Nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá f ab’ 2 từ huyết tương ngựa đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

1

..

ĐH Y Hà Nội

Thái Danh Tuyên

Nghiên cứu sản xuất Huyết thanh kháng nọc rắn cạp
nia đa giá F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất
lƣợng chế phẩm trong phịng thí nghiệm

2013


2

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị
máu phục vụ cấp cứu điều trị (2% dân số) [40], ngoài máu toàn phần và các
chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết
thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin,
anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152]...trong đó, huyết thanh kháng
nọc rắn (antivenom) là một loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều
trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nơng nghiệp, bờ biển
dài hơn 3000 km, Việt Nam có mơi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển.
Mặt khác, phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp,
rừng núi, hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]);
ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải
thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để

cứu tính mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền
≈ 46 lít máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải
sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên
cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến
nay, đã có một số nghiên cứu rất thành cơng, góp phần cứu sống hàng ngàn
bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm
trọng nhiều loại HTKNR; hầu như chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn
hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc
rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc
gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,


3

điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;
đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong
các lồi đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc
họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là lồi rắn độc có độc tính cực mạnh, gây
tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy:
nước ta có hai lồi rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam
(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai
loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thống nhìn rất
khó phân biệt. Hai lồi rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm
sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu khơng có tác dụng
chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15].
Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai lồi rắn độc nguy hiểm
nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp

nia cắn trong cả nước. Để tăng tính an tồn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối
ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm sốt chất lượng
tồn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho
người, theo Dược điển Việt Nam [9].
Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất lƣợng chế phẩm trong phịng
thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa,
đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.
2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phịng thí nghiệm.


4

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MÁU VÀ HUYẾT TƢƠNG
1.1.1. Máu:
- Khái niệm: máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn;
tạo thành từ các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc
sinh máu và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước....
- Đặc điểm: máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở
nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31].
- Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC và huyết tương, với chức năng
cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể,...tương tự ở người.
1.1.2. Huyết tƣơng:
- Khái niệm: là phần dịch lỏng thu được sau ly tâm hoặc để lắng tự nhiên
máu toàn phần đã được chống đông.
- Thành phần chủ yếu là nước (92%), chứa các protein hòa tan (tức làalbumin, globulin và fibrinogen), các protein dưới phân tử, đường, các yếu tố

đông máu, chất điện giải, vitamin, hormon, và carbon dioxide [31],[167].
- Protein huyết tương gồm: các globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông
máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận
chuyển...Các thành phần này thay đổi trong bệnh lý. Điện di protein, điện di
miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein. Mỗi protein huyết tương đều
có điểm đẳng điện tương ứng với pH. Tính hịa tan của protein chịu ảnh
hưởng của nhiệt độ và tính hòa tan trong dung dịch muối. Khi cấu trúc protein
thay đổi, độ hịa tan thay đổi, tính chất sinh học cũng mất đi; các yếu tố gây
biến tính protein gồm: nhiệt độ, độ acid hoặc base, tia cực tím làm đứt gãy
liên kết peptid, sóng siêu âm gây oxy hóa [31],[163].


5

1.2. CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG
1.2.1. Máu toàn phần:
- Lấy từ mạch máu người cho, hoặc động vật cho máu, bảo quản trong túi
(chai) có chất chống đông và bảo quản máu. Dung dịch bảo quản máu thông
thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin. Mỗi đơn vị
250 ml máu người cho khỏe mạnh có 30-40 gam hemoglobin [31],[170].
- Bảo quản máu tồn phần ở 2-6oC, thời gian bảo quản tối đa là 42 ngày (với
dung dịch bảo quản là CPDA). Máu toàn phần lưu trữ chứa thành phần chính
là hồng cầu, nếu mới thu nhận cịn có tiểu cầu và một số yếu tố đơng máu.
Bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các chất trung gian; ngồi
ra cịn chứa các tế bào lympho và các yếu tố huyết tương.
- Khi sản xuất HTKNR, lấy máu túi 450 ml, túi đôi để dễ sản xuất, đảm bảo
vô trùng và an tồn, khơng gây vỡ HC khi vận chuyển.
1.2.2. Khối hồng cầu [31],[170]:
- Là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương ở trên sang một
túi khác. Tuỳ cách sản xuất mà có các loại khối hồng cầu sau:

+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit khoảng 75%.
Thành phần có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương. Bảo quản: 26°C. Chế phẩm có tính chất đậm đặc nên phải truyền chậm.
+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: sau khi tách huyết tương khỏi hồng
cầu, trả lại dung dịch bảo quản. Thành phần: hồng cầu và dung dịch bảo quản,
cịn ít bạch cầu. Lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần. Bảo quản: 2-6°C
thời gian 42 ngày.
+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: máu toàn phần được tách huyết tương và
phần Buffy coast. Thành phần: hồng cầu + bạch cầu đã được loại bỏ còn


6

khoảng 10% so với khối hồng cầu thông thường. Ưu điểm: giảm phản ứng do
bạch cầu, giảm nguy cơ lây bệnh mà tác nhân cư trú trong bạch cầu.
+ Khối hồng cầu rửa: máu toàn phần hoặc khối hồng cầu, ly tâm bỏ hết huyết
tương rồi thay thế bằng nước muối sinh lý, trộn đều ly tâm tiếp để rửa ba lần.
Thành phần: hồng cầu + nước muối sinhh lý.
Bảo quản: 2oC-6°C dưới 24 giờ, 22°C dưới 6 giờ.
+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: khối hồng cầu đã
được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai. Bảo quản: 2-6°C dưới
hai tuần từ khi chiếu xạ, nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc khơng để q 24
giờ. Thành phần: hồng cầu, bạch cầu cịn lại rất ít, bạch cầu bị bất hoạt.
* Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả khối
HC ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi
dưỡng HC và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên đường đến nơi truyền
trả khối HC ngựa. Nếu lấy máu ngựa vào túi 450ml, việc truyền khối HC trở
lên đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít).
1.2.3. Khối tiểu cầu:
+ Khối tiểu cầu tách từ máu toàn phần: ly tâm các túi máu toàn phần, gạn lấy
lớp Buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu. Thường từ 3-4 đơn vị máu tồn

phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được một đơn vị pool tiểu cầu.
Bảo quản: nếu chưa pool, để 22°C, lắc liên tục 3-5 ngày.
Nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ.
Số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011.
+ Khối tiểu cầu tách chiết: dùng máy tách tế bào với bộ kit chuyên dụng để
lấy tiểu cầu từ một người cho. Thành phần: có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/ đơn vị, có
ít bạch cầu.
+ Bảo quản: 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày.


7

1.2.4. Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh:
- Huyết tương tách từ máu toàn phần trong 6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản
đông lạnh gọi là huyết tương tươi đông lạnh.
- Thành phần: albumin, globulin miễn dịch, các yếu tố đơng máu bền vững,
yếu tố VIII cịn khoảng 70% . Lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu
(250 ml) có khoảng 125-150ml. Thường pool lượng huyết tương tươi của hai
đơn vị máu tồn phần cùng nhóm, dung tích khoảng 250-300ml.
Bảo quản: - 25°C/năm, ≤ - 25°C trong hai năm [31],[170].
- Khi sản xuất HTKNR, không cần sử dụng huyết tương tươi đơng lạnh máu
ngựa vì khơng cần sử dụng các yếu tố đông máu. Nếu cần bảo quản để sản
xuất nhiều đợt trong thời điểm khác nhau, cần bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C.
1.2.5. Tủa VIII (cryo):
- Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần tủa, ly
tâm thu nhận các tủa này đó là cryo. Thành phần: tủa VIII khoảng 2 - 3 đơn
vị/ml, yếu tố V, fibrinogen.
- Trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng
phân tử IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở
Fraction I, loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì khơng cần thiết sử dụng.

1.2.6. Huyết tƣơng tƣơi đã tách tủa:
- Phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa ở huyết tương tươi đơng lạnh, bảo
quản ở -25°C. Thành phần gồm có: albumin, globulin, một số yếu tố đông
máu. Nếu sản xuất HTKNR theo phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ
lại để sản xuất do có γ -globulin.
- Bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh.


8

1.2.7. Huyết tƣơng đông lạnh:
- Thành phần: các yếu tố huyết tương, các yếu tố đơng máu khơng bền vững
cịn lại ít. Đây là huyết tương tách từ máu tồn phần sau 6 giờ kể từ khi lấy
máu và bảo quản ở - 25°C. Bảo quản: như huyết tương tươi đông lạnh.
- Chủ yếu tách huyết tương để sản xuất HTKNR theo dạng chế phẩm này.
1.2.8. Khối bạch cầu hạt:
- Tách từ phần Buffy-coast và pool của nhiều người cho máu. Thành phần:
chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tế bào lympho, các chất bạch
cầu giải phóng. Khối bạch cầu hạt tập hợp từ nhiều người cho nên nguy cơ
nhiễm virus rất cao.
- Bảo quản: 22°C ≤ 24 giờ.
- Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vì vậy cần để lại phần
bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối HC. Chú ý truyền lại máu ngựa sớm để
ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục.
1.2.9. Albumin:
-

Albumin là protein hình cầu, tính hịa tan cao, trọng lượng phân tử 66.500

Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70 - 80%

áp lực keo trong huyết tương và liên kết, vận chuyển các chất có phân tử nhỏ
như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc. Dung dịch
albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 - 20% protein toàn
phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa 5% protein [163].
- Do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm này theo phương
pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa Cohn cuối cùng.
- Khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ. Theo tiêu chuẩn
tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉ được phép
còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7].


9

1.2.10. Gamma globulin:

Hình 1.1. Hình ảnh điện di protein huyết thanh.

- Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin, xác định được khi điện di
protein huyết thanh. Có năm lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong
đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít.
- Năm 1940, -globulin được tách chiết lần đầu tiên; khơng lâu sau đó,
globulin miễn dịch tiêm bắp (IMIG) được đưa vào sử dụng, tạo miễn dịch thụ
động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô -globulin huyết (1950).
- Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IVIG) được sản xuất và đưa vào sử
dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IMIG.
- Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IVIG đầu tiên được đăng ký ở
Mỹ, Sandoglobulin hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984. Gamimune được
chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986 và sản phẩm này được đổi tên
thành Gamimuner N. Sau đó, một số IVIG khác được đăng ký ở Mỹ:
Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam bởi

Immuno, Venoglobulin-I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor và
GammaRaas của RAAS (Mỹ) [167].
- Năm 1991, IVIG sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấp nhận
(Venoglobulin-S). Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đến


10

Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột khơng hồ tan Gammagard và
Polygam bị đình chỉ.
- Năm 1980, bệnh nhân dùng IVIG điều trị giảm -globulin huyết, xuất huyết
giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy tăng số lượng tiểu cầu. Tiếp theo phát hiện
ngẫu nhiên này, việc sử dụng IVIG cho ITP được nghiên cứu và hiện nay nó
được dùng cho chỉ định này. Kể từ khi IVIG có hiệu quả đối với ITP, chúng
tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnh khác với giả định cơ chế tự
miễn. Hầu hết sử dụng IVIG đối với bệnh tự miễn đều có hiệu quả; ví dụ bệnh
Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ myelin viêm mạn tính, hội chứng
Guillain-Barre...Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy
giảm miễn dịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh
Kawasaki, ngăn ngừa nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện
ghép tuỷ xương.
- Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IVIG) là chế phẩm có trên 95% IgG từ
huyết tương người hiến máu được tinh chế. IGIM chứa 15-18% protein, trong
đó IgG chiếm trên 90%. IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, có thể có
màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt. Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn, không
chứa chất gây sốt, gồm các globin chứa nhiều loại kháng thể có mặt trong
máu người bình thường, pH 6,4 - 7,2 với thimerosal là chất bảo quản.
- Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong 2 ngày. IgG
có trong IGIM được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và
ngồi mạch máu. Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian

bán hủy của IgG khoảng 23 ngày. Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải
chia ra thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm
làm giảm đau tại chỗ và bớt khó chịu. Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không
được vượt quá 20 ml (ngay cả đối với người lớn). Bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ
2-8oC và không được để đông băng. Thời hạn dùng của IGIM không được
quá 3 năm kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123].


11

Bảng 1.1. Các thành phần của protein huyết tương:

Globulins

Albumins

α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin..
α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol
α-globulins
binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin,
haptoglobin...
hormone, binding globulin, transferrin,...
β-globulins angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor
H, plasminogen, properdin...
-globulin

Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)

Loại khác

Fibronectin, macroglobulin/microglobulin,
Transcobalamin...

Lòng trắng
Conalbumin, ovalbumin, avidin...
trứng
Serum
Human serum albumin, bovine serum albumin,
albumin
prealbumin...
Loại khác

C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin,
ricin...

1.2.11. Kháng huyết thanh (KHT):
- Khái niệm: kháng huyết thanh là sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có
khả năng trung hịa kháng ngun đặc hiệu, thu được từ huyết tương động vật
hoặc huyết tương người, đã được mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, được
tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và loại bỏ các
protein không cần thiết [7],[9]
- Một số KHT nghiên cứu, sử dụng trong Huyết học-Truyền máu:
+ Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ
huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173].
+ Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn
(sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109].


12

+ Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương
thỏ gây mẫn cảm) [132].
+ Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh,
dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] và
điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119].
+ Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria) [99].
+ Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất
từ huyết tương thỏ) [127].
+ Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111].
+ Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu,... do rắn
độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa)...
+ Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ
huyết tương thỏ, ngựa...[22].
- Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất chỉ
sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ ngựa tinh chế hai bước,...an toàn
hơn nhưng giá thành tăng lên gấp nhiều lần. Bên cạnh đó nguy cơ phải đóng
cửa các trang trại ni ngựa sản xuất KHT vì khơng đem lại lợi nhuận, giá đắt
và thị trường eo hẹp; những đạo luật bảo vệ động vật không cho dùng ngựa để
lấy máu,...là những điều khiến sản xuất KHT trở lên kém hấp dẫn; kết quả là
sự khan hiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên
người bệnh. Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số người nghèo như hiện
nay, chính phủ một số nước miễn thuế cho sản xuất và lưu hành KHT [77];
các tổ chức xã hội đứng ra sản xuất và hỗ trợ KHT miễn phí cho người nghèo
(Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148]. Các nhà sản xuất KHT luôn mong
đợi sự hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, chính phủ và các tổ chức từ
thiện để duy trì số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149].


13

1.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG:
1.3.1. Phƣơng pháp tủa lạnh bằng Ethanol:
- Phương pháp tủa Cohn: là phương pháp tách các thành phần máu và huyết
tương bằng thay đổi nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion... Quy trình này
cịn được gọi là: quy trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa
biết trong huyết tương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn
(1892-1953), người Mỹ [169]. Phát minh của ơng lúc đó đã góp phần cứu
sống hàng vạn người trong Chiến tranh thế giới thứ II. Phương pháp của Cohn
đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trong tách chiết các chế phẩm máu và
huyết tương tại các Trung tâm Huyết học-Truyền máu trên thế giới [31].
Cohn đã bắt đầu phịng thí nghiệm phân đoạn plasma sau khi được tài trợ
lớn từ các cơ quan chính phủ và các cơng ty dược tư nhân. Phân đoạn huyết
tương theo phương pháp Cohn đã thu được albumin huyết thanh, -globulin,
fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu. Fibrinogen và các phần
phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn, chế tạo thành các sản
phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin. Các -globulin tìm thấy trong
Fraction Cohn II, III được chứng minh có tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh
sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừa bệnh viêm gan truyền nhiễm cho
những người lính trong chiến tranh thế giới thứ hai. Fibrin keo lỏng, fibrin bọt
và màng fibrin đã được sử dụng điều trị nạn nhân bỏng, trong đó có một số
nạn nhân từ cuộc tấn cơng tại Trân Châu Cảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công
tăng cao. Fibrinogen keo lỏng rất hữu ích trong kết nối dây thần kinh bị cắt
đứt. Fibrin bọt và thrombin được sử dụng để kiểm soát chảy máu, đặc biệt là
trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểu chảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng
như đối phó với dị tật mạch máu trong não. Màng fibrin được sử dụng để cầm
máu trong các ứng dụng phẫu thuật khác nhau, bao gồm cả phẫu thuật thần
kinh, tuy nhiên, khơng hữu ích trong việc kiểm soát chảy máu động mạch.

14

Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm 90, đã
thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ; đây là
loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch.
Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sử
dụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ
ethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương,
như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),
Mulford , Kistler và Nitschmann, William N. Drohan....
- Phương pháp Cohn cải tiến bởi Van Aken (1996) [31]:
Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14.
Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein).
Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9.
Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein)
Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2.
Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.
Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8.
Thu được tủa IV- 4 có haptoglobin transferrin, -globulin.
Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 4) bằng ethanol 40%, pH 5,8.
Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein).
Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch.
Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong
đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn.
Như vậy, để sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn, ta chú ý vào sản
phẩm F-II (cho chúng ta IgG).


15

- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40% trong
Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợp hai
Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu.
- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử
dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV.
- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol (William N. Drohan): kết hợp
tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phần huyết tương có giá trị: tủa
lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố Von-Willebrand; IgG (F-II); albumin.
Phương pháp này hiện nay các nước như Mỹ, Đức, Pháp, Italy và nhiều nước
đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sản phẩm đạt độ
tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủa ethanol.
- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi xử
lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết).
- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,
tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độ
ethanol thấp hơn 19%, pH 5,8. Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol
40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, được
tinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3oC.
Như vậy, globulin miễn dịch có mặt trong F-II. Sản phẩm này có thể sử
dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IMIG; để đảm bảo an toàn và hiệu quả
cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IVIG. Có nhiều phương pháp sản xuất
IVIG, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn loại bỏ Fc của IgG được nhiều
nước sử dụng có kết quả. Có thể tóm tắt phương pháp này như sau: F-II thu
được bằng phương pháp Cohn cho tác dụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu
được đem thẩm tích loại bỏ Fc và pepsin, cho sản phẩm an tồn hơn, giảm
phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch. Sau phát minh của Cohn, việc nghiên
cứu sản xuất các sản phẩm máu và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh


16

ở các nước tiên tiến. Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập
trung vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin,
globulin miễn dịch, các yếu tố đông máu.
1.3.2. Phƣơng pháp tủa bằng muối:
- Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2.
- Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung
quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung mơi
hoặc các hố chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân
tử protein đó, giúp cho protein kết tủa. Thường sử dụng dung mơi (acetone,
ethanol) hoặc muối trung tính để kết tủa protein. Sự kết tủa có tính chọn lọc:
các protein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau.
- Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammonium sulfate
(NH4)2SO4, do muối này có mức độ hồ tan rất cao trong nước, ít làm mất
hoạt tính enzyme, thậm chí cịn có tác dụng làm bền enzyme; ưu điểm nữa là
khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều protein không mong
muốn trong huyết tương. Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vào huyết tương
một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ
của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm
biến tính một số protein kém bền. Hạn chế của phương pháp là mất nhiều thời
gian, do nồng độ ammonium sulfate cao, tỷ trọng của dung môi lớn, để kết tủa
được các protein, phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại
muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo.
- Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biện
pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng
cách lọc qua gel sephadex.
- Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở
25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độ

17

bão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại
huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất. Thu IgG qua ly
tâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tích
đối với đệm trước khi dùng.
- Để loại bỏ những thành phần protein khơng cần thiết, có thể gây biến tính
chọn lọc bằng nhiệt độ, pH. Phương pháp này thích hợp với protein chịu acid
và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50-70oC và pH ≤ 5;
những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, được
loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc.
- Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng các
enzyme pepsin hoặc papain. Đây là các protease thủy phân protein, xúc tác
cho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Nhiệt độ có tác
dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nào
enzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60-70oC, enzyme mất hẳn
hoạt tính. Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp
dưới 40oC, để hạn chế sự biến tính enzyme. Để loại bỏ các protein tạp và các
tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác
nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của
môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các
dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion), điện di, phương pháp lọc gel.
1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký (chromatography):
- Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM
(Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S-200,...bằng phương
pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99%. Tuy nhiên giá rất cao, sử dụng
một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phương pháp
Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao. Mất mát trong quá trình sắc ký

18

nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều nước
kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký. Theo phương pháp này,
sau ly tâm huyết tương tươi đơng lạnh có 3 nhóm nguyên liệu cần tinh khiết
và chiết tách bằng phương pháp sắc ký.
+ Nhóm 1 (tủa lạnh sau ly tâm): nếu sắc ký ta thu được 4 thành phần: F-VIII,
fibrinnogen, F.Von Willebrand, fibronectin.
+ Nhóm 2 (nước mặt sau ly tâm): Nếu sắc ký sẽ thu được 6 thành phần: FVII, IX, XI, AT III, pascal, protease inhibitor, IgG.
+ Nhóm 3: nhóm này có hàm lượng lớn nhất được tủa bằng ethanol 40%, pH
5,8 nhiệt độ 50C sẽ thu được albumin và -globulin, có thể tủa thêm lần 2,
với ethanol 40%, pH 4,8. Phương pháp sắc ký tuy thu được các sản phẩm khá
tinh khiết, nhưng mất mát qua các bước của quy trình cũng khá nhiều.
1.3.4. Phƣơng pháp miễn dịch hấp thụ:
Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch ra
khỏi hỗn hợp chung. Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nên chỉ
dùng trong phịng thí nghiệm.
1.3.5. Phƣơng pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:
Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion. Phương pháp này
sản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giá
thành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới.
Tóm lại: sản xuất  - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ
huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của
ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT
chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số lượng
lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác. Vậy nên, chỉ có thể tạo
nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động.

19

1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:
1.4.1. Khái niệm:
HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn có
khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từ
người đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết
theo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9].
Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từ
gốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison”. Năm 1895, thuật ngữ
antivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu. Từ 2003,
thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:
“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau.
1.4.2. Lịch sử phát minh:
Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa
học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh
thỏ. Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR
rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trị
cứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả
trên người (Barbara J. Hawgood, 1999)[43]. Việc gây miễn dịch cho động
vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive
immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh
năm 1890 đã được A. Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành công
HTKNR [64]. Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳ
mới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất. Từ đó, các nghiên cứu về
HTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an tồn.
HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc


20

nọc rắn và đóng một vai trị quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn
phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79]. Hàng
nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳng
định: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu,
giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6].
1.4.3. Cơ sở miễn dịch học:
1.4.3.1. Kháng nguyên nọc rắn:
Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an tồn cho
động vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính kháng
nguyên gọi là KN nọc rắn. Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc
điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có
thành phần và tính khơng thuần nhất về phương diện hố học, có khả năng
giáng hố. Khi kháng ngun xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch
phụ thuộc vào mức độ lạ. Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về kháng
nguyên giữa hai cơ thể càng nhiều. Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứ
nhất là hồn tồn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm. Các kháng ngun
có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa.
Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễn
dịch yếu. Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh
miễn dịch rất yếu [16],[34]. Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng
neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong
cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng ngun lại khó khăn do
có tính sinh miễn dịch yếu. Các phân tử khơng hồ tan có tính sinh miễn dịch
lớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý. Vì
vậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏ
bằng nhiệt, làm tăng tính khơng hồ tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi cho
đại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch.

21

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu cịn phụ thuộc tính
chất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ
và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các
tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28]. Cấu trúc di truyền của túc chủ
ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng.
Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn.
Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất.
Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối
ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đáp
ứng miễn dịch với cường độ cao nhất. Liều kháng nguyên quá thấp và liều
quá lớn kháng nguyên cũng khơng kích thích được đáp ứng miễn dịch vì
chúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng. Đưa
kháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độ
thấp. Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài
tuần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25].
Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm
gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Sử dụng tá
dược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịch
thấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên. Tá dược kéo dài sự
tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm. Khi tiêm kháng
nguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào
cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16].
Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứng
miễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn. Tá dược Freund
là một tá dược hay được sử dụng. Tá dược Freund hồn tồn (Freund’s
complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hồ trong nhũ tương dầu, có
hiệu lực cao hơn tá dược Freund khơng hồn tồn (Freund’s incomplete

22

adjuvant). Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm
tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tế
bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết
ra, là đồng kích thích tố hoạt hố các tế bào lympho TH. Cả hoạt động trình
diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tăng
lên khi có tá chất. Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạn
tính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có kháng
nguyên. Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thành
các u hạt. Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoá
lympho TH. Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, kháng
nguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phương
pháp khác nhau, theo từng tác giả,... miễn sao hiệu quả nhất [16],[25].
1.4.3.2. Kháng thể chống nọc rắn:
Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạt
động đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc,
được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắn
tương ứng, đặc hiệu.
Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một
kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên. Trong phản ứng chống
độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hịa,
làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên
lên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn do
các độc tố đó gây ra. Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể. Khi hệ thống bổ thể
được hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanh
lọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động được
diễn ra. Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có

23

thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Các tế bào NK có
thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởi
các kháng thể. Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đến
việc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực),
tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hồ độc tố hiệu quả hơn
[16],[25]. Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bào
lymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể
(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể. Tế bào plasma
chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh
ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ. Các tế bào
lymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưu
hành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng ngun tái xuất
hiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng. Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa
giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố
khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng
thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].
1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:
1.4.4.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:
Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an tồn cho ngựa gây mẫn
cảm, kháng ngun có tính sinh miễn dịch mạnh. Để chế tạo được kháng
nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc
cần sản xuất HTKNR. Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại
đúng loài rắn cần nghiên cứu. Tuyển chọn rắn khơng đại diện, HTKNR sẽ
khơng có tác dụng. Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc
tính di truyền từng lồi rắn. Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu
được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả khơng cao. Thí

24

dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR
cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W.,
Thorpe R.S, 1996) [20],[60]. Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn
thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần. Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn
máu, làm khô tự nhiên sau đó đơng khơ và bảo quản ở - 20oC. Chế tạo kháng
nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương
pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc.
Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ... có thể gây hủy hoại hồn tồn những
kháng ngun quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra
những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp.
Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động
vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an tồn trên chuột lang (Safety test),
kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng
nguyên vô khuẩn (Sterility test). Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,
thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm. Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảm
trên thỏ trước khi làm chính thức.
Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony,
ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể
[12],[15],[22],[26][73].
1.4.4.2. Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:
- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phơi trứng gà
[126],[129]...Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ
trước, nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do
ngựa cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều
đặn một khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang
đến hiệu quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát

triển, nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp. Thường


25

dùng ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350
kg. Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai
thác huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159]. Cừu có đáp ứng
miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá
dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A. et al., 1997) [84].
Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệu
tối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành.
- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tính
đặc hiệu và mức cơ đặc. Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá kháng
thể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt ra
cho tất cả các nhà sản xuất. Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịch
trình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăng theo
mỗi lần miễn dịch. Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa các lần
tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4 tuần.
Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo kháng nguyên để
qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp. Tá dược tạo
sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bào lympho, hỗ trợ
hiệu quả quá trình sinh kháng thể. Huyền dịch kháng nguyên nọc rắn trong tá
dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải phóng từ từ vào
cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972) [20].
- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi
sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tán
hai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa. Điện di miễn
dịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xác
định tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.