Nghiên cứu chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (glycine max (l ) merrill)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------------------------------------

NGÔ THỊ BẢO OANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------------------------------------

NGÔ THỊ BẢO OANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN
TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL)
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số ngành: 8.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. NGUYỄN TIẾN DŨNG
2. GS.TS. NGƠ XN BÌNH

Thái Ngun, năm 2020


i

LỜI CẢM ƠN
Trang đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nha trường,
Ban chu nhiệm khoa Công nghệ Sinh học va Công nghệ Thực phẩm cùng các
thầy cô giáo trong Khoa đa tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài
nghiên cứu nay.
Đặc biệt, em xin bay to lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành
tới GS.TS. Ngơ Xn Bình va thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên
khoa Công nghệ Sinh học va Công nghệ Thực phẩm đa tận tình chi bảo, giúp
đỡ va hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thanh va sâu sắc nhất tới gia
đình, người thân va bạn bè đa động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học
tập va thực hiện đề tai.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày tháng
Học viên

Ngô Thị Bảo Oanh

năm 2020


ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC.........................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...............................................................vii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tai........................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 3
3. Những đóng góp mới của đề tai. ................................................................... 3
4. Ý nghĩa Khoa học va thực tiễn của đè tài luận án. ....................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Nguồn gốc va phân loại cây đậu tương...................................................... 4
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ..................................................... 5
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước va trên thế giới......................... 6
1.3.1. Trên thế giới. ........................................................................................... 6
1.3.2. Tại Việt Nam........................................................................................... 8
1.4. Đặc điểm của gen CBF1 .......................................................................... 10
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1 .............................................................................. 10
1.4.2. Các nghiên cứu về gene CBF1.............................................................. 10
1.5. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens va quá trình chuyển gen vao cây
trồng ................................................................................................................ 12
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................. 12
1.5.2 Cấu trúc va chức năng của Ti-Plasmid .................................................. 13
1.5.3. Cấu trúc va chức năng T-DNA ............................................................. 13
1.5.4 Cơ chế phân tư của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens 14


3

Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

..16
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 16
2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 16
2.1.2. Vật liệu di truyền................................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 17
2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.5. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen................................................... 21
2.6. Chọn lọc dòng chuyển gen bằng phun chất diệt co Basta ....................... 24
2.7. Các chi tiêu đánh giá ................................................................................ 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 25
3.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc
Ha
Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ......................................................... 25
3.1.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương DT22. .................... 25
3.1.2. Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương cọc chùm ............... 31
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc ........... 37
3.2. Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính bằng sư dụng phương pháp
PCR. ................................................................................................................ 44
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 47
4.1. Kết luận. ................................................................................................... 47
4.2. Đề nghị. .................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO


4

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây...... 8
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần đây..... 9
Bảng 3. 1 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao
cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.
Tumefaciens………………………27
Bảng 3. 2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen
CBF1
vào cây đậu tương DT22 thơng qua vi khuẩn A. Tumefaciens. ......................
28
Bảng 3. 3 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens...................................................................................................... 29
Bảng 3. 4 Kết quả chuyển gen CBF1 vao cây đậu tương DT22 thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens ...................................................................................... 30
Bảng 3. 5 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao cây
đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens............................... 33
Bảng 3. 6 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen
CBF1
vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. .................
34
Bảng 3. 7 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens...................................................................................................... 35
Bảng 3. 8 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua
vi khuẩn A. tumefaciens ......................................................................................
36
Bảng 3. 9 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vao cây
đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens............................ 38
Bảng 3. 10 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen
CBF1

5

vào cây đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ..............
40


6

Bảng 3. 11 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí
nghiệm chuyển gen CBF1 vao cây đậu tương Cúc Ha Bắc thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens ................................................................................................. 41
Bảng 3. 12 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Ha Bắc thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens............................................................................ 42
Bảng 3. 13 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các cây chuyển gen T0 ...... 44
Bảng 3. 14 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen T0 bằng PCR .............
45


7

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne ......................................... 13
Hình 2 Sư tương tác giữa Agrobacterium với tế bao thực vật va cơ chế chuyển
T-DNA ............................................................................................................ 15
Hình 3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vao đậu tương ..................................... 19
Hình 4. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vao giống đậu tương
DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ...................................................... 26
Hình 5. Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A) va ra ... 28

Hình 6. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vao giống đậu tương DT22 thơng qua vi kh̉n A. tumefaciens..................... 30
Hình 7. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vao giống đậu
tương
cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens................................................. 32
Hình 8. Kết quả mẫu biến nạp kéo dai chồi va ra rễ....................................... 34
Hình 9. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1
vao giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens............... 36
Hình 10. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vao giống đậu
tương Cúc Ha Bắc thơng qua vi kh̉n A. tumefaciens .................................. 39
Hình 11. Kết quả mẫu biến nạp kéo dai chồi va ra rễ..................................... 40
Hình 12. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen
CBF1
vao giống đậu tương Cúc Ha Bắc thơng qua vi kh̉n A. tumefaciens........... 42
Hình 13. Hình ảnh sang lọc cây chuyển gen sau 3 ngay bằng Basta............. 43
Hình 14. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen T0 ..................................... 46


vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CCM

Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy

cDNA

Complementary DNA

CTAB

Hexadecyltrimethylammonium bromide

LB

Luria-Bertani

OD600
kế

Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCR

Polymerase Chain Reaction

RM

Rooting medium - Môi trường ra rễ

SEM

Shoot elongation medium - Môi trường kéo dai chồi

SIM

Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi


1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài.
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc ho Đậu (Fabaceae) la loại
cây trồng có giá trị dinh dưỡng va giá trị kinh tế cao. Các giống đậu tương
trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G. Soja, chi Glycine. Hiện nay, đậu tương
trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó la các giống địa phương va các giống
nhập nội [1], [2].
Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino
acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin...) va các vitamin (B1,
B2, C, D, E, K...) cần thiết cho cơ thể người va động vật. Ngoai giá trị dinh
dưỡng trong hạt, đậu tương còn la cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh
do có khả năng cải tạo đất. Sản phẩm từ cây đậu tương được sư dụng rất đa
dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thanh đậu phụ, ép thanh dầu đậu
tương, nước tương, lam bánh kẹo, sữa đậu tương...đáp ứng nhu cầu đạm trong
khẩu phần ăn hang ngay của người cũng như gia súc.
Việt Nam đứng thư 3 thế giới, sau Trung Quốc, Thái Lan về lượng tiêu
thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm va thư 7 thế giới tính theo bình
qn đầu người với 6,8 lít/người/năm. Theo Bộ Nơng nghiệp va Phát triển
nông thôn, đậu tương la một trong 4 loại cây trồng chu lực, nhưng điều bất
cập la diện tích gieo trồng ngay cang giảm. Diện tích đất canh tác nơng
nghiệp ngay cang bị thu hẹp do sư phát triển của các nganh cơng nghiệp va
dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho
phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngay một tăng. Sản lượng đậu
tương không đáp ứng đu nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các

nước bên ngoai (Theo Tổng


2

cục Hải quan (GCO), trong 8 tháng đầu vụ Mùa 2016-2017, Việt Nam đa nhập
khẩu 919 nghìn tấn đậu tương trị giá 392 triệu USD).
Thêm nữa, tình trạng biến đổi khí hậu toan cầu, hạn hán kéo dai, lượng
mưa khơng đều ở các vùng vao các thời điểm trong năm la một khó khăn lớn
cho sản xuất nơng nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ… Ngoài
những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu cịn lam thu
hẹp diện tích. Sư dụng giống đậu tương biến đổi gen la một tiến bộ quan trọng
trong nganh sản xuất đậu tương của thế giới nói chung va Việt Nam nói riêng.
Đậu tương được xem la cây trồng nhạy cảm với các biến đổi khí hậu.
Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như: hạn, mặn, lạnh…sẽ lam giảm khả
năng điều hòa trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng va phát triển
của cây, lam giảm năng suất cây trồng.
Gen CBF (C-repeat binding factor) la một nhóm gen có mặt trong nhiều
loại thực vật như: Arabidopsis, lúa mì, ca chua, cây cải… Có bốn thanh viên
của ho CBF giữ vai trò quan trọng trong cây, giúp cây phản ứng với những
stresses phi sinh học, giúp các hoạt động trao đổi chất tiếp tục diễn ra không bị
ngừng trệ, lam tăng thời gian sinh trưởng va phát triển của cây. Dó đó sẽ góp
phần cải thiện năng suất cũng như chất lượng hạt. Ba gen CBF1, CBF2 va
CBF3 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 phản ứng với nhiệt lạnh [30] đa chứng
minh vai trò nâng cao tính chịu lạnh ở cây thơng qua cơ chế bảo vệ tế bao khi
gặp điều kiện bất lợi [31] trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi
khơ hạn xảy ra. Ngoai vai trị tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật gen
CBF2 ở Arabidopsis đa được chứng minh lam chậm quá trình lao hóa của lá
va kéo dai tuổi tho khoảng thời gian hai tuần [28].

3

Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tai luận án: “Nghiên cứu
chuyển gen CBF1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương (Glycine max
(L.) Merill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu.
Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào một số giống đậu tương của Việt
Nam.
Đánh giá biểu hiện của gen CBF1 trên cây đậu tương bằng phương pháp
PCR
3. Những đóng góp mới của đề tài.
- Kết quả đạt được của đề tài có giá trị khoa học va thực tiễn cao trong
tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu stress, thích ứng với biến đổi khí hậu
bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.`
- Ứng dụng kĩ thuật PCR đa đánh giá được mức độ biểu hiện của gen
chuyển trong cây chuyển gen va bước đầu tạo được dòng đậu tương chuyển
gen mang gen .
4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đề tài luận văn.
 Ý nghĩa về mặt khoa học:
Đề tai cho thấy một hướng đi mới trong công tác chọn tạo giống cây
trồng bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khác
xa với các phương pháp chọn giống truyền thống.
 Ý nghĩa thực tiễn:
Các giống đậu tương chuyển gen tạo ra từ kết quả của đề tai có thể sư
dụng lam vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với
điều kiện bất lợi của môi trường mang thương hiệu Việt Nam.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương.
Đậu tương la một trong những loại cây trồng ma loài người đa biết sư
dụng va trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý va khảo cổ học đều công
nhận rằng đậu tương có nguyên sản ở Châu Á va có nguồn gốc từ Trung
Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại va
được đưa vao trồng trọt va khảo sát ở triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C)
trước công nguyên.
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] la một trong những cây trồng có
vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoai giá trị dinh dưỡng trong
hạt, đậu tương còn la cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả
năng cải tạo đất. Diện tích cây đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chi trên
170.000 ha, năng suất bình quân xấp xi 1,5 tấn/ha, sản lượng hạt trên 210
nghìn tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân của thế giới [32].
Nguyên nhân chính la do năng suất của giống không cao, tổn thất do
sâu bệnh hại trên đồng ruộng va sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt
hại về số lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%).
Chi Glycine từng được Carl Linnaeus đưa ra năm 1737 trong ấn bản đầu
tiên của quyển Genera Plantarum. Từ glycine có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp –
Glykys (ngọt) va có thể đề cập đến chất ngọt của cu ăn được sản xuất ở Bắc
Mỹ có dạng cây đậu thân leo, Glycine apios, nay la Apios Americana. Đậu
tương được trồng được xuất hiện đầu tiên trong quyển Species Plantarum của
Linnaeus, với tên goị Phaseolus max L. Việc kết hợp Glycine max (L.) Merr.,


5

theo đề nghị của Merrill năm 1917, đa trở thanh tên gọi chính thức được cơng
nhận của loai nay. [3], [33].
Cũng giống như các loai cây trồng khác có thời gian thuần hóa lâu dai,
mối quan hệ giữa các loai đậu tương hiện đại va các loai mọc hoang có thể
khơng cịn dấu vết ở bất kỳ mức độ chắc chắn nao.
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương
- Tính chịu lạnh của đậu tương
Nhiệt độ dưới 15oC có ảnh hưởng xấu đến nảy mần của hạt va sư hút
nước. Nhiệt độ dưới 13 - 15oC, giảm ra hoa, đậu quả va ảnh hưởng tới quang
hợp va bộ máy quang hợp. Tổn thương do lạnh thường gây hại mang tế bao,
do mang tế bao khơng có khả năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp. Các
mơ, chẳng hạn như hạt phấn đang lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các
mô khác va dẫn đến sư bất dục ở cây đậu tương.
- Tính chịu hạn của đậu tương
Các cây ho đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng la cây có nhu cầu về
nước cao hơn các loại cây khác. Đó chính la do đậu tương có ham lượng
protein va lipit cao, để tổng hợp 1 kg chất khơ cần 500-530 kg nước. Trong
quá trình nảy mầm nhu cầu về nước của đậu tương chiếm 50% khối lượng hạt,
trong khi đó ở ngơ chi la 30%, lúa la 26% [3] [4].
Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương
diện sinh lý va di truyền đa cho thấy các đặc tính nay liên quan liên quan chặt
chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao
đổi chất. Khả năng chịu hạn của cây đậu tương mang tính đa gen [4]. Chúng
thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: sư phát triển của bộ rễ [11], [12],
thời gian sinh trưởng [13], cũng như bản chất di truyền của từng giống. Căn cư
vào đặc điểm này, đậu tương được chia thanh hai nhóm:


6

- Nhóm chịu được sư mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sư thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của cây.
Trong những năm gần đây các nha khoa học đa có nhiều thanh cơng khi
nghiên cứu sâu hơn về tính chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương. Maitra va
Cushman (1994) đa phân lập được cDNA của LEA (late embryogeis abudant
protein) nhóm D-95 từ lá va rễ cây đậu tương khi bị hạn. Các tác giả khác đa
nghiên cứu khả năng chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tương, tiêu biểu la công
trình đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội của
Nguyễn Huy Hoang (1992) [4], nghiên cứu phân lập, xác định trình tư gen
chaperonin tế bao chất từ giống đậu tương đột biến M103; phân lập gen
dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương của Trần Thị
Phương Liên (1999) [6], Nguyễn Thu Hiền va cộng sư (2005) [5]. Nâng cao
tính chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm của
Chu Hoang Mậu (2001) [7].
1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới.
1.3.1. Trên thế giới.
Công tác tuyển chọn giống đậu tương trên thế giới hiện nay được tổ chức
bởi các tổ chưc nghiên cứu quốc tế như INTSOY (Chương trình Nghiên cứu
Đậu tương Quốc tế), Trung Tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia
(ASIAR), Viện Quốc tế Nông nghiệp nhiệt đới (IITA), Mạng lưới Đậu đỗ va
Ngũ cốc Châu Á (CLAN). Với sư phát triển mạnh mẽ của di truyền học va
công nghệ sinh học, các hướng nghiên cứu va thanh tựu nổi bật cải biến giống
đậu tương chống chịu các điều kiện bất lợi như: sâu bệnh, ngập úng, hạn hán,
tình trạng chua mặn va đất nghèo dinh dưỡng (FAO - Rapa, 2002).
Năm 2006, trạm Thư nghiệm Nông Nghiệp thuộc Đại học Bắc Dakota
(NDSU) đa phát triển giống đậu tương chuyển gen “G7008RR” kháng thuốc
trừ co Roundup năng suất 6 tấn/ha. Đang nghiên cứu đưa vao sản xuất giống


7

Đậu tương có tính chịu hạn (Hiệp hội Hạt giống Mỹ, 2006), chịu sâu
(Mosanto,
2006).
Trong tình hình biến đổi khí hậu toan cầu như hiện nay, khô hạn gây ảnh
hưởng bất lợi đến sư sinh trưởng va năng suất cây trồng. Trong các điều kiện
hạn, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý chung, phức tạp để thích
nghi va tồn tại. Thưc vật có cơ chế điều tiết chống chịu sư phân giải nước
trong các cơ quan có chưc năng quang hợp. Riêng với các cây đậu đỗ trong đó
có cây đậu tương, một đặc tính bất lợi khi gặp khơ hạn la khí khổng khơng
đóng kín hoàn toan, lam trầm trọng sư thiếu nước của cây. Để thích ứng, loai
cây nay dựa vao một loại protein gọi la Betta được cảm ứng tiết ra khi cây gặp
hạn.
Bộ Nông nghiệp Mỹ, tháng 6/2004 đa thiết lập một dư án nghiên cứu lam
tăng vị trí cạnh tranh của đậu tương Mỹ trên thị trường thế giới dựa vao đa
dạng di truyền va tạo giống (Dư án nghiên cứu: Tăng cường vị thế cạnh tranh
về đậu tương trên thị trường toan cầu thông qua sư đa dạng di truyền va nhân
giống cây trồng. Trong dư án nay, chọn tạo các dòng giống đậu tương có khả
năng chịu hạn la một trong những mục tiêu chính. Dư án đa thành lập đội ngũ
nghiên cứu tính chịu hạn gồm 3 lĩnh vực nghiên cứu chính: Sinh lý học – tìm
hiểu va đánh giá khả năng chịu hạn; Chọn giống - thực hiện các phép lai di
truyền va thư nghiệm đồng ruộng; Di truyền phân tư - sư dụng chi thị ADN
để xác định vị trí lập bản đồ các gen chịu hạn.
Tại Mỹ, nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới, các nghiên cứu cơ
bản, các hướng chiến lược chọn tạo, cải thiện giống đậu tương rất được quan
tâm. Ngân hàng dữ liệu đa được thanh lập, hộp tra cứu cho các nha chọn
giống đậu tương, đây la các kết quả nghiên cứu liên kết giữa các nha nghiên
cứu di truyền va sinh học phân tư đậu tương dùng để tra cứu, cập nhật, liên
kết nghiên cứu cơ bản phục vụ chọn giống đậu tương đang thực hiện.
Chương trình Soybean

8

genomics, đồng thời đưa ra Chiến lược chọn giống đậu tương trong những
năm tới, hy vọng sẽ có nhiều kết quả nghiên cứu ứng dụng có tính chất đột
phá về cây đậu tương như được cải thiện rõ rệt về năng suất, tính chống chịu
va chất lượng.
Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần
đây
Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(triệu ha)

(tạ/ha)

(triệu tấn)

2014

117,74

26,02

306,34

2015

120.90

26,74

323.30

2016

121,64

27,59

335,61

2017

123,89

28,49

353,02

2018

124,92

27,91

348,71

Năm

(Nguồn: FAOSTART,2020)
Qua số liệu bảng 1.1 cho thấy:
Về diện tích từ năm 2014- 2018 có tăng lên nhưng dao động trong
khoảng
117,74 – 124,92 (triệu ha). Cao nhất năm 2018 tăng 7,18 (triệu ha).
Về năng suất va sản lượng không ngừng tăng trưởng cao nhất vào năm
2017 đạt 353,02 (triệu tấn). Trong vòng 5 năm từ 2014 – 2018 sản lượng tăng
42,40 (triệu tấn). Sản lượng tăng như vậy la do diện tích trồng trong những
năm
gần đây tăng lên va đa được sư dụng các tiến bộ khoa học tiên tiến vao sản
xuất.
1.3.2. Tại Việt Nam.
Công tác chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam hiện do 8 cơ quan
nghiên cứu tham gia: Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Nghiên cứu
Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây Thực phẩm, Viện Khoa học Kỹ thuật


9

Nông nghiệp Miền Nam, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện
Nghiên cứu Ngô, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Cần Thơ, Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu. Thành tựu về việc Chọn tạo giống đậu
tương chuyển gen có khả năng chống chịu cao, thích ứng rộng.
Bảng 1. 2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần
đây
Diện tích

Sản lượng

Năng suất

(nghìn ha)

(ngàn tấn)

(tấn/ha)

2014

109,4

156,5

1,43

2015

100,8

146,4

1,45

2016

99,6

160,7

1,61

2017

68,4

101,7

1,49

2018

53,3

80,8

1,52

Năm

(Nguồn: Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thơn, 2020)
Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm ti lệ nho
trong tổng diện tích gieo trồng va ngay cang có xu hướng giảm xuống. Nếu
tính từ năm 2014 thì đến năm 2018 diện tích đa giảm xuống 56,1 nghìn ha
Về mặt năng suất: tuy số lượng chưa đáp ứng đu so với nhu cầu ngay
một tăng của nhu cầu trong nước, nhưng nhờ áp dụng những tiến bộ khoa học

trong việc chọn tạo giống va các biện pháp canh tác, năng suất đậu tương
trong năm năm gần đây đa tăng từ 1,43 tấn/ha (2014) lên 1,52 tấn/ha (2018)
trong khi diện tích gieo trồng giảm hơn nửa.
Hiện nay Bộ Tai nguyên va Môi trường đang ban hành qui định khung
(regulatory framework) đánh giá va xét duyệt các giống cây trồng chuyển gen


10

va sư dụng chúng trong thực phẩm va thức ăn chăn ni. Bộ cũng đang xây
dựng qui trình (Circular on the Procedure) chứng nhận an toan sinh học cho
các sản phẩm chuyển gen, đây cũng la khung pháp lý cơ bản để khảo nghiệm
đánh giá va hợp thức hóa các cây trồng chuyển gen như: bông vải, đậu tương,
bắp… Bộ Nông nghiệp va PTNT cũng xây dựng các thông tư hướng dẫn xét
duyệt các sản phẩm chuyển gen (Circulars on the approval of GMO) được
phép sư dụng lam thực phẩm va thức ăn chăn nuôi
1.4. Đặc điểm của gen CBF1
1.4.1. Đặc điểm gen CBF1
Hoạt chất phiên ma liên kết với yếu tố điều hòa DRE / CRT va gây ra sư
biểu hiện gen COR (lạnh được điều hòa) làm tăng khả năng chịu lạnh của cây
trồng. Nó ma hóa một thanh viên của ho DREB A-1 của ho hệ số phiên ma
ERF/AP2 (CBF1). Protein chứa một tên miền AP2. Có bốn thanh viên của ho
CBF đáp ứng với stress phi sinh học của cây. Ba gen đầu tiên la CBF1, CBF2
va CBF3 rất cần thiết cho phản ứng với nhiệt độ lạnh, trong khi gen CBF4 rất
cần thiết cho phản ứng khi có khơ hạn xảy ra. Gen CBF1 nay liên quan đến
phản ứng với nhiệt độ thấp va axit abscisic [36].
Ngoai vai trò trong việc tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật, sư
biểu hiện quá mức của gen CBF trong cây Arabidopsis đã góp phần lam chậm
quá trình khởi phát của lá lao hóa va kéo dai tuổi tho của cây. Sư biểu hiện của
gen CBF cũng có thể ảnh hưởng đến sư biểu hiện của gen yếu tố phiên ma va

gen liên quan đến chuyển hóa protein, suy thoái va biến đổi sau dịch ma [28].
1.4.2. Các nghiên cứu về gen CBF1
Để khai thác tốt chức năng khác nhau giữa CBF1 (StCBF1) của khoai tây
trồng va CBF1 (ScCBF1) của khoai tây hoang dại Commerson, nhóm nghiên
cứu của Jian Li thuộc Đại học Nông nghiệp Sơn Đông đa cho biểu hiện thanh


11

cơng hai gen nay trong cây Arabidopsis với hai dịng khác nhau. Tất cả cây
chuyển gen ấy đều biểu hiện kiểu hình lùn, trổ bơng muộn, lá dầy hơn va điểm
những chấm hồng. Tuy nhiên, dòng chuyển gen ScCBF1 biểu hiện sư chống
chịu đáng kể đối với lạnh giá va khô hạn hơn dòng chuyển gen StCBF1. Mức
độ thể hiện của nhiều gen liên quan đến chịu lạnh va phát triển, bao gồm các
gen ức chế cây tăng trưởng va trổ bông muộn, cũng cao hơn trong tất cả các
cây chuyển gen.
Kết quả cho thấy hai gen CBF1 có vai trò quan trọng trong phản ứng của
cây đối với stress phi sinh học, tăng trưởng va phát triển. Tuy nhiên, ScCBF1
có chức năng rõ hơn StCBF1 [37].
+ Nhóm tác giả: Li Y, Song Y, Xu B, Xie J, Zhang D, Cooke J thuộc
trường đại học khoa học va công nghệ sinh học, Đại học Lâm nghiệp Bắc
Kinh, Bắc Kinh, Trung Quốc đa tiến hanh nghiên cứu “Hoạt động đặc biệt của
gen CBF1 cây dương trong một mạng lưới điều hòa lạnh tích hợp”. Các yếu tố
liên kết C-repeat (CBFs), cũng được gọi la thanh viên nhóm protein yếu tố
phản ứng mất nước (DREB1), đóng vai trị quan trọng trong việc thu nhận khả
năng chịu stress, nhưng trong cây, các cơ chế cơ bản của khả năng chịu stress
vẫn cịn khó nắm bắt. Để hiểu rõ hơn về các cơ chế nay, nhóm nghiên cứu đa
phân lập năm orthologs CBF1 từ bốn phần cây dương (Populus spp). Va đánh
giá biểu hiện của chúng trong điều kiện hạn hán, lạnh, nhiệt va muối.
Biểu hiện trên toan phần gây ra trong phản ứng với lạnh gợi ý một mối

tương quan giữa biểu hiện CBF1 dương tính va việc thu nhận khả năng chịu
lạnh. Các phản hồi thay đổi giữa các phần có thể phản ánh các cơ chế chịu ứng
suất theo từng phần cụ thể, cho thấy ảnh hưởng của bối cảnh sinh thái đối với
sư phát triển khả năng chịu ứng suất trung gian CBF1 trong cây dương. Sau
đó, nhóm nghiên cứu đa sư dụng chiến lược tìm kiếm toan bộ bộ gen trong
Populus


12

trichocarpa để dư đoán 2263 gen mục tiêu CBF giả định; các gen được xác
định tham gia vao nhiều quá trình va con đường sinh học. Hầu như tất cả các
gen mục tiêu giả định có chứa nhiều yếu tố tác động cis ma trung gian phản
ứng với các tín hiệu môi trường va nội sinh khác nhau, phù hợp với vai trò
quan trọng của CBF1 trong một mạng lưới điều hịa lạnh tích hợp. Cuối cùng,
phân tích 528 cá thể của Populus simonii đa xác định sáu đa hình đơn
nucleotide (tỷ lệ phát hiện sai Q<0,10) đáng kể (P<0,005) kết hợp với sản xuất
malondialdehyde va rò điện phân, cho thấy tầm quan trọng tiềm năng của
PsCBF1 trong quy định một số chức năng liên quan đến mang tế bao. Phát
hiện của nhóm nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về chưc năng của
PsCBF1 va lam sáng to mạng lưới quy định trung gian CBF trong cây dương
[38].
1.5. Vi khuẩn A. tumefaciens và quá trình chuyển gen vào
cây trồng
1.5.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn A.
tumefaciens
A. tumefaciens la loai vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh khối u cho
140 loai cây trồng [14] A. tumefacien la một trong hai loai vi khuẩn sống trong
đất gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) ở các vị trí tổn thương của thực
vật hai lá mầm. Việc tạo thanh khối u do quá trình tổng hợp amino acid mới va

các dẫn xuất của đường được biết chung la opine [15]; [16]. Loại opine tổng
hợp trong khối u như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine va
agropine phụ thuộc vao dòng Agrobacterium khởi đầu sư hình thanh khối u.
Octopyne va nopaline la hai loại opine có nguồn gốc từ arginine va dễ dang
phát hiện nhất trong mơ khối u. Do đó nhiều dịng A. tumefaciens phổ biến
được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline. Agrobacterium chịu trách
nhiệm đối với sư hình thanh khối u dị hóa một cách có chọn lọc opine ma nó
tổng hợp được va sư dụng opine như la một nguồn cacbon va nitơ.


13

1.5.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid
Ti-plasmid được phát hiện ở tất cả các chủng A. tumefaciens gây nhiễm
va tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC. Đây la một phân tư DNA dạng
mạch vòng, sợi kép va tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chép độc lập,
có kích thước khoảng 200 kb [17].
Trên Ti-plasmid, chi có vùng T – DNA được chuyển từ vi khuẩn sang
genome của các cây bị bệnh va tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng
nay lại khơng ma hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T –
DNA ma cần có sư trợ giúp đặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng gây
độc (Virulence Region – vùng Vir) va trên nhiễm sắc thể vi khuẩn. Vùng Vir
dai khoảng 40 kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng
octopin, vùng Vir chứa tới 24 gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen nay
ma hóa đa kích thích sư tách biệt T – DNA, bao bọc che chở va giúp chúng
tiếp cận với genome cây chu [18].

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne
1.5.3. Cấu trúc và chức năng T-DNA
T-DNA la nhân tố chính trong việc chuyển DNA ngoại lai vao tế bao thực

vật va hợp nhất với hệ gen nhân. Vị trí hợp nhất của T-DNA vao DNA thực
vật la hoan toan ngẫu nhiên [19], [21]. Các vùng tương đồng với T-DNA đa
được


14

tìm thấy ở các Ti-plasmid khác nhau. Trong các dịng Agrobacterium
tumefaciens kiểu nopaline được sư dụng phổ biến. Vùng T-DNA có kích thước
khoảng 24 kb. T-DNA được giới hạn bởi đoạn trình tư lặp lại gần như hoàn
toan khoảng 25 bp gọi la đoạn biên [20].
Ở Ti-plasmid nopaline vị trí tmr ma hóa một enzyme liên quan đến hệ
thống cytokinin va sư đột biến ở đây dẫn đến sư tăng sinh rễ từ các khối u đa
gây ra ở một số loai. Các vị trí tms 1 va tms 2 liên quan đến sư tổng hợp khơng
điều hịa của auxin va sư đột biến một trong hai vị trí gây nên sư tăng sinh chồi
từ các khối u ở nhiều loại thực vật. Vì vậy, T-DNA mang các gen (tms 1, tms
2 và tmr) ma sản phẩm của chúng không chịu sư điều hòa bình thường của các
con đường chuyển hóa thực vật liên quan đến sư tổng hợp phytohormone. Do
đó các gen tms 1, tms 2 va tmr được xem la các gen gây khối u [22].
1.5.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium
tumefaciens Các tế bao thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học
dẫn dụ vi khuẩn như: bám vao thành tế bao chu va chuyển T – DNA vao tế
bao thực vật [23], [25]. Quá trình nay được sư trợ giúp đặc biệt của các gen
Vir va RB, LB. Cũng chính các hợp chất nay, với vai trị cảm ứng, giúp cho
các gen vùng Vir
hoạt động va tăng cường biểu hiện.
Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T – DNA lam xuất hiện bản
copy sợi bên dưới của T – DNA [24]. Chi đoạn sợi đơn DNA giữa hai trình tư
biên (LB và RB) của T – DNA mới được chuyển vao tế bao thực vật, va được
gắn vao genome của tế bao. Đó la yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận

chuyển T – DNA. Protein Vir D1, D2 đóng vai trị la chìa khóa trong bước
nay, chúng nhận ra trình tư biên T – DNA va cắt sợi bên dưới tại mỗi bên.
Điểm cắt la điểm đầu va kết thúc của sợi tái sinh. Sau đó, protein Vir D2 vẫn
cịn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T – DNA va tế bao thực vật [23], [25].
Nếu gây đột biến hay


15

loại bo đoạn RB thì hầu như mất hoan toan khả năng chuyển T – DNA, còn
nếu đột biến LB sẽ lam giảm hiệu quả chuyển T – DNA [26]. Điều đó chứng
to tổng hợp sợi T – DNA la từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB va kết
thúc ở LB.
Phức hợp sợi đơn T-DNA-vir D2 được bao bọc bởi protein vir E2 có
trọng lượng 96 kDa. Sư phối hợp nay giúp ngăn cản sư tấn công của nuclease,
hơn nữa sợi đơn T-DNA duỗi thẳng lam giảm kích thước của phức xuống
xấp xi
2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển qua các kênh dẫn truyền
trên mang tế bao. Protein vir E2 chứa đựng hai tín hiệu định vị trong nhân tế
bao thực vật va một protein vir D2 [27].
Protein vir D4 cũng la bắt buộc đối với sự vận chuyển phức ss-T-DNA.
Chức năng của protein vir D4 la liên kết với ATP độc lập với phức protein
cần thiết đối với quá trình di truyền T-DNA [23].
Mơ hình mơ tả các sư kiện xảy ra ở mức phân tư trong sư tương tác
giữa tế bao thực vật va Agrobacterium để hình thanh khối u.

Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế
chuyển T-DNA