Xây dựng quy trình sản xuất và bảo quản chế phẩm bifidobacterina

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
************

NGUYỄN MINH KHANG

XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT VÀ BẢO
QUẢN CHẾ PHẨM BIFIDOBACTERIA

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2006 – 2008
Mã số ngành: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2008


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI
TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CƠNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MNH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
CƠNG TY CỔ PHẦN VIỆT Á

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 1:
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
Cán bộ chấm nhận xét 2:
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
..........................................................................................................................
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ,
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA.

Ngày….tháng….năm 2008

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

LỜI CẢM ƠN
§ Trước hết, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách

Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn cơng nghệ sinh học,
cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tơi trong suốt q trình
học tại trường.
§ Đặc biệt cho phép tơi được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Hồng Quốc
Khánh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành luận văn theo cách
tốt nhất.
§ Cuối cùng tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tơi trong
thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong thời gian thực
tập.
Tôi xin gởi lời chúc sức khỏe đến tất cả các thầy cô và các anh chị.

Tp.HCM, Tháng 08 năm 2008.
Nguyễn Minh Khang

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


For evaluation
only.
CỘNG
HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA
VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc
TP.HCM, Ngày ….tháng….năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: NGUYỄN MINH KHANG

Phái: Nam

Sinh ngày: 25/04/1983

Nơi sinh: TPHCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 03106674

Năm trúng tuyển: 2006
1. TÊN ĐỀ TÀI: “Xây dựng qui trình sản xuất và bảo quản chế phẩm
bifidobacteria”
2. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG
• Phân lập chủng vi khuẩn từ nguồn nguyên liệu sữa bột nhập khẩu
Nestle.
• Định danh chủng vi sinh vật được phân lập bằng phương pháp sinh học
phân tử.
• Xác định điều kiện ni cấy tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn
bifidobacteria.
• Chọn và tối ưu hóa thành phần mơi trường huyết thanh sữa để ni cấy
vi khuẩn bifidobacteria.
• Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột bằng phương
pháp sấy phun.

3. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 25 tháng 02 năm 2008
4. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 30 tháng 06 năm 2008
5. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH

(Học hàm, học vị, họ tên và chữ ký)

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chun ngành thơng qua.
Ngày….tháng….năm 2008
TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH

TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xviii

TĨM TẮT

Bifidobacteria đóng vai trị quan trọng trong việc nâng cao sức đề kháng của
con người. Hơn nữa, bifidobacteria được xem là phương pháp chữa bệnh bằng
probiotic, giúp xây dựng và kích thích cơ thể tạo rào chắn miễn dịch để chống các

tác nhân gây hại: chất gây ung thư, vi khuẩn gây bệnh…
Hiện nay, vi khuẩn bifidobacteria được ứng dụng rất phổ biến trong ngành
công nghiệp chế biến sữa, bởi những tác động có lợi cho sức khỏe con người. Các
chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay, hoàn tồn chưa bổ sung vi khuẩn
bifidobacteria và chi phí để ni cấy lồi vi khuẩn này q tốn kém.
Trong nghiên cứu này, vi khuẩn bifidobacteria được phân lập từ sữa bột nhập
khẩu Nestle và được định danh bằng phương pháp PCR. Nguồn nguyên liệu rẻ tiền,
dễ kiếm là bột cheese whey (huyết thanh sữa) được sử dụng trong thí nghiệm nuôi
cấy vi khuẩn bifidobacteria.
Các nhân tố tăng trưởng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp tế
bào bifidobacteria bao gồm cao nấm men, peptone, glucosamine, cao thịt bò,
trytone và các khống chất có trong huyết thanh sữa. Trong thí nghiệm này, chúng
tơi xây dựng qui trình sản xuất bằng cách chọn và tối ưu hóa ba nhân tố tăng
trưởng: cao nấm men, peptone và N – acetyl D. Riêng các thành phần khác của môi
trường sẽ giữ cố định không đổi.
Kết quả thành phần môi trường sau khi tối ưu
Huyết thanh sữa

50 mg ml-1

Peptone

7,2 mg ml-1

Cao nấm men

10,4 mg ml-1

N – acetyl D glucosamine

0,66 mg ml-1

L-cystein

0,5 mg ml-1

Ascorbic acid

2,0 mg ml-1

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xix

Kết hợp với các điều kiện nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, chúng tôi tiến hành
nuôi cấy vi khuẩn bifidobacteria trên máy lắc ổn nhiệt ở 37oC, pH 6,8, tốc độ lắc
60rpm và sau 18 giờ mật độ tế bào đạt 3,8x109 CFU ml-1.
Để sản xuất chế phẩm bifidobacteria, chúng tôi thu nhận sinh khối bằng cách
ly tâm dịch khuẩn (5500 vịng/phút, 20 phút), sau đó rửa lại bằng dung dịch điệm
phosphate pH 7,0. Tác nhân vi bao được sử dụng là whey protein. Quá trình sấy
phun được cài đặc nhiệt độ đầu vào 150oC và nhiệt độ đầu ra của dòng sản phẩm đo
được là 98oC. Kết quả cho thấy, khi sử dụng hàm lượng chất vi bao 20%, hiệu xuất
thu hồi đạt 43% và tỷ lệ tế bào sống trong chế phẩm bifidobacteria là 9,747x106
CFU g-1. Sau 10 ngày bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC, khả năng sống của tế
bào giảm đáng kể còn 1,28x106 CFU g-1 và ngày thứ 20 chỉ còn 4,75 x105 CFU g-1.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

ABSTRACT
Bifidobacterium play an important role in human heath including the
enhancement of body resistance against the diseases. There are some experimental
evidences that certain bifidobacteria may actually protect the host from
carcinogentic caused by intestinal actions flora. Bifidobacteria may exert protective
intestinal action through various mechanisms and represent promising advances in
the fields of prophylaxis and therapy.
In this study, Bifidobacterium were isolated from the Nestle powdered milk.
We used the PCR method with different primers (g-Bifid-F and g-Bifid-R) to detect
the Bididobacterium genus. We dertermined some potential growth factors affecting
on their bifidus growth such as yeast extract, peptone and glucosamine. Cells
concentration were determined by measuring the optical density at 600nm (OD600)
The effect of the optimal culture conditions on growth in cheese whey was also
evaluated. Whey supplemented with N-acetyl-D-glucosamine (0,66 mg ml-1),
peptone (7,2 mg ml-1) and yeast extract (10,4 mg ml-1) at pH 6,8 and 37oC serves as
an inexpensive medium for the growth of bifidobacteria.
The productivity of the cell mass was 3,8x109 CFU ml-1 at 18h after
inoculation. Comparisons of the effect of carrier concentrations revealed the spaydrying at whey proteins 20% (w/w) resulted the highest survival of bifidobacteria.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

vi

MỤC LỤC

PHẦN

TRANG

Trang bìa .................................................................................................................i
Trang tựa.................................................................................................................ii
Lời cảm tạ ...............................................................................................................iii
Tóm Tắt...................................................................................................................iv
Mục lục ...................................................................................................................vi
Danh sách các bảng .................................................................................................xi
Danh sách các hình..................................................................................................xiii
Danh sách các biểu đồ .............................................................................................xiv
Danh sách các đồ thị................................................................................................xv
Danh sách các sơ đồ ................................................................................................xvi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................xvii
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1. MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1.1. Giới thiệu..........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu ...........................................................................................................1
1.3. Nội dung...........................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ BIFIDOBACTERIA. ...........................................................3
2.1.1. Phân loại........................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái.........................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm sinh lý ............................................................................................4

2.1.4. Đặc điểm di truyền.........................................................................................6
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa và nhu cầu dinh dưỡng.....................................................8

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

vii

2.1.5.1. Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................8
2.1.5.2. Nhu cầu dinh dưỡng....................................................................................8
2.1.5.3. Chuyển hóa sắt............................................................................................10
2.1.5.4. Chuyển hóa vitamin ....................................................................................10
2.1.5.5. Sản xuất acid amin......................................................................................10
2.1.5.6. Sản xuất chất kháng sinh và kháng khuẩn. ..................................................10
2.2. ĐẶC ĐIỂM ENZYME VÀ CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ĐƯỜNG
HEXOSE.................................................................................................................11
2.2.1. Đặc điểm enzym ............................................................................................11
2.2.2. Con đường chuyển hoá các hexose ................................................................11
2.3. SỰ PHÂN BỐ CỦA GIỐNG BIFIDOBACTERIA ..........................................13
2.3.1. Tồn tại trong ruột người................................................................................13
2.3.2. Tồn tại trong động vật....................................................................................15
2.3.3. Trong môi trường xung quanh .......................................................................16
2.4. ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA ......................................16
2.4.1. Probiotic ........................................................................................................16
2.4.2. Prebiotic ........................................................................................................16
2.4.3. Synbiotic .......................................................................................................17
2.5. CÁC ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA .............................18

2.5.1. Tăng cường hệ miễn dịch...............................................................................18
2.5.2. Giảm bớt triệu chứng dị ứng lactose ..............................................................19
2.5.3. Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy..............................................................................19
2.5.4. Ngăn ngừa ưng thu ........................................................................................20
2.5.5. Kháng lại vi khuẩn gây bệnh..........................................................................20
2.6. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA .................................................21
2.6.1. Môi trường không chọn lọc............................................................................22
2.6.2. Các môi trường chọn lọc................................................................................22
2.6.3. Môi trường phân biệt .....................................................................................24
2.7. PHÁT HIỆN BIFIDOBACTERIA THEO HÌNH THÁI TẾ BÀO.....................25

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

viii

2.7.1. Thử nghiệm fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-ppk).......................26
2.7.2. Xác định giống bifidobacteria bằng phương pháp PCR ..................................27
2.8. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT VI BAO ................................................................30
2.8.1 Định nghĩa. .....................................................................................................30
2.8.2. Tác nhân vi bao .............................................................................................30
2.8.2.1.Sấy thăng hoa ..............................................................................................31
2.8.2.2. Sấy phun.....................................................................................................32
PHẦN 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................................35
3.1.1. Giống và mơi trường phân lập .......................................................................35
3.1.2. Hóa chất ........................................................................................................35

3.1.3. Thiết bị ..........................................................................................................37
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................38
3.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................38
3.2.2. Phân lập vi sinh vật kỵ khí .............................................................................39
3.2.2.1. Tạo khuẩn lạc đơn trên các môi trường .......................................................39
3.2.2.2. Cấy chuyền vi khuẩn và làm thuần chủng ...................................................40
3.2.2.3. Cấy chuyền giữ giống trong ống thạch sâu..................................................40
3.2.3. Xác định giống bifidobacteria ........................................................................40
3.2.3.1. Quan sát hình thái, khả năng di động và xác định gram của vi sinh vật .......40
3.2.3.2. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn cacbonhydrat..............................40
3.2.4. Xác định giống bifidobacteria bằng phương pháp PCR ..................................41
3.2.4.1. Tách DNA (Tủa bằng isopropanol) .............................................................41
3.2.4.2. Phản ứng PCR ............................................................................................41
3.2.4.3. Điện di........................................................................................................42
3.3. XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ............................................................43
3.3.1. Xác định pH ban đầu của quá trình ni cấy .................................................43
3.3.2. Xác định nhiệt độ của q trình ni cấy ......................................................44

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

ix

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn
bifidobacteria ..........................................................................................................44
3.3.4. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa số khuẩn lạc vi khuẩn và độ
đục bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .....................................................................45

3.4. TỐI ƯU HỐ THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TUYẾN TÍNH.................................................................46
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucosamine đến tốc độ tăng trưởng ........................46
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của cao nấm men đến tốc độ tăng trưởng .......................47
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của peptone đến tốc độ tăng trưởng................................47
3.5. PHƯƠNG PHÁP QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM ...........................................47
3.5.1. Mục đích........................................................................................................47
3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................47
3.6. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BIFIDOBACTERIA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PHUN .........................................................................................50
3.6.1. Sản xuất chế phẩm bifidobacteria bằng phương pháp sấy phun......................50
3.6.2. Đánh giá khả năng sống của vi khuẩn sau quá trình sấy phun ........................50
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. PHÂP LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG BIFIDOBACTERIA........................52
4.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên mơi trường thạch đĩa ................................52
4.1.2. Đặc điểm hình thái tế bào, khả năng di động, cách sắp sếp tế bào và trạng
thái gram của chủng được phân lập..........................................................................53
4.1.3. Khả năng ảnh hưởng của oxy lên chủng vi sinh vật được phân lập.................54
4.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA ...............................................55
4.2.1. Khả năng tạo enzyme catalase .......................................................................55
4.2.2. Khảo sát khả năng sinh acid...........................................................................56
4.2.3. Thử nghiệm lên men các nguồn hyratcacbon .................................................56
4.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PCR.........................................................................................................................57

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

x

4.4. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BIFIDOBACTERIA................................................................................................59
4.5. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ..................................................................61
4.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................................61
4.5.2. Ảnh hưởng của pH.........................................................................................63
4.5.3. Khảo sát tốc độ lắc.........................................................................................65
4.6. TỐI ƯU HĨA THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG NI CẤY ..........................67
4.6.1. Xác định hàm lượng cao nấm men thích hợp trong mơi trường huyết thanh
sữa...........................................................................................................................67
4.6.2. Xác định hàm lượng peptone thích hợp trong môi trường huyết thanh sữa.....69
4.6.3. Xác định hàm lượng N – acetyl D glucosamine thích hợp trong mơi trường
huyết thanh sữa........................................................................................................71
4.7. TỐI ƯU HĨA THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA
NUÔI CẤY BIFIDOBACTERIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM........73
4.8. TỐI ƯU HĨA THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA
THEO PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG DỐC NHẤT .....................................................79
4.9. ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA PHƯƠNG PHÁP SẤY PHUN .........................82
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................87
5.2. KIẾN NGHỊ .....................................................................................................88

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Khả năng lên men các nguồn đường ở các loài Bifidobacterium ..............9
Bảng 2.2. Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột ở người..................14
Bảng 2.3. Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột động vật ................15
Bảng 2.4. Trình tự mồi (primer) ở một số chủng bifidobacteria ...............................27
Bảng 3.1. Các hóa chất được dùng trong q trình thí nghiệm .................................36
Bảng 3.2. Các thiết bị dùng trong q trình thí nghiệm ............................................37
Bảng 3.3. Các yếu tố thí nghiệm..............................................................................49
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm......................................................................................49
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn bifidobacteria ...................................54
Bảng 4.2. Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria thay đổi theo thời gian nuôi cấy
trên môi trường huyết thanh sữa ..............................................................................59
Bảng 4.3. Ảnh hưởng nhiệt độ lên tốc độ tạo sinh khối của vi khuẩn
bifidobacteria ..........................................................................................................61
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH lên tốc độ tạo sinh khối của vi khuẩn bifidobacteria ..63
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến tốc độ tạo sinh khối ..................................65
Bảng 4.6. Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria khi thay đổi thành phần cao nấm
men trong môi trường huyết thanh sữa ....................................................................68
Bảng 4.7. Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria khi thay đổi hàm lượng peptone
trong môi trường huyết thanh sữa ............................................................................70
Bảng 4.8. Ảnh hưởng hàm lượng N-Acetyl D glucosamine đến tốc độ tạo sinh
khối vi khuẩn bifidobacteria ....................................................................................72
Bảng 4.9. Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng.............................................74
Bảng 4.10. Kết quả bố trí và kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm .....75
Bảng 4.11. Chuyển sang hệ trục tọa độ không thứ nguyên .......................................76
Bảng 4.12. Kết quả thí nghiệm tại tâm phương án trung tâm ...................................77
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi qui......................78

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xii

Bảng 4.14. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy theo phương pháp
leo dốc.....................................................................................................................80
Bảng 4.15. Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria sau quá trình sấy phun ................84

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cây phát sinh lồi cùa các lồi Bifidobacterium được xây dựng dựa vào
16S rDNA ...............................................................................................................7
Hình 2.2. Các kiểu hình thái tế bào vi khuẩn bifidobacteria .....................................25
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc bifidobacteria trên mơi trường RCA .........................52
Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc bifidobacteria trên mơi trường thạch MRS...............52
Hình 4.3. Hình thái vi khuẩn bifidobacteria dưới vật kính dầu (x 100).....................53
Hình 4.4. Ảnh hưởng của oxy lên sự phát triển vi khuẩn bifidobacteria ...................55

Hình 4.5. Sự phân giải CaCO3 của vi khuẩn bifidobacteria......................................56
Hình 4.6. Khả năng lên men các nguồn cacbon của vi khuẩn bifidobacteria ............56
Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của chủng vi khuẩn bifidobacteria
phân lập từ sữa bột Nestle........................................................................................58
Hình 4.8. Sản phẩm bột bifidobacteria sau quá trình sấy phun .................................84

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xiv

DACH SÁCH CÁC BIỀU ĐỒ

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn bifidobacteria
trên môi trường huyết thanh sữa ..............................................................................62
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn bifidobacteria trên
môi trường huyết thanh sữa .....................................................................................64
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng tốc độ lắc đến tốc độ phát triển của vi khuẩn
bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa........................................................66
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men đến sự tăng trưởng của vi
khuẩn bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa ............................................68
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng hàm lượng peptone đến sự tăng trưởng của vi khuẩn
bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa........................................................70
Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng hàm lượng N-Acetyl D glucosamine đến sự tăng trưởng
của vi khuẩn bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa ...................................72
Biểu đồ 4.7. Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria trong thí nghiệm leo dốc...........81
Biểu đồ 4.8 . Hiệu suất thu hồi sản phẩm bột chế phẩm bifidobacteria.....................83

Biểu đồ 4.9. Ảnh hưởng của hàm lượng chất vi bao trong quá trình sấy phun lên
khả năng sống của vi khuẩn bifidobacteria theo thời gian bảo quản .........................85

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xv

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.8. Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn bifidobacteria trong môi
trường huyết thanh sữa ............................................................................................60

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xvi

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum..............................4
Sơ đồ 2.2. Đồng hóa oxygen của Bifidobacterium ...................................................5
Sơ đồ 2.3. Cây phát sinh loài của các loài Bifidobacterium được xây dựng dựa
vào 16S rDNA.........................................................................................................7

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

xvii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

• dNTP: Deoxynucleoside 5’triphosphate.
• F-6-PPK: Fructose-6-phosphate phosphoketolase.
• GL: Galactose Agar.
• LP: Lithium chloride – Sodium propionate Agar.
• MRS: De Man Rogosa Sharpe Agar.
• mMRS: Modified De Man Rogosa Sharpe Agar.
• mCol: Modified Columbia Agar.
•

NPNL: Neomycin sulfate – Paromomycin sulfate – Nalidixic acid – Lithium
chloride Agar.

• OD: Opical density (mật độ quang).
• pCMB: Acid p-chloromercuribenzoic.
• RAF 5,1: Môi trường Modified Columbia được bổ sung raffinose, lithium
chloride và sodium propionate và có pH 5,1.
• RB: Raffinose Bifidobacterium.
• RCA: Reinforced Clostridium Agar.
• AMC: Arroyo, Martin and Cotton Agar.

• BBM: Bifidobacterium selective medium.
• BFM: Bifidobacterium medium.
• BIM-25: Bifidobacterium iodoacetate medium.
• BL: Blood Glucose Liver Agar.
• BL-OG: Blood Glucose Liver Agar + Oxgall + Gentamycin.
• CTAB: Hexadexyltrimethylammonium bromide.
• EDTA: Ethylenediaminetetraacetate.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

-1-

Phần 1: MỞ

ĐẦU

1.1. GIỚI THIỆU
Trong những thập niên gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát
minh ra nhiều sản phẩm sinh học có chức năng probiotic. Chúng là các vi sinh vật
sống, có vai trị tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật đường ruột và gián tiếp cải
thiện tình trạng sức khỏe của con người.
Vi khuẩn bifidobacteria là một trong những nhóm vi sinh vật quan trọng đối
với sức khỏe của con người. Bifidobacterium được tìm thấy trong các mẫu phân của
trẻ sơ sinh trong tuần đầu tiên cịn bú sữa mẹ. Chính những tác động theo hướng có
lợi cho cơ thể mà trên thị trường đã xuất hiện hàng loạt những sản phẩm chức năng
liên quan đến bifidobacteria, với mục đích tăng cường sức khỏe của con người và

động vật.
Ngày nay, các sản phẩm thực phẩm chứa vi sinh vật này rất phổ biến như sữa
chua, sữa bột dành cho trẻ em, sản phẩm về phomai,…. Trong đó, lồi
Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. longum đang được ứng dụng phổ biến trong
các sản phẩm sữa giàu dinh dưỡng và sản phẩm sữa lên men.
Ở Việt Nam, có rất ít cơng trình nghiên cứu về bifidobacteria. Mức độ đa
dạng về các sản phẩm liên quan đến bifidobacteria còn rất hạn chế. Thực tế, các
probiotic ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm đa phần được nhập khẩu
từ nhiều nước trên thế giới. Tại Việt Nam, chế phẩm bifidobacteria hoàn toàn chưa
được sản xuất theo một qui trình cụ thể. Để khắc phục phần nào của vấn đề trên,
chúng tơi bước đầu xây dựng qui trình sản xuất và bảo quản chế phẩm
bifidobacteria. Kết quả nghiên cứu này, là cơ sở để sản xuất chế phẩm
bifidobacteria, phục vụ cho các đơn vị sản xuất có nhu cầu.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

-2-

1.2. MỤC TIÊU
• Phân lập và xác định vi khuẩn có nguồn gốc từ sữa bột nhập khẩu Nestle.
• Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột.
1.3. NỘI DUNG
• Phân lập chủng vi khuẩn từ nguồn nguyên liệu sữa bột nhập khẩu Nestle.
• Định danh chủng vi sinh vật được phân lập bằng phương pháp sinh học
phân tử.
• Xác định điều kiện ni cấy tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn

bifidobacteria.
• Chọn và tối ưu hóa thành phần mơi trường huyết thanh sữa để ni cấy vi
khuẩn bifidobacteria.
• Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột bằng phương
pháp sấy phun.
• Kiểm tra khả năng sống của chế phẩm theo thời gian bảo quản.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

-3-

Phần 2: TỔNG

QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ BIFIDOBACTERIA [18], [25], [27]
2.1.1. Phân loại
Bifidobacteria là vi khuẩn gram dương, không di động, kỵ khí bắt buộc và
được phân loại như sau
Lớp: Actinobacteria
Lớp phụ: Actinobacteriadae
Bộ: Bifidobacteriales
Họ: Bifidobacteriaceae
Giống: Firmicutes
2.1.3.2. Đặc điểm hình thái [18]
Vi khuẩn Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với

nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, dạng hình cây gậy đánh gơn,
dạng phân nhánh,… và cũng thường xuất hiện ở dạng chữ “Y”.
Các tế bào vi khuẩn bifidobacteria thường đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc
xếp thành hình chữ “V”. Kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,5 – 1,3mm.
Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhiều nhánh và
dưới điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào ở nhiều hình dạng khác nhau
(Tisser, 1990). Khi sử dụng N – Acetyl D – glucosaminde, alamine, acid aspartic,
acid glutamic, Serine và Ca2+ trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến hình
dạng của tế bào vi khuẩn bifidobacteria. [18]
Tế bào bifidobacteria khơng có vỏ bao và khơng có hệ thống tiêm mao bao
quanh. Vách tế bào được cấu tạo bởi 3 thành phần chính
+ Peptidoglycan (murein)
+ Polysaccharide
+ Acid lipoteichoic

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

-4-

Peptidoglycan của vi khuẩn bifidobacteria được cấu tạo từ acid N –
acetylmuramic và N – acetylglucosamine. Các phân tử này kết hợp với nhau tạo
thành chuổi oligopeptide. Ngoài ra, vách tế bào vi khuẩn bifidobacteria còn chứa
nhiều polysaccharide gồm các phân tử đường glucose, galactose, rhamnose,… liên
kết với nhau (Lauer và Kandler, 1983).

Sơ đồ 2.1. Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum

2.1.3. Đặc điểm sinh lý [9], [10], [18], [25]
Bifidobacterium cư trú trong ruột của cơ thể người và động vật. Chúng đóng
vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt pH ở đường ruột và kết tràng. Chúng được
phát hiện từ phân của trẻ sơ sinh còn bú sữa mẹ. Lượng vi khuẩn này phổ biến trong
đường ruột, tính ổn định của chúng liên quan đến tuổi tác, tuổi càng lớn thì lượng vi
khuẩn càng giảm. Lượng vi khuẩn bifidobacteria trong cơ thể bị tác động bởi nhiều
yếu tố như thức ăn, thức thuốc, sử dụng kháng sinh và tình trạng cơ thể.

Nguyễn Minh Khang


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
For evaluation only.

-5-

2.1.3.1. Dạng hơ hấp
Bifidobacterium là vi sinh vật kỵ khí bắt buộc. Tuy nhiên, tính nhạy cảm với
oxy thay đổi tuỳ theo loài và các giống khác nhau của mỗi lồi. Một số lồi có thể
chịu được oxy khi có sự hiện diện của CO2. Bifidobacterium có nhiều dạng hơ hấp
khác nhau, bao gồm
ü Tăng trưởng hiếu khí khơng có sự tích lũy H2O2: một dịng vi khuẩn
B.bifidum chịu được điều kiện hiếu khí, tạo ra một lượng nhỏ H2O2 bởi q
trình oxy hóa NADH.
ü Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H2O2: sự tích lũy hydrogen peroxide là
một độc tố đối với enzyme frutose-6-phosphate phosphoketolase trong quá
trình chuyển hóa đường của giống Bifidobacterium.
ü Tăng trưởng khơng có sự tích lũy H2O2: một số dịng vi khuẩn bifidobacteria
có mức oxy hóa khử thấp trong q trình chuyển hóa các chất và khơng tạo
H2O2.

Khi có mặt CO2, tính nhạy cảm với oxygen khác nhau đáng kể, phụ thuộc
vào các dòng. Một số dịng có thể phát triển trong sự hiện diện của oxy, một vài
dịng âm tính với catalase và dương tính với catalase. Một số dịng khác phát triển
trong sự có mặt đồng thời của catalase và hemin trong mơi trường.

Sơ đồ 2.2. Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium

Nguyễn Minh Khang