Phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng sinh họ eloquinolon trong nước thải bệnh viện

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

PHÂN TÍCH DÀNH GIÁ s ự c ố MẶT
CỦA CÁC KHÁNG SINH HỌ FL0QUIN0L0N
TRONG NƯỚC THẢI BỆNH
VIỆN
■
■

M Ã SỐ : Q T -0 5 -4 3

C H Ủ T R Ì Đ Ề T À I: TS. D ương H ồ n g A n h
C Á C C Á N B Ộ T H A M G IA : ThS. P h ạ m N g ọ c H à
CN . H o à n g T h ị T h ư ơ n g
CN. N guyễn H ồng Tùng

ĐA1 HOC QUỐC GìA HÀ \r
1 R U N C t1/yvi
A M TLDHC!
flQ N G tin t h u ý lE N
ĨRỊ1NC
D T / 5 T (5

HÀ NỘI - 2006


BÁO CÁO TÓM TẮ T K ẾT Q U Ả THỰC HIỆN
Đề tài cấp Đ H Q G H N năm 2005
1. Tên đề tài:
Phân tích đánh giá sự có m ặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước thải

bệnh viện
M ã số: Q T - 05 - 43
2. Chủ trì đề tài: TS. Dương Hồng Anh
3. Các cán bộ tham gia: ThS. Phạm N gọc Hà
CN. Hoàng Thị Thương
CN. N guyễn H oàng Tùng
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu của đê tài:
- Thiết lập phương pháp phân tích lượng vết m ột số kháng sinh họ Floquinolon
trong nước thải bệnh viện;
- Cung cấp thông tin về nồng độ một số chất kháng sinh trong nước thải bệnh viện
tại Hà nội
N ội dung nghiên cứu:
-

Nghiên cứu qui trình phân tích lượng vết m ột số kháng sinh họ Floquinolon
trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan: chiết tách và làm giàu bằng
phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết cation hỗn hợp (M PC), định tính
định lượng bằng sắc ký lỏng cao áp với detectơ huỳnh quang

-

Nghiên cứu việc sử dụng cột silicagel tự hoạt hoá thay th ế cho cột MPC trong
giai đoạn chiết tách mẫu.

-

Lấy mẫu nước thải tại các điểm khác nhau trong hệ thống xử lý nước thải của
bệnh viện Hữu Nghị theo giờ trong ngày (24 giờ/ngày, 1 m ẫu/3giờ). Phân tích dư
lượng kháng sinh Ciprofloxacin và N orfloxacin trong nước thải bệnh viện Hữu

Nghị

-

Phân tích đối chứng các mẫu nước thải tại Viện K hoa học và Công nghệ Môi
trường Liên bang Thuỵ sỹ

-

Phân lập vi khuẩn Ecoli từ mẫu nước thải và xác định tính kháng kháng sinh của
nó đối với Ciprofloxaxin và N oríloxaxin

5. Tóm tắt kết quả nghiên cứu đạt được
Tóm tất kết quả nghiên cứu, ý nghĩa khoa học của kết qu ả đạ t được:
-

Đã hồn thiện qui trình phân tích lượng vết m ột số kháng sinh họ Floquinolon
trong nước thải bệnh viện dựa trên hai giai đoan: chiết tách và làm giàu bằng
phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết cation hỗn hợp (M PC), định tính
định lượng bằng sắc ký lỏng cao áp với detectơ huỳnh quang. Qui trình có hiệu
suất thu hồi cao (trung bình 84 - 101%), giới hạn định lượng 0,5 - 1 |ig/L đáp
ứng u cầu phân tích m ẫu mơi trường

-

Đã thành cơng trong việc sử dụng cột silicagel tự hoạt hoá thay th ế cho cột MPC
trong giai đoạn chiết tách mẫu, qui trình phân tích cho hiệu suất thu hồi 80 81%. Kết quả phân tích mẫu nước thải thực tế tương đương với qui trình trên.
Hiện nay chưa có cơng trình nào cơng bố về việc sử dụng cột silicagel chiết tách

Floquinolon từ nước thải. Sử dụng cột silicagel có ưu thế tiết kiệm chi phí so với
cột MPC, tạo điều kiện chủ động cho nghiên cứu tại V iệt Nam.
-

Đã xác định dư lượng kháng sinh Ciprofloxacin và N orfloxacin trong nước thải
bệnh viện Hữu Nghị trong mẫu nước thải lấy tại các điểm khác nhau trong hệ
thống xử lý nước thải của bệnh viện Hữu Nghị theo giờ trong ngày (24 giờ/ngày,
1 mẫu/3giờ). Phát hiện thấy tổng dư lượng Ciprofloxacin và N orfloxacin trong
khoảng 3,5 tới 50,3 \xglL. Dư lượng Ciprofloxacin và N orfloxacin còn lại trong
nước thải sau xử lý so với nước thải chưa xử lý là 13 ± 3% và 21 ± 3%.

-

Vi khuẩn Ecoli phân lập từ mẫu nước thải chưa xử lý có tính kháng kháng sinh
đối với C iprofloxaxin và N orfloxaxin cao hơn so với vi khuẩn phân lập từ nước
thải đã xử lý m inh chứng cho sự xuất hiện tính kháng kháng sinh của vi khuẩn
sống trong mơi trường có dư lượng kháng sinh tương đối thấp.

Tóm tắt kết quả nghiên cứu, ý nghĩa thực tiễn của kết quả đạt được:
-

Qui trình phân tích lượng vết một số kháng sinh họ Floquinolon trong nước thải
bệnh viện dựa trên phương pháp chiết pha rắn kết hợp sắc ký lỏng cao áp với
detectơ huỳnh quang có hiệu suất thu hồi cao, giới hạn phát hiện đáp ứng yêu
cầu phân tích mẫu nước thải thực tế. Sử dụng cột silicagel trong giai đoạn chiết
tách mẫu là giải pháp tiết kiệm chi phí, tạo điều kiện chủ động cho nghiên cứu
tại Việt Nam.

-

Đã xác định dư lượng kháng sinh Ciprofloxacin và N orfloxacin trong nước thải
của bệnh viện Hữu Nghị tại các công đoan xử lý khác nhau của hệ thống xử lý
nước thải

6. Kinh phí của đề tài
6.1. K inh p h í được c ấ p : 15 triệu đồng
6.2. Giải trình các khoản chi:
-

Th khốn chun mơn:
Hố chất, ngun liệu, dụng cụ:
Hội nghị, hội thảo:
Điện nước và quản lý phí:

KHOA QUẢN LÝ
Phó Giám đốc,
Trung tâm NC C N M T &PTBV

PGS.TS. Vũ Q uyết Thắng

6.700.000 đồng
7.100.000 đổng
180.000 đồng
1.200.000 đồng

CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI

TS. Dương H ồng Anh

TR Ư Ờ N G ĐẠI HỌC K H O A HỌ C T ự N H IÊN

BRIEF OF TH E PR O JE C T
1. Nam e o f project:
Research on analytical method developm ent and determ ination o f Fluoroquinolone
A ntibacteria A gents in hospital w astew ater
T he code n u m b e r: Q T - 05 - 34
2. The C oordinator: Dr. Duong Hong Anh
3. The Participants o f the project:

MSc. Pham N goc Ha
BSc. H oang Thi Thuong
BSc. N guyen H oang Tung

4. Purpose and contents of the research
Purpose:
- Development and evaluation of analytical m ethod for determ ination of
Fluoroquinolone A ntibacteria agents (FQs) in hospital w astw ater
- Pleliminary providing inform ation on the occurence o f FQ s in hospital
wastwater in Hanoi
Content:
-

Evaluation of analytical procedure based on solid phase extraction method
(using M ix Phase Cation - MPC exchange disk cartridge) com bined with high
perform ance chrom atography/ fluorensence detector for determ ination of FQs in
hospital wastew ater

-

Studying on using hom e-m ade sillicagel cartridge instead for M PC cartridge in
the solid phase extraction step.

-

Sampling and analysing FQs in wastew ater o f Huu N ghi hospital. Samples were
collected at various points in the w astew ater treatm ent system and various day
and night times.

-

Cross- checking analysis in Swiss Federal Institute for Environm ental Science
and Technology

-

Determ ination of antibiotic resistance of Ecoli strains isolated from w astew aters
of Huu Nghi hospital

5. Sum m ary o f obtained investigation results
-

Com pleting analytical procedure based on solid phase extraction m ethod (using
Mix Phase Cation - MPC exchange disk cartridge) com bined with high
perform ance chrom atography/ fluorensence detector for determ ination of FQs in
hospital w astew ater. Average recoveries obtained for FQ s were in range o f 84 101%. Q uantitative determ ination limits were in range o f 0,5 - 1 |ig/L. The
investigated m ethod was suitable for naalysis o f environm ental sam ples.

-

The hom e- m ade silicagel cartridge was successfully applied for solid phase
extraction step instead o f the com m ercial M PC cartridge. A verage recoveries
obtained for FQs were in range of 80 -81% . Q uantitative determ ination limits
were in range o f 0,6 - 1 |ig/L. The com parison analysis o f FQ s in real


w astew ater sam ples showed a high relative value (> 0,9). It is the first
publication on using o f sillicagel for FQs extraction from wastewater. This
solution was the cost saving and suitable solution for laboratory in Vietnam.
Ciprofloxacin and N orfloxacin were found in hospital collected at various points
in w astew ater treatm ent system of Huu Nghi Hospital at total concentration in
range of 3,5 - 50,3 Hg/L. Levels of Ciprofloxacin and N orfloxacin in raw
w astew ater were 13 ± 3% and 21 ± 3%, respectively, in com pared with those in
finished wastewater.
Ecoli strains isolated from raw wastew ater showed higher antibiotic resistance
incompare with those isolated from finished wastewater. It is a evidence for the
extention of antibiotic resistance of bacteria grow ing in the environm ent, which
contained low level of antibiotic.


1

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC

1

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3

DANH MỤC CÁC BẢNG

4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ

4

MỚ ĐẦU

6

I. TỔNG QUAN

8

1.1.

Khía cạnh mơi trường của vấn đề dược phẩm

8

1.2.

Giới thiệu về kháng sinh nhóm Floquinolon

10

II. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1.

Mục tiêu nghiên cứu

13

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

13

2.2.1.

Xây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn/ kết hợp sắc
ký lỏng hiệu năng cao phân tích lượng vết FQ trong mẫu

2.2.2.

nước thải

13

Lấy mẫu, phân tích FQ trong m ẫu thực tế

12

III. THỰC NGHIỆM

14

3.1.

Hoá chất, dụng cụ, thiết bị

14

3.2.

Điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao

14

3.3.

Thực nghiệm

15

3.3.1.

Pha các dung dịch chuẩn và dung dịch cần sử dụng

3.3.2.

Xây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn/ kết hợp sắc

15

ký lỏng hiệu năng cao phân tích lượng vết FQ trong mẫu
nước thải
3.3.3.

Phân tích FQ trong các mẫu nước thải lấy tại bệnh viện Hữu
Nghị

3.3.4.

J^

18

Xác định tính kháng kháng sinh FQ của các vi khuẩn Ecoli
phân lập từ các mẫu nước thải lấy tại bệnh viện Hữu Nghị

20


2

IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.

Đánh giá phương pháp chiết pha rắn bằng cột M PC/ kết hợp sắc kí
lỏng hiệu năng cao phân tích lượng vết FQ trong mẫu nước:

4.2.

Xãy dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn bằng cột silicagel/ kết

hợp sắc kí lỏng hiệu năng cao phân tích lượng vết FQ trong m ẫu nước

4.3.

23

Kết quả phân tích FQ trong các mẫu nước thải lấy tại bệnh viện Hữu
Nghị

4.4.

21

26

Kết quả xác định tính kháng kháng sinh FQ của các vi khuẩn Ecoli
phân lập từ các mẫu nước thải lấy tại bệnh viện Hữu Nghị

29

V. KẾT LUẬN

32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

33


3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CIP

: kháng sinh ciprofloxacin

FQ

: kháng sinh họ floquinolon

HPLC/FLD

: sắc kí lỏng hiệu nãng cao/ detectơ fluoresen

LOD

: giới hạn phát hiện của phương pháp

LEV

: kháng sinh levofloxacin

LOME

: kháng sinh lom efloxacin

LOQ

: giới hạn định lượng của phương pháp

MIC

: nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn

MPC

: cột chiết pha rắn loại cation hỗn hợp

NOR

: kháng sinh norfloxacin

OFL

: kháng sinh ofloxacin

SPE

: chiết pha rắn


4

DANH MỤC CÁC BẢNG

Khối lượng silicagel và nước hoạt hoá của các cột chiết pha
rắn silicagel tự nhồi

17

Hiệu suất thu hổi của phương pháp phân tích FQ s trong nước
thải sử dụng kĩ thuật SPE (cột chiết M PC)/H PLC-FLD

21

Hiệu suất thu hồi trung bình [%] của quá trình chiết FQ
bằng các cột chiết silicagel tự nhồi

24

Nồng độ CIP và NOR trong nước thải bệnh viện Hữu Nghị
26
Tải lượng CIP và NOR trong nước thải bệnh viện Hữu Nghị
đưa vào hệ thống nước thải thành phố

27

Số lượng Ecoli và nồng độ ức chế tối thiểu (M IC) của CIP và
NOR đối với chủng Ecoli đã phân lập từ các mẫu nước thải
bệnh viện Hữu Nghị

30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ổ THỊ
Trang
K hoảng nồng độ của các loại dược phẩm được phát hiện trong
môi trường nước tại khu vực châu Âu và Bắc Mỹ

8

Các nguồn và con đường dược phẩm có thể xâm nhập vào mơi
trường
Cấu trúc chung của nhóm FQ và m ột số FQ tiêu biểu

9

11

Sơ đổ hệ thống xử lí nước thải tại bệnh viện Hữu nghị và các
điểm lấy mẫu

19

Ảnh toàn cảnh hộ thống xử lý nước thải của bệnh viện Hữu
Nghị và lấy m ẫu nước thải trước xử lý

19

Quy trình phân tích lượng vết FQ trong nước bằng phương pháp
chiết pha rắn cột M PC/ kết hợp sắc kí lỏng hiệu năng cao

21


5

Hình 7.

Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích FQs

trong nước thải sử dụng kĩ thuật SPE (cột chiết M P Q /H P L C FLD

Hình 8.

22

Kết quả thí nghiệm xác định thể tích Breakthrough khi chiết
tách FQ khỏi nền nước thải và nước ngầm sử dụng cột chiết
MPC

Hình 9.

Quy trình phân tích lượng vết FQ trong nước bằng phương pháp
chiết pha rắn cột silicagel/ kết hợp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Hình 10.

23

23

Kết quả thí nghiệm xác định thể tích Breakthrough khi chiết
tách FQ khỏi nền nước thải và nước ngầm sử dụng cột chiết
Silicagel

Hình 11.

So sánh kết quả phân tích mẫu thật khi sử dụng cột MPC và cột
Silicagel

Hình 12.

26

Dư lượng CIP và NOR cịn lại (so với ban đầu) qua từng công
đoạn cùa hệ thống xử lí nước thải tại bệnh viện Hữu Nghị

Hình 14.

25

Nồng độ NOR và CIP phát hiện được trong nước thải chưa xử
lý của một sô' bệnh viện ở Thuỵ sỹ và Việt Nam

Hình 13

25

28

Nồng độ N O R và CIP trong các mẫu nước thải lấy theo giờ và
mẫu trộn tại các điểm lấy mẫu thuộc hệ thống xử lí nước thải
bệnh viện Hữu nghị

Hình 15.

28

Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của N O R và CIP
đối với chủng Ecoli phân lập từ các m ẫu nước thải bệnh viện

Hữu nghị

29


6

MỎ ĐẦU

Thuốc kháng sinh được sử dụng rộng rãi vào mục đích điều trị bệnh cho con
người và thuốc thú y với số lượng ỉớn từ cách đây vài thập kỷ. Các thuốc điều trị bệnh
sau khi có tác dụng trong cơ thể sẽ đi vào môi trường qua phân, nước tiểu dưới dạng
hỗn hợp của những chất chưa bị chuyển hoá, các sản phẩm chuyển hoá và các phức
hợp. Trong q trình xử ỉí nước thải (nếu có) và trong mơi trường nước tự nhiên, chúng
có thể bị khống hoá, phân huỷ sinh học, hấp phụ vào bùn hoặc vẫn tồn tại trong nước
thải và cuối cùng đi vào nguồn nước mật tiếp nhận.
Dư lượng thuốc kháng sinh được xếp vào ỉoại các chất ô nhiễm mới (“em erging
contam inant” ) trong môi trường, do sự gia tăng sử dụng, thải bỏ vào mơi trường và các
hoạt tính sinh học của chúng. Hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và
những chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được bắt đầu từ
những nãm cuối thập kỉ 90 và rất được quan tâm hiện nay tại các nước đã phát triển
như Mỹ, Đức, Thuỵ sỹ [1, 3, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 17]... Các nghiên cứu cho thấy sự có
mặt của dư lượng kháng sinh và các sản phẩm chuyển hoá của chúng trong môi trường
nước đã trở nên phổ biến. Và đây là nguy cơ làm lan rộng hiện tượng kháng kháng
sinh trong môi trường, gây ra ảnh hưởng tiêu cực tới hiệu quả điều trị cũng như những
nguy cơ tiềm ẩn cho hệ sinh thái thuỷ quyển.
Tại Việt Nam hiện nay, các nhóm kháng sinh đang được sử dụng phổ biến cho
con người là (3-lactam, m acrolide, floquinolon... tuy nhiên việc phân loại và đánh giá
lượng kháng sinh tiêu thụ khó có thể thực hiện m ột cách chính xác do cách quản lí và
thói quen sử dụng thuốc khơng theo đơn. Các đô thị lớn như Hà nội, thành phô' Hồ Chí

M inh là nơi tập trung dân cư và những bệnh viện lớn, tuy nhiên hầu hết các bệnh viện
đểu đang hoạt động m à khơng có hệ thống xử lí nước thải, dẫn tới việc thải loại trực
tiếp các dược phẩm sau sử dụng trong đó có m ột ỉượng không nhỏ các kháng sinh vào
nước thải [20]. M ặt khác, sự gia tăng và khó kiểm sốt của việc sử dụng thuốc kháng
sinh trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi thuỷ sản cũng là nguồn tiềm ẩn đưa các dư
lượng kháng sinh vào môi trường nước mặt.
Tại Việt N am hiện nay chỉ có m ột vài phịng thí nghiệm chức năng kiểm sốt
dư lượng một số kháng sinh trong cá, tơm phục vụ xuất khẩu cịn vấn đề dư lượng


7

kháng sinh trong môi trường và ảnh hưởng của chúng là hồn tồn mới. Trên khía
cạnh mơi trường và sức khoẻ cộng đồng, bên cạnh việc giải quyết những ô nhiễm đã
được phát hiện, thì m ột nhu cầu cấp thiết m à xã hội đặt ra cho các nhà khoa học là tìm
hiểu về các chất ơ nhiễm mới (“em erging contam inant” ) để đưa ra những cảnh báo về
nguy cơ ô nhiễm tiềm ẩn đối với môi trường cũng như ảnh hưởng bất lợi cho sức khoẻ.
Xuất phát từ các nhu cầu đó, chúng tơi đề xuất đề tài nghiên cứu xây dựng qui
trình phân tích và áp dụng để đánh giá sự tồn lưu của dư lượng của một số kháng sinh
họ floquinolon trong nước thải bệnh viện và nước mặt. Đây là nghiên cứu đầu tiên sẽ
cung cấp qui trinh phân tích chính xác và đặc biệt là các thơng tin về sự có mặt của dư
lượng thuốc kháng sinh trong nước thải tại một số bệnh viện Hà nội. Các kết quả
nghiên cứu sẽ đóng góp vào việc tãng cường kiến thức, thơng tin về thuốc kháng sinh
một đối tượng mới có khả năng gây ô nhiễm môi trường và tác động tới hiện tượng
kháng thuốc của ví khuẩn trong mơi trường.


8

I. TỔNG QUAN:

Khía cạnh mỏi trường của vấn đề dược phẩm
Từ những thập kỉ cuối của thế kỉ 20, các nhà khoa học đã nhận dạng được rất
nhiều hoá chất sử dụng trong nông nghiệp, công nghiệp cũng như dân dụng có khả
nâng xâm nhập, khuếch tán một cách rộng rãi và tồn tại bền vững trong môi trường.
Gần đây, người ta bắt đầu quan tâm dược tới dược phẩm nói chung và các sản phẩm
bảo vệ sức khoẻ như những chất gây ổ nhiễm môi trường mới. ở nhiều nước trên thế
giới như Úc, Brazil, Canada, Mỹ, Đan M ạch, Phần Lan, Hà Lan, Anh, Đức, Thuỵ Sỹ,
Italia, Croatia, Tây Ba N ha [1, 3, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 17] đã phát hiện sự có mật trong
mơi trường của dư lượng nhiều nhóm dược phẩm như các thuốc kháng sinh, thuốc
chống dị ứng, thuốc an thần, thuốc điều chỉnh huyết áp .....Hình 1 là bức tranh chung
mơ tả khoảng nồng độ của các dược phẩm tìm thấy trong môi trường nước tại khu vực
châu Âu và Bắc Mỹ.
■ Nước thải thành phố dã xử lý
Nước mặt
□ Nước ngầm

Floquinolon
Kháng sinh

M acrolite

Sunfonamit
Tetracyclin
Thuốc chống dị ứng
Thuốc chống động kinh
Thuốc điều hoà huyết áp
Thuốc chữa bệnh phổi
Thuốc điểu hoà lipit
Thuốc an thần

—I
10

100

1000

10000

Nồng độ (n g /L )

H ình 1. K hoảng nồng độ của các loại dược p hẩm được ph á t hiện
trong m ôi trường nước tại khu vực châu Âu và Bắc M ỹ [1,5]


9

Bang các phương pháp phân tích hiện đại, với độ nhạy và độ chọn lọc cao, có
thể phát hiện dược phẩm ở khoảng nồng độ cỡ |ig/L , trong nền mẫu môi trường khá
phức tạp. ơ mức độ nồng độ thấp như vậy, dư lượng thuốc khơng cịn tác động dược lý
tới con người, tuy nhiên các tác động sinh thái học do phải tiếp nhiễm lâu dài và liên
tục với hỗn hợp dư lượng dược phẩm là vấn đề chưa được biết và rất khó đánh giá. Vì
dược phẩm sử dụng cho con người và thú y ngày càng gia tăng cả về số lượng và
chủng loại nên các nghiên cứu về dược phẩm trong môi trường hiện đang trở thành
vấn đề đặc biệt chú ý của các nhà khoa học.

* Sự có mặt và chun hố của dược phẩm trong mơi trường
Dược phám có thể đi vào mơi trường thơng qua q trình sản xuất, sử dụng và
thải bỏ. Sơ đồ về con đường xâm nhập của dược phẩm vào mơi trường được trình bày
trong hình 2 .

Thuốc chừa bệnh cho con người

'°
-Q
-ộj

Thuốc thú y

-C

diểu trị

điểu tn
Thải bò thuốc
khỏng sử dụng

kich thích sinh trướng

Thải loại khỏi cơ thể thòng qua
phản và nước tiểu

^................................-

phụ gia thức ăn

'ra
C
3"O
->3

Thuốc dư

ư)

---- ——---------

J

JZ

C ^ x ừ l ý nưốc t h a T ^ ^ ) l ý phản bùrT^

D1
C

nước thài

‘*o

bùn thải


H
Chôn lấp bãi rác

đất

Trẩm tích

Nước mặt

C
<0)
lc
c
'D-

Nước ngấm

H ình 2. C ác nguồn và con đường dược phẩm có th ể xám nhập vào m ôi trường

Đối với dược phẩm chữa bệnh cho người, sau khi có tác dụng điều trị trong cơ
thể các dược phẩm còn dư và một số sản phẩm chuyển hoá sẽ bị thải qua phân, nước


10

tiểu và đi vào hệ thống cống thải sau đó đi tới hệ thống xử lý nước thải đô thị tập trung
(nếu có). Tại các hệ thống xử lý này, có thể xảy ra các q trình đối với dược phẩm:a.
chuyển hố sinh học hoặc khống hố hồn tồn, b) hấp thu vào bùn, c) tiếp tục ở lại
trong nước thải đã xử lý. Trên thực tế, người ta đã tìm thấy dư lượng dược phẩm trong
nước thải đầu ra, đó chính là bằng chứng của việc khơng loại bỏ được hồn tồn các
hố chất này của các hệ thống xử lý nước thải tập trung; Và do đó các chất ô nhiễm
này sẽ được đưa vào môi trường nước mặt.
1.2. Giới th iệ u về k h á n g sinh nhóm Floquinolon
Trong sách dược lý học của trường Đại học Y khoa Hà Nội kháng sinh được
định nghĩa như sau: “ Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoặc là sản
phẩm bán tổng hợp (như ampicilin, amikacin), cũng có khi là sản phẩm tổng hợp (như

cloram phenicol, các quinolon) có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều thấp do ức chế
quá trình sống của m ột sơ' vi sinh vật”
Kháng sinh có thể làm thay đổi hình dáng của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp
protein cũa vi khuẩn, kìm hãm sự tạo vách của vi khuẩn. Ngược lại một số vi khuẩn có
thể kháng lại với thuốc kháng sinh, thường do tạo được các enzym hủy kháng sinh.
Để phân loại kháng sinh có thể dựa vào nguồn gốc hoặc cơ chế tác dụng, nhưng
thường chúng được sắp xếp theo nhóm có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Các nhóm
kháng sinh được sử dụng rộng rãi hiện nay trong điều trị bệnh là: nhóm p Lactam
A m inoglycosid (gọi tắt là các Aminozid), Cloramphenicol và dẫn xuất, Tetracylin,
M acrolid, R ifam ycin và các Quinolon
* Q uinolon kinh điển
Q uinolon kinh điển là nhóm kháng sinh tổng hợp, gồm các axit nalidixic,
oxolinic, pipem idic, pirom idic và flum equin. Trong cấu trúc của các phân tử này
khơng có ngun tố F và nhân piperazin.
A xit nalidixic ức chế sự tổng hợp ADN ở vi khuẩn, thường là các enzym tham
gia tạo dây xoắn ADN. Nó tạo được phức với ADN hoặc với m ột protein tham gia
nhân đôi A D N . N hóm thuốc này tác dụng chủ yếu trên trực khuẩn Gram (-), đặc biệt
trên khuẩn ruột. Q uinolon kinh điển có phổ hẹp, chỉ hạn chế trong điều trị nhiễm
khuẩn đường tiết niệu, vì vậy hiện nay người ta ít dùng quinolon kinh điển.


11

* F loquinolon (FQ)
Sau 20 năm nghiên cứu, cùng với việc gắn thèm vào nhân Quinolon nguyên tố
F và dị vòng piperazin, người ta thu đươc những Q uinolon thế hệ hai đó là các
Floquinolon. So với Q uinolon kinh điển, các FQ có phổ tác dung lớn hơn, tác dụng
mạnh hơn, hấp thu tốt qua ống tiêu hóa, phân phối tốt trong cơ thể, có thể dùng uống
được để chữa các bệnh nhiễm khuấn ở người và động vật, đặc biệt là các bệnh nhiễm
khuẩn nãng toàn thân như nhiễm khuẩn huyết, viêm m àng não, viêm màng trong tim,

nhiễm khuẩn xươn2, khớp trong do khuẩn Gram (-). Đến những năm đầu của thập ki
80, FQ được đưa ra sừ dụng rộns rãi và phổ biến ở ngoài thị trườna, bao gồm:
ciprofloxacin,

norfloxacin,

ofloxacin,

levofloxacin,

fleroxacin.

lomefloxcin,

tosufloxacin, difloxacin...
Theo công thức cáu tạo. FQ là dẫn xuất của 3-cacboxyl-4-oxoquinolon. với
nguyên tố F đính vào vị trí cacbon số 6 , nhóm piperazin ở vị trí cacbon số 7, và vị trí
cacbon số 1 có thè nhận các nhóm chất khác, nhưng thường gập nhất là nhóm
xyclopropyl.

c
C G O H

stprotlavicm
C IP

o t lo x a c in

OFL

le v o llo x a c in
LEV

n o rflo x a c in
NOR

lo m e f lo x a c in

LOM

H ình 3. C ấu trúc chung của nhóm FQ và m ột SỐFQ tiêu biểu
Do có cấu trúc p- xetonìc, nên các FQ có khả nãng liên kết với các ion kim loại
hoá trị II (M g2+. Fe2+, C u2+...) vì vậy những protein có chứa kim loại trở thành đích thu
hút các FQ. Sự kết hợp giữa các FQ với các ion kim loại tạo ra các phức hợp đẳng
phân tử điện dương (chelat) có tính diệt khuẩn.
|J

-


12

Sau khi sử dụng tại bệnh viện, nhà dân, các cơ sở sản xuất dược phẩm, kháng
sinh FQ đi vào môi trường chủ yếu qua con đường nước thải, nước ni trồng thủy
sản, phân động vật và bùn thải bón cho ruộng. Khác với nhiều loại kháng sinh, trong
môi trường FQ không bị phân hủy bởi vi khuẩn [12]. Các nghiên cứu về phản ứng
phân hủy quang hóa cho thấy đây là con đường thoái biến quan trọng cùa FQ trong
nước mật, tuy nhiên tốc độ phản ứng quang hóa này bị giảm đáng kể khi có mặt các
hợp chất humic. Các kháng sinh FQ có khả năng hấp thu rất tốt vào đất, các chất
humic hoặc các vật chất hữu cơ hịa tan. Chính do các tính chất trên. FQ là loại kháng

sinh tồn tại trong môi trường tương đối bền vững hơn so với các họ kháng sinh khác.
Tính bền cùng với tốc độ gia tăng sử dụng FQ chính là mối ỉo ngại cho việc lan rộng
tính kháng kháng sinh đối với vi khuẩn trong môi trường cũng như các vấn đề về độc
học sinh thái và độc học gen có liên quan khác [5].
Tại Thụy sỹ, tác giả Golet E.M. đã công bố luận án tiến sỹ năm 2002 [5], đánh
giá sự có mặt của dư lượng FQ trong nước thải đô thị, bùn thải và nước mật đồng thời
đánh giá nguy cơ độc học gen đối với vi khuẩn. Tác giả Phạm N.A. đã công bố luận
vãn thạc sỹ năm 2003 [15] về nồng độ của một số FQ trong nước thải của bệnh viện
tại Thụy sỹ. Kết quả cho thấy dòng thải từ bệnh viện đóng góp phần đáng kể vào tải
lượng FQ trong nước thải thành phố. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tơi đánh giá
lại quy trình phân tích mà tác giả Golet đã xây dựng cho đối tượng là nước thải bệnh
viện của Việt Nam. Đ ồng thời nghiên cứu sử dụng cột silicagel tự nhồi để thay thế cho
cột chiết thương mại được sử dụng trong qui trình nói trên với mục tiêu giảm chi phí
và tăng tính chủ động khi thực hiện phép phân tích tại phịng thí nghiệm ở Việt Nam.
Quy trình phân tích đã nghiên cứu đựoc sử dụng để xác định dư lượng thuốc kháng
sinh trong nước thải tại bệnh viện Hữu Nghị là một ví dụ về bệnh viện đa khoa có hệ
thống xử lý nước thải. Nồng độ ức chế tối thiểu của FQ với các chùng Ecoli phân lập
từ nước thải đã được xác định để bước đầu tìm hiểu tìm hiểu về hiện tượng kháng
thuốc của vi khuẩn trong môi trường khi có mặt của dư lượng kháng sinh ở nồng độ
thấp.


13

II. M ỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP N G H IÊN CỨU:
2.1. M ục tiêu nghiên cứu:
-

Thiết lập phương pháp phân tích lượng vết m ột số kháng sinh FQ trong nước thải

-

Cung cấp thông tin về nồng độ một sô' kháng sinh FQ trong nước thải bệnh viện tại
Hà nội và tìm hiểu khả năng kháng kháng sinh FQ của vi khuẩn Ecoli trong nước
thải.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1. X ây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắní kết hợp sắc ký lỏng hiệu •
năng cao phán tích lượng vết FQ trong mẫu nước thải
Lượng vết FQ được chiết tách, làm sạch và làm giàu bằng phương pháp chiết
pha rắn sử dụng cột chiết pha rắn loại cation hỗn hợp (MPC) hoặc cột silicagel tự nhồi.
Sau đó, FQ được phân tích định tính và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử
dụng cột tách C16 Amit.
Các thông số như hiệu suất thu hồi, độ lặp lại, giới hạn phát hiện và thể tích
breakthrough được xác định để đánh giá phương pháp phân tích. M ột số mẫu thật
được phân tích đồng thời bằng cả hai qui trình phân tích (sử dụng cột MPC hoặc cột
silicagel) để so sánh.
2.2.2. Lấy mẩu, phán tích FQ trong mẫu thực tê'
Mẫu nước thải được lấy tại bệnh viện Hữu nghị tại các điểm khác nhau của hệ
thống xử lý nước thải và tại các thời điểm khác nhau trong ngày khảo sát để đánh giá
sự có m ặt của các FQ, hiệu quả xử lý của từng giai đoạn, sự dao động của hàm lượng
FQ trong ngày. Đ ồng thời với việc phân tích hàm lượng FQ, vi khuẩn Ecoli được phân
lập từ m ẫu nước thải sẽ được xác định tính kháng kháng sinh FQ.


14

III. THỰC NGHIỆM :

3.1. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị
-

Chất chuẩn dạng bột: C ip ro flo x acin (B io F lu k a -1 7 8 5 0 ), N o rflo x acin
(S IG M A :0 -8 7 5 7 ), O flo x a c in (S IG M A : N -9 8 9 0 ), L o m e flo x a c in (SIG M A :
L -2 9 0 6 ), L ev o flx a c in (F lu k a 2 8 2 6 6 )

-

Dung dịch axit photphoric 85%, A xetonitril, am oniac 25% , axit chlohydric
37%, M etanol tinh khiết (M erck, Darmstadt, Đức)

-

Giấy pH, giấy lọc kích thước 0,45|im , 0,2|im

-

Bình định mức 1, 2, 5, 50, 2000 ml, lọ đựng mẫu thể tích 1,5ml, micropipet 10,
100, 1000, 5000 ịú.

-

Bộ chiết pha rắn Buchi

-

Cân phân tích độ chính xác 0,000 lg M ettler (Thuỵ sỹ)

-

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC LC10A), sử dụng detectơ huỳnh quang (FLD) của hãng Shimadzu - Nhật Bản.

3.2. Điều kiện phản tích sắc kỷ lỏng hiệu nãng cao:
Các điều kiện phân tích sắc kí lỏng hiệu năng cao được sử dụng như sau:
-

Tiền cột: RP-A m it C16 (3,0 mm), cột: RP-A m it C16 (250 X 3,0 mm; 5ụm ,
Supelco)

-

N hiệt độ lò: 50l,c

-

Áp suất tối thiểu: lObar; áp suất tối đa: 400bar

-

Thể tích bơm mẫu: 200 ỊJl.

-

Tốc độ dịng 0,7m l/phút.

-

Detectơ huỳnh quang (FLD): Bước sóng kích thích (excitation): Vị = 278nm
Bước sóng phát xạ (em ission): v2= 445nm

-

Pha động: Sử dụng chế độ gradien dung môi với: Dung dịch H 3PO4 25mM (A),
dung môi A xetonitril (B)


15

3.3. Thực nghiệm
3.3.1. Pha các dung dịch chuẩn và dung dịch cần sử dụng
-

Dung dịch axit photphoric 25mM: Lấy 3412 ụl dung dịch H3PO4 85%, pha
thành 2L dung dịch H3P 0 4 25mM trong nước deion

-

Pha lOOml dung dịch hỗn hợp M eO H /H 20 (1:1) + 0.2% HCỈ: Lấy 50ml
M eOH + 50ml H20 + 550ụl HC1 37%

-

Pha lOOml dung dịch hổn hợp N H 3ỈM e0 H ỈH 20 (5:15:85): Lấy 5ml NH3 +
15ml M eOH + 85ml nước deion

-

Nước deion đ ể hoạt hóa cột (được điêu chỉnh vê giá trị p H = 3: Dùng axit
chlohydric để điều chỉnh nước deion về pH = 3

-

Pha dung dịch chuẩn gốc - nồng độ 400ppm : Cân 0,02g từng chất chuẩn cho
vào bình định mức 50ml, dùng dung dịch M eOH / H 20 (1:1) + 0,2% HC1 đê
định mức được các dung dịch chuẩn gốc của từng đơn chất có nồng độ
400ppm. Dung dịch được đựng trong lọ nâu, bảo quản trong tủ lạnh và pha lại
hàng tháng

-

Pha dung dịch hỏn hợp chuẩn đ ể phán tích: Từ dung dịch chuẩn gốc của các
đơn chất có nồng độ 400ppm, pha loãng trong axit H 3P 0 4 25mM được dãy
dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ từ lppm đến lOppm. Dung dịch sau khi
pha được lọc qua màng lọc, rồi cho vào lọ đựng mẫu, sau đó đem đi phân tích
trên thiết bị HPLC

3.3.2. X ây dựng, đánh giá phương pháp chiết pha rắn! kết hợp sắc k ý lỏng hiệu
năng cao phàn tích lượng vết FQ trong mẫu nước thải
Q uy trình tách chiết lượng vết FQ từ nước thải bẳng phương pháp chiết pha rắn
sử dụng cột chiết pha rắn loại cation hỗn hợp (MPC) sau đó phân tích bằng sắc ký
lỏng hiệu nãng cao sử dụng cột tách C16 A m it đã được G olet E.M . [4] phát triển và sử
dụng để phân tích lượng vết FQ trong nước thải bệnh viện và nước mặt tại Thụy sỹ.
Q uy trình này được đánh giá lại khi sử dụng trong điểu kiện phịng thí nghiệm Viêt


I

16

Nam trên cơ sở xác định các thông số về hiệu suất thu hồi, độ ỉặp lại, giới hạn phát
hiện và thể tích breakthrough.
Cột chiết pha rắn MPC ỉà loại cột chiết tương đối đặc hiệu, phải đặt m ua nhập
ngoại do vậy song song với việc áp dụng quy trình nói trên, chúng tơi khảo sát việc sử
dụng silicagel - một chất hấp phụ phổ biến thay th ế cho cột M PC tách chiết các FQ từ
mẫu nước thải.
Các công việc cụ thể đã thực hiện trong phần xây dựng, đánh giá phương pháp
phân tích được trình bày như sau:

a. Đánh siá phươne pháp chiết pha rắn ban s cơt MPC! kết hơp sắc kí ỉỏne hiêu
n án s cao phán tích lư ơns vết FO trone mẫu nước:
* H iệu suất thu hồi và độ lập lại:
Hiệu suất thu hồi và độ ỉặp lại của phương pháp được kiểm tra qua việc phân
tích lặp ỉại 6 lần mẫu nước máy và nước thải đã được thêm hỗn hợp FQ ở nồng độ
20ppb.
* Giới hạn phát hiện:
Giới hạn phát hiện của phương pháp được kiểm tra qua việc phân tích lặp lại 6
lần mẫu nước máy và nước thải đã được thêm hỗn hợp FQ ở nồng độ 5ppb. Giá trị giới
hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được tính bằng 10 lần giá trị độ lệch chuẩn
của việc phân tích ỉặp [14].
* T h ể tích breakthrough:
Khi cho mẫu chứa chất phân tích qua cột chiết pha rắn, trên cơ sở tương tác
khác nhau của các chất trong pha động (pha mẫu lỏng) và pha tĩnh (chất nhồi cột),
chất cần phân tích sẽ được giữ lại trên cột. Tuy nhiên nếu thể tích mẫu quá lớn, bên
cạnh q trình pha tĩnh hấp thu các chất phân tích từ dung dịch mẫu cịn có q trình
ngược lại tức là dung dịch mẫu rửa giải m ột phần chất phân tích đã giữ trên cột. Do
vậy cột chiết pha rắn chỉ giữ được một phần lượng chất phân tích


17

b. X ảy d im e và đánh siá phương pháp chiết pha rắn b ằ n s cô t silicaeel/ kết hơp sắc
kí ỉỏne hiêu năn e cao phân tích lươn£ vết F 0 trone m ẩu nước:
* N hối côt silicasel:
Trước khi nhồi cột, silicagel được sấy ở nhiệt độ 150°c trong thời gian 12h.
Cân các khối lượng khác nhau của silicagel cho vào các cốc thuỷ tinh, sau đó thêm
nước deion vào cốc, trộn đều với silicagel. Khối lượng silicagel và nước trong từng cốc
được trình bày trong bảng sau
Bảng 1. Khối lượng silicagel và nước hoạt hoá của các cột chiết pha rắn
silicagel tự nhồi
Cốc

1

2

3

4

5

6

7

8

9

m Silicagel (g)

0,2

0,2

0,2

0,5

0,5

0,5

1,0

1,0

1,0

V nước deion (|^L)

2

4

10

5

10

25

10

20

50

Tỉ lệ hoạt hố (%)

1

2

5

1

2

5

1

2

5

Kí hiệu cột silicagel

Si-0.2-1

Si-O.2-2 Si-0.2-5

Si-0.5-1

Si-0.5-2 Si-O.5-5 Si-1.0-1

Si-1.0-2 Si-1.0-5

Nhồi lượng silicagel đã hoạt hoá
bằng nước đề ion nói trên vào các cột
chiết nhựa có thể tích 6 mL được chặn
bằng các m iếng chặn như hình bên.
Silicagel

* K hảo sát khả năne hấp phu của FO từ nên nước m áy lên côt silicaeel:
Lấy 20 |iL dung dịch hỗn hợp chuẩn các FQ nồng độ 25 ppm thêm vào 25 mL
nước máy (đã lọc qua giấy lọc 0,45|im và axit hoá tới pH = 3) được dung dịch chuẩn
FQ có nồng độ 20 ppb trong nền nước máy. Thực hiện quá trình chiết pha rắn sử dụng
từng loại cột silicagel đã hoạt hoá với tốc độ 1 mL/phút. Sau khi các FQ được hấp phụ
lên cột silicagel, dùng M eO H rửa giải (3 lần mỗi lần 2 m L), m ẫu sau đó được cô nitơ
và định mức tới 2,5 m L bằng dung môi N H j/M eOH/HzO (5/15/80). Các FQ được phân
tích định lượng bằng HPLC. Sau khi tính hiệu suất thu hồi của cả q trình phân tích

■ ~
Q u o c W r . / N<
T R U N G T Â M T H Õ N G TIN T H ir \/|F

D T / S ĩC


18

khi sử dụng các cột silicagel khác nhau sẽ xác định được cột silicagel thích hợp nhất
cho việc chiết các FQ từ nền nước máy.
* Khảo sát khả năne hấp phu của FO từ nên nước thải lên cô t siỉicaeei:
M ột mẫu nước sông Tô lịch sau khi phân tích khơng phát hiện thấy FQ được
dùng làm nền nước thải. Lấy 20 nL dung dịch hỗn hợp chuẩn các FQ nồng độ 25 ppm
thêm vào 25 mL sống Tô lịch (đã lọc qua giấy lọc 0,45 |im và axit hố tới pH = 3)
được dung dịch chuẩn FQ có nồng độ 20 ppb trong nền nước thải. Thực hiện quá trình
chiết pha rắn sử dụng từng loại cột silicagel đã hoạt hoá với tốc độ 1 mL/phút. Sau khi
các FQ được hấp phụ lên cột silicagel, dùng M eOH rửa giải (3 lần mỗi lần 2 mL), mẫu
sau đó được cô nitơ và định mức tới 2,5 mL bằng dung môi N H 3/M e0 H /H 20
(5/15/80). Các FQ được phân tích định lượng bằng HPLC. Sau khi tính hiệu suất thu
hồi của cả q trình phân tích khi sử dụng các cột silicagel khác nhau sẽ xác định
được cột silicagel thích hợp nhất cho việc chiết các FQ từ nền nước thải.
* Đánh giá hiệu suất thu hồi, độ lặp lạị, giới hạn p h á t hiện và th ể tích
breakthrough:
Sau khi khảo sát khả nãng chiết FQ của các cột silicagel, cột Si-0.5-2 được lựa
chọn là cột thích hợp nhất. Các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá hiệu suất thu hồi, độ
lặp lại, giới hạn phát hiện của phương pháp và thể tích breakthrough khi dùng cột Si0.5-2 làm cột chiết pha rắn được làm hoàn toàn tương tự như đối với cột MPC.

c. So sánh khả năn e sử d u n s của côt M PC và Silicaeel:
5 mẫu nước thải được lấy tại các giai đoạn xử lý và thời gian khác nhau tại
Bệnh viện Hữu Nghị. Song song chiết FQs từ các m ẫu nước thải trên bằng cột MPC và
Si-0.5-2 sau đó phân tích bằng sắc kí lỏng áp suất cao sử dụng đêtectơ huỳnh quang.
Lập biểu đồ biểu diễn sự so sánh kết quả thu được từ 2 phương pháp.

3.3.3. Phân tích FQ trong các mầu nước thải lấy tại bệnh viện Hữu Nghị
Hệ thống xử lý nước thải tại bệnh viện Hữu nghị là hệ thống xử lý theo công
nghệ vi sinh BIO FO R với công suất 600 mVngày bao gồm các đơn vị theo hình 4.


19

Trên thực tế, hê thống xử lý của bệnh viện hoat động không liẻn tuc, công suất của hệ
thống thưỡng từ 300- 400 m 3/ngày.

J

Thu khl metan

Hình 4. Sơ đị hệ thống xử lí nước thải tai bênh viên Hữu nghị va các điểm lấy máu
Mẫu nước thải được lấy tai 4 vi trí: mẫu trước xử lý (điểm số 1), mẫu đã qua bế
xử lý bùn hoat tính (điểm số 2 ), mẫu đã qua bế vi sinh thoáng khí vã lắng 1 (điểm sỏ
3) và mẫu đã đươc xử lý qua tồn bơ hê thống (điểm só 4) thải trưc tiếp vào cống thải
của thành phố. Các mẫu nước thải tai các vi trí trẽn được lấy theo thời gian trong vịng
24h, cứ 3h lấy mơt mẫu để phàn tích.
Mẫu được vân chuyển về phịng thí nghiêm, loc qua màng lọc có đường kính
0,45(am, điều chỉnh về pH = 3 để tránh sư phân huy vi sinh, sau đó đươc bào quản
trong lọ thủy tinh nâu ờ 4°c trước khi phân tích. Q ua khảo sát sơ bơ cho thấy CIP và
NOR là 2 loai FQs đươc dùng nhiều nhất trong bênh viện Việt Nam do vây chỉ thưc
hiện phân tích 2 kháng sinh này.

H ình 5. Ảnh toàn cảnh hê thống xứ lý nước thdi của bênh viên HCai Nghi
và lấy mẫu nước thải trước x ử ly

20

X ử lý mẫu bằng k ĩ th u ật chiết ph a rắn (SPE): Cột chiết pha rắn M PC trước khi dùng
cần được hoạt hoá bàng 2 mL m etanol và 2 ml nước cất. Cho 25 m L mẫu qua cột MPC
với tốc độ 1 mL/phút. Sau đó các chất cần phân tích được rửa giải khỏi cột bầng 2,5ml
dung dịch N H 3/M e 0 H /H 20 (5:14:80). Mẫu rửa giải được thêm 0,4 mL axit photphoric
85% trước khi phân tích.
Phán tích sắc k í lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang (LC /F LD ): Thể tích bơm mẫu
200 |iL, tốc độ dịng 0,7 mL/phút, pha động chạy theo chế độ gradien với dung môi
H3PO4 25 mM (dung môi A) và axetonitril (dung môi B) . Detectơ huỳnh quang sử

dụng ở bước sóng kích thích 278nm, bước sóng phản xạ 445nm .

3.3.4. Xác định tính kháng kháng sinh FQ của các vi khuẩn Ecoli phản lập từ
các mẩu nước thải láy tại bệnh viện Hữu Nghị
Các mẫu nước thải lấy tại từng công đoạn khác nhau trong hệ thống xử lý nước
thải của bệnh viện Hữu Nghị. Ecoli phân lập từ các mẫu nước thải, được đưa vào các
dĩa chứa môi trường nuôi cấy. Đặt vào các đĩa đó băng giấy đã tẩm thuốc kháng sinh
(CIP hoặc NOR) với những nồng độ khác nhau. Sau thời gian 1 ngày, quan sát đường
kính của vịng vi khuẩn bị tiêu diệt dưới tác động của kháng sinh sẽ xác định được
nồng độ ức chế tối thiểu (M inimum Ihibitory Concentration - MIC) của CIP và NOR
đối với chủng Ecoli đã phân lập từ nước thải.
Các thí nghiệm xác định tính kháng kháng sinh được thực hiện tại phịng thí
nghiệm vi sinh của V iện Y học lâm sàng và các bệnh nhiệt đới, Bệnh viện Bạch Mai.