Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme, thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo

-I-

Lời Cám Ơn
Xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Đức
Lượng, người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện luận
văn.
Xin cảm Ba mẹ và gia đình đã ni dưỡng và tạo điều kiện cho con được học
tập và thực hiện được luận văn này.
Xin bày tỏ lịng biết ơn cơ Nguyễn Thị Thùy Dương đã tận tình truyền đạt kiến
thức kinh, kinh nghiệm trong quá trình làm luận văn.
Xin chân thành biết ơn các Cơ trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ
và tạo điều kiện tốt cho tôi trong thời gian làm luận văn này.
Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tơi học tập, trao đổi, động viên và có
những giúp đỡ quý báu trong thời gian làm luận văn này
Cuối cùng tôi xin cám ơn chồng tôi, người đã động viên và luôn ở bên và giúp
tôi vượt qua giai đoạn khăn trong thời gian tôi thực hiện luận văn này.

Chu Thị Hà


- II -

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày
trong phần kết quả của luận văn này là do
chính bản thân tơi thực hiện, khơng sao chép
của người khác.
Chu Thị Hà

- III MỤC LỤC
LỚI CÁM ƠN .............................................................................................................................. I
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………………………….. II
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................................V
DANH MỤC ĐỒ THỊ .................................................................................................................VI
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................................VII
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................................................VIII
TÓM TẮT NỘI DUNG............................................................................................................... IX
ABSTRACT ...............................................................................................................................X

Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................... 1
Chương 2. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
2.1 Kiểm soát khả năng kháng khuẩn ......................................................................... 2
2.1.1 Tác nhân vật lý và hóa học ảnh hưởng đến việc kiểm soát sự phát triển của vi
khuẩn.............................................................................................................................. 2
2.1.2 Các ảnh hưởng đối với vi khuẩn ..................................................................... 3
2.2 Enzyme lysozyme ................................................................................................. 9
2.2.1 Cấu trúc của enzyme lysozyme. .................................................................... 10
2.2.2 Tính chất hóa học của enzyme lysozyme. .................................................... 12
2.2.3 Lysozyme ức chế vi khuẩn ............................................................................ 12
2.2.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm của lysozyme.................. 14
2.2.5 Tăng khả năng kháng khuẩn của lysozyme bằng cách kết hợp với một số chất
kháng khuẩn................................................................................................................. 15
2.2.6. Ứng Dụng của lysozyme trong các lãnh vực khác nhau trên thế giới .......... 21
2.2.7 Những nghiên cứu và ứng dụng lysozyme tại Việt Nam............................... 25
2.3 Bảo quản thịt heo ................................................................................................ 26
2.3.1 Các biến đổi của thịt sau khi giết mổ ............................................................ 26
2.3.2 Các dạng hư hỏng thịt ................................................................................... 27
2.3.3 Một số loại vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng của thịt........................... 28
2.3.3 Các phương pháp bảo quản thịt hiện nay....................................................... 30

Chương 3. MỤC TIÊU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 31
3.1 Nội dung của đề tài ............................................................................................. 31
3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 31
3.2.1.Nguyên liệu, giống vi sinh vật, hoá chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm..... 31
3.2.2 Phương pháp phân tích .................................................................................. 35
3.2.3 Xử lý số liệu................................................................................................... 36


- IV 3.2.4 Các phương pháp nghiên cứu cụ thể.............................................................. 37
Chương 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN ..................................................................... 44
4.1 Tương quan giữa nồng độ lysozyme và khả năng kháng E. coli, Listeria
monocytogens............................................................................................................... 44
4.2 Tương quan giữa nồng độ nisin và khả năng kháng E. coli, Listeria monocytogens
..................................................................................................................................... 45
4.3 Tương quan giữa nồng độ EDTA và khả năng kháng E. coli, Listeria
monocytogens............................................................................................................... 46
4.4 Khả năng khả năng kháng E. Coli, Listeria monocytogenes của hỗn hợp kháng
khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE). .................................................................... 46
4.5 Ảnh hưởng của các loại màng khác nhau đến lượng vi sinh vật trên mặt thịt trong
quá trình bảo quản........................................................................................................ 49
4.6 Tác dụng kháng vi sinh vật các tác nhân kháng khuẩn gắn lên màng gelatin trong
5 tuần............................................................................................................................ 51
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 55
5.1 Kết luận............................................................................................................... 55
5.2 Kiến nghị............................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 56


-V-

DANH MỤC BẢNG
Bảng
Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo của thành tế bào của vi khuẩn………………. …....
..
Bảng 2.2 Tác dụng của lysozyme lên các vi sinh vật khác nhau từ các nguồn thực
phẩm khác nhau………………………………............................................

Trang

4
23

Bảng 3.1 Phương pháp pha dung dịch lysozyme có nồng độ cần khảo sát…………

38

Bảng 3.2 Phương pháp pha dung dịch nisin có nồng độ cần khảo
sát………………

39

Bảng 3.3 Phương pháp pha dung dịch EDTA có nồng độ cần khảo sát……………

39

Bảng 3.4 Phương pháp pha hỗn hợp dung dịch kháng Listeria monocytogenes có
nồng độ cần khảo sát……………………………………………………...

40

Bảng 3.5 Phương pháp pha hỗn hợp dung dịch kháng E.coli có nồng độ cần khảo sát……

41

Bảng 3.6 Thành phần các chất có trong màng kháng Listeria monocytogenes…………

42

Bảng 3.7 Thành phần các chất có trong màng kháng E.coli……………………………

43

Bảng 4.1 Tương quan giữa giữa nồng độ lysozyme và hiệu suất kháng E. coli,
Listeria monocytogens…………………………………………………….

44

Bảng 4.2 Tương quan giữa nồng độ nisin và hiệu suất kháng E. coli, Listeria
monocytogens

45

Bảng 4.3 Tương quan giữa nồng độ EDTA và hiệu suất kháng E. coli, Listeria
monocytogens……………………………………………………………...
.
Bảng 4.4 Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ các chất trong hỗn hợp LNE
đối với E.coli ………………………………………………………….......
Bảng 4.4 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng
gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần ……………………
Bảng 4.5 Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ các chất trong hỗn hợp LNE

đối với Listeria monocytogenes …………………………………………
Bảng 4.6 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng
gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần ……………………
Bảng 4.7 Tác dụng kháng E.coli trên bề mặt thịt của màng gelatin có gắn các tác
nhân kháng khuẩn trong 5 tuần …………………………………………...

46
47
48
51
51
53


- VI -

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị
Đồ thị 4.1 Bề mặt đáp ứng của hiệu suất kháng Listeria monocytogenes đối với
các nhân tố kháng khuẩn………………………………………………
Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của các màng kháng khuẩn khác nhau lên lương Listeria
monocytogenes trên bề mặt thịt…………………………………………
Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của các màng kháng khuẩn khác nhau lên lương E. Coli
trên bề mặt thịt…………………………………………………………
Đồ thị 4.4 Khả năng khả năng kháng E. Coli, Listeria monocytogenes của hỗn
hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE)………………
Đồ thị 4.5 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng
gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần…………………
Đồ thị 4.6 Tác dụng kháng E.coli trên bề mặt thịt của màng gelatin có gắn các
tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần………………………………………

Trang

47
49
50
52
52
53


- VII -

DANH MỤC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1 Cấu tạo lớp peptidoglican……………………………………………

5

Hình 2.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G+, G_………………………………

8

Hình 2.3 Các cách tác động của chất kháng khuẩn lên vi khuẩn………………

9

Hình 2.4 Cấu trúc bậc một của lysozyme………………………………………

10

Hình 2.5 Cấu trúc bậc 3 của lysozyme…………………………………………

11

Hình 2.6 Cơ chế phân cắt cơ chất của lysozyme ………………………………

14

Hình 2.7 Cấu tạo của Nisin……………………………………………………

15

Hình 2.8 Phân tử EDTA………………………………………………………

16


- VIII -

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ đầy đủ

Từ viết tắt

Escherichia coli

E. coli

Ethylenediaminetetraacetic

EDTA

Gram âm

G-

Gram dương

G+

Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme - nisin

NE

Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme - EDTA

LE

Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin

LN

Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin - EDTA
Màng kháng khuẩn gelatin
Màng kháng khuẩn gelatin có gắn EDTA
Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme –

EDTA
Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin
Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin
- EDTA
Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn nisin - EDTA

LNE
G
GE
GLE
GLN
GLNE
GNE

Màng kháng khuẩn gelatin có gắn lysozyme

GL

Màng kháng khuẩn gelatin có gắn nisin

GN

Mẫu trắng

C

Môi trường lỏng dinh dưỡng nutrient broth

NB

Môi trường rắn dinh dưỡng nutrient agar

NA

N-acetylglucosamine

NAG

N-acetylmuramic

NAM

Peptidoglican

PG


- IX -

TÓM TẮT NỘI DUNG
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme và thử nghiệm
sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo
Lysozyme là enzyme được tìm thầy nhiều trong lịng trắng trứng, nước
mắt, sữa, nước bọt và một số loại rau, củ, quả. Enzyme này có hoạt tính làm tan
thành tế bào vi khuẩn bằng cách thủy phân liên kết 1,4 giữa acit N-acetyl
muramic, N-acetyl glucosamine của mucopolysacharit trong peptidoglucan của
thành tế bào vi khuẩn. Lysozyme được Fleming phát hiện năm 1922 từ đó đến
nay đã có nhiều nghiên cứu nhiều về tính chất, cũng như ứng dụng. Nghiên cứu
này khảo sát khả năng kháng khuẩn (G+, G-) của lysozyme, tăng cường khả năng
này bằng cách kết hợp với các tác nhân kháng khuẩn khác, và bước đầu tiến

hành thử nghiệm bảo quản thịt heo bằng cách tạo màng kháng khuẩn.
Sử dụng hai loại vi sinh vật chỉ thị E. Coli, listeria monocytogenes để
khảo sát khả năng kháng khuẩn của lysozyme, và hỗn hợp chứa lysozyme chúng
tôi thu được kết quả như sau:
Lysozyme có hiệu quả khi chống lại Listeria monocytogenes nhưng bị
hạn chế đối với E. coli.
Với nồng độ 500 µg/ml diệt được 99,99 % Listeria monocytogenes,
48.917% đối với E.coli
Khi kết hợp với EDTA, nisin thì khả năng kháng khuẩn của lysozyme
được tăng cường.
o Để ức chế 99,99 Listeria monocytogenes, lysozyme kết hợp với nisin
theo tỷ lệ: 150:125
o Để ức chế 99,012 , lysozyme kết hợp với nisin và EDTA theo tỷ lệ
lysozyme:nisin:EDTA: 500:500:125
Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: 150:125 để phủ lên
miếng thịt nạc 1g nhiễm Listeria monocytogenes
thì lượng Listeria
0
monocytogenes sau 24h ở nhiệt độ 4 C giảm nhiều hơn so với từng tác nhân gắn
lên màng.
Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: EDTA để phủ lên
miếng thịt nạc 1g nhiễm E.coli thì lượng sau 24h ở nhiệt độ 40C giảm nhiều
hơn so với từng tác nhân gắn lên màng E.coli .
Đối với thịt cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để trong môi trường lạnh thì
màng GLN chỉ có tác dụng ức chế được Listeria monocytogenes trong 7 ngày,
sau đó hoạt tính giảm dần theo thời gian.
Đối với thit cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để trong mơi trường lạnh thì
màng GLNE chỉ có tác dụng ức chế được E.coli trong 35 ngày.

-X-

ABSTRACT
Survey the antiviral ability of lysozyme, initiating experiment sticking
enzyme lysozyme the antimicrobial film to preserve pork.
Lysozyme is one kind of enzyme found mostly in egg white, tear , slaver
and several kinds of vegetable. This enzyme has the ability to dissolve
bacterium’s cell wall by hydrolysising the link 1-4 between acit N-acetyl
muramic, N-acetyl glucosamine of mucopolysacharit in peptidoglucan of
bacterium’s cell wall. Lysozyme was found by Fleming in 1922 and have been
attracting many researches and applications since then. This research survey the
antiviral ability (G+, G-) of lysozyme, strengthening this ability by combining
with others agent that have antiviral ability. This also initially experiment
preserving pork by creating the antiviral membrane
Using two kinds of micro-organism as indicators: E.coli and listeria
monocytogenes to screen antiviral ability of lysozyme, and the compound that
contain lysozyme, we obtain result as follow:
Lysozyme has effectiveness when it resists Listeria monocytogenes, but
restricts to E. coli. With the concentration of 500 µg/ml, Lysozyme can kill
99,99 % Listeria monocytogenes, 48.917% E.coli
Antiviral ability of lysozyme will be strengthened when combine with
EDTA, nisin.
Combination of 150 µg/ml lysozyme and 125 µg/ml nisin treatments
inhibit 99,99% Listeria monocytogenes
Combination of 500 µg/ml lysozyme and 500 µg/ml nisin, 125 EDTA
treatments inhibit 99,012% E.coli
Stick agents of antiviral ability on to the gelatin film (7%) that contain
lysozyme, nisin, mixture of lysozyme – nisin respectively , then use it to cover a
piece of 1gram pork which is inoculated Listeria monocytogenes
in

environment of 4 degree Celcius, 24 hours. The result is that the quatity of
Listeria monocytogenes most decreased when we use the film containing
lysozyme – nisin.
Stick agents of antiviral ability on to the gelatin film (7%) that contain
lysozyme, nisin, mixture of lysozyme – nisin respectively , then use it to cover a
piece of 1gram pork which is inoculated E.coli in environment of 4 degree
Celcius, 24 hours. The result is that the quatity of E.coli most decreased when
we use the membrane containing lysozyme – nisin – EDTA.
For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of 4
degree Celcius, Lysozyme only inhibit Listeria monocytogenes in 7 days, after
that, its active ability decrease gradually.
For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of 4
degree Celcius, Lysozyme only inhibit E.coli in 35 days


- XI -


-1-

Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Cục an toàn thực phẩm – Bộ y tế, trong 5 năm (2001-2005) cả nước
xảy ra gần 1.000 vụ với hơn 23.000 người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó có hơn
260 người chết. Qua phân tích, ngộ độc do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm
tỷ lệ cao nhất (33-49%), do hóa chất (11-27%), do chất độc tự nhiên (6-25%),
cịn lại khơng xác định được nguyên nhân. Tỷ lệ tử vong 2005 được xác nhận là
tăng 90% so với năm 2004.So cùng kỳ năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm và số
người mắc trong năm 2007 đều tăng từ hơn 6% đến 22,4%, riêng số người chết
giảm hơn 40%. Những vi sinh vật chủ yếu gây ngộ độc là Salmonella anatum,
Listeria monocytogens, Escherichia coli, và Campylobacte [7].

Như vậy, thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh
dưỡng cho con người phát triển, duy trì sự sống và lao động, mà thực phẩm còn
là nguyên nhân gây ngộ độc cho con người, nếu như các biện pháp an toàn thực
phẩm không được chúng ta tuân thủ.
Một trong những phương pháp ức chế vi sinh vật, đó là sử dụng những tác
nhân gây ức chế quá trình sinh sản và phát triển của vi sinh vật. Các tác nhân này
có thể là những hợp chất hóa học được tổng hợp nhân tạo và cũng có thể là
những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên. Xu hướng ngày nay, hạn chế sử dụng
hóa chất , tăng cường sử dụng các tác nhân sinh học để bảo quản thực phẩm. Do
đó, có nhiều nghiên cứu đã và đang tiến hành để tìm kiếm và sử dụng các tác
nhân sinh học trong công nghiệp thực phẩm nói chung và trong bảo quản thực
phẩm nói riêng.
Một trong những tác nhân kháng khuẩn tự nhiên là lysozyme, một loại
enzyme có trong trứng gà, nước mắt, một số loại thực vật…. Lysozyme có tác
dụng ức chế vi sinh vật với cơ chế phá hủy thành tế bào vi khuẩn. Do cấu tạo
thành tế bào của hai loại vi khuẩn Gram dương, Gram âm khác nhau nên khả
năng kháng khuẩn của lysozyme chỉ hiệu quả cao đối với vi khuẩn Gram dương,
đối với vi khuẩn Gram âm thì thấp hơn. Vì vậy cần phải nghiên cứu hiệu quả
tương tác của lysozyme với các chất khác để tăng cường khả năng sử dụng
lysozyme ức chế nhiều loại vi sinh vật đồng thời ứng dụng bảo quản các loại
thực phẩm khác nhau bằng lysozyme. Được sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn
Đức Lượng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng kháng
khuẩn của enzyme lysozyme và thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao
kháng khuẩn để bảo quản thịt heo”
Đề tài này mang ý nghĩa khoa học: Góp phần giải quyết được một phần
vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và ứng dụng
lysozyme trong thực phẩm và các ngành khác.
Yêu cầu của đề tài: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của lysozyme đối với
các vi sinh vật chỉ thị. Tạo được màng bao kháng khuẩn có chứa lysozyme. Khảo
sát tác dụng bảo quản của màng bao lên thực phẩm được bảo quản

-2-

Chương 2. TỔNG QUAN
2.1 Kiểm soát khả năng kháng khuẩn
Việc kiểm soát sự phát triển của các vi sinh vật có trong mơi trường khơng
khí trong nhà, mơi trường cơng nghiệp, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm và
công nghệ sản xuất dược phẩm là rất cần thiết. Kiểm soát q trình sống của vi
sinh vật có thể giúp ngăn chặn và điều trị các căn bệnh lây nhiễm, kìm hãm sự
phân hủy thực phẩm và các sản phẩm công nghiệp khác. Hiện nay, phương pháp
phổ biến để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn là sử dụng các tác nhân hóa học
và tác nhân vật lý. Đây là những tác nhân ảnh hưởng lên cấu trúc và chức năng
của tế bào, từ đó sản xuất các chất diệt khuẩn hay các chất kìm hãm sự phát triển
của vi khuẩn. Khái niệm hiệu quả diệt khuẩn được hiểu là khả năng tiêu diệt vi
khuẩn ngay lập tức hoặc kìm hãm sự tái tạo số lượng tế bào và duy trì số vi
khuẩn ở một lượng nhất định. Việc quan tâm đến dạng hoạt động của các tác
nhân hóa học và tác nhân vật lý là rất cần thiết nhằm lựa chọn và ứng dụng hình
thức kiểm sốt sự phát triển của vi khuẩn một cách thích hợp.
2.1.1 Tác nhân vật lý và hóa học ảnh hưởng đến việc kiểm sốt sự phát
triển của vi khuẩn
Tác nhân hóa học
Có thể sử dụng các hóa chất có tác dụng tiệt trùng, khử trùng hoặc tẩy uế
để điều khiển sự phát triển của vi khuẩn.
Tiệt trùng là dùng kỹ thuật vật lý hoặc hoá học để diệt tất cả những dạng sống
của vi khuẩn. Tẩy uế nói chung là một q trình gây chết ít, trong đó, nội bào tử vi
khuẩn thường không vô hoạt nếu không để cho tiếp xúc thời gian lâu với những chất tẩy
uế có nồng độ cao. Khử trùng là dùng chất sát trùng tác động lên mô sống nhằm ức chế
hoặc phá huỷ vi sinh vật. Một số chất sát trùng có thể được sử dụng với cả hai vai trò:
tẩy uế và sát trùng.

Tác nhân vật lý
Các phương pháp vật lý để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn bao gồm:
− Ảnh hưởng của nhiệt độ
− Ảnh hưởng của các tia bức xạ
− Ảnh hưởng của áp suất thấm lọc


-3-

− Ảnh hưởng của quá trình sấy
− Ảnh hưởng của dao động sóng âm
− Ảnh hưởng của q trình lọc
2.1.2 Các ảnh hưởng đối với vi khuẩn
Các tác nhân vật lý và hóa học có hoạt tính khác nhau đối với quá trình
phát triển của vi khuẩn. Các tác nhân này tạo ra sự tổn hại, ảnh hưởng đến cấu
trúc của một hoặc nhiều tế bào chính làm cho tế bào hoặc kìm hãm sự phát triển
của tế bào. Cơ chế của quá trình này là làm cho các bộ phận của tế bào như thành
tế bào, tế bào chất, enzyme và các axít nucleic khơng cịn đảm nhận tốt chức
năng của nó. Các tác nhân có gây ra ảnh hưởng sau đối với tế bào:
Tổn thương thành tế bào
Việc làm tổn thương thành tế bào có thể đạt được bằng hai cách. Một là,
các tác nhân sẽ có tác dụng phá hủy một phần hoặc toàn bộ thành tế bào và làm
cho chất nguyên sinh bị tổn thương. Hai là, một số tác nhân khác sẽ kìm hãm sự
tổng hợp thành tế bào, đây là một quá trình cần thiết trong suốt quá trình tái tạo tế
bào của vi khuẩn. Lúc này, do thành tế bào đã bị tổn thương, tế bào vi khuẩn trở
nên dễ bị tiêu diệt vì chất ngun sinh của nó khơng được bảo vệ. Có sự khác
biệt về cấu tạo giữa vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Chính sự khác
biệt này đã tạo ra cơ chế ức chế của lysozyme đối với vi khuẩn gram âm và
dương khác nhau. Lysozyme phân cắt liên kết β(1-4) glycosidic giữa C1 của Nacetylmuramic acid và C4 của N-acetylglucosamine, một liên kết tạo nên thành

tế bào vi khuẩn. Thành tế bào có chức năng: duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ
sự chuyển động của tiên mao , giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ
quá trình phân cắt tế bào , cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn,
liên quan đến tính kháng ngun , tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn
thể. Nồng độ đường và muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngồi tế bào vì
vậy mà tế bào hấp thu khá nhiều nước từ môi trường từ bên ngoài vào, điều này
dẫn đến tế bào sẽ bị phá vỡ nếu khơng có thành vững chắc. Trong những trường
hợp sau khơng quan sát thấy có sự tồn tại của thành tế bào:


-4-

Thể nguyên sinh. Sau khi dung lysozyme để phá vỡ thành tế bào hoặc
dung penixilin để ức chế việc tổng hợp thành tế bào có thể tạo ra những tế bào
chỉ được bao bọc bởi màng tế bào chất. Thường gặp ở vi khuẩn G+ .
Thể trần. Thể nguyên sinh chỉ cịn sót lại một phần của thành tế bào,
thường chỉ gặp ở vi khuẩn G - .
Vi khuẩn dạng L. Chủng vi khuẩn thiếu thành tế bào được sinh ra do đột
biến trong phịng thí nghiệm. Tế bào của chúng phình to lên và rất mẫn cảm với
áp suất thẩm thấu, trên môi trường đặc, khuẩn lạc nhỏ bé và có dạng ốp lết.
Microplasma. Một dạng vi khuẩn khơng có thành tế bào sinh ra trong q
trình tiến hóa lâu dài của tự nhiên.
Thể nguyên sinh và thể cầu có đặc điểm chung là khơng có thành tế bào,
tế bào trở lên có hình cầu, rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu, có thể có tiêm mao
nhưng khơng di động được, không mẫn cảm với thể thực khuẩn, tế bào khơng
phân cắt được…Nếu đang hình thành bào tử trước khi sinh ra thể nguyên sinh thì
bào tử này vẫn hình thành một cách bình thường.
Hoạt tính kháng khuẩn của lysozyme chỉ hiệu quả đối với vi khuẩn gram
dương (G+), cịn đối với vi khuẩn gram âm hoạt tính kháng khuẩn của lysozyme
lại bị hạn chế. Do vị trí và tỷ lệ của peptidoglican trong thành tế bào vi khuẩn

gram dương và gram âm là khác nhau nên khả năng kháng khuẩn có sự khác
nhau. . Một sai khác chủ yếu như sau về tỉ lệ các thành phần của thành tế bào:
Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo của thành tế bào của vi khuẩn
Thành phần

Tỉ lệ % theo khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn
G+

G-

30-95

5-20

cao

0

Lipit

hầu như khơng có

20

Protein

khơng có hoặc ít

cao

Peptidoglican
Axit teicoic

(Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, Vi Sinh Vật Học)


-5-

Cấu tạo thành tế bào vi khuẩnG+
Peptidoglican là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững, bao
quanh tế bào như một mạng lưới. Cấu trúc cơ bản của peptidoglican gồm có 3
thành phần: N-axetylglucozamin (NAG), axit N-axetylmuramic (NAM) và
tetrapeptit chứa cả L và D axit amin. Để tạo thành mạng lưới cứng, tetrapeptit
trên mỗi chuỗi peptidoglican (PG) liên kết chéo với các tetrapeptit trên chuỗi
khác. Cấu tạo của lơp peptidoglican được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 cấu tạo lớp peptidoglican
(Nguồn: )
Axit teicoic là một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+. Axit
teicoic là polime của ribitol và glixerol phosphate liên kết với PG hoặc màng tế
bào chất. Loại liên kết với màng tế bào chất được gọi là axit lipoteicoic. Do tích
điện âm, axit teicoic giúp cho việc vận chuyển các ion dương vào, ra tế bào và
giúp tế bào dự trữ phosphate. Ngoài ra axit teicoic còn liên quan đến kháng
nguyên bề mặt và tính gây bệnh của một số vi khuẩn G+. Chúng còn gọi là thụ
thể hấp phụ đặc biệt đối với một số thể thực khuẩn. Như vậy, nếu sử dụng
lysozyme để phá vỡ thành thì tế bào sẽ hình thành thể nguyên sinh, mất kháng
nguyên dễ bị tổn thương. Năm 1957, Salton đã phát hiện ra cơ chế hoạt động của
lysozyme, khi mà ông sử dụng 3 loại vi khuẩn gram dương để chứng minh
lysozyme làm mất đi hoàn toàn thành tế bào của những vi khuẩn này và phóng
thích acetyl amino đường và acetyl muranic acid [25].

-6-

Thành tế bào GVi khuẩn G- có thành tế bào với cấu trúc khá phức tạp. Lớp ngoài cùng
của thành phần tế bào là hai lớp lipopolisaccarit có đan xen với các phân tử
protein. Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn
cơng của các vi khuẩn khác. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua
nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào
(thuốc nhuộm, một số chất kháng sinh, muối mật, muối kim loại năng, một số
enzyme phân giải).
Thành tế bào vi khuẩn gram âm có cấu tạo như sau:
Lớp trong cùng là một lớp PG mỏng. PG của vi khuẩn G- chỉ khoảng 510%, tiếp theo lớp PG là một lớp không gian chu chất và cuối cùng là lớp màng
ngoài.
- Màng ngoài là lipopolisaccarit (LPS). LPS dày khoảng 8-10 nm và cấu
tạo bởi 3 thành phần như sau:
+ Lipit A: bao gồm 2 phân tử N-axetylglucozamin và 5 chuỗi dài axit béo.
Phần lipit A là nội độc tố của vi khuẩn, gây ra sốt, tiêu chảy, phá hủy hồng cầu và
dẫn đến sốc, gây nguy hiểm.
+ Polisaccarit lõi:
Vùng lõi trong: gồm 3 phân tử KDO (ketodexyoctulosonic acid) và 3 phân
tử Hep (L-glixerin-D-heptose).
Vùng lõi ngoài: các phân tử hexozơ (bao gồm glucozamin, galactozơ,
glucozơ).
+ Kháng nguyên O: phần polisaccarit vươn khỏi màng vào môi trường,
gồm các phân tử hexozơ (bao gồm galactozơ, ramnozơ, mannozơ, abequozơ).
Kháng nguyên O quyết định nhiều đặc tính huyết thanh của các vi khuẩn có chứa
LPS và là vị trí gắn (thụ thể) của thể thực khuẩn.
Màng ngồi của vi khuẩn G- cịn có thể chứa một số loại protein, đó là:

-7-

Protein cơ chất (matrix protein): chẳng hạn porin ở vi khuẩn E.coli. Porin
còn gọi là protein lỗ. Các protein này nằm xuyên suốt qua màng ngoài và cho
phép đi qua chúng một số loại phân tử như đường (nhất là disaccarit), axit amin,
dipeptit, tripeptit, penixilin và các ion vô cơ.
Protein màng ngồi (outer membrane protein, OMP): OMP là loại protein
có năng lực vận chuyển chuyên biệt một số phân tử khá lớn và đưa chúng đi qua
màng ngoài, như vitamin B12, nucleotit, fericrom, enterokelin.
Lipoprotein: bao gồm rất nhiều chủng loại, chủ yếu là các lipoprotein có
khối lượng phân tử 7200, chúng có vai trị liên kết giữa lớp PG bên trong với lớp
màng ngoài.
Sự hiện diện của màng ngoài vi khuẩn đã hỗ trợ hàng rào thấm lọc chính
chống lại các phân tử nguy hiểm như lysozyme và chất kháng sinh.
- Lớp không gian chu chất: lớp không gian chu chất khơng chỉ ở giữa lớp
màng ngồi và lớp PG mỏng ở thành tế bào vi khuẩn G- mà còn có ở giữa lớp
thành tế bào và lớp màng tế bào chất của cả vi khuẩn G+ lẫn vi khuẩn G-. Bên
trong lớp này có chứa rất nhiều thành phần như proteinaza, nucleaza, protein vận
chuyển qua màng, protein thụ thể (làm chỗ bám của thể thực khuẩn)… Ngồi ra,
nó cũng chứa enzyme phân giải làm vỡ các chất nền không vận chuyển được và
tạo thành các chất dinh dưỡng vận chuyển được.
- Lớp trong chứa một lớp đơn peptidoglican mỏng (5-20nm) không chứa
acid teichoic [2]
Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G- và G+ được mơ tả ở hình 2.2 dưới đây


-8-

Hình 2.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G+, G( nguồn www.employees.csbsju.edu)

Phá hủy màng tế bào
Việc điều khiển sự phát triển của vi khuẩn có thể đạt được bằng cách phá
huỷ màng tế bào, đây cũng là nguyên nhân gián tiếp gây chết tế bào. Hơn nữa,
bản chất lựa chọn của màng có thể bị ảnh hưởng mà khơng gây phá hủy hoàn
toàn. Hậu quả dẫn đến là làm giảm đi các phân tử tế bào chính hoặc cản trở sự
hấp thu chất dinh dưỡng của màng tế bào vi khuẩn. Trong cả hai trường hợp, quá
trình trao đổi chất sẽ bị ảnh hưởng.
Sự biến đổi trạng thái của tế bào chất
Khi xảy ra sự biến đổi trạng thái của tế bào chất, tế bào sẽ bị phá huỷ bởi
vì các tác nhân điều khiển sẽ tạo nên sự biến chất protein của tế bào chất. Các
protein bị đông lại, trong trạng thái dạng khối, cục và do đó không thể hoạt động
về mặt sinh học.


-9-

Khử hoạt tính của enzyme
Tuỳ thuộc vào hoạt tính của tác nhân hóa học hoặc tác nhân vật lý được
đưa vào để điều khiển quá trình phát triển của vi khuẩn mà enzyme do vi khuẩn
tạo ra sẽ bị khử hoạt tính. Khi này, tế bào khơng thể thực hiện các chức năng
sống thiết yếu của nó. Việc khử hoạt tính của enzyme được thực hiện thơng qua
cơ chế kìm hãm cạnh tranh hoặc cơ chế kìm hãm khơng cạnh tranh.
Thay đổi cấu trúc và chức năng của phân tử ADN
Phân tử ADN là trung tâm điều khiển tế bào. Vì vậy, tác động vào ADN
sẽ làm tế bào kìm hãm sự phát triển hoặc thậm chí có thể tiêu diệt tế bào vi
khuẩn. Các tác nhân tác động lên ADN gây nên nhiều chổ nứt hoặc bóp méo cấu
trúc phân tử ADN, từ đó gây cản trở sự tái tạo và vai trò trong tổng hợp protein
của ADN.
Các ảnh hưởng nói trên của các tác nhân đến vi khuẩn được thể hiện ở
hình 2.3

Hình 2.3 Các cách tác động của chất kháng khuẩn lên vi khuẩn
2.2 Enzyme lysozyme
Lysozyme được Fleming khám phá lần đầu tiên ở trong nước mũi vào
năm 1922. Chẳng bao lâu sau, Fleming khám phá hoạt tính phân hủy vi khuẩn
của lysozyme tìm thấy trong lịng trắng trứng, nước mắt, sữa, nước miếng và một
số loại rau củ. Tên lysozyme bắt nguồn từ chữ enzyme và hoạt tính làm tan thành
tế bào vi khuẩn. Ơng đã chứng minh được lysozyme là một chất kháng vi khuẩn
Gram dương.


- 10 -

2.2.1 Cấu trúc của enzyme lysozyme.
Lysozyme từ lòng trắng trứng gà là loại đầu tiên nhờ kỹ thuật 3-D, xác
định cấu trúc và tính chất [9].
EC 3-2-1-17, lysozyme (muramidase, mucopeptit N-acetylhydrolase) từ
lòng trắng trứng gà là một polypeptit gồm 129 gốc acid amino có phân tử lượng
14400. Lysozyme là một protein tích điện dương với điểm đẳng điện 10.7-11.
Trong lòng trắng trứng, lysozyme chiếm khoảng 3.5% trong tổng lượng protein.
Lyszoyme là một enzyme có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram-dương bằng
cách thủy phân liên kết -1,4 giữa acid N-acetylmuramic (NAM) và Nacetylglucosamine (NAG) của mucopolysaccharid trong peptidoglican của thành
tế bào vi khuẩn.

Hình 2. 4 Cấu trúc bậc một của lysozyme (Nguồn: Astrid Rau,Structure of the muramidase)

Lysozyme là protein có trật tự và cấu trúc 3-D được phân tích tồn diện.
Lysozyme từ lịng trắng trứng gà là một protein monomeric, chứa 4 cầu nối
disulfit: Cys 6-127, 30-115, 64-80, và 76-94 và khơng có nhóm sulfhydryl tự do

- 11 -

nào. Lysozyme có cấu trúc bền bỉ trong dung dịch hòa tan nước. Khi các nối
disulfit bị mất đi, lysozyme chuyển từ cấu trúc nguyên thủy sang cấu trúc lỏng.
Phân tử lysozyme có dạng hình trứng, chứa hai vùng hay hai thùy, liên kết
bởi một -helix dài, ở giữa là vị trí hoạt động của enzyme. Thuỳ dưới được tạo bởi
các gốc 40-88, chứa vài cấu trúc xoắn ốc và phần lớn các cấu trúc -sheet không
song song. Thuỳ thứ trên được tạo bởi gốc 1-39 và 89-129, chủ yếu là các cấu
trúc xoăn ốc lớn. Hai thùy của phân tử được liên kết với nhau thông qua tương
tác giữa gốc Lys 97 và gốc Phe 38. Phân tử cấu tạo theo quy luật “kị nước ở
trong”, “hút nước ở ngồi” của protein, tất cả các nhóm phân cực nằm trên bề
mặt và đa số các nhóm khơng phân cực (kị nước) nằm bên trong. [23]
Sự chuyển đổi trạng thái để thích nghi của lysozyme liên quan đến sự
chuyển động của hai thùy tương tác với nhau, do đó cho phép các chuyển động
quan trọng của các vùng cấu trúc bên trong phân tử. Sự chuyển động của hai thùy
gây ảnh hưởng lẫn nhau giữa các vùng trong phân tử lysozyme, gây ra một sự
thay đổi toàn diện về hình dạng, từ đó có thể cho phép lysozyme xâm nhập vào
chất nền và tạo ra mơi trường thích hợp cho các xúc tác. Sự chuyển đổi hình thái
để thích nghi của lysozyme có vai trị quan trọng trong hoạt tính enzyme. [23]

α helix

Cystine S–S
Liên kết disulfit

β bend
β sheet

Hình 2.5 Cấu trúc bậc 3 của lysozyme

(nguồn: )


- 12 -

Mơ hình của lysozyme được vẽ bằng máy tính. Các gốc Cα làm thành
xương sống của lysozyme, có màu xanh và lớp vỏ protein màu tím. Nhìn tổng
qt, lớp vỏ protein có dạng hình elip. Các axit amin quan trọng cho xúc tác là
gluctamtae-35 (Glu-35) và aspartate (Asp-52). Rãnh trong của lysozyme là nơi
chất nền được kết nối vào.
2.2.2 Tính chất hóa học của enzyme lysozyme. [17]
Kể từ khi được Alexander Fleming phát hiện ra lysozyme, đã có nhiều
nghiên cứu về đặc tính kháng khuẩn của enzyme này đối với nhiều loại vi sinh
vật khác nhau và các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của nó như nhiệt độ, pH,
ion… cụ thể các tác nhân ảnh hưởng như sau:
pH: một số nhà nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm trong mơi trường
trung tính và mơi trường acid, đã nhận thấy rằng đối với lysozyme có nguồn gốc
từ trứng gà có vùng pH hoạt động là 6.0-7.0, cịn pH tối thích khoảng 6.2. Đối
với lysozyme sị, pH tối thích trong điều kiện có ion là khoảng 5.5 đến 6.0.
Nhiệt độ: Khả năng phân cắt thành tế bào của lysozyme trong lòng trắng
trứng tăng dần khi nhiệt độ tăng (khoảng 60o C). Lysozyme sị có họat tính tăng
khi nhiệt độ tăng dần từ 00 – 450C và giảm dần khi nhiệt độ lớn hơn 550C [30].
Sự có mặt của các chất hoạt hóa: lysozyme có họat tính phân cắt lớn nhất
khi có mặt của muối kali, magiê, canxi với nồng độ khoảng 0,1.
2.2.3 Lysozyme ức chế vi khuẩn
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được rằng lysozyme có khả năng ức
chế sự phát triển của cả Gram dương bằng hoạt tính enzyme và Gram âm khơng
bằng hoạt tính enzyme . [18]
Có 6 vịng đường kết gắn với trung tâm hoạt động của lysozyme. Khi tiếp
xúc với trung tâm hoạt động của lysozyme NAM và NAG của peptidoglican liên

kết với nhau tạo thành một hexasaccharid theo thứ tự sau đây: NAM NAG NAM
NAG NAM NAG được ký hiệu A, B,C, D, E, F. Lysozyme phân cắt liên kết β(14) glycosidic giữa vị trí D và E.


- 13 -

Quá trình phân cắt của enzyme này đối với peptidoglican trải qua các giai
đoạn sau:
ƒ Giai đoạn I: trung tâm hoạt động của lysozyme là một rãnh, chạy dọc
phân tử enzyme. Ba vịng đường ở vị trí D, E, F đi vào trung tâm hoạt
động của enzyme. Do có sự xoắn từ hình dạng ghế (chair) sang nửa ghế
(half chair) với trạng thái tự nhiên của vòng đường thứ D (vị trí
hexasaccharid bị cắt bởi lysozyme chính tại liên kết glycosidic của vòng
cacbon D và E) mà hexasaccharid mới có thể gắn vào được trung tâm
hoạt động của lysozyme.
ƒ Giai đoạn II: Sau khi vị trí thứ 4 bị xoắn làm cho liên kết glycosidic
giữa vị trí thứ D và E bị giãn ra. Làm cho năng lượng của liên kết này
chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động. Amino acid Glu 35
gần 2 vị trí D và E (cách cầu nối –O– bị bẻ gãy khoảng 3 Ao) cung cấp
tính chất hóa học thích hợp để hồn thành việc liên kết.
ƒ Giai đoạn III: Nhóm carboxyl tự do của acid glutamic thứ 35 là chất
nhường hydrogen và có khả năng chuyển H+ sang nguyên tử Oxy. Khi bị
mất điện tử Cacbon của Glu34 mang điện tích dương. Bình thường ion
cacbon khơng ổn định , nhưng nhờ lực hút điện tích âm nhóm carboxyl
của Asp-52 sẽ tạo nên lực hút làm cho ion –OH có thể gắn với cacbon .
Tại pH=7, H20 sẽ phân ly thành H+ và OH- . Sau đó H+ sẽ di chuyển về
phía trái để thay thế vị trí đã mất của Glu-35. Kết quả l hexasaccharide sẽ
bị phân cắt và enzyme sẽ trở lại trạng thái ban đầu của chúng.

- 14 -

Hình 2.6 Cơ chế phân cắt cơ chất của lysozyme
(www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a)
Lysozyme ức chế vi khuẩn gram âm không nhờ trung tâm hoạt động mà phụ
thuộc vào cấu trúc xoắn ốc ở hai bên thùy. Đoạn cuối C (C-terminal) của cấu trúc xoắn
ốc sẽ tấn công vào kênh vận chuyển của lớp màng ngồi và phá hủy màng trong thơng
qua prolein lỗ.

2.2.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm của lysozyme.
Năm 1957, Salton đã sử dụng lysozyme là tác nhân kháng 3 vi khuẩn
Micococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, và Bacillus megaterium thì thấy có sự
phóng thích các nhóm đường acetyl amino. Hoạt tính của lysozyme được xác
định bằng cách đo độ đục của huyền phù và xác định lượng cơ chất tự do bị
phóng thích [25].
Nếu như lysozyme phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn gram dương bằng
việc phân cắt peptidoglican, thì việc ức chế của lysozyme với gram âm theo cơ
chế nào? Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy, khi thành tế bào đã cô lập
của một loại vi khuẩn gram âm nào đó được ủ với lysozyme, thì độ đục của
huyền phù bị giảm đi khơng đáng kể. Điều này có thể giải thích là do những hợp
chất khơng bị phân tách phóng thích bởi lysozyme bao gồm: alanine, axit
glutamic, axit diaminopimelic, một phần nhỏ axit muramic, và axit amin [25].
Trong một nghiên cứu của Ibarahim chỉ ra rằng hoạt tính kháng khuẩn của