Xây dựng quy trình định danh lactobacillus acidophilus và bacillus subtills có trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự RDNA 16s

1

ðẠI HOC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒNG TƯỜNG VI
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ðỊNH DANH
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS
CÓ TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG
THỦY SẢN
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ RDNA 16S
Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2008

Học viên Hoàng Tường Vi


2

LỜI CẢM ƠN
Hồn thành luận văn thạc sĩ này tơi xin :
Trân trọng tri ân TS.BS Phạm Hùng Vân- một cánh chim đầu đàn trong
lĩnh vực cơng nghệ sinh hoc y học. Thầy đã ln tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em
trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp từ bậc ñại học ñến bậc cao học.
Trân trọng cảm ơn các thầy cô trường ðại học Bách Khoa- ngành Cơng
nghệ Sinh học đã tiếp thêm cho tơi nhiều kiên thức chuyên ngành trong suốt hai
năm học tại trường.
Tôi xin gửi những lời cảm ơn chân thành ñến Ban Giám ðốc, các anh chị

nhân viên Công Ty TNHH-TM-DV Nam Khoa đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành
ln văn này. ðặc biệt xin cảm ơn các anh chị phòng RD, anh Thái Bình, chị Ngọc
Thảo, chị Hiếu Ngọc đã khơng ngại khó khăn giúp đỡ tơi.
Xin thật lịng cảm ơn Anh- Xn Phán vì những giúp đỡ vơ cùng quan
trọng, những lời ñộng viên, chia sẻ trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Gia đình tơi – Bố, mẹ và em luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tơi, là
nơi tơi cảm thấy bình n nhất mỗi khi trở về. Thành công ngày hôm nay là q
tặng tơi muốn gởi đến Gia ðình và Anh.
Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn!

Học viên Hoàng Tường Vi


3
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA
VIỆT NAM
PHÒNG ðÀO TẠO SðH
PHÚC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA
ðỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH
Tp. HCM, ngày …. tháng …năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: HOÀNG TƯỜNG VI

Phái: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 03/08/1983.

Nơi sinh: Tp HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học.

MSHV:

I- TÊN ðỀ TÀI: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM
SINH HỌC CÓ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILUS SUBTILIS DÙNG
TRONG THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ”.
II – NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
SỬ DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ rDNA 16 VÀ KĨ THUẬT ðỊNH LƯỢNG
ðẾM KHUẨN LẠC ðỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ
PHẨM SINH HỌC TRONG THỦY SẢN.
ÁP DỤNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG ðỂ KIỂM TRA MỘT SỐ SẢN
PHẨM CHẾ PHẨM SINH HỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG
III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V – CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MƠN
QL CHUN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ ñã ñược Hội ñồng chuyên ngành thơng qua.
Ngày … tháng … năm
2008
TRƯỞNG PHỊNG ðT – SðH
NGÀNH

TRƯỞNG KHOA QL

Học viên Hoàng Tường Vi


4

TÓM TẮT
Một trong những khuynh hướng hiện nay trong ngành thủy sản là sử dụng chế
phẩm sinh học để góp phần gia tăng sản lượng, chất lượng ñồng thời tạo sự phát

triển bền vững với đối với mơi trường. Trong các chế phẩm sinh học yêu cầu bắt
buộc là phải định danh chính xác các lịai vi sinh vật và ñầy ñủ hàm lượng ñể
mang lại kết quả tốt nhất ñối với người sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tơi
tiến hành xây dựng q trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học trong thủy
sản có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học
phân tử và phương pháp vi sinh. ðối với định danh, chúng tơi xây dựng quy trình
định danh hai chủng vi khuẩn này bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S dựa trên
cơ sở vùng rDNA 16S là vùng có tính bảo tồn và ñặc hiệu cao ñối với từng loài.
ðối với ñịnh lượng, chúng tơi sử dụng vi sinh kỹ thuật định lượng gián tiếp khuẩn
lạc trên môi trường BA (Bacillus subtilis), BAYK (Lactobacillus acidophilus). Áp
dụng quy trình kiểm tra chất lượng này ñể kiểm tra 15 chế phẩm sinh học có
Bacillus subtilis và 12 chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus, chúng tơi
thu được kết quả 9/15 chế phẩm có kết quả định danh chính xác Bacillus subtilis,
8/9 chế phẩm có định danh Bacillus subtilis khơng đạt so với hàm lượng đã đăng
kí chất lượng; 1/12 chế phẩm sinh học có định danh là Lactobacillus acidophilus
và hàm lượng cũng thấp hơn hàm lượng đã đăng kí

Học viên Hoàng Tường Vi

5

ABSTRACT
Now one of the trends in aquaculture is using probiotic to increase quantity,
quality and protect from the polluted environment in stable development. Probiotic
requires the exact identified organism and adequate organism’s quantity to have
great influence on aquaculture. In this research, we aimed to build a quality
control procedure of aquaculture probiotic having Lactobacillus acidophilus and
Bacillus subtilis by bio-molecular method and microbiological method. In terms of
identification, we built the procedure based on rDNA 16S sequence analysis
because rDNA 16S is a highly conserved region. In expression of enumberation,
we used plate counting technic with BA medium (Bacillus subtilis), BAYK
medium (Lactobacillus acidophilus). Using this quality control procedure to
examine 15 probiotic products having Bacillus subtilis on labels and 12 probiotic
products having Lactobacillus acidophilus on labels. We identified Bacillus
subtilis in 9/15 products and the number of this species in 8/9 products is not as
many as printed on labels. We identified Lactobacillus acidophilus in 1/12
products and the number of this species is less 100 times than printed on the
labels.

Hoïc viên Hoàng Tường Vi


6

Mục lục

Trang

Danh mục bảng ...........................................................................................................

Danh mục hình ............................................................................................................
Danh mục chữ viết tắt .................................................................................................
ðẶT VẤN ðỀ ..........................................................................................................1
PHẦN MỘT
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC......................................................................3
1.1.1. Lịch sử của Probiotic .....................................................................................3
1.1.2. Tác dụng của Probiotic .................................................................................3
1.1.2.1. Tác dụng ñối với con người .....................................................................4
1.1.2.2. Tác dụng ñối với ñộng vật........................................................................5
1.1.2.3. Tác dụng ñối với môi trường....................................................................5
1.1.3. Các yêu cầu ñối với vi sinh vật trong probiotic .........................................6
1.1.4. Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt ñộng nuôi trồng thủy sản
tại Việt Nam...................................................................................................6
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ
BACILLUS SUBTILIS....................................................................................9
1.2.1. Lactobacillus acidophilus ...........................................................................9
1.2.1.1. Lịch sử phát hiện Lactobacillus acidophilus............................................9
1.2.1.2. Phân loại ..................................................................................................9
1.2.1.3. ðặc điểm hình thái ................................................................................10
1.2.1.4. ðặc điểm sinh hóa .................................................................................10
1.2.1.5. ðiều kiện ni cấy .................................................................................10
1.2.1.6. Vai trò của L. acidophilus ......................................................................11
1.2.2. Bacillus subtilis........................................................................................12
1.2.2.1. Phân loại ................................................................................................12
1.2.2.2 ðặc điểm hình thái ................................................................................13
1.2.2.3. ðặc điểm sinh hóa .................................................................................13
1.2.2.4. ðiều kiện ni cấy..................................................................................14
1.2.2.5. Vai trị của B. subtilis .............................................................................14
1.2.2.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ...............15
Học viên Hoàng Tường Vi

7

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ..........................................................17
1.3.1. Các phương pháp ñịnh danh vi sinh vật ......................................................17
1.3..1.1. ðịnh danh bằng thử nghiệm sinh hóa.....................................................17
1.3..1.2. ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự gen ........................................18
a. Giải trình tự bằng phương pháp hóa học ......................................................18
b. Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy .................................................19
c. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động....................................20
1.3.1.3. ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S ..........................20
1.3.2
Các phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật ................................................22
1.3.2.1. Phương pháp ñếm trực tiếp ....................................................................22
1.3.2.2. Phương pháp ñếm khuẩn lạc .................................................................22
1.3.2.3. Phương pháp màng lọc ...........................................................................23
1.3.2.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)........................................23
1.3.2.5. ðịnh lượng vi sinh vật bằng phương pháp ño mật ñộ quang ...............23
PHẦN HAI
2.1. VẬT LIỆU ...................................................................................................25
2.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................................25
2.1.2. ðịnh lượng vi sinh vật .................................................................................25
2.1.3. Tạo sản phẩm khuếch đại .............................................................................25
2.1.3.1. Ly trích DNA vi khuẩn ...........................................................................25
2.1.3.2. Khuếch ñại DNA vi khuẩn và phát hiện sản phẩm..................................26
2.1.4. Giải trình tự sản phẩm khuếch ñại .............................................................27
2.1.4.1. Tinh sạch và kiểm tra sản phẩm...............................................................27
2.1.4.2 Chạy chu trình nhiệt giải trình tự.............................................................27
2.1.4.3 Tủa sản phẩm khuyếch ñại.......................................................................28

2.1.4.4. ðiện di mao quản .....................................................................................28
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN...................................................................29
2.2.1. Phương pháp xác định vi khuẩn yếm khí.....................................................29
2.2.2. Phương pháp cấy định lượng .......................................................................29
2.2.2.1. Pha lỗng mẫu theo dãy thập phân ..........................................................29
2.2.2.2. Cấy ñịnh lượng.........................................................................................29
2.2.2.3. ðếm khuẩn lạc .........................................................................................30
2.2.3. Nhuộm gram ...............................................................................................30
2.2.4. Thử nghiệm catalase ...................................................................................31
2.2.5. Tạo sản phẩm khuếch đại.............................................................................32
Học viên Hoàng Tường Vi


8

2.2.5.1.
2.2.5.2.
2.2.5.3.
2.2.6.
2.2.6.1.
2.2.6.2.
2.2.6.3.
2.2.6.4.

Ly trích DNA vi khuẩn ...........................................................................32
Khuếch đại DNA vi khuẩn ......................................................................33
ðiện di phát hiện sản phẩm 16S – DNA .................................................35
Giải trình tự sản phẩm...............................................................................36
Tinh sạch sản phẩm..................................................................................37
Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự..........................................................38

Tủa sản phẩm của phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự............................38
Chạy điện di mao quản giải trình tự ........................................................39

PHẦN BA
3.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HĨA
HAI CHỦNG B1 VÀ L1: ............................................................................40
3.1.1. B. subtilis B1 .............................................................................................40
3.1.2. L. acidophilus L1 ......................................................................................40
3.2. KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ HAI CHỦNG
VI KHUẨN B. SUBTILIS VÀ L. ACIDOPHILUS .....................................41
3.2.1. Ly trích và tạo sản phẩm khuếch ñại rDNA 16S: ........................................41
3.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR 16S......................................................................42
3.2.3. Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự và tủa DNA .........................................43
3.2.4. ðiện di mao quản và phân tích kết quả........................................................44
3.3. XÂY DỰNG KỸ THUẬT ðỊNH LƯỢNG L.ACIDOPHILUS VÀ B.
SUBTILIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY
SẢN..............................................................................................................46
3.3.1. ðối với B. subtilis ........................................................................................46
3.3.2. ðối với L. acidophilus .................................................................................47
3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI
SINH ðỐI VỚI CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG
THỦY SẢN CÓ L. ACIDOPHILUS VÀ B. SUBTILIS...............................48
3.5.
Kết quả ứng dụng quy trình kiểm tra chất lượng ñối với các mẫu chế
phẩm sinh học dùng trong thủy sản ...........................................................50
3.5.1. ðối với B. subtilis ......................................................................................50
3.5.1.1. Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh ......................................50
3.5.1.2. Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử .........................51
3.5.2. ðối với L. acidophilus...............................................................................53

3.5.2.1. Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh .......................................53
3.5.2.2. Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử .........................54

Học viên Hoàng Tường Vi


9

3.6.
3.6.1.
a.
b.
3.6.2.
a.
b.

BÀN LUẬN ...............................................................................................56
Kết quả ñịnh danh: .....................................................................................57
ðối với B. subtilis:.....................................................................................57
ðối với L. acidophilus...............................................................................59
Kết quả ñịnh lượng ....................................................................................60
ðối với B. subtilis......................................................................................60
ðối với L. acidophilus...............................................................................61

PHẦN BỐN
4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................62
4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................................63
PHẦN NĂM
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT..........................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH ..........................................................65

Học viên Hoàng Tường Vi


10

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Kết quả ñịnh danh của 15 mẫu chế phẩm sinh học có đăng ký chất lượng
B. subtilis
Bảng 2: Kết quả ñịnh danh 12 mẫu chế phẩm sinh học có đăng ký chất lượng
L. acidophilus
Bảng 3: Kết quả định lượng của 9 mẫu có kết quả định danh là B. subtilis

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Kết quả định danh bẳng sinh hóa
Hình 2: Kết quả định lượng của mẫu V5 và V26
Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có
B. subtilis
Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có
L. acidophilus

Học viên Hoàng Tường Vi


11

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A

:

Adenin

AOAC

:

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống
(Association of Official Analytical Chemists)

bp

:

base pair (cặp base)

C

:

Cytosin

CFU

:

Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn

dATP

:

2’ – deoxyadenosin – 5’ – triphosphate

dCTP

:

2’ – deoxycytidin – 5’ – triphosphate

ddNTP

:

2’ – dideoxynucleoside – 5’ – triphosphate

dGTP

:

2’ – deoxyguanosin – 5’ – triphosphate

DNA

:

deoxyribonucleic acid

dNTP

:

2’ – deoxynucleoside – 5’ – triphosphate

DTCS

:

Dye Terminator Cycle Sequencing

dTTP

:

2’ – deoxythymidin – 5’ – triphosphate

EDTA

:

ethylendiamin tetra – acetic acid

lạc)

FDA

:

Cơ quan quan lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

(Food and Drug Administration)
g

:

gam

G

:

Guanin

ml

:

mililit

mm

:

milimet
Học viên Hoàng Tường Vi


12

mM

:

milimol

µl

:

microlit

µm

:

micromet

µM

:

micromol

MBS

:

dung

MWS

:

dung dịch rửa (mambrane wash solution)

nm

:

nanomet

NCBI

:

National Center for Biotechnology Information

PCR

:

polymerase chain reaction

rDNA

:

trình tự DNA mã hố cho rRNA

RNA

:

ribonucleic acid

rpm

:

vịng trên phút (revolution per minute)

S

:

hệ số lắng

SLS

:

dung dịch tải mẫu (sample loading solution)

T

:

Thymin

TAE

:

Tris – acetic acid – EDTA

Taq

:

Thermus aquaticus

TBE

:

Tris – boric acid – EDTA

TE

:

Tris – EDTA

U

:

Uracil

dịch

bám

màng

(membrane

binding

solution)

Học viên Hoàng Tường Vi


13

ðẶT VẤN ðỀ
Ngày nay các chế phẩm sinh học (hay cịn gọi là Probiotic) được ứng dụng
rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của ñời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người
đến chăn ni, trồng trọt, xử lý mơi trường… Trong đó ngành ni trồng thủy sản
là một trong những ngành mà hằng năm tiêu thụ một khối lượng rất lớn các chế
phẩm sinh học. Việc sử dụng chế phẩm sinh học trong ngành thủy sản ngoài việc
nâng cao chất lượng, gia tăng sản lượng còn tạo ñược sự phát triển bền vững với
môi trường sinh thái.
Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp
phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Các
chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, đại lý cho các cơng ty
nước ngồi hoặc sử dụng cơng nghệ của nước ngồi đề sản xuất và phân phối tại

Việt Nam. Với rất nhiều lồi vi sinh vật hiện có trong các chế phẩm, thì hai chủng
Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis có mặt ở hầu hết các sản phẩm.[4]
ðối với những chủng vi khuẩn ñược sử dụng làm chế phẩm sinh học thì chúng
ta cẩn phải định danh chinh xác đến lồi.
ðể định danh các vi khuẩn này một cách chính xác ta có thể sử dụng các thử
nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên cần phải thực hiện hàng loạt các phản ứng sinh hóa
cũng như việc biện luận kết quả vô cùng phức tạp, chính vì thế một số cơng ty dã
cho ra đời các bộ kit ñịnh danh. Tuy nhiên ñối với B. subtilis thì chưa có bộ kit
định danh nào hồn chỉnh. Cịn đối với L. acidophilus có thể sử dụng bộ kit API
20E nhưng ñây là bộ kit dùng ñể ñịnh danh vi khuẩn kỵ khí gây bệnh nên kết quả
đối với L. acidophilus trong nhiều trường hợp khơng chính xác. Vì vậy tơi thực
hiện nghiên cứu: “Xây dựng quy trình định danh Lactobacillus acidophilus và

Học viên Hoàng Tường Vi


14

Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải
trình tự rDNA 16s”.
Bên cạnh đó, chất lượng chế phẩm sinh học còn phụ thuộc vào hàm lượng vi
khuẩn có trong chế phẩm. Muốn xác định được chỉ tiêu này thì chỉ có thể thực
hiện bằng phương pháp cấy ñịnh lượng. Do thời gian thực hiện luận văn cho phép
nên tơi xin được thực hiện thêm phần xây dựng quy trình định lượng Lactobacillus
acidophilus và Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng
phương pháp vi sinh”.
Với quy trình định danh và định lượng được thiết lập tơi xin đề xuất một quy
trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus và
Bacillus subtilis bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử.
Với những lý do như đã trình bày chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài nghiên

cứu với mục tiêu tổng quát là: “Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm
sinh học có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis dùng trong thủy sản
bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử”.

MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT CỦA ðỀ TÀI
-

Xây dựng quy trình định danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S đối
với hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis.

-

Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp vi sinh

-

Kết hợp quy trình định danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S với
phương pháp định lượng vi sinh vật ñể kiểm tra một số chế phẩm sinh học
dùng trong thủy sản ñang lưu hành trên thị trường.

THỜI GIAN – ðỊA ðIỂM THỰC HIỆN
-

Thời gian tiến hành: từ tháng 1/2008 đến tháng 7/2008.

-

ðịa điểm: Cơng ty TNHH-TM-DV Nam Khoa.
Học viên Hoàng Tường Vi

15

Phần một

TỔNG QUAN

1.1.

GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC

1.1.1. Lịch sử của Probiotic [12, 13]

Học viên Hoàng Tường Vi


16

Probiotic bắt nguồn từ ngơn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (fọr life).
Năm 1974, Parker là người ñầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic và ông ñã
ñịnh nghĩa:”Probiotic là những vi sinh vật và những chất góp phần vào sự cân
bằng hệ vi sinh vật ñường ruột.
ðến năm 1980, Yasuda và Taga ñã ñề xuất việc sử dụng probiotic như là một
tác nhân kiểm soát sinh học trong ni trồng thủy sản.
Sau đó, vào năm 1989, Fuller ñã nghiên cứu và ñịnh nghiã lại dựa trên ñịnh
nghĩa trước ñây của Parker về probiotic: probiotic là phần bổ sung vào thực phẩm
những vi sinh vật sống tạo ảnh hưởng có lợi lên trên động vật chủ bằng cách cải
thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột của vật chủ. Mãi ñến năm 1992,
Havenaar và Huis In’t Veld ñã nghiên cứu và ñưa ra một ñịnh nghĩa ñầy ñủ
hơn:”probiotic là một hỗn hợp vi khuẩn có thể tồn tại ñược khi ñưa vào cơ thể

ñộng vật hoặc con người và tạo nên những tác động có ích trên vật củ bằng cách
cải thiện đặc tính hệ vsv vật chủ.”
Vào năm 1998, một ñịnh nghĩa khác cũng ñược Guarner và Schafsma ñưa ra:
probiotic là những vi sinh vật sống khi được tiêu thụ một lượng thích hợp sẽ tạo
nên hiệu quả tốt cho sức khỏe của cơ thể chủ.
Tất cả các ñịnh nghĩa trên ñều nhấn mạnh tác dụng của probiotic ñối với việc
bảo vệ sức khỏe con người, động vật cũng như mơi trường và trong trồng trọt,
chăn nuôi.
1.1.2. Tác dụng của Probiotic
Ngày nay chế phẩm sinh học ñược ứng dụng rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của
đời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người đến chăn ni, trồng trọt, xử lý
mơi trường… Các tác dụng của probiotic có thể kể đến như sau:
1.1.2.1.

Tác dụng đối với con người

• Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

Học viên Hoàng Tường Vi


17

Probiotic có khả năng ức chế, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong ruột,
làm thay đổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi. Khả năng này được giải thích
nhờ:
- Tranh giành vị trí bám trên niêm mạc
- Tranh giành thức ăn với những sinh vật khác
- Tạo ra môi trường acid, các chất kháng khuẩn, ức chế các vi sinh vật
khác.

Vì vậy, probiotic được sử dụng để điều trị tiêu chảy do loạn khuẩn đường
ruột.
• Tăng cường khả năng tiêu hóa sữa
Một số sản phẩm sữa hiện nay bổ sung thêm probiotic do các vi sinh vật
probiotic có khả năng sinh ra lactase, số đơn vị lactase này tùy thuộc từng loại vi
khuẩn. Việc bổ sung probiotic sẽ cải thiện dung nạp lactose, tăng cường khả năng
tiêu hóa và dung nạp sữa cho người dùng.
• Tăng cường khả năng miễn dịch
Probiotic kích thích miễn dịch tại chỗ, đặc biệt kích thích làm tăng số tế bào
sản xuất IgA, làm ức chế khả năng đính, cư trú cũng như khả năng hoạt ñộng và
gắn ñộc tố vi khuẩn.
• Chống ung thư
Có thể do chúng cạnh tranh với các vi khuẩn tạo amin trong ruột, hạn chế
sự tạo những sản phẩm đồng hóa có hại là các chất gây ung thư.
• Một số tác dụng khác
Làm giảm cholesterol; tăng và cân bằng oestrogen, phịng chống lỗng
xương; trị viêm khớp, viêm niệu, bệnh nấm Candida…

1.1.2.2.

Tác dụng ñối với động vật

Học viên Hoàng Tường Vi


18

Khi probiotic ñược ñưa vào ñường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong các chế
phẩm có khả năng cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại
hoặc gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại gây

ra. Từ đó giúp cho các chức năng của đường rụơt hoạt động tốt hơn. Ngồi ra,
probiotic cịn làm tăng cường hệ số tiêu hóa của thức ăn tức là tăng hệ số hấp thu
và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Probiotic còn giúp ñộng vật tăng
cường khả năng miễn dịch của cơ thể.
Các probiotic có nhóm vi khuẩn lactic và Bacillus có tác dụng ức chế vi sinh vật
gây bệnh như Salmonella, Shigella, Vibrio. Ngi ra axit lactic được tạo ngồi tác
dụng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột cịn là cơ chất dinh dưỡng cho động vật
tiêu hóa. Các chất kháng sinh do các vi khuẩn này tạo ra cịn có tác dụng ức chế
các vi khuẩn gây hại khác.
Hiện nay, probiotic sử dụng cho ñộng vật thường ñược dùng theo nhiều cách khác
nhau nhưng thtường thấy nhất là trộn vào thức ăn của vật nuôi hoặc phun rắc vào
môi trường với dạng bột hoặc dạng dịch.
1.1.2.3.

Tác dụng đối với mơi trường [4]

Các nhóm vi khuẩn trong probiotic, đặc biệt là nhóm Bacillus có khả năng sinh
các laọi enzyme thủy phân ngoại bào có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các
vi khuẩn gây bệnh và phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn dư thừa và phân bài tiết
từ động vật ni để làm giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường.
Ngồi ra, trong các chế phẩm sinh học có sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn có
khả năng sử dụng các loại cơ chất như H2S, NH3, CO2… làm cơ chất dẫn ñến việc
làm giảm thiểu các chất này trong mơi trường ni.

1.1.3.

Các u cầu đối với vi sinh vật trong probiotic
Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn ñạt ñược hiệu quả mong muốn

cần phải ñáp ứng đúng một số u cầu :

Học viên Hoàng Tường Vi


19

- Chủng loại vi sinh vật phải ñược ñịnh danh chính xác.
- Chủng loại vi sinh vật cần thiết là vi sinh vật cư trú bình thường ở
người, khơng độc, khơng gây bệnh.
- ðủ số lượng để trị liệu: thường liều ñiều trị trong một ngày khoảng 108
– 109 tế bào.
- Có khả năng tồn tại khi đi qua dạ dày, nơi có pH thay đổi từ 1 – 4.
- Có khả năng chịu đựng được khi đi qua ruột non, nơi mà dịch mật tồn
phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%.
- Có khả năng ñề kháng với một số loại kháng sinh.
- Di truyền ổn định.
- Khơng có khả năng chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi
sinh vật khác.
- Khơng được mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh.
- Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và
bám vào niêm mạc ñường tiêu hóa.
1.1.4.

Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt động ni trồng thủy sản
tại Việt Nam [4]

Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành nghề sử dụng nguồn tài nguyên
thiên nhiên nhiên là dất và nước – hai nhân tố gắn liền với mơi trường sinh thái. Vì
vậy bên cạnh việc phải nâng cao năng suất, sản lượng tiêu thụ còn phải phát triển
một cách bền vững. Những ao hồ ni thâm canh có mơi trường nước rất phú
dưỡng do sử dụng nhiều thức ăn tổng hợp có thành phần đạm cao 30 – 45%. Do

đó ơ nhiễm trong các ao hồ chủ yếu có nguồn gốc từ thức ăn dư thừa, kế ñến là do
hoạt ñộng bài tiết của vật ni. Khi mơi trường nước bị ơ nhiễm thì dịch bệnh có
cơ hội phát triển. Như vậy, để hạn chế dịch bệnh, người nuôi phải dùng thường
xuyên chất diệt khuẩn như Clorin, Iodin,…Biện pháp hóa học này đều có hậu quả
nguy hiểm đối với sức khỏe của vật ni và sức khỏe người sử dụng. Khi vật ni
có dấu hiệu nhiễm bệnh thì người ni sử dụng các chất kháng sinh để trị bệnh.

Học viên Hoàng Tường Vi


20

Việc lạm dụng chất kháng sinh dẫn ñến sự nhờn thuốc của các vi sinh vật gây
bệnh và có thể khơng kiểm sốt được dịch bệnh, Ngồi ra việc dùng hóa chất và
kháng sinh là một trở ngại đối với các loại thủy sản xuất khẩu. Chính vì vậy, việc
sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ñể xử lý môi trường là biện
pháp tối ưu ñang ñược sử dụng khá phổ biến tại Việt Nam.
Chế phẩm sinh học được sử dụng có tác dụng điều chỉnh hệ vi sinh vật theo
hướng hạn chế các vi sinh vật gây bệnh, tăng cường sự phân hủy các chất hữu cơ
do thức ăn thừa, do động vật ni bài tiết, do xác ñộng thực vật thối rữa … ñể cải
thiện mơi trường, đồng thời làm tăng khả năng miễn dịch của vật nuôi với vi sinh
vật gây bệnh. Bên cạnh đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong ni trồng thủy
sản sẽ hạn chế sử dụng hóa chất và kháng sinh tạo ñiều kiện thuận lợi cho ngành
thủy sản của nước ta tiến vào thị trường các nước mà khơng gặp phải rào cản gì.
Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp
phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước. Các
chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, đại lý cho các cơng ty
nước ngồi hoặc sử dụng cơng nghệ của nước ngồi đề sản xuất và phân phối tại
Việt Nam. Mặc dù nhiều công ty tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật
ñến người ni nhưng do vì mục đích thương mại để có thể thu ñược nhiều lợi

nhuận nên các sản phẩm này ña phần không ñáp ứng ñúng với chất lượng ñã cơng
bố. Chưa kể đến các chế phẩm ngoại nhập hay chủng vi sinh vật từ nước ngồi
đưa vào Việt Nam có phù hợp với điều kiện của Việt Nam hay khơng, tác dụng
như thế nào nhưng xét về khía cạnh an tồn sinh học thì việc đưa các chủng vi sinh
vật vào nước ta cũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng.
Vì vậy u cầu cần có một quy trình hồn thiện để kiểm tra chất lượng vi sinh
vật có trong các chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản là ñiều cần thiết phải thực
hiện trong giai ñoạn hiện nay. Quy trình này cần phải có sự chính xác và mức độ
tin cậy cao.

Học viên Hoàng Tường Vi


21

1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ
BACILLUS SUBTILIS
1.2.1.
1.2.1.1.

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
Lịch sử phát hiện LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Vào những năm ñầu thế kỷ 20 (1900), Moro ñã lần ñầu tiên phân lập ñược vi
khuẩn L. acidophilus từ phân của trẻ sơ sinh qua phẫu thuật. Ơng đã mơ tả được
các đặc điểm của q ttrình trao đổi chất cũng như chức năg của vi khuẩn
này.[22,30]
ðến năm 1906, Metchnikoff cho xuất bản quyển sách “ Prolongation of life
optimistic studies”. Trong sách này ơng đã chứng tỏ được rằng L. acidophilus có
khả năng lên men đồng hình và có thể sống trong đường rụơt, miệng và âm ñạo.

Vào năm 1995, Hammes và Vogel ñã phân nhóm Lactobacillus các nhóm có liên
quan dựa trên kiểu lên men và cách phát sinh chủng lồi. Từ đó giúp con người
hiểu rõ hơn về hình thức phân loại của L. acidophilus.
1.2.1.2.

Phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey thì L. acidophilus thuộc
Ngành Firicules
Lớp Bacilli
Bộ Lactobacillales
Họ Lactobacillaceae
Giống Lactobacillus
Lồi Lactobacillus acidophilus[18]

Học viên Hoàng Tường Vi


22

1.2.1.3.

ðặc điểm hình thái

L. acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, dài, mảnh có
kích thước từ 0,5 1 ì 2 10 àm, thng xp theo cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn.
Khuẩn lạc trên môi trường thạch có kích thước 2-5 mm, lồi, đục, đều và khơng
sinh chất tạo màu. ðặc điểm chung của họ vi khuẩn lactic là không sinh bào tử.
ðây là vi khuẩn ưa nhiệt, có thể phát triển ở 45oC. [17,18]
1.2.1.4.

ðặc điểm sinh hóa

L. acidophilus là lồi ít có khả năng di động, khơng phân giải protein, phản
ứng catalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính. L. acidophilus lên men
đường lactose nhưng chậm, có khả năng lên men các loại đường glucose, sacarose,
maltose, mannose, salicin, không lên men mannit, arabinose, xilose, ramnose,
sorbit, glycerin.
L. acidophilus có khả năng tạo bacteriocin gồm lactacin F, lactacin B, acidocin
A có khả năng ức chế các lồi Lactobacillus khác và Enterococcus.[17,10]
1.2.1.5.

ðiều kiện ni cấy

L. acidophilus là lồi vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng chúng phát triển
mạnh trong mơi trường lỏng và agar ở điều kiện kị khí chuẩn (5% CO2, 10% H2,
và 85% N2). Nhiệt ñộ tối ưu là 370C. pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao ñộng trong
khoảng 3,8 – 6,5. Nhu cầu dinh dưỡng của L. acidophilus phản ánh bản chất rất
khó nuôi cấy của vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu
axit amin và vitamin như peptone, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bị,
ngồi ra còn chứa sorbitol, monooleate (tween 80), sodium acetat và muối magiê
kích thích sự tăng trưởng. Mơi trường ni cấy hay dược sử dụng là MRS (De
Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar.
Ngồi ra hiện nay người ta cịn sử dụng một số loại mơi trường để chọn lọc
L. acidophilus từ mẫu thực phẩm và sinh thiết với ba tác nhân chính là:Sodium
acetate (15-25 g/l), dịch cà chua và mật (dao ñộng từ 0.15-1% oxgall) [5]

Học viên Hoàng Tường Vi

23

1.2.1.6.

Vai trị của L. acidophilus

Như chúng ta biết, trong đường ruột thường có sự cân bằng giữa hệ vi sinh
vật phân giải ñường và hệ vi sinh vật phân giải protein. ðiều này tạo nên trạng thái
cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột. Khi có yếu tố tấn cơng vào hệ vi sinh vật
phân giải đường như cồn, chất kháng sinh, hóa trị liệu, nhiễm trùng, stress thì sự
cân bằng này sẽ bị phá vỡ. Khi đó có sự tăng sinh của hệ vi sinh vật phân giải
protein và sẽ gây ra một số bệnh như tiêu chẩy cấp hoặc mãn tính, rối lọan tiêu
hóa, táo bó, trướng bụng,.v.v… L. acidophilus sống là một phần của hệ vi sinh vật
phân giải đường sẽ giúp phịng ngừa hay điều trị các bệnh này khi ñưa trực tiế[
một lượng lớn vào ruột, tái lập lại sự cân bằng của hệ vi sinh ñường ruột.
Ngừơi ta cũng nghiên cứu thấy rằng L .acidophilus có khả năng sống 2
ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong dịch ruột.
Chúng có khả năng tạo ra các bacterocin như lactocidin, acidophilin. Ngồi ra,
chúng cịn có vai trị trong hoạt động sinh lí bình thường của cơ thể do chúng có
khả năng tổng hợp vitamin.
ðối với gà, người ta thấy rằng L. acidophilus có thể ức chế vi khuẩn gây
bệnh như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium cũng như E.coli.

2.2.2. BACILLUS SUBTILIS
B. subtilis ñược phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1835, ñược nhà khoa học
Christan Gottfried Ehrenberg ñặt tên là Vibrio subtilis. ðến năm 1872, Ferdinard
Cohn mới ñổi tên lại thành B. subtilis như ngày nay.
Cùng với sự phát hiện và phân lập được nhiều lồi Bacillus khác, Gordan và
các cộng sự ñã lần ñầu tiên nghiên cứu phân loại và ñịnh tên Bacillus. Hệ thống
phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái và vị trí của bào tử. Tuy nhên đặc điểm

hình thái dễ bị biến động và có giá trị phân loại thấp. Phương pháp phân loại và
định danh bằng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa có nhiều hạn chế về khí cạnh thời

Học viên Hoàng Tường Vi


24

gian, hiệu quả kinh tế, đơi khi khơng thể phân biệt sự khác nhau giữa nhóm, dẫn
đến nhầm lẫn khi phân loại đến lồi. Ứng dụng của khóa phân loại số cũng ñã làm
sáng tỏ mối quan hệ Bacillus ở mức độ lồi. Việc phân biệt các chi trong lồi chỉ
được thực hiện dựa vào trình tự RNA của các ñơn vị 16S. Toàn bộ bộ gen của
Bacillus ñã ñược khám phá, với số lượng khoảng 4.100 gen.
1.2.2.1.

Phân loại

Theo phân loại Bergey, Bacillus subtilis thuộc:
Ngành (Phylum): Protophyta
Lớp (Class): Schyzomycetes
Bộ (Order): Eubacteriales
Họ (Family): Bacillaceae
Giống (Genus): Bacillus
Lồi (Species): Bacillus subtilis[17]

1.2.2.2

ðặc điểm hình thái

B. subtilis là lồi vi khuẩn hiếu khí Gram dương, sống trong đất, có nhiều

trong bụi và cỏ khơ. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc B. subtilis không màu hay
màu vàng nhạt ñến xám, hơi nhăn, tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch. Xét về mặt
vi thể, B. subtilis cú hỡnh dng trc, kớch thc 3-5 ì0,5àm, thng xp thành
chuỗi và có khả năng di động bằng tiêm mao. Nhiệt ñộ phát triển khá rộng từ 35
oC ñến 45oC. Cũng như các loài khác thuộc giống Bacillus, B. subtilis có khả
năng tạo bào tử theo chu kỳ phát triển tự nhiên hay khi gặp ñiều kiện bất lợi về
enzyme nội bào, ngoại bào hay cạn kiệt nguồn dinh dưỡng. Bo t hỡnh bu dc cú
kớch thc 0,9 ì0,6àm, l nội bào tử nằm lệch tâm hay gần tâm, không làm biến
dạng tế bào mẹ. [17, 18]

Học viên Hoàng Tường Vi


25

1.2.2.3.

ðặc điểm sinh hóa

Lên men khơng sinh hơi các loại ñường sau ñây: Glucose, maltose, manitol,
saccharose, arabinose, salicin.
Indol

(–)

MR

(+)

VP

(+)

Nitrate

(+)

H2S

(–)

Catalase

(+)

Citrat

(+)

Di ñộng

(+)

ONPG

(+)

Urease

(–)

Oxidase

(–)

Gelatine

(+)

B. subtilis có khả năng chịu được nồng độ muối lên đến 7,5%, tạo được
enzyme phân giải tinh bột.
B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp bacitracin.[10,11,12]
1.2.2.4.

ðiều kiện nuôi cấy

B. subtilis là lồi vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.
B. subtilis mọc tốt trên mơi trường có nguồn Cacbon duy nhất là đường, axit
hữu cơ, rượu, … Nguồn Nitơ duy nhất là muối amon từ peptone, cao thịt. Ngồi ra
cịn có u cầu về các loại chất khống từ muối K+, Mg2+.
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 37 oC.
pH thích hợp trong khoảng 5,8 – 8,5.

Học viên Hoàng Tường Vi