Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp pcr rflp

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------    ------

NGUYỄN THỊ HOA

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP PCR-RFLP

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



1


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------    ------

NGUYỄN THỊ HOA

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP PCR-RFLP

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Cƣờng

Thái Nguyên - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn
Văn Cường, phịng Cơng nghệ gen động vật, viện Công nghệ sinh học, viện
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam; PGS đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng
và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình cơng tác, học tập và
nghiên cứu để thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các nghiên cứu
viên, các cán bộ phịng Cơng nghệ gen động vật... đã chỉ bảo, hướng dẫn

tôi về mặt kỹ thuật, chuyên môn, giúp đỡ tơi học tập và làm việc.
Để hồn thành tốt luận văn, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ, động
viên khuyến khích của gia đình, bạn bè trong suốt q trình học tập,
nghiên cứu và hồn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn‼

Thái Nguyên, ngày 22 tháng 8 năm 1010

Tác giả

Nguyễn Thị Hoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



3


CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
chữ

Tên Tiếng Anh

Tên Tiếng Việt

Amplifed Fragment Length

Đa hình chiều dài các đoạn DNA

Polymorphism

được khuyếch đại

bp

Base paire

cặp bazơ

BF

Backfat

Độ dày mỡ lưng

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

Deoxynucleosit triphotphat

DGAT

Diacyl glycerol acyltransferase

Enzyme Diacyl glycerol

AFLP

acyltransferase
H-FABP

Heart fatty acid binding protein

Protein liên kết acid béo ở tim

EDTA

Ethylene diamine tetracetic acid

Axit ethylen diamin tetracetic

EtBt

Ethidium bromid

Ethiđium bromit

IMF

Intramuscular fat content

Hàm lượng mỡ giắt trong cơ

Lpin1

Lipin1 gene

Gen Lpin1

LB

Loading buffer

DNA vi vệ tinh

OD

Optical density

Mật độ quang học

PAP

Phosphatidate phosphatase

Enzyme Phosphatidate
phosphatase

PPARα

Peroxisome proliferator

Thụ thể Peroxisome

PGC-1α

Coactivator-1α

Coactivator-1α

QTL

Quantitative trait loci

Vị trí tính trạng số lượng

RAPD

Random Amplified Polymorphic

Đa hình DNA được khuyếch đại

DNA

ngẫu nhiên

Restriction Fragment Length

Đa hình độ dài các đoạn cắt giới

Polymorphism

hạn

RNase

Ribonucleasa

Ribonucleaza

SDS

Sodium dodecyl sulfate

Sodium dodexyl sunfat

TAG

Triacylglycerol

Triacylglycerol

TE

Tris- EDTA

Đệm TE

TBE

Tris boric acid- EDTA

Đệm TBE

RFLP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



4


MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU

1

1. Tính cấp thiết của đề tài

1

2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1.

Chỉ thị di truyền (Genetic marker)

3

1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function)

5

1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function)

5

1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng

6

số lượng ở lợn
1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài

7

1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam

9

1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP)

11

1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP

11

1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP

15

1.4. Gen Lipin 1 (Lpin1)

18

1.4.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen Lpin1

18

1.4.2. Đa hình di truyền gen Lpin1

25

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

28

2.1. Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị

28

2.1.1. Ngun liệu

28

2.1.2. Hố chất

28

2.1.3. Máy móc, trang thiết bị

30

2.2. Phương pháp nghiên cứu

30

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợn

32

2.2.2. Phương pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



5

2.2.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế

35

2.2.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

36

2.2.5. Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP)

38

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

40

3.1.Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn

40

3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP

41

3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR

41

3.2.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII

42

3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR- RFLP

47

3.3.1. Phương pháp phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR

47

3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI

48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

51

1. KẾT LUẬN

51

2. ĐỀ NGHỊ

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

53

1. TIẾNG VIỆT

53

2. TIẾNG ANH

55

PHỤ LỤC

61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



6


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Các loại chỉ thị di truyền phân tử chính ở động vật

6

Bảng 1.2

Một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử có tương

8

quan với các tính trạng quan trọng ở lợn.
Bảng 1.3.

Vị trí của các yếu tố phiên mã bám trên vùng phía

12

trước đầu 5’ của gen mã hóa H-FABP
Bảng 2.1.

Danh mục hố chất đã sử dụng trong luận văn

28

Bảng 2.2.

Trình tự mồi và điều kiện phản ứng

29

Bảng 2.3.

Đệm và các dung dịch pha chế

29

Bảng 2.4.

Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

30

Bảng 2.5.

Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước

34

đoạn DNA cần phân tích theo Sambrook và CS
Bảng 2.6.

Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và

37

Lpin1
Bảng 2.7.

Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen H-FABP và

38

Lpin1
Bảng 2.8.

Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR

39

Bảng 3.1.

Tần số các alen ở cả 3 vị trí RFLP của gen H-FABP

43

của một số giống lợn
Bảng 3.2.

Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-

44

FABP
Bảng 3.3.

Kết quả phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP

45

bằng enzyme HaeIII.
Bảng 3.4.

Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1

48

Bảng 3.5.

Tần số alen và tần số kiểu gen Lpin1

49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



7


Tên hình vẽ, Bảng biểu

Hình

Trang

Hình 1.1. Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6

11

ở lợn
Hình 1.2

Trình tự aminoacid của các loại F-ABP

14

Hình 1.3

Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào

15

Hình 1.4. Vị trí gen Lpin1 của lợn trên nhiễm sắc thể số 3

19

Hình 1.5. Chức năng phân tử của gen Lipin 1, 2, 3

20

Hình 1.6. Các loại Lpins: Lpin-1A, Lpin-1B, Lpin-2, Lpin-3.

25

Hình 1.7. Gen Lpin1 trong các loại tế bào.

26

Sơ đồ

31

Quy trình thí nghiệm

Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai

40

lợn
Hình 3.2. Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái

41

và Yorshire
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H-

42

FABP
Sơ đồ

Vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-

44

FABP
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng

44

enzyme HaeIII
Đồ thị

Tần số kiểu gen H-FABP

46

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1

47

Sơ đồ

48

Vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 bằng

49

enzyme MspI
Đồ thị

Tần số kiểu gen của Lpin1

50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



8


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngành chăn ni lợn của Việt Nam đóng vai trị quan trọng trong sản
xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt được tiêu thụ và
chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp của Việt Nam [7]. Từ nhiều năm qua
sự phát triển của nghành chăn ni lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng
cao chất lượng cuộc sống cho người dân.
Theo thông báo của FAO, 55% số lượng lợn trên thế giới thuộc về
vùng Châu Á – Thái Bình Dương. Trong đó, Việt Nam có số lượng lợn lớn
nhất với khoảng 12 triệu con. Các giống lợn nội ở Việt Nam rất đa dạng,
chiếm 60 – 90% về mặt số lượng chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt
đới và điều kiện chăn nuôi của các vùng nông thôn nghèo [26]. Các giống lợn
thường cho chất lượng thịt tốt, ngon khi chế biến. Song nhược điểm của các
giống lợn này là tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành phần mỡ nhiều,
trong thịt xẻ và tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao. Do vậy, các hướng nghiên cứu
nhằm cải thiện giống vật nuôi cho năng suất cao mà vẫn giữ được chất lượng
thịt ngon, phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam có ý nghĩa rất quan trọng
trong sản xuất.

Trong công tác lai tạo và chọn giống truyền thống ở lợn, các chỉ tiêu
chọn lọc thuộc về kiểu hình mà chủ yếu là các chỉ tiêu về hình thái và một số
chỉ tiêu về hóa sinh như: tốc độ sinh trưởng được xác định bằng cân, đo; chất
lượng thịt được xác định bằng màu sắc thịt, số lượng cơ, độ pH...[17]. Phương
pháp trên đã góp phần vào việc cải tạo giống lợn nuôi ở Việt Nam. Tuy nhiên
việc lựa chọn bằng ngoại hình có trở ngại là địi hỏi nhiều thời gian, thường
khơng ổn định và nhiều khi khơng chính xác hoặc khơng thể thực hiện được.
Những thành tựu về giải mã gen người và động vật đã làm sáng tỏ
nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế. Thành tựu này mở ra khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



1


năng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống trong ngành công
nghiệp chăn nuôi lợn. Phương pháp này cho phép khắc phục những hạn chế
của phương pháp chọn lọc truyền thống như: rút ngắn thời gian chọn lọc,
chọn lọc chính xác hơn, thực hiện chọn lọc được đối với những tính trạng khó
xác định dựa vào ngoại hình. Do tính ưu việt trên nên thời gian qua hướng
nghiên cứu này phát triển rất mạnh mẽ. Đến nay đã có 4928 QTLs liên quan
đến 499 tính trạng khác nhau đã được xác định chủ yếu tập chung vào các
tính trạng có ý nghĩa kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ tăng trọng, số con
sinh trong một lứa, gen kháng bệnh...[27].
Để nâng cao năng xuất, trong những năm vừa qua tiến hành lai giữa lợn
thuần ngoại với lợn nội. Trong chương trình nghiên cứu này, lợn ngoại được
sử dụng là Yorshire cho lai với lợn nội là Móng Cái.

Với mục đích xác định tính đa hình của một số ứng cử gen liên quan
đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ
cho công tác chọn giống chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng
phương pháp PCR -RFLP’’.
2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài
Mục tiêu
Xác định các biến thể DNA của gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất
lượng thịt lợn, nhằm hỗ trợ công tác chọn giống.
Nhiệm vụ
Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP ở lợn Móng Cái và Yorshire
bằng phương pháp PCR-RFLP.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



2


CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Chỉ thị di truyền (Genetic marker)
Chỉ thị di truyền phân tử (genetic marker) là một gen hay một trình tự
DNA đã được xác định vị trí trên nhiễm sắc thể, và có tương quan với một
gen hoặc một tính trạng cụ thể. Nó được biết như một biến dị được sinh ra do
đột biến hoặc do sự biến đổi vị trí trong hệ gen. Một chỉ thị di truyền có thể là

một trình tự DNA ngắn như trình tự lặp lại xung quanh một base-pair hoặc
một đoạn dài như minisatellites [28].
Trong nhiều thập kỷ qua, ứng dụng các phương pháp chọn lọc dựa trên
khoa học về di truyền quần thể và khoa học thống kê đã cho phép tạo ra vật
ni có hiệu suất tăng trưởng cao. Các kết quả dựa trên chọn lọc kiểu hình với
một số tính trạng kinh tế quan trọng ở gia súc, gia cầm đã đạt được nhiều
thành tựu đáng kể. Tuy nhiên, theo thời gian những hạn chế của phương pháp
này trong việc cải thiện tính di truyền vật nuôi đã trở nên rõ ràng. Hiệu quả
của chúng giảm khi các tính trạng mong muốn khó định lượng, khả năng di
truyền thấp (ví dụ: tính kháng bệnh). thêm vào đó, việc chọn lọc nói chung
chỉ hạn chế vào các đặc tính có thể đo lường một cách phù hợp ở một số
lượng lớn các mẫu. Một vài đặc tính như: tỉ lệ sống sót, năng suất trứng...lại
biểu hiện rất muộn trong q trình sống nên khó có thể dùng để làm tiêu chí
có ích trong chọn lọc. Ngồi ra hiệu quả chọn lọc dựa trên kiểu hình thường
khơng cao khi mục tiêu chọn lọc có tương quan di truyền khơng phù hợp (ví
dụ: năng suất sữa và hàm lượng protein của sữa), sự tương tác giữa các gen
trong cùng một locus hay các locus khác nhau (hiện tượng át gen) và giữa các
gen với môi trường cũng rất phức tạp, do đó khó có thể xác định một cách
chính xác nếu chỉ dựa trên thơng tin về kiểu hình và phả hệ [24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



3


Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra khả năng xác định

và sử dụng các biến dị hệ gen cho việc nâng cao tính di truyền của giống vật
nuôi. Đặc biệt sự ra đời của các chỉ thị di truyền (các trình tự đánh dấu trên bộ
gen liên kết với các tính trạng cần quan tâm) có thể giúp giải quyết những hạn
chế của phương pháp trên.
Việc sử dụng các thành phần của kiểu gen, các chỉ thị di truyền cho
phép bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi được các biến
động di truyền khơng biểu hiện ra kiểu hình, xác định sớm các tính trạng, do
vậy rút ngắn được thời gian chọn lọc. Hơn nữa, phương pháp này đi vào xác
định trực tiếp trên vật liệu di truyền nên kết quả chọn lọc nhanh và chính xác
hơn so với dựa vào ngoại hình [46].
Hệ thống các chỉ thị phân tử chính ở động vật có thể kể đến: RFLP,
RAPD, AFLP, Microsatellites...Trong nghiên cứu, các chỉ thị này được sử
dụng vào rất nhiều mục đích:
* Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền trong một quần thể vật nuôi.
Nếu mức biến động di truyền này cịn cao thì cần tiếp tục q trình chọn lọc
nhằm ổn định dịng.
* Cho phép đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai cá thể bố mẹ. Sự khác
biệt này càng lớn thì tính dị hợp tử ở thế hệ con càng cao.
* Theo dõi hiệu quả của một chương trình chọn giống định hướng đối với một
allele đặc biệt.
* Xác định các chỉ thị ở các locus có liên kết chặt chẽ với các tính trạng mong
muốn.
Dựa trên chức năng, người ta chia chỉ thị di truyền làm 2 loại cơ bản
như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-

4


1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function)
Còn gọi là các ứng cử gen (candidate gene) - là những chỉ thị đối với
những gen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện, do vậy được coi là quyết
định tới các tính trạng mong muốn [46]. Những chỉ thị loại này được phát
hiện nhờ kỹ thuật RFLP, SNP chủ yếu là các chỉ thị đối với các gen nằm trong
vùng mã hóa (coding gene).
Ví dụ:
Đột biến gen RYR-1 ở vị trí 1843 (do việc thay thế base C bằng T) có
liên quan đến bệnh tăng thân nhiệt ác tính (malignant hyperthermia) ở lợn [1].
1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function)
Là những chỉ thị nằm ngồi vùng mã hóa của gen, nó có thể nằm gần
hoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện. Chỉ thị loại này chưa được
biết sản phẩm của nó, song được xác định là có tác động hoặc ảnh hưởng đến
tính trạng [46]. Chỉ thị DNA này thường được phát hiện nhờ kỹ thuật RAPD,
AFLP, Microsatellite, Minisatellite…
Trong nghiên cứu và phân tích di truyền các giống vật ni, mỗi loại
chỉ thị phân tử có thế mạnh riêng và đem lại hiệu quả nhất định. Do vậy, việc
lựa chọn và sử dụng chỉ thị phân tử nào phù hợp cịn tùy thuộc vào mục đích
nghiên cứu cũng như điều kiện về cơ sở vật chất và các trang thiết bị thí
nghiệm. Một vài chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng phổ biến trên động
vật, thể hiện ở bảng 1.1 dưới đây:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-

5


Bảng 1.1. Các loại chỉ thị di truyền phân tử chính ở động vật
Loại chỉ
thị

RFLP

SNP

1

1

Microsatellite
2

Tồn bộ

Tồn bộ

Tồn bộ

Thấp

Cao

Tương
đối

Phân bố
Tồn bộ
hệ gen
PIG*

Thấp

RAPD
2

Minisatellite
2
Vùng dị
nhiễm sắc
Cao

AFLP
2
Toàn
bộ
Tương
đối

Số
lượng
2
2

2-30
2
2
2
allele
Kiểu di
Đồng
Đồng
Đồng trội
Trội
Trội
Trội
truyền
trội
trội
Độ tin
Tương
Cao
Cao
Cao
Thấp
Cao
cậy
đối
Tốc độ
phép
Thấp
Cao
Cao
Cao

Thấp
Cao
thử
Đầu tư
Tương
Tương
Cao
Cao
Thấp
Thấp
ban đầu
đối
đối
Giá
Tương
Tương
Tương
Cao
Thấp
Cao
thành
đối
đối
đối
*: Hàm lượng thơng tin đa hình (Polymorphism Information Content)
1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lƣợng ở lợn
Trong chọn giống ở lợn và nhiều gia súc khác, thường các chỉ thị di
truyền được sử dụng có liên quan đến các tính trạng năng suất, chất lượng
thịt, sức sống cao, khả năng kháng bệnh…Đó là các tính trạng số lượng
(quantitative trait) hay cịn gọi là các tính trạng liên tục (vì trong quần thể, giá

trị của các tính trạng này biến thiên liên tục) và vị trí di truyền tương ứng của
chúng được gọi là các vị trí tính trạng số lượng (QTL – Quantitative trait
loci).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



6


Hiện nay, việc sử dụng các chỉ thị di truyền để phát hiện những vùng
trong bộ gen liên quan đến các tính trạng số lượng được ứng dụng rộng rãi,
đặc biệt chúng được sử dụng vào việc xác định dấu vết di truyền, hình thành
các bản đồ liên kết (linkage map) hay bản đồ khu trú tính trạng số lượng
(QTL mapping) với vị trí các gen mã hóa cho những tính trạng mong muốn,
nhằm đáp ứng nhanh và hiệu quả việc chọn lọc phục vụ cho những chiến lược
lai tạo và chọn giống theo phương pháp cổ điển.
Phát triển các chỉ thị di truyền phân tử nhìn chung đều địi hỏi trình độ
kỹ thuật cao song có nhiều ưu điểm như: cho phép sử dụng nguồn gen mà
không làm ảnh hưởng đến sự điều hòa, biểu hiện tự nhiên của gen, chỉ với
lượng mẫu chứa vật liệu di truyền ít vẫn cho kết quả nhanh và chính xác. Do
vậy mà thời gian qua, số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản đồ di truyền
lợn liên tục được phát triển. Nhiều chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng có
ý nghĩa kinh tế đã đem lại hiệu quả to lớn trong điều khiển năng suất giống
vật nuôi này.
1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nƣớc ngoài
Đầu những năm 90, các nước trong khối EU đã bắt đầu tiến hành

chương trình nghiên cứu genome của lợn (PigMap), tiếp theo đó là chương
trình nghiên cứu gen lợn của Mỹ, Úc, Trung Quốc…Mục đích của chương
trình nghiên cứu gen lợn để tìm ra chỉ thị di truyền phân tử giúp chương trình
chọn tạo giống được nhanh và chính xác hơn. Đến nay hơn 4000 chỉ thị di
truyền phân tử và gen lợn đã được phân tích và chủ yếu tập trung vào những
tính trạng sinh trưởng nhanh, tỷ lệ nạc cao, chất lượng thịt tốt, khả năng sinh
sản và chống được bệnh tật tốt...Dưới đây là một số gen và các chỉ thị di
truyền phân tử chính liên quan đến các tính trạng: tăng trưởng, khả năng sinh
sản, chất lượng thịt đã được nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



7


Một số chỉ thị di truyền đã phát triển ở lợn được thể hiện trong bảng 1.2
dưới đây:
Bảng 1.2. Một số gen và các chỉ thị di truyền phân tử có tƣơng quan với
các tính trạng quan trọng ở lợn.
Tính trạng Tên chỉ thị
phân tử, gen
GH
Tốc
độ
tăng
MYOG

trưởng
FSH
Khả
năng
sinh sản

Chất
lượng
thịt

ESR
PRLR
RN
SLA
RYR-1, HAL
PIT-1
H-FAPB,A-FABP
Lpin 1

Đặc tính quy định

Tài liệu tham
khảo
Tăng trưởng nhanh
Water M.J.2006
Wang
W.,C.2003
Trọng lượng sơ sinh, Te Pas. 1999
tốc độ tăng trưởng, tỷ
lệ nạc...

số con/ lứa đẻ
Nguyễn T. D
Thúy, 2004
số con/ lứa đẻ
Rothschild, 1996
Kích cỡ lứa đẻ
Vincent, 1998
Độ pH, hàm lượng Milan, 1996
nước trong thịt
Phẩm chất thịt
Rothschild, 1995
Độ pH, màu sắc thịt, Nguyễn
Văn
mẫn cảm stress
Cường, 2002
Dày mỡ lưng
Anderson, 1994
Hàm lượng mỡ cơ
Gerbens, 1998
Hàm lượng mỡ mô
Ponsuksili et al.
2001

Nghiên cứu lập bản đồ gen lợn
Năm 1964, bản đồ di truyền lợn được công bố bởi Andreson và Baker,
số lượng gen và chỉ thị di truyền trên bản đồ di truyền lợn liên tục được phát
triển. Mục đích chính của chương trình nghiên cứu hệ gen vật ni nói chung
và lợn nói riêng là xác định và đặc trưng hóa các vùng trên nhiễm sắc thể mà
có ảnh hưởng, điều khiển các đặc tính kiểu hình [12].
Các vạch ghi trên bản đồ gen lợn đã nhanh chóng được tăng lên từ 28

locus trong năm 1984, năm 1989 có 50 gen và chỉ thị, đến năm 1994 có gần
800 chỉ thị và gen lợn đã được tìm thấy. Năm 1999 số lượng gen và chỉ thị di
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



8


truyền là hơn 1800 trong đó có khoảng hơn 250 gen, năm 2003 con số này lên
tới 3017 locus. Đến tháng 1/2006 cơ sở dữ liệu QTLs có 4081 chỉ thị liên
quan đến 236 tính trạng kinh tế [47]. Đến tháng 1/2009 ngân hàng dữ liệu bản
đồ gen lợn đã có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau, trong đó
3711 QTLs liên quan đến tính trạng chất lượng thịt, 494 QTLs liên quan đến
tính trạng sản lượng thịt, 199 QTLs liên quan đến khả năng sinh sản [27].
/>1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam
Nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này đã được bắt đầu quan tâm, tuy
nhiên kết quả mới dừng ở một số gen riêng lẻ. Nghiên cứu về đặc điểm di
truyền của một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa có liên quan đến khả năng kháng
bệnh của lợn nội và lợn ngoại được nuôi ở Việt Nam đã được đề cập trong
công trình nghiên cứu của Văn Lệ Hằng và cs (1998) [4] cho thấy rằng giống
lợn nội có khả năng kháng bệnh do thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới
tốt hơn so với các giống lợn ngoại.
Trình tự nucleotid của gen hormone sinh trưởng của một số giống lợn
nội Việt Nam như lợn Móng Cái, lợn Ỉ, lợn H’mơng đã được xác định trong
cơng trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Diệu Thúy, Geldermann H (2004) [9].
Bằng kỹ thuật PCR Nguyễn Văn Cường và cs (2003) [2], Nguyễn Thị
Diệu Thúy và cs (2003, 2004) [10, 11] cũng xác định kiểu gen liên quan đến

số con/lứa đẻ qua phân tích gen FSH. Việc xác định tần suất xuất hiện kiểu
gen này ở các giống lợn nghiên cứu đã chỉ ra rằng: với giống lợn ngoại do đã
qua quá trình chọn lọc nhân tạo nên kiểu gen có số con/ lứa đẻ thấp đã bị loại,
cịn ở lợn nội do hồn tồn chăn ni tự nhiên nên kiểu gen quy định tính
trạng này còn cao. Do vậy, ở các giống lợn nội nếu được tiến hành chọn lọc
có định hướng sẽ nâng cao được năng suất sinh sản và số con/ lứa đẻ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



9


Các nghiên cứu sử dụng RFLP cũng đem lại kết quả nhanh chóng và
chính xác trong chẩn đốn, phát hiện các bệnh di truyền ở lợn [1, 2]. Các cá
thể mang kiểu gen RYR-1 ở dạng đồng hợp tử lặn (nn) có biểu hiện bệnh mẫn
cảm với stress (Pocine stress Syndrome- PSS). Áp dụng kỹ thuật này vào việc
xác định tần suất kiểu gen RYR-1 trong quần thể lợn: Móng Cái, Landrace và
Yorshire cho thấy khả năng mắc bệnh PSS ở lợn nội Móng Cái thấp hơn
nhiều so với lợn ngoại.
Nguyễn Ngọc Tuân và cs (2001) đã bước đầu nghiên cứu khảo sát tần
số gen Halothane và ảnh hưởng lên sức tăng trưởng, phẩm chất thịt và khả
năng sinh sản của lợn tại thành phố Hồ Chí Minh [6].
Nghiên cứu về đa hình gen H-FABP và gen RYR-1 ở một số giống lợn
ở Việt Nam được đề cập đến trong cơng trình nghiên cứu của Nguyễn Thu
Thúy và cs (2005). Kết quả cho thấy 5 giống lợn nội chỉ xuất hiện 2 kiểu gen
DD và Dd và kiểu gen DD có tần số xuất hiện cao hơn nhiều so với kiểu gen

Dd. Tỷ lệ kiểu gen DD ở 5 giống lợn Tạp Ná, Móng Cái, Cỏ, Mường
Khương, Mẹo lần lượt là: 100%, 98,82%, 94,59%, 94,44%, 93,62% và tỷ lệ
kiểu gen Dd tương ứng là 0%, 1,18%, 5,41%, 5,56%, 6,38% [8].
Tạ Thị Thoa và cs (2009) Đã tiến hành phân tích đánh giá mức độ liên
quan giữa Haplotype của gen MYOG và H-FABP với tốc độ sinh trưởng và
chất lượng thịt lợn. Hàm lượng mỡ cơ tương ứng của kiểu gen DD2,27<2,49<2,91% [7].
Tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
từ năm 2001 đã hợp tác với trường đại học Stuttgart, CHLB Đức nghiên cứu
đa hình gen trong một số giống lợn thuần nội Việt Nam. Kết quả nghiên cứu
cho thấy các giống lợn nội Việt Nam có tính di truyền cao. Tuy nhiên tần suất
kiểu gen liên quan đến tốc độ sinh trưởng cao, chất lượng thịt tốt ở lợn Việt
Nam là thấp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



10


Để nâng cao tần suất gen có ý nghĩa kinh tế trong lợn nuôi thương
phẩm chúng tôi xác định kiểu gen liên quan đến chất lượng thịt của lợn
Yorshire và Móng Cái với mong muốn từ đó đưa ra mơ hình lai thích hợp.
1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP)
1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mã hóa cho protein gắn axit béo ở cơ, nằm trên
nhiễm sắc thể số 6 ở lợn, tại vị trí 6q21 -> 6q26 [19], tương ứng vị trí gen HFABP ở người là 1p32 -> 1p33, ở chuột nằm trên nhiễm sắc thể số 4. Đó là

vùng có tính bảo thủ cao trong q trình tiến hóa. Khi tiến hành nghiên cứu
bản đồ liên kết của 7 microsatellites trên nhiễm sắc thể số 6, Ovilo đã xác
định được gen H-FABP nằm trong khoảng giữa marker SW316 và SO228
(SW316- 3,4cM – H-FABP – 12,5cM – SO228) [39, 40].

Hình 1.1. Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6 ở lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



11


Cấu trúc gen H-FABP gồm: 4 exon mã hóa lần lượt cho các đoạn
polipeptide gồm 24, 58, 34, 17 axit amin và 3 intron có kích thước khoảng
4,2; 2,5; 1,5 kb [19].
Phân tích vùng trình tự điều khiển 5’ của gen H-FABP chứa các TATA
- Box nằm phía trước mã khởi đầu (ATG) 92 bp và có chứa nhiều vị trí liên
kết tiềm năng tương ứng với các yếu tố phiên mã khác nhau, các thụ thể của
các hormone.
Bảng 1.3. Vị trí của các yếu tố phiên mã bám trên vùng phía trƣớc đầu 5’
của gen mã hóa H-FABP
Yếu tố
Yếu tố hoạt
hóa protein 1 (AP-1)
Yếu tố hoạt
hóa protein 2 (AP-2)

Yếu tố hoạt
hóa protein 3 (AP-3)
CCAAT–EBP
(C/EBP)
E-Box

Trình tự tƣơng ứng
STGACTMA

-875

CCSCRGGC

-408

TGTGWWW

-1545, -714

TKNNGYAAK

Growth hormone
(GH-cse2)
Glucocorticoids (GRE)
Krox-24
Yếu tố hoạt hóa
tuyến vú (MAF)
Sat-5

AATAAAT

-1608, -1504, -1072,
-665, -628
-1539, -1328, -1308,
-1111, -768, -110
-1441

TGTTCT
GCGSGGGCG
GRRGSAAGK

-1000
-134
-1134

TTCNNNGAA

-1178

CANNTG

Vị trí

Những yếu tố này phù hợp với những báo cáo về sự biểu hiện đặc hiệu
mô hay chức năng của H-FABP. E-Box có chức năng điều khiển biểu hiện
các H-FABP đặc hiệu trong tế bào cơ xương nhờ sự liên kết với họ protein
MYOD của cơ. Cơ chế chung điều khiển H-FABP có thể giải thích bằng sự có
mặt của các vị trí liên kết tiềm năng tương ứng như yếu tố hoạt hóa protein
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



12


(activator protein- AP 1, 2, 3), Krox 24 và các yếu tố đáp ứng glucocorticoid.
Một đoạn 13 nucleotid (CTTCCT[A/C]TTTCGG) tìm thấy ở vị trí nucleotid
- 250 ở lợn là một nhân tố mới trong điều khiển phiên mã khi so sánh với
trình tự trên genbank/EMBL. Yếu tố liên kết tiềm năng Stat-5 giải thích cho
sự phụ thuộc của q trình tiết sữa với sự biểu hiện của gen H-FABP. Vị trí
liên kết Stat-5 cũng được phát hiện trong các promotor của các gen mã hóa
protein sữa.
Vùng 3’ khơng dịch mã bao gồm các đoạn poly-A.
Chức năng của gen H-FABP
Gen H-FABP là gen mã hóa cho một protein H-FABP liên kết axit béo
ở cơ, có kích thước là 15kDa. H-FABP là một thành viên thuộc nhóm protein
liên kết lipid nằm trong tế bào, chúng bao gồm 9 loại F-ABP khác nhau nằm ở
các mô đặc hiệu khác nhau của cơ thể. Đó là A-FABP nằm ở mơ mỡ, B-FABP
ở các tế bào thần kinh của não, E-FABP ở biểu bì, H-FABP ở tế bào cơ, IFABP ở ruột, IL-FABP ở ruột hồi, L-FABP ở gan, M-FABP ở myelin và TFABP nằm ở tinh hồn [14].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



13

Hình 1.2 Trình tự aminoacid của các loại F-ABP
H-FABP thường có mặt ở các mơ có nhu cầu cao về các axit béo là mô
cơ hay các mô cơ tim hay mô cơ xương và tuyến sữa. Nguồn gốc của chất ức
chế sinh trưởng trong vú là một protein ức chế sự phát triển các tế bào u, thực
chất là hỗn hợp của H-FABP và một loại A-FABP.
H-FABP là các protein nhỏ nội bào liên kết với các axit béo để vận
chuyển các axit béo này qua màng tế bào chất đến vị trí β-oxi hóa các axit béo
để cung cấp năng lượng hoặc tổng hợp triacylglycerol (TAG) hay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



14


phospholipid [62]. Hơn thế nữa, H-FABP có thể điều chỉnh hàm lượng axit
béo trong cơ và thông qua con đường này chúng điều khiển quá trình tổng
hợp lipid. H-FABP và A-FABP được coi là hai ứng cử gen cho tính trạng hàm
lượng mỡ ở lợn.

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào
1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP
Tính trạng chất lượng thịt gồm một tập hợp các tính trạng được điều
khiển bởi nhiều gen. Các tính trạng này bao gồm các thành phần của cơ (hàm
lượng mỡ cơ, tỷ lệ cũng như độ dày của thịt nạc, hàm lượng cholesterol) và
các chỉ tiêu chất lượng (độ pH, màu sắc, khả năng giữ nước hay mất nước, độ

mềm, ngon khi chế biến). Hàm lượng mỡ giắt trong cơ (intramuscular fat
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



15


content - IMF) là lượng mỡ được phân bố trong thịt nạc. Hàm lượng mỡ cơ
ảnh hưởng đến lượng nước, độ mềm và vị ngon của thịt lợn.
Chất lượng thịt lợn bị ảnh hưởng bởi hai yếu tố di truyền và dinh
dưỡng. Để nghiên cứu đồng tác dụng của hai loại yếu tố đó, Li C.L., Sa X.Y.,
Meng H., Pan Y.C. (2009), thực hiện thử nghiệm này trên 136 lợn lai với
khoảng 65 kg trọng lượng, chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm được cho ăn với
khẩu phần khác nhau. Sau 35 ngày nuôi, lợn thịt khoảng 95 kg trọng lượng cơ
thể và chất lượng thịt lợn được đánh giá. Đa hình gen H-FABP được phân
tích. Các kết quả thu được: (1) nguồn thức ăn có tác dụng rất lớn đến màu thịt
(MC), pH24, chất béo trong cơ (IMF,%), và protein trong cơ bắp (IMP,%);
(2) đa hình gen H-FABP ảnh hưởng đến IMF (%) và IMP (%); (3) sự tương
tác giữa gen và thành phần thức ăn có tác dụng đáng kể đến pH và IMF (%)
[31].
Gen H-FABP nằm trên nhiễm sắc thể số 6, chúng được giải trình tự và
có 3 vị trí cắt của enzym giới hạn. Ba vị trí đa hình độ dài đoạn giới hạn đã
được xác định trên trình tự gen H-FABP: điểm cắt của enzyme HinfI tại
nucleotit 1324 nằm ở phía trước đầu 5’ của gen H-FABP (T bị thay thế bằng
C), điểm cắt của enzyme MspI tại nucleotit 1489 (T bị thay thế bằng C), điểm
cắt của enzyme HaeIII tại nucleotit 1811 (G bị thay thế bằng C), cả 2 điểm cắt
của enzyme MspI và HaeIII nằm trên intron của gen H-FABP [19].

FABPs là một họ các protein nhỏ có khả năng liên kết và vận chuyển
các axit béo đến các vị trí mà ở đó các axit béo được sử dụng. H-FABP là một
thành viên của họ protein FABPs, vì vậy H-FABP được coi là ứng cử gen cho
hàm lượng mỡ cơ liên quan đến độ dày mỡ lưng ở lợn. Gerben và cs [21],
bằng cách sử dụng ba vị trí đa hình ở gen H-FABP của lợn đã phát hiện ra
mối liên quan giữa kiểu gen mã hóa cho H-FABP với IMF (hàm lượng mỡ
giắt trong cơ) và BF (hàm lượng mỡ lưng). Nghiên cứu này cho thấy lợn có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



16


kiểu gen H-FABP là aaddHH có hàm lượng IMF cao nhất. Kết quả nghiên
cứu cho thấy đa hình RFLP gen H-FABP có liên quan đến hàm lượng IMF
cũng như hàm lượng BF.
Ảnh hưởng của đa hình gen H-FABP với sự tăng hàm lượng IMF có
thể là do sự khác biệt trong vận chuyển các axit béo của các protein H-FABP.
Sự khác biệt của các allele tăng sự tích lũy mỡ trong cơ bằng cách tăng hiệu
quả tích lũy của các axit béo trong mô cơ xương và diều khiển vận chuyển các
axit béo nội bào khác nhau. Ngược lại, gen H-FABP tác động làm tăng lượng
mỡ lưng một cách gián tiếp, bởi vì các mơ mỡ dưới da khơng biểu hiện HFABP, nhưng có mặt của A-FABP. Do H-FABP khơng được tiết ra bởi các tế
bào cơ cho nên chúng không tương tác trực tiếp với các mô mỡ dưới da. Bên
cạnh ảnh hưởng không trực tiếp của H-FABP lên độ dày mỡ lưng, thì ảnh
hưởng của H-FABP lên IMF cũng góp phần giải thích sự biến đổi của độ dày
mỡ lưng. Đã có những bằng chứng cho thấy ảnh hưởng của đa hình gen HFABP liên quan đến tốc độ phát triển của lợn. Tóm lại, H-FABP ảnh hưởng

đến hàm lượng IMF, độ dày mỡ lưng và tốc độ sinh trưởng của quần thể lợn
[21].
Ảnh hưởng hàm lượng mỡ cơ với đa hình gen mã hóa H-FABP cũng
được nghiên cứu ở lợn: Landrace, Large White, và một số giống lợn nội ở
Trung Quốc: Neijiang, Rongchang, Hanjiang đen, Hanzhong trắng,
Banmei...Thì kiểu gen H-FABP có tương quan với hàm lượng mỡ cơ. Dựa
trên phương pháp đa hình đoạn cắt giới hạn, kết quả nghiên cứu cho thấy có
sự khác nhau về các tính trạng hàm lượng mỡ ở trong thịt giữa các nhóm kiểu
gen lần lượt là: AAtương ứng là: 2,28<2,7<2,95; 3,89>3,42>3,17; 2,27<2,49<2,91 [41]. Những
nghiên cứu trên lợn Cinta Senese cũng cho thấy đa hình H-FABP liên quan
đến hàm lượng mỡ trong cơ [15]. Ở lợn Calabrese đã chứng minh là lợn mang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

-



17