lần)
• Rửa lam bằng cồn tuyệt đối (3'). Hơ qua
lửa cho khô
• Phủ dung dịch Tannic acid lên - hơ lửa
cho bốc khói (30'') - để nguội
• Rửa nước thường rồi rửa lại DW


XOẮN KHUẨN
2. Phương pháp nhuộm:

• Phủ dung dịch AgNO3 để vài giây rồi
bỏ, phủ dung dịch AgNO3 lên hơ lửa cho
đến khi miếng lam bốc khói và màu
nâu óng ánh kim loại (30'')
• Rửa nước - để khô - xem vật kính dầu
Kết quả: Leptospira sẽ có màu hơi
nâu đen trên nền màu nâu vàng.


XOẮN KHUẨN
* Phương pháp violet de gentian
1. Thuốc nhuộm:
• Dung dịch A: mercurochrome 2% ( mercurochrome 2g
+ 100 nước cất vừa đủ)
• Dung dịch B:violet de gentian 1% ( violet de gentian 1
g + 100 nước cất vừa đủ)
2. Cách nhuộm:
• Tiêu bản để khơ tự nhiên, khơng cố định.
• Nhỏ dung dịch A, hơ nóng vừa bốc hơi thì ngưng - lập
lại như vậy trong vòng 5 phút. Rửa nước ,vẩy để khơ
• Nhỏ dung dịch B, hơ nóng vừa bốc hơi thì ngưng - lập
lại như vậy trong 5 phút.Rửa nước ,vẩy ráo


XOẮN KHUẨN
* Phương pháp nhuộm âm bản

1. Vật liệu, hoá chất:
•         Mực tàu
•         Metanol

•         Dung dịch safranin 0,5%


XOẮN KHUẨN
* Phương pháp nhuộm âm bản
2. Các bước tiến hành 
• Lấy vi khuẩn hồ vào giọt nước trên phiến kính.
• Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh
lamen dàn mỏng vết bơi, làm khơ trong khơng khí.
• Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bơi,
giữ trong 1 phút.
• Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bơi
để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm
lại, rửa nước, thấm khơ.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100×


XOẮN KHUẨN
• Phương pháp nhuộm âm bản
Kết quả:
• Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy
màu hồng.
Strep. pneumonia; Klebsiella spp.
 


KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ
 Lấy máu để chiết xuất huyết thanh
Chuẩn bị dụng cụ
Cách lấy máu:

Lấy từ 2 – 3 ml máu

chiết huyết thanh

Quay ly
tâm

Tủ ấm/
tủ lạnh


KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ


KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ
 Lấy máu để chiết xuất huyết thanh
Chú ý:
Khi chiết xuất huyết thanh tránh làm vỡ
hồng cầu (tránh tạo bọt)
Lấy máu đúng thời gian của bệnh
→ ∆ chính xác