Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn và tế bào tua biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Hương Diễm

ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC
TRUNG MƠ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HĨA TỪ TẾ
BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Hương Diễm

ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC
TRUNG MƠ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HĨA
TỪ TẾ BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8460201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Thân Thị Trang Uyên
PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn GS. TS. BS. Nguyễn Thanh Liêm, Viện
trưởng Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec đã tạo điều kiện cho tơi
có cơ hội được thực tập qua đó giúp tơi có cơ hội được tiếp cận với những kỹ thuật và
trang thiết bị hiện đại hàng đầu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người đầu
tiên truyền cảm hứng cho tơi tìm đến Bộ mơn Sinh học Tế bào, người đã tận tình hướng
dẫn, và dìu dắt tơi trong q trình học tập và nghiên cứu, đồng thời cũng là người luôn
lắng nghe, động viên và giúp đỡ tôi những lúc gặp khó khăn.
Tơi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS. Thân Thị Trang Uyên, cán bộ hướng
dẫn trực tiếp của tơi trong q trình thực hiện nghiên cứu, người đã ln tận tình hướng
dẫn và giải đáp những thắc mắc, khó khăn đồng thời ln động viên và hỗ trợ tơi trong
suốt q trình nghiên cứu để hồn thành tốt luận văn của mình.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Việt Anh, ThS. Chu Thị Thảo, ThS. Nguyễn
Đắc Tú, CN. Đỗ Thị Hoài Thu, CN. Phạm Thị Cường, và ThS. Lê Thị Huyền cùng các
cán bộ của Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Cơng nghệ Gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình
cho tơi trong suốt q trình hồn thành luận văn cao học này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Bùi Thị Vân Khánh, người đã hướng dẫn
và chỉ bảo tôi những điều cơ bản nhất từ ngày đầu tiên tôi tham gia vào nhóm Ung thư
thực nghiệm. Cùng với đó tôi cũng xin cảm ơn tới các Thầy, Cô trong Bộ Môn Sinh học
Tế bào, các anh chị, và các em trong nhóm Ung thư thực nghiệm đã đồng hành và hỗ trợ
tơi trong suốt q trình làm việc.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và bạn bè
đã ln u thương, ủng hộ, và tạo cho tôi một chỗ dựa vững chắc để giúp tơi vượt qua
mọi khó khăn, thử thách.
Xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp ĐHQG
“Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các
tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống
ung thư”, mã số: QG 18.09.

Hà Nội, tháng 11 năm 2020
Học viên cao học,

Hoàng Hương Diễm



MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………………....... 3
1.1. Thể tiết exosome………………………………………………………………

3

1.1.1. Giới thiệu chung về exosome và thể tiết ngoại bào………………………....... 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và cơ chế hình thành…………………………………….. 3
1.1.3. Chức năng của exosome……………………………………………………... 9
1.2. Exosome từ tế bào tua máu cuống rốn người……………………………........... 11
1.2.1. Giới thiệu chung về tế bào tua………………………………………………... 11
1.2.2. Tế bào tua biệt hóa và trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono (moDC)……….. 12
1.2.3. Máu cuống rốn – một nguồn cung cấp tế bào mono………………………….. 12
1.2.4. Exosome từ tế bào tua……………………………………………………....... 13
1.3. Exosome từ tế bào gốc trung mô……………………………………………... 15
1.3.1. Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô……………………………………... 15

1.3.2. Dây rốn - Nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô…………………………….... 16
1.3.3. Exosome từ tế bào gốc trung mô……………………………………………... 17
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………. 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………………….... 20
2.1.1. Mẫu máu cuống rốn………………………………………………………...... 20
2.1.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn người………………………………………….. 20
2.1.3. Tế bào ung thư phổi khơng tế bào nhỏ A549………………………………… 21
2.2. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………………… 21
2.2.1. Hóa chất……………………………………………………………………...

21

2.2.2. Thiết bị……………………………………………………………………….

24

2.2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao……………………………………………………. 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………….. 26
2.3.1. Phương pháp ni cấy biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch
cầu mono máu cuống rốn người…………………………………………….

26

2.3.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ dây rốn……………………………………... 30


2.3.3. Phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy……………………………….. 30
2.3.4. Phương pháp phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào………………. 33
2.3.5. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và kích thước của exosome………. 34
2.3.6. Phương pháp tách chiết protein tồn phần có trong exosome………………… 35

2.3.7. Phương pháp xác định đặc điểm protein chỉ thị của exosome………………... 38
2.3.8. Phương pháp loại bỏ kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp…………………. 39
2.3.9. Phương pháp xác định sự phân bố phổ protein tách chiết từ EX trên gel…… 39
2.3.10. Phương pháp phân tích thống kê……………………………………………. 40
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ…………………………………………………………. 41
3.1. Kết quả biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu
cuống rốn người………………………………………………………………….... 41
3.1.1. Kết quả phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân và tế bào mono từ máu cuống
rốn…………………………………………………………………………………... 41
3.1.2. Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thư phổi A549………….. 45
3.1.3. Số lượng tế bào tua thu được từ q trình ni cấy biệt hóa và trưởng thành
từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn…………………………………………….. 46
3.1.4. Kết quả đặc điểm hình thái tế bào trong q trình ni cấy…………………… 46
3.1.5. Kết quả phân tích dấu ấn bề mặt của tế bào mono và tế bào tua trưởng
thành………………………………………………………………………………... 48
3.2. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô dây rốn……………………. 50
3.3. Đặc điểm hình thái và kích thước exosome thu được từ môi trường nuôi
cấy tế bào………………………………………………………………………....... 52
3.4. Kết quả định lượng protein tổng số trong exosome thu được………………. 53
3.5. Kết quả phân tách của protein trên gel SDS-PAGE dựa trên phương pháp
nhuộm bạc (Silver stain)…………………………………………………………... 53
3.6. Kết quả phát hiện protein chỉ thị sử dụng phương pháp Western Blot…….. 54
CHƯƠNG 4 - THẢO LUẬN……………………………………………………… 58
KẾT LUẬN………………………………………………………………………... 63


KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………….. 64
BÀI BÁO CÔNG BỐ……………………………………………………………… 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 66
PHỤ LỤC………………………………………………………………………….. 72

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1: Q trình hình thành EX…………………………………………………… 5
Hình 2: Thành phần protein của EX được phân loại theo chức năng………………... 7
Hình 3: Mẫu máu cuống rốn được thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec,
Hà Nội………………………………………………………………………………

20

Hình 4: Quy trình ni cấy biệt hóa và trưởng thành DC từ tế bào bạch cầu mono
máu cuống rốn người……………………………………………………………….. 26
Hình 5: Máu cuống rốn sau khi ly tâm theo tỷ trọng………………………………… 28
Hình 6: Quy trình phân lập EX từ mơi trường ni cấy tế bào……………………… 34
Hình 7: Hình ảnh buồng đếm tế bào sau khi phân lập bằng phương pháp Ficoll……. 38
Hình 8: Quần thể tế bào đơn nhân phân lập từ máu cuống rốn……………………… 40
Hình 9: Tế bào mono bám dính trên bề mặt chai ni cấy sau 2 giờ ni cấy bám
dính……………………………………………………………………………........

42

Hình 10: Hình thái tế bào trong q trình ni cấy biệt hóa và trưởng thành tế bào
DC…………………………………………………………………………………... 43
Hình 11: Kết quả phân tích tế bào theo dòng chảy của tế bào bạch cầu mono (ngày
0) và tế bào DC trưởng thành (ngày 7)………………………………………………. 44
Hình 12: Sự biểu hiện các kháng nguyên bề mặt của tế bào bạch cầu mono và tế bào
mDC vào ngày 0 và ngày 7………………………………………………………….. 45
Hình 13: Hình thái và sự biểu hiện kháng nguyên bề mặt của tế bào UCMSC tại
passage 1……………………………………………………………………………

46

Hình 14: Hình thái EX được phân tích bằng TEM…………………………………... 47
Hình 15: Sự phân bố phổ protein trên gel SDS-PAGE tách chiết từ EX có nguồn
gốc từ mDC và UCMSC…………………………………………………………….. 49
Hình 16: Sự biểu hiện các protein chỉ thị đặc trưng của EX được kiểm tra bằng
phương pháp miễn dịch màng lai………………………………………………….... 50


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp EX……………………… 17
Bảng 2: Các hóa chất được sử dụng………………………………………………… 28
Bảng 3: Các thiết bị được sử dụng………………………………………………….. 31
Bảng 4: Dụng cụ và vật tư tiêu hao…………………………………………………. 32
Bảng 5: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy của
tế bào MNC và tế bào mDC……………………………………………………….... 38
Bảng 6: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dịng chảy của
tế bào MSC…………………………………………………………………………. 39
Bảng 7: Pha loãng nồng độ protein chuẩn…………………………………………... 43
Bảng 8: Chuẩn bị protein chuẩn…………………………………………………….. 44
Bảng 9: Kết quả phân lập tế bào MNC từ máu toàn phần…………………………… 49
Bảng 10: : Số lượng tế bào MNC bám dính sau khi thay môi trường……………….. 50
Bảng 11: Tỷ lệ tế bào bạch cầu mono qua quá trình phân lập vào ngày 0 dựa trên
phân tích bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy………………………………… 51
Bảng 12: Số lượng DC thu được……………………………………………………. 53
Bảng 13: Kết quả định lượng protein tổng số thu được từ EX có nguồn gốc từ mDC. 60
Bảng 14: Kết quả định lượng protein tổng số thu được từ EX có nguồn gốc từ
UCMSC…………………………………………………………………………….

60

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AB

Apoptotic body

Thể tế bào chết theo
chương trình

BCA

Bicinchoninic acid

Axit bicinchoninic

BSA

Bovine serum albumin

Albumin huyết thanh bị

DC

Dendritic cell

Tế bào tua

Dex

Exosome – derived from dendritic cells

DMEM

Thể tiết exosome tiết ra
bởi tế bào tua

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EV

Extracellular vesicles

Thể tiết ngoại bào

EX

Exosome

Thể tiết exosome

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh thai bò

FDA

Food and Drug Administration

GM-CSF

Cục Quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ

Granulocyte/macrophage colony

Yếu tố kích thích tạo cụm

stimulating factor

dịng hạt-mono
Các tiêu chuẩn thực hành

GMP

Good Manufacturing Practices

HRP

Horseradish peroxidase

iDC

Immature dendritic cell

IFN

Interferon

Interferon

IL

Interleukin

Interleukin

lâm sàng tốt

Tế bào tua chưa trưởng
thành


ISCT
mDC
Mex

International Society for Cellular

Hiệp hội quốc tế về liệu

Therapy

pháp tế bào

Mature dendrictic cell

Tế bào tua trưởng thành

Exosome – derived from mesenchymal

Thể tiết exosome tiết ra

stem cells

bởi tế bào gốc trung mô
Phức hệ phù hợp tổ chức

MHC

Major Histocompatibility Complex

MNC

Mononuclear cell

Tế bào bạch cầu đơn nhân

MSC

Mesenchymal stem cell

Tế bào gốc trung mô

MV

Microvesicle

Vi thể

MVB

Multivesiclevesicle body

Thể đa bào

NCT

National Clinical Trial

NK cell

chính

Thử nghiệm lâm sàng
quốc gia

Natural killer cell

Tế bào tiêu diệt tự nhiên

OD

Optical density

Mật độ quang

PBS

Phosphate-buffered saline

PDGF

Platelet-derived growth factor

PVDF

Polyvinylidene florua

TEM

Transmission electron microscopy

TNF - α

Tumor necrosis factor alpha

Nhân tố tăng trưởng từ
tiểu cầu

Kính hiển vi điện tử
truyền qua
Yếu tố hoại tử khối u
alpha


UCMSC

Mesenchymal stem cell derived from

Tế bào gốc trung mô từ

umbilical cord

dây rốn


MỞ ĐẦU
Thể tiết exosome hay còn gọi là thể tiết ngoại bào exosome là các túi nhỏ được
đóng kín bởi cấu trúc màng lipid kép. Chúng đóng vai trị quan trọng trong sự trao đổi
thông tin giữa các tế bào do có mang các hoạt chất phân tử sinh học có nguồn gốc từ tế
bào tiết và truyền thơng tin này sang tế bào đích. Tuy nhiên, những đặc điểm sinh học
phân tử này là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc và tình trạng sinh lý học của các tế
bào tiết.
Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thể tiết exosome được tiết ra từ nhiều loại tế
bào khác nhau, trong đó phải kể đến cả tế bào miễn dịch và tế bào gốc trung mô. Một
trong những loại tế bào miễn dịch đóng góp vai trị quan trọng trong liệu pháp miễn dịch
kháng ung thư đó là tế bào tua (Dendritic cells – DC). Gần đây các nhà khoa học đã
nghiên cứu và nhận thấy rằng exosome từ tế bào tua (Dexosomes – Dex) có khả năng
thay thế chính tế bào tua trong việc trình diện kháng ngun để kích thích hệ miễn dịch
tiêu diệt tế bào ung thư, và gây đáp ứng chống hình thành khối u. Ngày càng nhiều các
nghiên cứu chứng minh được rằng hiệu quả trị liệu của tế bào gốc trung mô chủ yếu
thông qua các chất tiết hơn là cơ chế biệt hóa trực tiếp của chúng, đặc biệt là sự đóng gói
của thể tiết ngoại bào hay exosome. Những nghiên cứu trên các mơ hình bệnh khác nhau
cho thấy các exosome tiết từ tế bào gốc trung mô (Mexosomes – Mex) đặc biệt có lợi
trong việc tăng cường khả năng hồi phục của cơ thể như cải thiện tình trạng xơ gan bảo
vệ thận và liền vết thương trên da. Ngoài ra, exosome cịn có ưu điểm hơn so với chính

tế bào mẹ khi sử dụng liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh. Quy trình bảo quản và trữ
đơng các exosome đơn giản hơn so với tế bào. Hơn nữa, thể tiết exosome khá bền và ổn
định, có thể bảo quản lạnh ít nhất sáu tháng tại – 80 ℃ mà không ảnh hưởng đến cấu
trúc và chức năng. Việc sử dụng exosome rất an tồn và chúng có thể vượt qua rào chắn
thần kinh - máu mà tế bào không thể vượt qua được rào chắn này.
Mặc dù exosome đã được chứng minh là có tiềm năng trong chẩn đoán và điều
trị các bệnh ung thư cũng như các bệnh lý phức tạp khác, tuy nhiên việc lựa chọn điều
kiện nuôi cấy tế bào tiết exosome, phương pháp phân lập tối ưu và xác định các đặc điểm
1


đặc trưng của chúng vẫn cịn gặp khó khăn. Dựa trên cơ sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài
nghiên cứu: “Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mơ dây rốn và tế bào tua biệt
hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn”. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng

trong việc thiết lập một quy trình phân lập thành cơng exosome từ mơi trường ni cấy
tế bào với mục đích tạo ra exosome trong điều kiện GMP và có hoạt tính sinh học làm
cơ sở để khẳng định sự khả thi của việc phân lập thể tiết exosome nhằm ứng dụng điều
trị bệnh lý trong tương lai.
Mục đích nghiên cứu:
-

Phân lập được thể tiết EX từ hai loại tế bào tua trưởng thành và tế bào gốc
trung mô dây rốn được nuôi cấy trong môi trường thương mại không bổ sung
huyết thanh đạt tiêu chuẩn thực hành lâm sàng tốt (Good Manufacture Practice
– GMP).

-

Xác định đặc điểm hình thái và kích thước của thể tiết EX tiết ra từ hai loại tế

bào tua trưởng thành và tế bào gốc trung mô dây rốn.

-

Xác định đặc điểm protein chỉ thị đặc trưng của EX tiết từ hai loại tế bào tua
trưởng thành và tế bào gốc trung mô dây rốn.

2


CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1.

Thể tiết exosome

1.1.1. Giới thiệu chung về exosome và thể tiết ngoại bào
Thể tiết ngoại bào (extracellular membrane vesicles - EV) là các túi nhỏ có lớp
màng lipid kép giống như màng tế bào và được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác nhau.
Chúng được tìm thấy trong mơi trường ni cấy tế bào và nhiều loại dịch cơ thể như
huyết tương, nước tiểu, nước bọt, dịch ối và sữa mẹ [30]. Thể tiết hay EV được phân làm
3 loại: thể tế bào chết theo chương trình - apoptotic body (AB, 1 - 5 µm) là sản phẩm
của quá trình tế bào chết theo chương trình; vi bóng bào - microvesicles (MV, 100 - 1000
nm) được hình thành theo phương thức mọc chồi trực tiếp từ màng tế bào; và thể tiết
exosome (EX, 40 - 250 nm) được hình thành do sự nhập bào tạo thành thể đa bào, sau
đó nhờ sự dung hợp với màng tế bào để giải phóng EX ra mơi trường ngoại bào [18, 24,
29]. Trong đó, hiện nay EX đặc biệt được chú ý và nghiên cứu nhiều nhất về thành phần
sinh học phân tử và chức năng của nó.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và cơ chế hình thành
Cơ chế giải phóng ra các túi tiết có tên là “apoptotic body” trong quá trình tế bào
chết theo chu trình đã được biết đến từ năm 2004 [21], nhưng thực tế có nhiều nghiên

cứu đã chứng minh rằng các tế bào hoàn toàn khỏe mạnh cũng tiết ra các túi tiết ngoại
bào mà hiện nay được gọi là thể tiết [18]. Exosome ban đầu được sử dụng để mô tả
những túi tiết có kích thước từ 40 – 1000 nm và được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác
nhau [58], tuy nhiên tại thời điểm này thì nguồn gốc hình thành của những túi tiết này
thì vẫn chưa được rõ ràng. Sau đó, vào năm 1984, các nhà khoa học đã sử dụng danh
pháp này để mô tả những túi tiết có kích thước từ 40 – 100 nm, được tiết ra trong q
trình biệt hóa tế bào hồng cầu lưới [19]. Tuy nhiên một thập kỷ sau đó, các nhà khoa học
đã phát hiện ra rằng EX được tiết ra từ tế bào lympho B và tế bào tua thông qua một cơ
chế giống nhau [18]. Trước đây, việc đặt tên cho các túi tiết rất đa dạng, không có quy
luật xác định do chưa rõ cơ chế hình thành. Hầu hết các túi tiết được đặt tên có liên quan
3


tế bào mẹ tiết ra chúng. Mặc dù những nghiên cứu phát hiện ra các túi tiết có nguồn gốc
từ các tế bào có trong mơ hoặc dịch cơ thể của động vât có vú được mơ tả từ rất lâu,
nhưng mãi đến năm 2011 người ta mới xếp chung những túi tiết đó vào nhóm thể tiết
ngoại bào và cấu trúc đều được bao quanh bởi lớp lipid kép [29].
Ngày nay, thể tiết ngoại bào được phân chia thành ba loại chính dựa trên cơ chế
hình thành của từng quần thể thể tiết, gồm có: AB (thể tế bào chết theo chương trình),
MV (vi bóng bào) và EX (thể tiết exosome). Trong đó, EX là quần thể nhỏ nhất với kích
thước đường kính dao động từ 40 – 250 nm và có hình thái dạng cốc (cup-shaped) khi
được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) [24, 30]. Q trình hình thành
EX thơng qua sự nhập bào tạo thành các thể nội bào, các thể nội bào dung hợp tạo nên
thể nội bào sớm. Bộ máy Golgi và lưới nội chất cũng góp phần vào việc hình thành nên
thể nội bào sớm [29]. Thể nội bào sớm tiếp tục trưởng thành để trở thành thể nội bào
muộn. Các thể nội bào muộn có hai số phận: hoặc là phát triển thành tiêu thể hoặc phát
triển tạo thành thể đa bào (multivesicle body - MVB) có chứa EX bên trong [24, 29, 30,
53]. Thể đa bào này dung hợp màng với màng tế bào và giải phóng EX ra môi trường
ngoại bào [18, 29, 30, 53]. Trong q trình hình thành và giải phóng, các phân tử sinh
học được đóng gói vào trong EX và sau đó được giải phóng cùng EX ra mơi trường ngoại

bào. Sơ đồ tóm tắt q trình hình thành và giải phóng EX được mơ tả trong Hình 1.
Có nhiều thành phần protein tham gia vào sự hình thành EX, trong đó có vai trị
quan trọng của phức hệ phân loại của thể nội bào cần thiết cho vận chuyển (endosomal
sorting complexes required for transport, ESCRT). ESCRT gồm bốn phức hợp protein
khác nhau, ESRCT-0, -I, -II, và -III, và phức hệ AAA-ATPase Vps4. Các nghiên cứu
chỉ ra rằng việc loại bỏ đi các protein ESCRT-0, Hrs, TSG101, ESCRT-I, và STAM1 sẽ
làm giảm q trình tiết EX; trong khi đó nếu loại đi các protein ESCRT-III và các protein
có liên quan như CHMP4C, Vps4B, VTA1, và Alix sẽ tăng khả năng tiết EX [20]. Bên
cạnh protein ESCRT thì lipid và một số protein khác chẳng hạn như lactadherin, thụ thể
của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (platelet-derived growht factor, PDGF),
annexin, flotillins, GTPases, protein shock nhiệt, và tetraspanins cũng tham gia vào quá
4


trình hình thành và giải phóng EX [18]. EX sau khi được tiết ra đóng vai trị như một sứ
giả, giao tiếp với các tế bào khác thông qua quá trình neo đậu và dung hợp màng nhờ
phức hệ thụ thể protein gắn yếu tố nhạy cảm với Nethylmaleimide (soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNAREs), cụ thể là liên
kết giữa protein v-SNARE trên tế bào cho và protein t-SNARE trên tế bào nhận) và
ESCRT [18].

Hình 1: Quá trình hình thành EX [20]
Sử dụng cả kỹ thuật truyền thống và hiện đại, rất nhiều protein, lipid và
microRNA đã được phát hiện trong EX. Theo thống kê, hiện có 41.860 protein, 2.838
microRNA và 1.116 lipid đã đăng tải trên cơ sở dữ liệu ExoCarta để tham khảo
( truy cập 16/3/2020).
1.1.2.1.

Protein

Protein và lipid là hai thành phần chính của màng EX [65]. Tuy nhiên, thành phần

protein của EX có thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của tế bào tiết ra chúng. Một họ
5


protein cytosol thường thấy trong EX đó là protein Rab, họ protein lớn nhất thuộc lớp G
protein nhỏ giúp điều hịa q trình gắn và hợp màng của EX [30]. Ngồi Rab ra, annexin
cũng có rất nhiều trong EX (annexin I, II, IV, V, VII, và X1) hỗ trợ quá trình vận chuyển,
và dung hợp màng [30].
EX cịn được làm giàu bởi họ protein tetraspanins (CD63, CD81, và CD9) tương
tác với nhau tạo thành một phức hệ có vai trị trong việc trao đổi các protein xuyên màng.
Các protein shock nhiệt (HSP60, HSP70, và HSP90) cũng được biểu hiện trong EX. Bên
cạnh đó, EX chứa cả những protein đặc hiệu cho tế bào như A33 (tế bào biểu mô đại
tràng), CD86 (tế bào trình diện kháng nguyên), và CD24 (đặc trưng cho các EX phân lập
từ nước tiểu và nước ối) [30].
Ngoài ra, các protein ngoại bào khác cũng được phát hiện nhiều trong EX, bao
gồm các enzyme chuyển hóa (GAPDH, enolase 1, aldolase 1, PKM2, PGK1, PDIA3,
GSTP1, DPP4, AHCY, TPL1,...), ribosomal protein (RPS3), protein chuyển màng
(PIGR, LAMP1, và CD59), protein truyền tín hiệu (syntenin, G protein...), protein bám
dính màng (MFGE8 và integrin), ATPase, khung xương tế bào (actin, tubulin, keratin,
fibronectin 1,...), và các phân tử ubiquitin (ubiquitin B và C) (Hình 2) [30].

6


Hình 2: Thành phần protein của EX được phân loại theo chức năng [30]
1.1.2.2.

Lipid

EX cũng có lớp màng lipid kép tương tự như của tế bào [53], do vậy ngoài protein

thì lipid cũng chính là một thành phần quan trọng trong quá trình hình thành EX [30].
Cholesterol và sphingolipid (bao gồm sphingomyelin và hexosylceramide) là hai thành
phần được tìm thấy với hàm lượng cao trong EX, thậm chí cao hơn so với màng tế bào
mẹ [57]. Nhưng ngược lại, thành phần phosphatidylcholine lại được tìm thấy ít hơn trong
EX [57]. Quan trọng hơn, các nhà khoa học đã phát hiện thấy nồng độ ceramide khá cao
tại vị trí MVB được hình thành, điều này đưa ra đề xuất rằng có thể ceramide là thành
phần hữu ích giúp tạo điều kiện cho việc hình thành EX [57]. Ngồi ra, màng bên trong
của MVB được chứng minh là chứa rất nhiều axit lyosbisphosphatidic (LBPA), và do đó
LBPA cũng được cho là đóng vai trị quan trọng trong q trình hình thành EX [30].

7


1.1.2.3.

Vật chất di truyền

Dựa trên cơ sở dữ liệu đăng tải trên trang có thể thấy
rằng có rất nhiều phân tử axit nucleic được đóng gói trong EX. Các thành phần mRNA
và microRNA (miRNA) đã được xác định có nhiều trong EX và chúng có thể được vận
chuyển tới các tế bào nhận ở gần hoặc xa nơi tiết và sau đó điều hịa các q trình sinh
lý của tế bào nhận [65].
Trong số những phân tử này, miRNA đã thu hút hầu hết sự chú ý của các nhà
khoa học nhờ vai trò điều hòa của chúng trong biểu hiện gen [65]. Goldie và cộng sự đã
chứng minh rằng trong số những RNA nhỏ, một số miRNA được tìm thấy trong EX với
mức độ cao hơn so với ở tế bào mẹ [17]. Ohshima cùng các cộng sự thực hiện so sánh
mức độ biểu hiện của các phân tử miRNA thuộc họ let-7 trong EX có nguồn gốc từ dòng
tế bào ung thư dạ dày AZ-P7a cùng với một số dòng tế bào ung thư khác bao gồm: dòng
tế bào ung thư phổi SBC-3/DMS-35/NCI-H69, dòng tế bào ung thư đại trực tràng
SW480/ SW620, và dòng tế bào ung thư dạ dày AZ-521. Kết quả, các tác giả phát hiện

thấy rằng các phân tử thuộc họ let-7 miRNA có rất nhiều trong EX có nguồn gốc từ dịng
tế bào ung thư dạ dày AZ-P7a và ít hơn trong EX có nguồn gốc từ những dịng tế bào
cịn lại [38]. Ngoài ra, mức độ biểu hiện của miRNA thay đổi theo các điều kiện sinh lý
khác nhau [65]. Ví dụ mức độ biểu hiện của miR-21 trong EX có nguồn gốc từ huyết
tương của người khỏe mạnh thấp hơn so với bệnh nhân mắc bệnh u não [47]. Do vậy,
thành phần và hàm lượng miRNA trong EX cũng phản ánh nguồn gốc tế bào tiết và tình
trạng sinh lý bình thường hay bệnh lý của tế bào tiết ra chúng. Điều này cho thấy miRNA
trong EX có tiềm năng sử dụng như là dấu ấn sinh học (biomarker) để chuẩn đoán bệnh
[65]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng miRNA có thể được sử dụng để hỗ trợ chẩn
đốn lâm sàng chẳng hạn như một tập hợp các miRNA có trong EX có nguồn gốc từ
huyết tương gồm let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, và miR-23a
có thể được sử dụng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng [37].
Nhờ các thành phần được đóng gói vào bên trong mà EX được chứng minh là có
vai trị quan trọng trong việc điều hịa các q trình sinh học của cơ thể theo các cơ chế
8


khác nhau: (1) tương tác qua phối tử/thụ thể: thể tiết nhận diện tế bào đích và tác động
điều chỉnh chức năng tế bào đích thơng qua các thụ thể trên bề mặt tế bào; (2) tương tác
thông qua dung hợp trực tiếp màng: thể tiết nhận ra tế bào đích thơng qua thụ thể trên bề
mặt tế bào, sau đó màng thể tiết dung hợp với màng tế bào và giải phóng các phân tử nội
tại trong thể tiết vào tế bào chất của tế bào nhận; và (3) tương tác thơng qua nhập nội
bào: tồn bộ thể tiết nhập vào trong tế bào trước khi màng thể tiết bị phân giải để giải
phóng các thành phần phân tử nội tại trong thể tiết vào tế bào chất của tế bào nhận [51].
Sự hoạt động của EX như vậy được gọi là cơ chế truyền tin. Kết quả của quá trình là gây
ra sự thay đổi chức năng sinh lý của cơ thể.
1.1.3. Chức năng của exosome
EX có vai trị quan trọng trong các q trình sinh lý học của cơ thể do chúng có
thể tác động đến chính nhóm tế bào tiết ra chúng hoặc tác động đến các tế bào khác ở
môi trường xung quanh [51]. EX ngày càng được nghiên cứu nhiều trong việc thiết lập

nguồn dấu ấn sinh học (biomarker) để chẩn đoán bệnh và là vec tơ mang thuốc đến đích
cho các ứng dụng điều trị lâm sàng [42]. Tính đến năm 2019, theo thống kê đã có 93 thử
nghiệm lâm sàng liên quan đến EX đăng tải trên trang thử nghiệm lâm sàng
www.clinicaltrials.gov. Phần lớn các thử nghiệm này tập trung vào việc sử dụng EX từ
một số dịch lỏng của cơ thể làm cơng cụ chuẩn đốn bệnh sớm để dự đốn kết quả của
các phương pháp điều trị khác nhau [31]. Năm 2016, sản phẩm thương mại đầu tiên trên
thế giới sử dụng EX trong máu bệnh nhân để chẩn đoán ung thư phổi có tên ExoDx Lung
của cơng ty Exosome Diagnostics ở Cambridge (Massachusetts, Mỹ) đã được lưu hành
[46]. Ngoài ra, việc sử dụng EX cho việc chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt đang trải qua
sự kiểm tra phê duyệt của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [8].
Ngày càng có nhiều nghiên cứu đã chứng minh được vai trò của EX trong việc điều trị
các bệnh lý tim mạch, thối hóa thần kinh, ung thư và cả viêm gan [23, 45].

9


Bảng 1: Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp EX [8]

Nghiên cứu

Hiệu quả của EX có nguồn

Bệnh

Loét da

gốc từ huyết tương trong

Giai

Can thiệp

đoạn

Huyết tương giàu

nghiệm lâm
sàng
NCT02565264

đầu của

EX tự thân

việc chữa lành vết thương ở

giai

da: thử nghiệm tiềm năng

đoạn 1

Nghiên cứu khả năng của Ung thư đại Curcumin
EX có nguồn gốc từ thực

Bước

Mã số thử

trực tràng

vật trong việc vận chuyển

được

vận chuyển bởi

Giai

NCT01294072

đoạn 2

EX

curcumin đến các mô đại
trực tràng bình thường và
ung thư
Hiệu quả của liệu pháp sử Tiểu đường MV, và EX có
dụng MV và EX đến tế bào

typ I

β của bệnh nhân tiểu đường

nguồn

gốc

từ

Giai

NCT02138331

đoạn 2

MSC dây rốn

và 3

typ I (T1DM)
Thử nghiệm lâm sàng sơ bộ

Ung thư

Bổ sung chế độ

Giai

đánh giá khả năng của EX

đầu và cổ

ăn: chiết xuất nho

đoạn 1

nguồn gốc từ thực vật để

Thuốc:

loại bỏ viêm niêm mạc

miếng dán fent-

miệng gây ra bởi hóa trị và

anyl, nước súc

xạ trị ở bệnh nhân ung thư

miệng

NCT01668849

lortab,

đầu và cổ
Nghiên cứu trọng điểm về

Ung thư

Xạ

ảnh hưởng của metformin

đầu và cổ

phóng xạ

đến các cytokine tiền viêm

10

trị:

ngoại

Bước
đầu của

NCT03109873


và EX ở bệnh nhân ung thư

Thuốc:

đầu cổ mãn tính

metformin

giai
đoạn 1

hydrocholoride
Giả dược
Thử nghiệm giai đoạn 2

Ung thư

EX nguồn gốc từ

Giai

tiêm vắc xin sử dụng EX

phổi không

tế bào DC cảm

đoạn 2

nguồn gốc từ tế bào DC

tế bào nhỏ

ứng với kháng

cảm ứng với kháng nguyên

NCT01159288

nguyên ung thư

ung thư đối với bệnh nhân
mắc bệnh ung thư phổi
khơng tế bào nhỏ đáp ứng
với hóa trị

Thử nghiệm lâm sàng sử

Tràn dịch

Các vi hạt có

dụng thuốc hóa trị đóng gói

màng phổi

nguồn

các vi hạt (microparticles)

ác tính

khối u

có nguồn gốc từ tế bào ung

gốc

từ

Giai

NCT02657460

đoạn 2

Thuốc: cisplatin

thư điều trị tràn dịch màng
phổi ác tính

1.2. Exosome từ tế bào tua máu cuống rốn người
1.2.1. Giới thiệu chung về tế bào tua
Tế bào tua (Dendritic cells – DC) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên
nghiệp, hữu hiệu nhất trong cơ thể chúng ta và đóng vai trị quan trọng trong việc điều
hòa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. Khi được cảm ứng với các
kháng nguyên, các DC sẽ hoạt hóa cả tế bào T hỗ trợ và tế bào T gây chết cũng như các
tế bào B [54]. Trong q trình hoạt hóa tế bào T, thông qua sự tương tác với thụ thể của
tế bào T (T cell receptor – TCR), các tế bào DC tiết ra các cytokine đặc hiệu và kích hoạt
các đáp ứng miễn dịch đối với tế bào TH1, TH2 hoặc T điều hịa [28]. Chính vì sự chun
nghiệp trong quá trình trình diện kháng nguyên chéo (sự trình diện cho cả tế bào T CD4+
11


và T CD8+) mà DC đã được sử dụng làm nền tảng cho việc tạo ra các vắc xin dựa trên
tế bào tua nhằm thúc đẩy các đáp ứng miễn dịch chống ung thư của tế bào T một cách
hiệu quả. Nhiều loại vắc xin dựa trên tế bào DC đã được đánh giá trong các thử nghiệm
lâm sàng [28].
1.2.2. Tế bào tua biệt hóa và trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono (moDC)
Trong cơ thể, DC có thể được phân lập từ nhiều nguồn như máu ngoại vi, tủy
xương, và máu cuống rốn,…Tuy nhiên, tỷ lệ của DC trong các dịch cơ thể thường khá
thấp, chỉ chiếm ít hơn 1% tổng số tế bào bạch cầu mono trong máu ngoại vi [28]. Do
vậy, để có được số lượng DC đủ lớn cho đáp ứng miễn dịch, các phương pháp tạo ra DC
bằng cách biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu CD34+ hoặc tế bào bạch cầu mono được sử
dụng phổ biến.
Tế bào bạch cầu mono là một loại tế bào bạch cầu có khả năng biệt hóa để trở

thành đại thực bào và DC. Thông thường, tế bào mono chiếm khoảng 10% tổng số tế
bào máu có nhân [9]. Dựa vào sự biểu hiện các dấu ấn bề mặt, quần thể tế bào mono
được chia thành các tập con gồm: CD14++ CD16-, CD14dim CD16++ và CD14++ CD16+.
Trong đó các tế bào mono CD14++ CD16- chiếm tới 85% tổng số tế bào mono trong máu
ngoại vi [9]. Một số thí nghiệm in vitro cũng đã chứng minh được rằng trong mơi trường
có chất kích thích phù hợp như GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating
factor) và IL-4 (interleukin-4), tế bào mono CD14+ có khả năng biệt hóa thành DC. Sự
trưởng thành của DC này có thể đạt được bằng cách ni cấy bổ sung với yếu tố hoại tử
khối u (TNF-∝) cùng sự kích thích của kháng nguyên [33, 35]. DC có nguồn gốc từ tế
bào mono được tạo ra trong điều kiện in vitro biểu hiện cao các phân tử đặc trưng của tế
bào trình diện kháng nguyên gồm: HLA-DR, CD40, CD80 và CD86 [10, 33, 35].
1.2.3. Máu cuống rốn – một nguồn cung cấp tế bào mono
Máu cuống rốn là máu còn lại trong dây rốn và nhau thai sau khi sinh con. Máu
cuống rốn có chứa tất cả các thành phần của máu gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và
huyết tương. Bên cạnh đó, máu cuống rốn cũng là một nguồn cung cấp tế bào gốc tạo
12