Xác định giới tính gà bằng kỹ thuật PCR

TAP CHÍ KHOA HOC DHQGHN. KHTN & CN. T XX. So 2PT . 2004

X Á C Đ ỊN H G IỚ I T ÍN H G À B A N G K Ỹ T H U Ậ T P C R
P h a n T u â n N g h ĩa , N g u y ễ n M ộng H ù n g , N g u y ế n T h ị V ân A n h ,
N g u y ế n Q u ố c T ru n g , N g u y ễ n T h ị T h ả o , N gu y ễ n T u ấ n A n h , Vũ P h ư ơ n g Ly
K hoa Sin h học, Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
1. M ở đ ầ u

Gà nói riêng hay gia cầm nói chung là nhóm vật ni đóng vai trị q u an trọng bậc
nhất trong việc cung cấp th ịt cho con người. Xác định sớm giới tính ở gia cầm có ý nghĩa
quan trọng trong cả nghiên cứu về phôi học cũng như ứng dụng trong sản x u ất dê chủ động
diều khiên tỷ lộ đực /cái theo các hướng mong muốn. Đê xác định sớm giới tín h ở gia cầm đã
có một sơ phương pháp khác nhau được áp dụng như phân tích hình th ái lỗ h u y ệt hay phán
biệt kiểu nhân. Tuy vậy, các phương pháp vừa nêu có hạn c h ế ở chỗ hoặc là m ất nhiều thòi
gian hoặc chi’ áp dụng dược cho một sơ’ ít đơi tượng. Chính vì vậy, trong n h ũng năm gần đây
các phương pháp sinh học phân tử dựa trê n sự sai khác ở m ức ADN giữa các cá th ể đực và
cái đã dược áp dụng [2.3,4,6,7,8,9,11]. Mặc dầu vậy, khi chúng tơi áp dụng m ột sơ’ qui trình
kỹ th u ật đã công bô' [3,9] để xác định giới tính ở gà đã khơng th u được k ết quả thực sự tin
cậy. Hơn thê nữa, cho đến nay ở Việt Nam việc áp dụng các kỹ th u ậ t sinh học phân tử để
xác dịnh giới tính gia cầm vẫn chưa dược quan tâm . Nghiên cứu của chúng tơi nhằm từng
bước th iết lập qui trìn h xác định giói tính của gia cầm từ giai đoạn phôi đến trưởng thành
bằng kỹ th u ậ t PCR cỏ độ nhạy và độ tin cậy cao, góp phần hỗ trợ cho công tác nghiên cửu
phôi sinh học củng như p h át triển chản nuôi ỏ trong nước.
2. N gu y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
2.1. N guyên liệu
Nguyên liệu sử dụng để tách ADN là m áu lấy từ gồ (G alus dom esticus), chim cút
{Turnix tanki), bồ câu (Colum ba livià), vịt (Anas platyrhincha) và phôi gà. M ẫu phơi do
Phịng Cơng nghệ t ế bào động vật, thuộc T rung tâm S inh học phán tử và Công nghệ tế
bào cung cấp.
Các cập mồi dược m ua từ hãng Integrated DNA Technology (IDT, Mỹ), th an g chuẩn
ADN klH in d ĩĩỉ và 1 kb của hãng F erm entas (Lithoania). Các hoá ch ấ t còn lại đểu đ ạt mức

tinh khiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. P hư ơng p h á p
ADN của máu gà hay gia cầm khác và của phôi gà được tách bằng kit GFX của hãng
Pharm acia (Thuỵ Điển). Ngồi ra ADN cịn được tách theo phương pháp củ a Albarino và
Romanowski [1] có cải tiến. ADN được định lượng bằng cách đo dộ hấp th ụ ở bước sóng 260
nm (AMn) và kiểm tra băng điện di gel agarose.
P hản ứng chuỗi polym erase (PCR) được thực hiện trong m ột th ể tích 25^1 có chứa 1070 ng ADN khuôn, mồi xuôi và mồi ngược ở nồng độ 0,5 nM, 2,5 đơn vị Taq ADN
156


X.R ill nil JJII'I hull ;j.I h.m ;■ k\ [hu.'H l’( k

157

polym erase v à dNTP 0.4 mM. C hẽ độ nhiệt bao gồm các bước khởi dộng nóng ỏ 94°c trong 5
phút, biến tín h ADN khn ở 94"C trong 30 giây, gắn mồi ớ 65"C trong 15 giây, kéo dài
chuỗi ớ 72"C trong 25 giây, với 35 chu kv lặp lại và giũ phán ứng ớ 72"C trong 1 phút, s à n
phấm dược phàn tích bằng điện di gel agarose và nhuộm băng bang ethidium bromide.
3. K ết q u á n g h iê n cử u
3.1.

T ách A D N từ m á u và p h ô i gà

Để tách ADN từ m áu gà chúng tôi đã sử dụng kit tinh sạch ADN từ máu ký hiệu
CrFX của h ãn g P harm acia, lượng máu sử dụng là 2j.ll. Riêng với phôi phải có thêm bước
nghiền tế bào trước khi lấy m ẫu tách ADN, Lượng ADN thu được từ khoảng 2-6 ng. K ết quả
kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel agarosel% dược trìn h bày ỏ hình 1. Có thế dễ dàng
nhận thấy rà n g ch ế phẩm ADN của các mẫu máu gà (A), chim cút (B; hai cột đầu) hay bồ
cảu (B: hai cột tiếp theo) thuộc hai giới đực và cái dều cho một băng ngun vẹn. có kích
thước lớn. khõng lần ARN. chứ ng tỏ chế phấin thu được có độ sạch cao.

Bẽn cạnh việc tách ADN bằng kit GFX, chúng tôi cũng đã liến hàn h tách ADN từ
m áu gà theo phương pháp của Albarino và Romanowski []]. Đây là phương pháp áp dụng
cho tách ADN lừ m áu người và không dùng chất chống dông. Tuv vậy, khi chúng tôi áp
dụng phưrlng pháp này đè' tách ADN từ m áu gà thì thấy rằ n g m áu gà dơng r ấ t nhanh vì vậy
chúng tỏi đã bơ sung thêm vào m áu một the tích tương điíơng dung dịch muôi sinh lý (NaCl
0.9%) và sứ dụng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (ti lệ 25:24:1 vê th ế tích) thay
cho việc sử dụng chiết hai bước bằng phenol và bằng chloroform: isoamyl alcohol như trong
qui trình gốc. Kết quả phân tích cho thấy lượng ADN thu được tương tự như khi sử dụng
kit, tuy nhiên để tách ADN theo phương pháp này, lượng m ẫu cần lấy ban đổu là từ 20 ị.il
trỏ lên. Kết quả diện di chế phẩm ADN thu đươe ở hình 1D cho thấy ADN thu từ máu gi1!
trông và gà m ái đều cho m ột bâng, kích thưốc lớn, khơng lẫn ARN. Dể tách ADN từ phôi,
chúng Lôi đã nghiền m ẫu và ủ ở 37°c trong 1 phút. Sau đó ly tâm để thu tế bào và tiếp tục
tách chiết với qui trìn h tương tự nhu với m ẫu máu. Ngồi ra , qui trìn h tách ADN từ phơi
cẩn có thâm bưỏc xứ lỹ bảng ARNase dê loại ARN. C hế phẩm thu dược có chất lượng khơng
sai khác với ch ế phàm lách bằn g kit.
A

Hình 1: Điện di agarose chè phãm ADN
m áu g ia c ắm và ph ôi gà.

A: ADN cùa mâu gà. B: ADN cùa
m áu c h im cú t (2 cột đẩu tiê n ) v à bố

câu (2 cột cuối cùng). C: ADN củạ
phõi, D: ADN của máu sà tách băng
phương pháp không dùng kit. M:
thang chuân 1 kb (A, B và C) hay
HindiII (D), P: Phơi.

M

B

đ 1

* t <ì M

c
M PI P2

D

n

M

f

9

Eiil

3.2. X á c đ ịn h giớ i tin h b ằ n g k ĩ th u ậ t PCR

Đe xác tlịnh giới lính gà bằng PCR. chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi có ký hiệu
NP/MP2 và NP8/M P3 (bảngl). được th iết kế dụa cặp mồi NP/M P trong nghiên cứu Ito và
tập thê [7] đ ẽ xác dịnh giới lính một sơ' lồi thuộc họ chim cát (Falconìformes) bằng PCR.
Các cặp mồi này dểu dựa vào sự sai khác về trìn h tụ nucleotit ớ vùng intron của gen

158

Phan Tuẫn Nghĩa. Nguyẻn Mộng Hùng. Nguyen Thi Vân Anh

CDH1W và CDH1Z nằm tương ứng trên nhiễm sắc th ể w và z đặc trưng cho giới tín h cái và
đực của gà. Trong 2 cặp mồi NP/MP2 và NP8/MP3 (bảng 1) th ì N P có trin h tự giơng nhau
giữa các gen CHD1 của các lồi chim cắt và gà còn MP2 và M P3 là được chúng tơi th iết kê
dựa trên trìn h tự đặc trư n g của CDH1W. MP2 được lựa chọn để k ết thúc bằng adenin ờ đầu
3’-OH nên không th ể gắn bơ su n g vào trìn h tự gen C D H 1Z (giới tín h đực) vốn chứa
cytosine. Ngồi ra , tro n g trìn h tự của M P2 cịn có m ột nucleotit sai khác (A) giữa CDH1Z
so với CDH1W (T).
Qua nghiên cửu chúng tôi th ấy rà n g khi sử dụng cặp mồi NP/MP2 cho PCR với lượng
ADN khuôn từ 50-70 ng và chế độ nhiêt: biến tính ban đầu â 94°C-5\ tiếp theo là 35 chu ký
gồm 94°C-30”, 64°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1' đã cho phép thu được bảng nh ân bản với kích
thước 286 bp rấ t rõ n é t với m ẫu ADN khuôn của con cái và chỉ là m ột băng mị n h ạt có kích
thước 269 bp với các m ẫu ADN của con đực (đoạn gen này của CDH1Z ngắn hơn của
CDH1W 17 nucleotit). Theo chúng tôi, sử dụng kỹ th u ậ t PCR với cặp mồi NP/M P2 đú cho
phép xác đinh giới tính ỏ gà. Qui trìn h này khi được th ử nghiệm trê n các m ẫu ADN tách từ
phôi đều hoặc cho bảng nh ân bản 286 bp, chứng tỏ đó là phơi cái hoặc cho có kích thước gần
tương đương nhưng mờ nhạt, chứng tị đỏ là phơi đực. Toàn bộ thời gian đê thực hiện việc
xác định giới tính của m ẫu khoảng 3,5 giờ, bao gồm việc tách ADN (khoảng 40 phút), chạy
PCR ( khoảng 130 phút) và chạy điện di, phân tích kết quả (khoảng 40 phút).
Cặp mồi NP8/MP3 được chúng tôi sử dụng nhằm làm tăn g tính đặc hiệu cũng như độ
tin cậy của phương pháp. Trong đó MP3 vẫn là trìn h tự gen CDH1W nhưng lùi về sau 37
nucleotit so với MP2 để có tới 5 nucleotit sai khác so với trìn h tự tương ứng trong gen
CDH1Z của con đực [7] cịn N P8 chửa một phần trìn h tự của N8 và tồn bộ trình tự của NP.
Việc kéo dài N P th àn h N P8 là để cả h ai mồi N P8 và M P3 có n h iệt độ tách chuỗi (Tm) gẩn
như nhau, cho phép chúng tôi sử dụng nhiệt độ gắn mồi cao như đơi với M P3 (65°C).

B ả n g 1. Trình tự các cặp mồi dùng để xác đinh giới tính gà, vịt, chim cút và bồ câu.
TT
1
2

Ký hiệu
của cặp mồí
NP

T rình tự
5’-GAG AAA CTG TGC AAA ACG A

MP2

5’-CGT TTT CTT TCT GAT ATG GAA

N P8

5’-GAG AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACAG

MP3

5’-ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG

B ăng nhân bản
đặc hiệu giới tính s
286 bp
328 bp

Kết quả chạy PCR sử dụng cặp mồi NP8/MP3 với chế độ nhiệt: biến tính ban dầu ị

94°C-5\ tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 94°C-30”, 65°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1’ (hình 3A) cho
thấy tấ t cả m ẫu ADN khuôn của gà trống đểu khơng cho băng nh ân bản nào, cịn các mẫu
ADN khuôn của gà m ái đểu cho m ột băng nhân bản rất rõ n ét có kích thước 328 bp. Khi thử
nghiệm qui trình để xác định giới tính của các m ẫu vịt, chim c ú t và bồ cáu đểu cho k ết quả
tương tự (hình 3A). Mặc dầu băng nh ân bản ỏ mẫu ADN khuôn của vịt ít rõ nét hơn so với
các đơi tượng khác nhưng vẫn đủ tính đặc trưng cho việc ph ân b iệt đực - cái. C húng tôi đã
áp dụng qui trình này với ADN tách từ 5 m ẫu phôi (P) gà khác nhau, k ế t quả thu dược


I'.IIIL' k\ lhu.ll I’CR

(hình 3B) cho thấy, trong 5 m ẫu phịi này thì P l và P3 khơng có bảng 328 bp, tương tự như
khi s ứ dụng m ầu ADN của gã trống trướng thành, chứng tó chúng là phơi đực. cịn các mẫu
P2. P-l và P5 đều có băng 328 hp tương tự như m ẫu gà m ái trướng th àn h và chứng tó các
mẫu này là phôi cái.
C húng tôi cũng dã tiến hành thí nghiệm xác định giới tinh gà với các nồng độ ADN
khuôn khác nhau và dã phát hiện được ràng nồng độ ADN khn tối thiểu dế có th ể thu
được bằng nhãn bán rõ n é t là 10 ng. Theo tính tốn thi lượng ADN 10 ng có th ế tách được từ
khoang 5 nanolit m áu hay từ khống vài tế bào phơi ban đẩu.
M

í

.t 1
H inh 2: Điện di gd agarose sán phẩm PCR xác ilịnh giới
lính gà sứ dụng cặp mới NP và MP2.
M: Thang chuẩn ADN (5(}-20(X)hp).
* tương ứng vrti các
màu ADN khuôn của máu gà tríína và mái irướng thành.

IIin h ỉ: ĐiỌii Ui gcl agarose s;in phẩm PCR xác định giỏi lính gii sir dụng cặp mói NPH/MP.V
A: Sán phàm PCR VỚI until ADN khn lừ máu gia cám truitng Ihìrnh. B: Síin phẩin l’CR v«ïi inAu ADN
khn cùa phói (P). M: Ihang chuẩn ADN Ikb.

4. T h ả o lu ậ n
Xác dịnh giới tính của nhiều lồi thuộc tớp chim thường gập khó khồn do con đực và
con cái rấ t giơng nh au vể hình thái, đặc biệt là ỏ giai đoạn con non [5,8.12]. Nhiều kỹ th u ật
dựa trẽn sự khác nh au về ADN giữa hai giới đã được p h át triển để giải quyết vấn đề này.
T rong sô' các kỹ đã được sử dụng thì PCR được xem là phương pháp dáng tin cậy nhất. Điếm
chung trong sử dụng PCR của các nhá nghiên cứu là dựa vào sự sai khác vé gen mà hoá như
ATPase [9], DMRT1 [10] hay C DHl [3,7]... nằm trê n nhiễm sắc th ê giới tính w của con cái
và z của con dực. C húng tôi khi áp dụng kỷ thuật PCH với các cặp mồi như W 02/W 03 theo
qui trìn h của P etitte vã Kegelmeyer [9] hay cặp SS1/SS2 theo qui trin h của D’C osta vã
P etittc [3] đế xá c định giới tinh cùa gà đã không cho kết q u á tin cậy. Cụ thế chúng tôi hoặc
là thu được bãng nh ân bán như nhau với m ẫu ADN của cà hai giới, hoặc không th u được
băng nhân bán dặc hiệu. Nguyên nhản chính cúa những sai khác này có th ế do cặp mồi
W 02/W 03 chi có th ê áp dụng cho PCR với sự biến đôi các ch ế độ nhiệt trong thời gian rấ t
ngắn mà các máy PCR thông thường không thực hiện được. Còn độ lặp lại thấp khi áp dụng
các qui trìn h khác có th ể lã do qui trình này chi áp dụng dược cho đơì tượng lồi mà các tác
giá đó quan tâm . Ito và tậ p thê [7] cho thấy việc sử dụng các cập mồi có nucleotit kết thúc ỏ
đầu 3’ vào chính điểm khác nhau đặc trư ng của gen C D H 1W và C D H IZ đã cho phép phán
biệt được giỏi tinh của nhiều loài thuộc họ chim cắt. Tuy vậy, do trìn h tự gen CDH1W và


Phan Tuán N ghĩa. Nguvỏn M òng Hùng. Nguyèn Thị Van Anh.

160

CDH1Z ỏ gà có n h ũng sai khác so vỏi trìn h tự C D H lW và CDH1Z của các lồi chim cắt nên
khơng th ế dùng các cặp mồi này đế xác định giới tín h gà bằng PCR. Vối nguyên tắc th iế t k ế

mồi tương tự chúng tôi đã th iế t kê cặp mồi NP/M P2 dặc trư n g cho gen C D H l ỏ gà và nhờ
vậv đã cho phép dễ dàng nh ận dạng giới tính của gà bằng PCR. Nhằm m ột bước phát triển
tính đặc hiệu của phương pháp, chúng tôi đã th iế t k ế cặp mồi N P8 và M P3, trong đó NP8
chửa ph ần trìn h tự có m ặt ở cả C D H lW v à CDH1Z còn M P3 dựa trên phần trìn h trìn h tự có
sự sai khác tỏi 5 nucleotit giữa gen CDH1W và CDH1Z, nhờ vậy đã làm cho phép phân biệt
chính xác giới tính đực-cái của m ẫu vối lượng ADN khn rả't th ấp (10 ng) và loại trừ hoàn
toàn sự x u ấ t hiện của (các) bảng không đặc hiệu.
Qui trìn h th iế t lập với cặp mồi NP8/M P3 còn cho phép dễ dàng p h á t hiện giới tính của
vịt, chim cú t và bồ câu, chứ ng tỏ các lồi nàv có vùng gen CDH1 chọn nghiên cứu rấ t giống
vói trìn h tự gen C D H l ở gà. Q ui trìn h cho phép p h á t hiện chính xác giới tín h của gà ở ngay
giai đoạn phơi. Với thời gian thực hiện gắn, số lượng m ẫu mồi lần phân tích từ vài chục trở
lên, qui trìn h chắc chắn sẽ rất có ý nghĩa cho việc nghiên CÛU phôi cũng như cho việc phát
triển chản nuôi gia cầm .
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
1.

Albarifto. C.G. and Romanowski, V, Phenol extraction revisited: A rapid method for the
isolation and preservation of hum an genomic DNA from whole blood. Mol. (6 Cell. Probes
8. 1994. pp. 423- 427.

2.

Clinton, M, A rapid protocol for sexing chick embryos (Gallus g. domesticus), Anim. Genet.
25, 1994. pp. 361- 162.

3.

D’Costa, S. and Petitte, J. N, Sex identification of turkey embryos using a multiplex
Polymerase chain reaction, Poultry Sci, 77, 1998, pp. 718- 721.

4.

E'llegren, H., Hens, cocks and avian sex determ ination, A quest for genes on z or w?.
EM BO Rep, 2, 2001, pp. 192-196.

5.

Ellegren, H, Evolution of the avian chromosomes and their role in sex determination.
Trends Ecol. Evol, 25, 2000, pp. 188- 192.

6.

Griffiths, R., Daan, s ., Dijkstra, c . Sex identification in birds using two CDH genes. Proc.
R. Soc. Lond, 263, 1996, pp. 1249-1254.

7.

Ito. H., Sudo-Yamaji, A. Abe, M., Murase, T., Tsubota, T. Sex identification by alternative
polymerase chian reaction methods in Falconiformes, Zool. Sci, 20, 2003, pp. 339-344.

8.

O'Neill, M., Binder. M., Smith, c ., Andrews, J., Reed, K., Smith. M.. Millar, C-, Lambert,
D.. Sinclair. A. ASW: a gene with conserved avian W-linkage and female specific expression
in chick embryonic gonad. Dev. Genes Evol, 210, 2000, pp. 243- 249.

9.

P etitte, J. N. and Kegelmeyer, A. Rapid sex determ ination of chick embryos using the
Polymerase chain reaction, Anim. Biotechnol, 6 ,1995, pp. 119- 130.

10. Shan, z., N anda, I., Wang, Y., Schmid, M., Vortkamp, A.. Haaf, T. Sex-specific expression
of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DMRT1, in birds, Cytogen. Cell Genet,
89. 2000, pp. 252-257.
11. Sohr», S.H., Lee, c . Y., Ryu, E. K., Han, J. Y., M ultani, A. s . and P athak, s . Rapid sex
identification of chicken Fluorescence in situ hybridization using a w chromosome-specific
DNA probe, Asian-Aust. J. Anim. Sci, 15, 2002, pp. 1531- 1535.


Xác tlịnh giói linh gà bảng kỷ ihuặt PCR

161

12. Stevens, L., Sex chromosomes and sex determ ining mechanism in birds, Sci. Program. 80,
1997, pp. 197-216.
Đi' lài dược thực hiện với sự líó n ợ kinh phi của đề tài cấp nhà nước KC.04.24
VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nai, Sci.. & Tech., T.xx. Nọ2AP.. 2004

D E T E R M IN A T IO N O F C H IC K E N S E X B Y P C R T E C H N IQ U E
P h a n T u a n N g h ia , N g u y e n M o n g H u n g , N g u y e n T h i V a n A n h ,
N g u y e n Q u o c T ru n g , N g u y e n T h i T h a o , N g u y e n T u a n A n h , V u P h u o n g Ly
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U

A protocol for determ ination of the sex of chicken an d th e ir em bryos by PCR
technique has been reported using a p a ir of prim ers N P 8 : 5’-AGA AAT GAG AAA CTG TGC
AAA ACA G (forward) và MP3: 5’ -ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG (reverse). The
prim ers w ere designed on th e difference in nucleotide sequences of CDH1 gene located on
chromosome z and w of th e m ale and female chicks, respectively. U sing th e m ethod, no
amplified band h as been observed from the DNA sam ples of th e m ale w hile a 328 bp band
has been am plified from the fem ale DNA sam ples. T he m ethod can be applied for early and

accurate identification of th e sex not only for chicken and th eir em bryos b u t also for
pigeons, ducks and quails using a sm all DNA am o u n t (10 ng), w hich is isolated from about
5 nanolitre of blood o r a few em bryonic cells. In addition, a m odified protocol for isolation of
DNA from chicken blood and em bryos has been developed, which can be used directly for
application of the poultry sex detem ination technique.