Nghiên cứu khả năng phân giải 2 4 d của một số chủng vi nấm

TẠP CHÌ KH O A H Ọ C DHQGHN, KHTN & CN, T.xx. Số 2PT.. 2004

N G H I Ê N C Ứ U K H Ả N Ă N G P H Â N G I Ả I 2 ,4 -D
CỦA MỘT SỐ CH ỦNG VI NẤM
T rầ n V ăn T u â n , K iều H ữ u Ả nh
Khoa S in h học, Trường Đại học K hoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
1. M ở d ẩ u

2.4-D (2,4-Diclorophenoxyaxetic aciđ) là m ột trong n h ữ ng chất d iệt cỏ được sử dụng
phô biến n h ấ t hiện nay. 2,4-D có khả năng tiêu diệt chọn lọc nh iều loại cỏ dại nên được sản
xuất và sử dụng hàn g năm vối những lượng khổng lồ. Việc sử dụng các ch ấ t này và nguồn
nưóc thải sinh ra từ việc sản x u ất chúng đ ã có những tác động tiêu cực đến mơi trường sống
và sức khoẻ con ngưòi. N hiều nghiên cứu cho thấy, 2,4-D có th ể gây tổn thương gan, thận,
hệ thần kinh ở người và động vật, giết chết nhiều lồi thuỷ sinh vật.
Việc tìm kiếm các vi sinh v ậ t có khả năng phân giải ch ấ t d iệt cỏ này hiện đang được
nhiêu nước trên th ế giới quan tâm . Đ ẵ có nhiều cơng bô về khả năng ph ân giải 2,4-D của
nhiều chủng vi khuẩn như R alstonia eutropha, Pseudom onas pu tid a , Arthrobacter sp,... tuy
nhiên, nghiên cứu sự phân giải sinh học 2,4-D của các chủng vi nấm cịn ít được quan tâm ,
trong khi tiềm năng phân giải các hợp chất ô nhiễm của chúng là r ấ t lón. C hính vì lý do nêu
trên chúng tơi đã tiến th àn h thực hiện đê' tài này.
2. P h ư ơ n g p h á p n g h iê n c ứ u

2.1. T hu m ẫu
Các m ẫu đ ất dùng phân lập được lấy ỏ độ sâu cách m ặt đ ấ t 10-15cm tạ i những vùng
đất nông nghiệp thường xuyên sử dụng chất diệt cỏ 2,4-D.
2.2. H oá chất
2.4-D ở dạng ax it của hãn g Merk (Đức) với độ tin h k h iết 99% được hoà ta n trong KOH
30% hoặc etanol 96%, thạch tinh khiết Bacto của hãng Difco và nhiều hố chất cần thiết khác.
2.3. Mơi trườ ng
Mõi trường khoáng B runner: N a-,HP04 - 2,44g; KH2P 0 4 - 1,52 g; (N H4)2S 0 4 - 0,50 g;
M gS04.7H.,0 - 0,2g; CaCl2.2H20 - 0,05 g; dung dịch vi lượng SL4 - 10 ml; nước c ấ t - 1000 ml;

pH 6,5. Bổ sung 2,4-D với hàm lượng 250mg/l hoà tan trong etanol 96% và kháng sinh
streptom yxin sau khi môi trường đã được khử trùng.
D ung dịch vi lượng:
SL4:

EDTA - 0,5g; FeS0.j.7H20 - 0,2g; SL6 - 100ml; nước cất - 900ml.

SL6: Z n S 0 4.7 H ,0 - 0,lg; MgCl2.4H20 • 0,03g; H3BOa - 0,3g; CoC12.6H20 - 0,2g;
NiCl2.6H20 - 0,02g; Cu C12.2H20 - 0,01g; Na,M oO.,.2H.,0 • 0,03g; nước cất
1000ml.
190


Nghiên cứu khá nũng phim giai 2.4-L) của mội

<6

chủng vi nấm__________________________________________ [9]^

2.4. P hư ơng p h á p
Các chủng vi nấm có khá năng phán giải 2,4-D được phân lập bằng kỹ th u ậ t nuôi làm
giàu trê n mỏi trường có nguồn cacbon là 2.4-D.
Xác định khả năng phân giải 2,4-D bàng phương pháp đo pho hấp th ụ ở bước sóng
283nm với máy UV-VIS-NIR Scanning S pectrophotom eter ƯV-3101 PC của hãng Shim adzu
- N hặt Bản.
Định tên các chúng vi nấm : Q uan s á t hình thái, m àu sắc khuẩn lạc; hình dạng tê bào
dũới kính hiến vi; hinh thức sinh sàn và nhiều đặc điểm sinh lý sinh hoá khác.
3. K ế t q u ả n g h iê n cứ u
3.1. P h â n lập và nghiên cứ u kh ả n ă n g p h á n g iã i 2,4-D
S au thòi gian làm giàu 5 ngày, chứng tôi đã phân lập được 4 chủng vi nấm trong đó có

3 chủng nấm sợi (D l. D2, D3) và 1 chủng nấm men (H3). Trên môi trường thạch tinh khiết
với nguồn cacbon là 2,4 D (250 mg/1), chủng H3, D l và D2 sinh trưởng rấ t m ạnh cịn chủng
D3 thì sinh trường bình thường. Các chủng này được thuần khiết trên nguồn cacbon 2,4-D
và sau đó dược cấy vào các bình mơi trường riêng rẽ chứa 2,4-D (250 mg/1), đôi chứng gồm 2
loại (1 bình có cây vi nấm nhưng khơng chứa 2,4-D và bình cịn lại chứa 2,4-D nhưng khơng
cấy vi nấm). Sau 7 ngày nuôi ở 28-30°C, k ế t quả dược trìn h bày ờ hinh 1 và báng 1.

Hinh 1. Khả năng sinh trưỏng của chủng H3 và D2 trên nguồn cacbon 2,4-D
B ả n g 1. Khá năng sinh trưởng và phân giải 2,4-D của 4 chủng vi nấm
Hàm lượng 2,4-D
ban đẩu (mg/1)

Hàm lượng 2,4-D đã
được chuyển hoá
(mg/1)

% 2,4-D đã
được chuyển
hoá

250

211

84,4

2.
DI
250
+++

D2
3.
250
4.
D3
250
++
Ghi chú: +++ ; sinh trường m ạ n h

108
198

43,2
79,2

STT

C hủng

1.

H3

Khả năng
sinh
trưởng
+++
+++

19

++ : sinh trưởng bình thường

7,6


192

Trăn Vùn Tuấn. Kiểu H ữu Ảnh

Kết quả ỏ bảng 1 cho thấy chủng H3 và D2 sinh trưởng m ạnh trê n nguồn 2,4-D và có
khá nàng chuyển hố một lượng lớn chất nàv trong vòng 1 tu ần (chủng H3 chuyển hoá được
84,4%, chủng D2 chuyển hoá dược 79,2%). Trong khi đó chủng DI sinh trưởng m ạnh trên
2.4-D nhưng lại chỉ chuyển hoá được 43,2% chất này và chùng D3 sinh trưởng tôt trẽn
nguồn 2,4-D nhưng lại khơng có khả năng phân giải chất này vì lượng 2,4-D giảm đi chỉ
tương ứng với lượng 2,4-D biến m ất ở bình đối chứng (6%).
3.2. Đ ịnh loại các c h ù n g ng h iên cứu
Sơ bộ nhận dạng chủng D3 thuộc chi P énicillium , nhưng do chủng này khơng có khả
năng phán giải 2,4-D nên chúng tơi khơng phân loại.
Chủng D l là lồi A spergillus terreus vái những đặc điểm như sau: khuẩn lạc phát
triển khá nhanh trên mơi trưịng Czapek, đường kính 3,5-5 cm khi nuôi ỏ 24-26°C trong 10
ngày. Khuân lạc phăng hoặc có khía, dạng nhung, mép mỏng, nhiêu bào tử, có m àu vàng
chanh đến nâu xám. Đầu sinh bào tử trầ n dài, dạng cột, chặt. Giá sinh bào tử trầ n ít, khúc
khuỷu. Bọng hình bán cầu, th ể bình 2 tầng. Bào tử hình cầu dến hơi elip, nhẳn. Bên cạnh
các sợi ná m thường sinh ra các tế bào sợi nấm trong suốt, có hình cầu hoặc hìn h oval (hình 2).

Hình 2. Hình thái tếbào và cuống sinh bào từ cùa chùng DI
Đ áng chú ý là chủng H3 và D2, hai chủng này đều có khả năng ph ân giải m ạnh 2,4-D
và hầu như chưa có một cơng bơ’ nào về khả năng phán giải 2,4-D của chúng. C hủng D2 là
loài Paecilomyces variotii và có những đặc điểm như sau: khuẩn lạc m àu lục nâu, vàng lục,
m ặt dạng bột, đỏi khi xốp bơng hoặc có ít bó sợi, khơng có giọt tiết hoặc ít gặp. M ặt trái

khuấn lạc m àu vàng đến vàng nâu. Sợi nấm rộng 3-5 um, sợi chìm có th ể phồng to tới 16
um, giá bào tử m ang

cácnhánh xếp th àn h vòng hoặc khơng đều. Thể bình tạo th àn h cụm 2-

7 chiếc hoặc dơn độc. phẩn gốc có hình trụ hoặc elip. Bào tử trầ n không màu hoặc vàng
nhạt, nhẵn, hình gần trụ hoặc elip, khơng có vách ngăn. Bào tử áo đơn đơc hoặc thành
chuỗi, hơi xù xì, m àu nâu, hình cầu hoặc hình quả lê (hình 3).


y phfln guil 2.4-1) Cl

Hình 3. Hinh thái khuân lạc và tẽ’ bào của chùng D2 trên nguồn cacbon 2,4-D
C hủng H3 là loài nấm men Cryptococcus ater với những đặc điểm sinh học như sau:
- K huân lạc tròn, m àu kem. bóng, nhẵn, hơi lồi, có vịng đồng tâm , khi già khuẩn lạc
có m àu đen. T ế bào hình oval, bào tử túi, nảy chồi m ột bên (hình 4).
- Sinh lipaza th u ỷ phán lipit, có khả năn g thuỷ phân urê.
■ Khơng sinh bào tử bắn, khơng sinh axit, khơng có khả nàng

thủy phân tinh bột,

khơng có khá năng lên men glucoza.
- Đổng hoá các nguồn hydrat cacbon: glucoza, L-sorboza, D-glucosamin, D-riboza, Dxyloza, L-arabinoza. D-arabinoza, L-rhamnoza, trehaloza, arbutin, lactoza, erythrytol,
xylitol, m annito). sucroza, xenlobioza, sorbitol, melezitoza, rham noza, m altoza. raffinoza, Dgalactoza, myo- inositol, D-gluconat, galactitol.
- Khơng đổng hố các nguồn hydrat cacbon: D-glucono-l,5-lacton, D- glucuronat,
melebioza, hexandecan, alanin, glyxerol,

Hình 4. Hinh thái khuẩn lạc và ảnh hiển vi tế bào chủng H3

194

Tran Vãn Tuan. Kièu Hữu Ảnh

4. K ết lu ậ n
1. Dã phân lặp được 4 chủng vi nấm sinh trưởng được trẽ n môi trườ ng chứa nồng độ
cao chất diệt cỏ 2,4-D, trong đó có 3 chủng nấm sợi và 1 chủng nấm men.
2. Chủng nấm sợi D3 có khả năn g sinh trưởng tốt trên mơi trường chứa 2,4-D nhưng
lại khơng có khả nàn g phán giải châ't này, chủng D l sinh trưởng m ạnh trê n nguồn 2,4-D
nhưng cùng chỉ phán giải được khoảng 40% cơ chất trong thòi gian 1 tu ần . Hai chủng D2 và
H3 có triển vọng hơn cả, trong thời gian 1 tu ầ n chủng D2 đã phán giải được 79.2% và chủng
nấm men H3 phân giải được 84,4% cơ chất.
3. Phân loại được đến loài 3 chủng D l, D2 và H3, trong đó D l là A spergillus terreus,
D2 là Paecilomyces variotii và H3 là Cryptococcus ater.
T À I L IỆ U TH A M KHẢO

1. Caroline Cox. Herbicide factsheet, 2,4-D: Ecological effects, J. Pest. Reform, 19(3). 1999. pp. 14-19.
2. Caroline Cox, Herbicide factsheet, 2,4-D: Toxicology part l,J. Pest .Reform, 19(1), 1999, pp. 14-19.
3. Elke Hammer, Dừk Krowas, Annett Schafer, Michael Specht, Wittko Francke, Frieder Schauer.
Isolation and Characterization of a Dibenzofuran-Degrading Yeast: Identification of Oxidation and
Ring Cleavage Products, Applied and Environmental Microbiology, 64(6), 1998. pp. 2215-2219.
4. J. S. Yadav, c. A. Reddy, Mineralization of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Add and Mixtures of 2.4-D and
2,4,5Trichlorophenoxyacetic Acid by Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental
Microbiology, 59(9), 1993. pp. 2904-2908.
5. Linda E. Greer, Daniel R. Shelton, Effect of Inoculant Strain and Organic Matter Content on Kinetics
of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Degradation in Soil, Applied and Environmental Microbiology,
58(5), 1992, pp. 1459-1465.
6. Maria Kopytko, Graciela Chalela, Fernando Zauscher., Biodégradation of two commercial herbicides
(Gramoxone and Matancha) by the bacteria Pseudomonas putida., EJB Electronic Journal of
Biotechnology. 5(2),2002, pp. 182-195.

7. Penny s. Amy, James w. Schulke, Linda M. Frazier, Ramon J. Seidler., Characterization of Aquatic
Bacteria and Cloning of Genes Specifying Partial Degradation of 2 ,4 -Dichlorophenoxyacetic Acid,
Applied and Environmental Microbiology, 49(5), 1985, pp. 1237-1245.
8. S. B. Pointing, Feasibility of Bioremediation by White-Rot Fungi, Applied Mkrobwlogy and
Biotechnology, 57, 2001, pp. 20-33.


Nghiên cứu khá tiãng phân giái 2.4-D của mội sò'chúng vi nấm

195

VNU JOURNAL OF SCIENCE. Nat.. Sci.. & Tech., T.xx, N02AP„ 2004

B I O D E G R A D A T I O N O F 2 ,4 -D B Y S O M E S T R A I N S O F F U N G I
T r a n V an T u a n , K ie u H u u A nh
Departm ent o f Biology, College o f Science, VN U
Soil sam ples collected from th e treated 2,4-D agricultural soils w ere tested for the
presence of fungi which u tilize 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) as a sole source of
carbon. F our strain s capable of growing on th e m edium containing 2,4-D a s a sole source of
carbon w ere isolated, one of which was yeast (H3) and th e others w ere filam entous fungi
(D l, D2 and D3). The D l, D2 and H3 strain s showed a significant degradativity of this
su b strate (43.2%, 79.2% and 84.4% per week respectively) w hereas th e D3 s train h as no
this activity. The re su lts suggest th a t th ese 2,4-D-metabolizing fungi belong to the
following species: Aspergillus terreus (D l), Paecilomyces variotii (D2) and Cryptococcus ater
(H3).